Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering, karakterisering og total DNA-ekstraksjon for å identifisere endofytiske sopp i mykoheterotrofe planter

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65135
Automatic Translation
1, 1, 1
1LabPlaM - Mycoheterotrophic Plants Research Lab, Department of Plant Biology, State University of Campinas (UNICAMP)

Summary

Den nåværende artikkelen tar sikte på å gi detaljerte og tilstrekkelige protokoller for isolering av planteassosierte endofytiske sopp, langsiktig bevaring av isolater, morfologisk karakterisering og total DNA-ekstraksjon for påfølgende molekylær identifikasjon og metagenomiske analyser.

Abstract

Mycoheterotrophic planter presenterer en av de mest ekstreme former for mycorrhizal avhengighet, og har helt mistet sin autotrofe kapasitet. Like viktig som enhver annen viktig ressurs, er soppene som disse plantene intimt forbinder med avgjørende for dem. Derfor er noen av de mest relevante teknikkene for å studere mykoheterotrofe arter de som muliggjør undersøkelse av tilknyttede sopp, spesielt de som bor i røtter og underjordiske organer. I denne sammenheng brukes ofte teknikker for å identifisere kulturavhengige og kulturuavhengige endofytiske sopp. Isolering av soppendofytter gir et middel for morfologisk å identifisere dem, analysere deres mangfold og opprettholde inokula for applikasjoner i symbiotisk spiring av orkidéfrø. Det er imidlertid kjent at det er et stort utvalg av ikke-kulturable sopp som bor i plantevev. Dermed tilbyr kulturuavhengige molekylære identifikasjonsteknikker et bredere dekke av artsmangfold og overflod. Denne artikkelen tar sikte på å gi den metodiske støtten som er nødvendig for å starte to undersøkelsesprosedyrer: en kulturavhengig og en uavhengig. Når det gjelder den kulturavhengige protokollen, er prosessene for innsamling og vedlikehold av planteprøver fra innsamlingssteder til laboratorieanlegg detaljert, sammen med isolering av trådformede sopp fra underjordiske og luftorganer av mykoheterotrofe planter, holde en samling av isolater, morfologisk karakterisere hyfer ved lysbildekulturmetodikk og molekylær identifikasjon av sopp ved total DNA-ekstraksjon. De detaljerte prosedyrene omfatter kulturuavhengige metoder og inkluderer innsamling av planteprøver for metagenomiske analyser og total DNA-ekstraksjon fra aklorofyllløse planteorganer ved hjelp av et kommersielt sett. Til slutt foreslås også kontinuitetsprotokoller (f.eks. polymerasekjedereaksjon [PCR], sekvensering) for analyser, og teknikker presenteres her.

Introduction

Endofytiske sopp er per definisjon de som bor i det indre av planteorganer og vev i iøynefallende infeksjoner (dvs. uten å skade verten)1,2. Disse soppene kan nøytralt eller fordelaktig samhandle med vertsplanter, kan gi motstand mot patogener og ugunstige miljøforhold, og kan bidra til syntese av gunstige forbindelser for planten (f.eks. vekstfaktorer og andre fytohormoner)1,3. Mycorrhizal endofytter er sopp som etablerer mycorrhizal foreninger med planten, og deltar i næringsoverføring4. Hos Orchidaceae er samspillet med mycorrhizal endofytter grunnleggende for frøspredning hos de aller fleste arter, og frøplanteetablering i alle plantene i familien5. I slike sammenhenger representerer mykoheterotrofe orkideer et tilfelle av total avhengighet av deres mykorrhizalpartnere, da de er avhengige av mineralnæringsstoffer og overføring av karbonforbindelser av disse soppene i hele livssyklusen6. Derfor er isolering og identifisering av assosierende sopp en grunnleggende base når man undersøker mykoheterotrofe livsstrategier. Videre er lite kjent om rollene til soppendofytter i mykoheterotrofe planter eller til og med det virkelige mangfoldet av disse soppene 7,8.

Undersøkelsen av endofytiske sopp kan utføres via forskjellige teknikker, tradisjonelt beskrevet som kulturuavhengige eller -avhengige, for eksempel: (a) direkte observasjon, (b) soppisolering og morfologisk og/eller molekylær identifikasjon, og (c) total DNA-ekstraksjon av plantevev og molekylær identifikasjon9. Ved direkte observasjon (a) kan endofytiske sopp undersøkes mens de fortsatt er i det indre av planteceller og vev ved lys eller elektronmikroskopi9, da forskjellige mikroskopiprotokoller er beskrevet av Pena-Passos et al.10. Ved isolasjonsmetoder (b) kan soppendofytter karakteriseres i henhold til deres kolonier, hyfer og reproduktiv eller resistensstrukturmorfologi. Også via isolasjonsteknikker er det mulig å utføre molekylær identifikasjon av isolater gjennom DNA-ekstraksjon, amplifisering av molekylære identifikasjonssekvenser (strekkoder eller fingeravtrykk) og sekvensering11. Sistnevnte teknikk (c) muliggjør molekylær identifikasjon av endofytiske sopp per DNA-ekstraksjon mens den er i det indre av plantevev (metabarkoding), etterfulgt av bibliotekforberedelse og sekvensering12.

Videre kan soppisolater brukes i symbiotiske spiringsforsøk, ved bruk av frø fra autotrofe eller mykoheterotrofe orkideer. Et eksempel på en slik applikasjon er undersøkelsen utført av Sisti et al.13, som beskriver spiring og innledende stadier av protokormutvikling i Pogoniopsis schenckii, en mykoheterotrofisk orkidé, i forbindelse med noen av dens isolater, som omfatter ikke-mykorrhizal endofytiske sopp. Den anvendte symbiotiske spiringsprotokollen er detaljert og presentert i en video av Pena-Passos et al.10. Isolering av sopp i forbindelse med forskjellige planteorganer tillater ulike undersøkelsesfokus angående arten av plante-sopp-interaksjoner (f.eks. å forstå enten økologiske eller fysiologiske aspekter av foreningen, samt undersøkelser av næringsoverføringen fra sopp til planten)9.

Metodene som presenteres i avsnitt 1 er basert på en samling av underjordiske organprøver, da disse organene presenterer de fleste vanskeligheter med innsamling, og de er av stor interesse siden mykorrhizale endofytter koloniserer dem. Imidlertid kan begge de inkluderte protokollene (trinn 1.1 og 1.2) brukes på andre mykoheterotrofe planteorganer (f.eks. jordstengler, blomsterstengler og frukt). Innsamlingsmetodikken beskrevet i trinn 1.1 er beregnet for isolering av endofytisk sopp (pkt. 2) for morfologisk karakterisering (pkt. 4 og 5) og/eller total DNA-ekstraksjon for isolatidentifikasjon (pkt. 6). På den annen side er innsamlingsmetodikken beskrevet i trinn 1.2 utelukkende tilordnet total DNA-ekstraksjon av plantevev for metastrekkodingsteknikker (avsnitt 7). I avsnitt 3 presenteres fire metoder for lagring og konservering av trådformet sopp, to for korttidslagring (3-6 måneder) og de to andre tilstrekkelig for langtidslagring (>1 år). Den morfologiske karakteriseringen (avsnitt 4 og 5) kan være assosiert med molekylær identifikasjon for å forsterke den og gi viktig informasjon om soppmakro- og mikromorfologi. Figur 1 oppsummerer de kollektive metodene som er beskrevet deretter.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oppsummering av de presenterte metodene. Planteinnsamling og soppisolering, bevaring og molekylær identifikasjon ved kulturavhengige og -uavhengige metoder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Innsamling av planteprøver

  1. Prøvetaking for dyrkningsavhengige metoder
    1. Forsiktig grave de underjordiske organene; Disse kan være røtter, stengler, jordstengler eller lagringsorganer av planten som skal samles inn. Bortsett fra svært kompakte jordarter, samle disse prøvene for hånd.
      MERK: Bruk av verktøy som sparkel eller skjeer i dette trinnet er dårlig anbefalt, da det kan skade de skjøre strukturer av mykoheterotrofe planter og kan forårsake vevsforurensning av ikke-endofytiske sopp.
    2. Samle så mange underjordiske organer som mulig. Oppbevar prøvene i papirposer inne i en avkjølt beholder (f.eks. polystyrenskumboks eller termisk pose med is). Hvis luftorganer også samles inn, transporterer du dem separat fra de underjordiske.
  2. Prøveinnsamling for kulturuavhengige metoder
    1. Grav forsiktig røttene til planten som skal samles inn under de samme anbefalingene som er påpekt i NOTE fra trinn 1.1.1.
    2. Samle så mange underjordiske organer som mulig. Vedlikehold de oppsamlede prøvene i kryorør inne i flytende nitrogen (ønskelig alternativ) eller bruk sentrifugerør omgitt av tørris (alternativt alternativ). Vedlikehold luftorganer separat, hvis samlet.

2. Isolering av endofytiske sopp assosiert med planteorganer14

MERK: Alle materialer, oppløsninger og reagenser som brukes i denne delen, må være sterile. De som ikke kan kjøpes allerede sterilisert, bør autoklaveres ved 121 °C i 20 minutter.

  1. Overfladisk disinfestation av planteorganer
    1. Vask de oppsamlede prøvene (trinn 1.1.2) i rennende vann og fjern så mye underlag og annet rusk som prøvene kan ha som mulig.
    2. Inne i en laminær strømningshette, hold de vaskede prøvene nedsenket i 70% etanol i 1 min (et beger eller en glassburk kan brukes).
    3. Overfør prøvene til en annen beholder med natriumhypokloritt med 2% aktivt klor i 3 minutter.
    4. Bytt prøvene til en beholder med 70% etanol og hold nedsenket i 1 min. Etterpå vasker du prøvene sekvensielt i to beholdere med destillert vann.
  2. Installasjon av plantefragmenter i kulturmedium
    MERK: Hvert trinn som er beskrevet i trinn 2.2, må utføres inne i en avtrekkshette for laminær luftstrøm.
    1. Før montering, tilbered petriskåler (8-10 cm i diameter) med 19,5 g/l potetdekstrose-agarkulturmedium (PDA) + 7 g/l bakteriologisk agar + 3 ml/l antibiotika (f.eks. streptomycin, penicillin, tetracyklin, ampicillin).
    2. Vedlikehold petriskålene med dyrkingsmediet ved 36 °C i 24 timer før du bruker dem, for å sikre at det ikke er forurensning. Kast retter forurenset med bakterier eller soppkolonier.
      MERK: Tilsetning av antibiotika i mediet er viktig i dette trinnet, da organene er svært infisert av bakterier som kan hemme soppvekst. Kontroller om antibiotika kan varmes opp under autoklavering; Noen antibiotika må tilsettes etter avkjøling av mediet til rundt 36 °C (før det legges i oppvasken).
    3. Umiddelbart etter overfladisk desinfisering av prøvene og fortsatt inne i en laminær strømningshette, i PDA, inokulerer noen dråper av destillert vann fra den siste beholderen som ble brukt til å vaske prøvene. Dette trinnet er viktig for å evaluere effekten av overfladisk desinfisering av prøver.
    4. I en tom autoklavert tallerken, plasser prøvene og bruk en flammet skalpell og tang for å seksjonere prøvene til en tykkelse på rundt 0,2 cm.
    5. Seksjon sylindriske prøver i lengderetningen i to halvdeler om ønskelig for å forsterke overflaten i kontakt med mediet. For bedre å eksponere frukt og andre mer sfæriske organer, hogge opp eller skjære strukturene grundig. Frøene kan også være viktige soppkilder, så sørg for at snittet frukt utsetter dem for mediet.
      MERK: Bare friske organer, uten vevskader eller signaler om mulige sykdommer eller patogene infeksjoner, bør brukes i soppendofyttisolasjon.
    6. Fordel fem fragmenter av de underjordiske organene i petriskålene med PDA + antibiotika. Sørg for at fragmentene er så langt unna hverandre som mulig, og at de heller ikke berører oppvaskkantene. Ikke matrise noen fragmenter på mediet. Forbered replikater av hvert organ installert, som en forholdsregel i tilfelle forurensning.
    7. Forsegl petriskålene med plastfolie og oppbevar dem i mørket ved 25-27 °C (helst i en inkubator) i 5 dager.
  3. Isolasjonsfrekvens (IF) kalkulus11
    1. Etter 5 dager med organfragmentinkubasjon, beregne IF, i henhold til antall inkuberte fragmenter som presenterer soppkolonier som vokser delt på summen av inkuberte fragmenter, som representert i følgende ligning:
      Equation 1
  4. Rensing av soppisolater ved striating og subculturing
    MERK: Hvert trinn som er beskrevet i trinn 2.4, må utføres inne i en avtrekkshette med laminær luftstrøm.
    1. Tilbered petriskåler (5 cm i diameter) med 5-7 g/l agar-agar (AA; kun bakteriologisk agar). Ta oppvasken i 24 timer ved 36 °C for å eliminere mulig forurensede.
    2. Identifiser hver vokst soppkoloni med en kode og avgrens marginene på undersiden av fatet (kan gjøres med en permanent markør). Differensiere koloniene etter farge, vekstmønster, tekstur og margformat.
    3. Med en autoklavert tretannpirker, ved hjelp av den fine spissen, gjenoppretter du en liten mengde mycelium fra en soppkoloni. Konsentrer deg helst om kolonimarginene og velg et område så langt som mulig fra en annen koloni, og unngå å gjenopprette mer enn en type koloni samtidig.
    4. Bruk samme tannpirker med mycel på spissen, striate AA produsere tre striae (spor). Sørg for at hver stria er i en avstand på 1 cm fra en annen og parabolkantene. Skriv riktig kode (med klistremerkepapir og blyant), forsegl oppvasken og hold dem inkubert i mørket ved 25-27 °C i 3 dager.
    5. Tilbered petriskåler (8 cm i diameter) med 39 g/l PDA. Det er ikke nødvendig å legge til antibiotika på dette stadiet.
    6. Etter å ha inkubert AA-tallerkenene, observer dem nøye mot lys (fra en lampe eller et vindu), med sikte på å identifisere fine hyfer som danner individuelle kolonier. Avgrens arealet til en enkelt koloni per tallerken, ved hjelp av en permanent markør på undersiden av petriskålen.
    7. I en laminær strømningshette, bruk en autoklavert tannpirker for å kutte en del av mediet som inneholder kolonien og overfør kuttvolumet til midten av en ny PDA-tallerken.
    8. Identifiser petriskålene med kodene til isolatene, forsegl oppvasken med plastfolie og hold dem i mørket ved 25-27 °C i 7-14 dager.

3. Konservering av rensede soppisolater

MERK: Alle materialer, oppløsninger og reagenser som brukes i denne delen, må være sterile. De som ikke kan kjøpes allerede sterilisert, bør autoklaveres ved 121 °C i 20 minutter.

  1. Konservering med Castellanis metode eller i mineralolje (3-6 måneder)11,15
    1. Forbered 2 ml mikrosentrifugerør med 0,5 ml destillert vann eller inneholdende 0,5 ml mineralolje (avhengig av valgt metode). Forsikre deg om at rørene autoklaveres tomme, og at det autoklaverte vannet og oljen tilsettes rørene inne i en avtrekkshette for laminær luftstrøm.
    2. I en avtrekkshette med laminær strøm, plasser petriskålene med rensede isolater som allerede er dyrket i PDA (39 g / l) i 7-14 dager. Bruk en autoklavert tannpirker til å kutte små kuber (0,5 cm x 0,5 cm i øvre område) av medium som inneholder myceliummarginene.
    3. Plasser fire til seks kuber i mikrosentrifugerørene med destillert vann (Castellanis metode) eller mineralolje. Oppbevar tubene i mørket, ved 25 °C så lenge som nødvendig, og følg metodens tidsbegrensninger.
      MERK: Unngå å legge for mange cuboider til rørene og gjøre dem fulle, noe som kan øke forurensningssjansene. Det er mulig å holde rørene nedkjølt, noe som kan favorisere bevaring av noen isolater lenger. Currah et al.16 anbefaler å lagre replikater av mykorrhizal soppisolater fra tropiske orkideer både nedkjølt og ved 25 °C, da de kan gå tapt når de er i kjølelager.
    4. Recuperate en cuboid og plasser den i midten av en ny PDA tallerken for å vokse en lagret isolat.
  2. Kryopreservering i riskorn uten skrog (>1 år)17
    1. Vask riskorn uten skrog i rennende vann og kok dem til risskroget begynner å åpne seg. Fordel de kokte kornene i glassreagensrør med en skruehett og autoklav to ganger med et intervall på 24 timer i mellom.
    2. I en avtrekkshette med laminær strøm, plasser petriskålene med rensede isolater som allerede er dyrket i PDA (39 g / l) i 7-14 dager. Bruk en autoklavert tannpirker, gjenopprett fem små hyferfragmenter fra myceliummarginene og inokuler dem i røret som inneholder autoklaverte riskorn.
      MERK: Inokulerende hyfer på forskjellige punkter og dybder av røret garanterer at isolatet koloniserer riskornene uten skrog på kortere tid.
    3. Inkuber tubene i mørket ved 25-27 °C i 14 dager. Agiter rørene ved å virvle dem hver 3. dag for å holde kornene individualiserte.
    4. Etter å ha observert soppvekst i riskornene, fordel kornene i en autoklavert petriskål foret med filterpapir for å absorbere fuktighet, over papiret slik at kornene kan tørke. Oppbevares i mørket ved 25-27 °C i 2-3 dager.
    5. Forbered kryorør med 1/3 silikagel i bunnen og 1/3 glassull over silikaen. Til slutt fordeler du 1/3 av riskornene med dyrket soppmycel. Oppbevares ved -20 °C i 24 timer.
    6. Etter 24 timer, oppbevar kryorørene ved -80 °C så lenge som nødvendig, og følg tidsbegrensningene for metoden.
  3. Kryopreservering ved vermikulitt ved bruk av kryobeskyttelsesmiddel (>1 år)18
    1. Forbered et flytende kulturmedium sammensatt av 0,2% gjærekstrakt og 2% glukose i destillert vann. Juster pH til 5 og autoklav den.
    2. Fordel 0,2 g vermikulitt (bruk fin granulometri) i kryorør med en skruehett og autoklav dem. Tilsett 0,8 ml autoklavert flytende medium til kryorørene som inneholder vermikulitt.
    3. I en avtrekkshette med laminær strøm, plasser petriskålene med rensede isolater som allerede er dyrket i PDA (39 g / l) i 7-14 dager. Bruk en autoklavert tannpirker til å gjenopprette tre til fem hyferfragmenter fra mycelmarginene og inokulere langs røret som inneholder vermikulitt + flytende kulturmedium. Husk å identifisere kryorørene med den respektive isolatkoden.
      MERK: Inokulering av hyfer i forskjellige punkter og dybder av kryorøret garanterer at isolatet koloniserer vermikulitten på kortere tid.
    4. Oppbevar kryorørene i mørket ved 25-27 °C til kolonisering av de fleste vermikulittkorn kan observeres, noe som vanligvis tar rundt 14 dager.
    5. Forbered en kryobeskyttelsesmiddelløsning bestående av 5% glyserol og 5% trehalose i destillert vann og autoklav det. La løsningen avkjøles før du bruker den.
    6. Etter at vermikulitten i kryorør er kolonisert av det respektive soppisolatet, fordel 0,4 ml kryobeskyttelsesmiddel i hvert rør og hold kryorørene nedkjølt ved 4 °C i 48 timer. Deretter opprettholdes kryorørene ved -80 °C så lenge som nødvendig, og tidsbegrensningene for metoden overholdes.

4. Makromorfologisk karakterisering av trådformede sopp (kolonimorfologi)

  1. Oppretthold et fotografisk register over myceliet dyrket i hver petriskål med 39 g / l PDA i 7-14 dager. Husk å registrere begge sider av kolonien, over- og undersiden (baksiden). Hvis oppvasken skal brukes lett i seksjon 6 eller ikke vedlikeholdes, åpne oppvasken når du fotograferer dem for å få bedre bilder.
  2. Hvis du er interessert i kvantitative data om kolonimorfologi, replikerer subkultur av isolatene og opprettholder dem under de samme vekstforholdene og i en konstant periode for å registrere koloniens diameter og beregne veksthastigheten (vanligvis i mm / t).
    MERK: Mer sofistikerte kvantitative resultater kan oppnås ved å bruke ulike typer kulturmedier for sammenligning19 og ved å vurdere statistikkverktøyene for å behandle data.
  3. Observer koloniene under et stereomikroskop også for å identifisere morfologiske egenskaper og fotografere i forstørrelse. Evaluer koloniene i henhold til deres makromorfologiske egenskaper, som beskrevet i resultatdelen. Rådfør deg med ulike bibliografiske kilder for å hjelpe til med å kategorisere og relatere makromorfologien til molekylær og / eller morfologisk identifikasjon.

5. Mikromorfologisk karakterisering av trådformede sopp (hyphalmorfologi)

MERK: De mikromorfologiske teknikkene sammenlignes i diskusjonsdelen, med tanke på mulige bruksområder og ulemper.

  1. Dyrk isolatene på petriskåler med 39 g/l PDA i 7-14 dager. For å evaluere antatt orkidé mycorrhizal sopp, dyrk isolatene på 17 g / L maismellagar (CMA; eller et annet næringsbegrensende medium) i 3-7 dager19.
  2. Erte montering
    1. Arbeid inne i en hette med laminær flyt. Plasser en dråpe av en valgt flekk (trinn 5.5) på et rent glassglass.
    2. Bruk en autoklavert tannpirker eller et annet sterilt materiale, fjern forsiktig noen hyfer fra det dyrkede isolatet og legg dem i flekkdråpen. Plasser en dekkslipp (helst i en innledende vinkel på 45 ° for å unngå luftbobler) og analyser under et lysmikroskop.
  3. Selvklebende tapefeste
    MERK: Denne teknikken brukes vanligvis i soppkulturer som lett kan brukes i seksjon 6 eller ikke vedlikeholdes, siden tapen ikke kan autoklaveres, og forurensninger kan oppstå etter at metoden er utført.
    1. Plasser en dråpe av en valgt flekk (trinn 5.5) på et rent glassglass. Klipp en stripe med gjennomsiktig tape i en størrelse som passer til glassglasset og den sentrale flekken faller godt.
    2. Rett den klebrige overflaten av stripen til myceliumoverflaten. Ikke trykk, og prøv å samle noen hyfer uten å stikke for mange av dem.
    3. Fest båndet til glassglasset, og sørg for at flekken er i kontakt med de oppsamlede hyfer. Plasser en dråpe vann over båndet og legg en deksel. Analyser lysbildet under et lysmikroskop.
  4. Lysbildekultur av trådformede sopp20
    1. Inne i en stor petriskål (>9 cm i diameter, helst), plasser: filterpapir i bunnen, en U-formet glassstang eller en tilpasning (målet er å gi en høyde for glassglasset), ett glassglass og to deksler. Høyere petriskåler letter manipulasjonen. Autoklav disse settene med petriskåler, en for hvert isolat.
    2. Forbered et lite volum på 39 g / l PDA eller 17 g / l CMA, tilsett 10 g / l bakteriologisk agar og autoklav (volumet for en petriskål er nok for mer enn 30 isolater). Kulturmediene som brukes i lysbildekulturen må være hardere enn vanlige medier. Autoklav 100 ml destillert vann.
    3. Arbeid inne i en hette med laminær flyt. Legg det flytende mediet i en petriskål, og lag rundt 0,5 cm høyt. La mediet stivne. Når den er solid, bruk en steril skalpell til å kutte firkanter av mediet som er 1 cm x 1 cm i dimensjon.
    4. Åpne petriskålsettet inne i en hette med laminær flyt og bruk flammet tang til å organisere materialet autoklavert inne i fatet. Ordne materialet i nummerert rekkefølge, som vist i figur 2A, og plasser et kvadrat med kulturmedium på glassglasset. Før du legger dekselet over mediet, går du videre til trinn 5.4.5.
    5. Bruk en autoklavert tannpirker for å gjenopprette noen hyfer fra et isolat og gni forsiktig de fire sideflatene til mediet som er plassert på glassglasset. Legg et autoklavert deksel over den mellomstore firkanten med flammede tang.
    6. Bruk en steril pipettespiss til å plassere autoklavert vann i filterpapiret for å lage et fuktig kammer. Bruk et volum for å mette papiret uten å plassere vann i overkant. Forsegl petriskålen med klamfilm og identifiser den med den respektive isolatkoden. Oppvasken skal oppvaskes i mørket ved 25-27 °C i 3-7 dager.
    7. Vurder hyfevekst i glassglasset og dekselet. To lysbilder produseres fra hvert lysbildekultursett, en ved hjelp av glassglasset med hyfer og det autoklaverte dekselet, det andre ved hjelp av dekselet med hyfer og et annet glassglass.
    8. Etter at hyphalvekst er observert, løsner du forsiktig kvadratet av medium fra glassglasset (figur 2B), monterer de to lysbildene ved hjelp av en valgt flekk (trinn 5.5) og analyserer under et lysmikroskop. Husk å identifisere den isolerte koden på lysbildet. For å produsere semi-permanente lysbilder, forsegle dekselet med klar neglelakk.
    9. For å produsere permanente lysbilder, vask fargestoffet forsiktig fra vedheftede hyfer etter farging og la lysbildet tørke. Monteres med et hurtigmonteringsmedium (for detaljer, les Pena-Passos et al.10).
      MERK: Ulempen med å produsere et permanent lysbilde med denne teknikken er at sporer og strukturer som ikke er festet til glasset, kan vaskes.
  5. Fargemetoder og observasjon av hyfer
    1. Laktofenol bomullsblå (LPCB)21: Tilsett 20 ml melkesyre, 40 ml glyserol og 20 ml destillert vann. Løs opp 20 g fenolkrystaller i denne oppløsningen ved forsiktig oppvarming. Løs opp 0,05 g metylblått (bomullsblått eller 2 ml 1 % vandig oppløsning). LPCB kan også enkelt kjøpes allerede forberedt.
      FORSIKTIG: Fenol er svært giftig og flyktig; Manipuler den utelukkende inne i en avtrekkshette og bruk hansker.
    2. Toluidinblå O10 (TBO): Forbered 0,05% TBO i 0,1 M fosfatbuffer (pH 6,8).
    3. Kongo rød22,23,24: Forbered en løsning av 1% Kongo rød i destillert vann og filtrer den. Inkuber i 5-10 min. Dette fargestoffet kan også påføres for fluorescensmikroskopi25.
    4. Når du observerer og fotograferer sopphyfer under et lysmikroskop, konsulter ulike bibliografiske kilder for å identifisere strukturer (sjekk diskusjonen).

Figure 2
Figur 2: Prosedyrer for lysbildekultur av trådformet sopp . (A) Skjematisk konfigurasjon av et lysbildekultursett, der tallene angir rekkefølgen for å ordne elementene. (B) Løsne kvadratet av kulturmediet etter hyphalvekst observeres i glassglasset og dekselet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Total DNA-ekstraksjon fra soppisolater (hjemmelaget protokoll26 med modifikasjoner 27)

MERK: Alle materialer, oppløsninger og reagenser som brukes i denne delen, må være sterile. De som ikke kan kjøpes allerede sterilisert, bør autoklaveres ved 121 °C i 20 minutter. Bruk hansker under hele protokollen og utfør noen trinn inne i en avtrekkshette.

  1. Forbered ekstraksjonsbufferen: 1% natriumdodecylsulfat (SDS), 250 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 25 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Dyrk de rensede isolatene i 39 g/l PDA i 7-14 dager.
  2. Skrap forsiktig myceliet fra et isolat ved hjelp av en spatel eller en skje og overfør fragmentene til en autoklavert mørtel, unngå å overføre kulturmediet med hyferaggregatet. Bruk en porselenspistol, slip myceliet med flytende nitrogen til et fint pulver. Ikke la myceliet smelte, og tilsett nitrogen for å unngå det.
  3. Tilsett 1 ml ekstraksjonsbuffer i et 2 ml mikrosentrifugerør og plasser jordprøven til 1,5 ml-merket. Forsiktig agitere innholdet i rørene for å homogenisere.
  4. Rørene beveges i en virvel i 5 s og legg dem i en termoblokk ved 65 °C i 20 minutter. Forsiktig homogeniser innholdet ved inversjon hver 7-10 min.
  5. Sentrifuger rørene ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør 800 μL fra overordnet fase til et nytt 2 ml mikrosentrifugerør, tilsett 800 μL fenol til rørene, og bland innholdet ved inversjon.
    FORSIKTIG: Fenol er et svært giftig og flyktig reagens; Det kan forårsake erytem, koldbrann og vevnekrose. Ved innånding kan det forårsake dyspné og hoste. Den systemiske absorpsjonen kan skade leveren, nyrene og sentralnervesystemet. Manipuler fenol utelukkende inne i en avtrekkshette og bruk hansker.
    MERK: Fra neste trinn, bruk hansker og før protokollen inne i en avtrekkshette.
  6. Sentrifuger rørene ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 °C og overfør 800 μL fra overfasen til et nytt 2 ml rør, og unngå forsiktig overføring av underfaseinnholdet.
  7. Tilsett 400 μL fenol og 400 μL kloroform til rørene og bland innholdet ved inversjon. Sentrifuger dem ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    FORSIKTIG: Kloroform er et svært giftig og flyktig reagens; Det kan forårsake irritasjon og skader når det kommer i kontakt med huden, og ved innånding påvirker det sentralnervesystemet og kardiorespiratoriske systemer, lever og nyrer. Manipuler kloroform utelukkende inne i en avtrekkshette og bruk hansker.
  8. Gjenvinn 800 μL eller mindre fra overfasen til et nytt 2 ml rør. Tilsett 800 μL kloroform, bland innholdet ved inversjon, og sentrifuge ved 10 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    MERK: I dette trinnet må ingen rester fra underfasen overføres til nye rør. Vær derfor ekstra forsiktig når du gjenoppretter den overlegne fasen.
  9. Overfør 600-800 μL fra overordnet fase til et nytt 1,5 ml rør og tilsett 450 μL isopropanol. Bland innholdet ved inversjon og inkuber ved 25 °C i 5 minutter.
  10. Sentrifuger rørene ved 10 000 x g i 5 minutter ved 4 °C og kast supernatanten med en mikropipette. Vær forsiktig så du ikke kaster pelleten som er avsatt i bunnen av røret.
  11. Tilsett 500 μL 80% etanol og sentrifuge i 5 minutter. Gjenta to ganger i tilfelle pelleten ikke er avklart.
  12. Fjern etanolen med en mikropipette og tørk pelleten ved 37 °C i 30-60 minutter. Tilsett 30-50 μL avionisert vann, eluer pelleten ved hjelp av en mikropipette.
  13. Hold tubene ved 4 °C over natten for fullstendig DNA-eluering og frys innholdet ved -20 °C.

7. Total DNA-ekstraksjon fra planteorganer for metabarkodingsmetodikk (kommersielt sett)

MERK: For følgende metodikk er det nødvendig å kjøpe det kommersielle settet som er angitt i materialfortegnelsen som et jord-DNA-ekstraksjonssett. Hvert materiale, oppløsning og reagens som brukes i denne delen må være sterilt. De som ikke kan kjøpes allerede sterilisert, bør autoklaveres ved 121 °C i 20 minutter. Det anbefales på det sterkeste å bruke hansker under hele protokollen, og trinnene kan utføres inne i en laminær hette. Den beskrevne protokollen er modifisert fra De Souza et al.12, fra protokollen beskrevet av produsenten.

  1. Bruk porselenspestler og mørtel, slip røttene samlet etter trinn 1.2 i flytende nitrogen, og reduser prøvene til et fint pulver. Tilsett 0,3 g fra jordprøvene til PowerBead-rørene og beveg forsiktig for å homogenisere.
  2. Tilsett 60 μL løsning C1 (inkludert i settet) til PowerBead-rørene og bland innholdet ved inversjon. Bruk en vevshomogenisator og cellelyser (materialfortegnelse), bind rørene fast til tilstrekkelig støtte, koble støtten til virvelen og start utstyret med maksimal hastighet i 10-20 minutter.
    MERK: Hvis C1-oppløsningen felles ut, varm den opp ved 60 °C til den er fullstendig oppløst.
  3. Sentrifuger rørene ved 10 000 x g i 30 s ved 25 °C. Overfør 500 mikrosentrifugerør av supernatanten til 2 ml mikrosentrifugerør. Det overførte innholdet kan være partikler.
  4. Tilsett 250 μL løsning C2 til rørene og rør i en virvel i 5 s. Inkuber ved 4 °C i 5 minutter og sentrifuge deretter ved 10 000 x g i 1-2 minutter ved 25 °C.
  5. Overfør mer enn 600 μl av supernatanten til nye 2 ml rør, unngå pelleten. Tilsett 200 μL løsning C3 og rør på en virvel i 5 s.
  6. Inkuber ved 4 °C i 5 minutter og sentrifuge deretter ved 10 000 x g i 1 minutt ved 25 °C. I dette stadiet må du forsikre deg om at supernatanten ikke er partikkelformet.
  7. Overfør mer enn 750 μl av supernatanten til nye 2 ml rør, unngå pelleten. Homogeniser løsningen C4 godt, tilsett 1,100 μL løsning C4 til supernatanten, og agiter i en hvirvel i 5 s.
  8. Legg 675 μL fra innholdet i rørene i MB Spinn-kolonnene, over filteret, og sentrifuge ved 10 000 x g i 1 minutt ved 25 °C. Kast væskeinnholdet.
  9. Gjenta forrige trinn to ganger til alt innholdet i hvert rør er behandlet. Deretter tilsettes 500 μL løsning C5 i midten av filteret som er tilstede ved rørets øvre kolonne og sentrifuge ved 10 000 x g i 30 s ved 25 °C.
  10. Kast væskeinnholdet og sentrifugen igjen under de samme forholdene som forrige trinn. Overfør forsiktig den øvre kolonnen i MB Spinnkolonne til nye 2 ml mikrosentrifugerør, slik at det ikke drypper væskeinnhold i kolonnen.
  11. Tilsett 85-100 μL løsning C6 i midten av filteret og vent 1 min. Sentrifuge ved 10 000 x g i 30 s ved 25 °C og kast MB Spinnkolonne. Oppbevar tubene ved -80 °C.

8. DNA-kvantifisering i et spektrofotometer (se materialfortegnelsen)

  1. Åpne programvaren ved hjelp av det angitte spektrofotometeret. Velg alternativet Nukleinsyre, velg alternativet DNA, og sett konsentrasjonen til ng / μL.
  2. Tilsett 1 μL avionisert vann til spektrofotometerdetektoren og kalibrer ved å velge alternativet Blank. Etter å ha lest, tørk detektoren forsiktig med mykt silkepapir.
  3. Navngi feltprøven med isolatkoden til prøven som skal leses, og plasser 1 μL av den i utstyrsdetektoren. Velg alternativet Mål; En graf og en tabell med resultatene genereres.
  4. Gjenta trinn 8.3 til alle prøvene er lest. Det anbefales å lagre tabellen med de genererte resultatene for registrering og analyse: velg alternativet Rapporter og stedet der .xml filen skal lagres.
  5. Tilsett 5 μL avionisert vann til detektoren, vent flere minutter, og tørk det forsiktig med mykt silkepapir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I isolasjonsprotokollen, med tanke på at det er forurensning fra vannet som ble brukt ved siste vask og forurensningen også påvises i petriskålene med inokulerte fragmenter, kan forskjellige tiltak iverksettes, avhengig av type forurensning (tabell 1). Denne prosedyren må gjentas fra begynnelsen i tilfelle svært sporulerende soppforurensninger, som også presenterer akselerert vekst og intenst multipliserende bakterier, resistente mot de valgte antibiotika. I stedet, hvis soppforurensningen presenterer langsom vekst eller ikke sporulerer, er det mulig å bare unngå å isolere det i de påfølgende trinnene i protokollen. Endelig kan forurensninger med bakteriestammer som multipliserer sakte, også lett unngås i de bakre trinnene, spesielt i rensing, når man gjenoppretter hyfer.

I alle tilfellene som tidligere er presentert, er det ideelle scenariet å gjenta desinfiseringsprosedyren ved hjelp av andre prøver og installere plantefragmentene i et kulturmedium som kombinerer andre antibiotika, med et bredere spekter av virkning, i tilfeller av resistente bakterier som forurenser de første rettene. Imidlertid, med tanke på vanskelighetene med å samle inn nye prøver og skaffe organer fra mykoheterotrofe planter, kan noen tilfeller løses med hell i de bakre stadiene av protokollen, som presentert i tabell 1.

Miljøgifter Karakteristisk for forurensning Mulig konsekvens av forurensning Nødvendig handling
Bakterier Intens multiplikasjon Total eller delvis inhibering av veksten av endofytter av interesse Start isolasjonen på nytt fra begynnelsen
Langsom multiplikasjon Isolering av bakteriene sammen med endofyten av interesse Unngå bakteriekolonier under rensing
Sopp Kraftig vekst og/eller svært sporulerende Gjør det umulig å isolere og/eller rense endofytter av interesse Start isolasjonen på nytt fra begynnelsen
Langsom vekst og/eller ikke-sporulerende Isolering av forurensningen ved en feil Unngå isolering av forurensningen

Tabell 1: Beskrivelse av mulige forurensninger i prosessen med endofytisk soppisolering, forurensningskonsekvenser og avbøtende prosedyrer.

Etter 5 dager fra installasjonen av organfragmenter i PDA-mediet, er det mulig å visualisere veksten av små grupper av filamentøse soppmycelier, som kommer fra det indre av fragmentene (figur 3). Hver mycelial morfotype skal resultere i et soppisolat ved slutten av isolasjonsprotokollen, med tanke på at hver enkelt av dem må stripes i en ny petriskål med AA-medium for rensing. Det anbefales at de originale rettene fra fragmentinstallasjonen ikke kasseres før hele isolasjonsprotokollen er fullført. De kan oppbevares i kjøleskap ved 4 °C inntil de rensede koloniene er oppnådd. Når det gjelder denne delen av protokollen, kan IF-analysen også være til stor hjelp for å evaluere prosentandelen vevsprøver som resulterer i isolerte sopp blant de totale installerte prøvene.

Figure 3
Figur 3: Rotfragmenter for soppisolering i potetdruesukkeragar. Dyrkbare endofytiske sopp som vokser fra rotfragmentene av en mykoheterotrofisk orkidé etter ca. 5 dagers inkubasjon. Hver petriskål (A, B og C) inneholder fem rotfragmenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Etter 3 dager etter inkubasjon av AA-fatene for isolert rensing, bør små hyphalkolonier, nesten umerkelig, ha vokst fra striae i AA-mediet. På dette stadiet, i tilfelle det var forurensning fra langsomt voksende bakterier i isolasjonsskålene, er det mulig at disse bakteriene også ble overført til AA-fatene med de valgte soppendofytthyfer. I så fall vil bakterier være begrenset til striaregioner, med liten vekst sammenlignet med soppen, slik at restitusjon av utelukkende soppen er av interesse for nye PDA-retter.

I løpet av 7-14 dager med inokulering av de rensede soppisolatene i PDA-retter, må den rene kolonien vokse sentrifugal (fra midten av parabolen til periferien), og danne et eneste sirkulært mycelium (figur 4). Mulige forurensninger er lett å identifisere i dette stadiet, da de i betydelig grad kompromitterer koloniens homogenitet med hensyn til vekst, form, aspekt, farge, pigmentproduksjon i mediet osv. (figur 5). Forutsatt at de endelige koloniene som er oppnådd ikke er rene, må soppene som opprinnelig ble dyrket fra organfragmentene, underkastes igjen til renseprosedyrer, ved strikking og subkulturering (trinn 2.4). Det er mulig å gjenopprette isolatene fra enten de opprinnelig installerte organene eller de endelige isolasjonsfatene som inneholder heterogene kulturer.

Figure 4
Figur 4: Representasjon av rensede soppisolater, dyrket i 7-14 dager i et PDA-dyrkningsmedium. I første og tredje kolonne (A, C, E, G, I og K) ses de registrerte koloniene fra oversiden; Den andre og fjerde kolonnen (B, D, F, H, J og L) presenterer de samme koloniene, henholdsvis sett fra undersiden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representasjon av urene soppisolater, dyrket i 7-14 dager i PDA-dyrkningsmedium. I den første kolonnen (A, D og G) ses et generelt syn på koloniene fra oversiden; den andre kolonnen (B, E og F) viser koloniene i detalj; den tredje kolonnen (C, F og I) viser koloniene fra undersiden. Tallene representerer forskjellige soppmorfotyper som er tilstede i hver tallerken, og linjene representerer en subtil avgrensning mellom de forskjellige soppisolatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Konservering av isolater bør ikke gjøres ved hjelp av en eneste lagringsmetode, da hver sopp kan presentere mer eller mindre følsomhet for hver metode som er beskrevet. Det anbefales sterkt å velge minst to typer lagring for hvert soppisolat, noe som garanterer flere sjanser for suksess med å bevare det. Vi fremhever at unviability av sopp bevart i Castellani eller mineralolje forventes etter 6 måneder eller mindre. Forskere bør vurdere om disse er de eneste konserveringsmetodene som er valgt, for å unngå mulige uventede tap av isolater. For å forlenge denne begrensede perioden er det mulig å reaktivere soppisolatene ved å dyrke dem i PDA-mediet (39 g / L) i 2-3 uker og deretter lagre dem igjen. Etter en periode med lagring forventes det at isolatene presenterer en langsommere vekst, sammenlignet med den observerte vekstraten før bevaring, og kolonier med mindre kraftige aspekter (dvs. mindre tette, forskjellige i farge). Subkulturering noen ganger i et næringsrikt kulturmedium er nok til å gjenopprette slike egenskaper.

Ved evaluering av makromorfologien til koloniene oppnådd i isolasjonsprosedyren, bør kvalitative data samles inn, med tanke på så mange egenskaper som mulig: (a) farge på kolonien (topp og underside), som kan analyseres ved hjelp av trykte fargeguider (f.eks. Rayner28, Kornerup & Wanscher29, Ridgway30); (b) koloniens opasitet: gjennomsiktig, ugjennomsiktig, gjennomsiktig; (c) diffusible pigmenter i mediet31 (tilstedeværelse / fravær og farge); (d) ekssudater31 (tilstedeværelse/fravær, farge, generelt utseende); (e) makroskopiske strukturer31 (tilstedeværelse/fravær, type og utseende; f.eks. skleroti, pycnidia); (f) luftig og nedsenket mycelia 19,32,21 (tilstedeværelse/fravær, utseende-lite eller rikelig); (g) marginutseende19 (farge, form, ensartethet - nedsenket eller antenne); og (h) kolonitopografi (toppet, rynket, krateriform, flat, etc.), det generelle utseendet og tekstur - bomull, fløyelsaktig, pulveraktig, ullaktig, talgaktig (voksaktig), glabrous, krittaktig, slimete, læraktig, stikkende, etc.19,21.

Figure 6
Figur 6: Makro- og mikromorfologi av uidentifisert sopp isolert fra mykoheterotrofisk orkidé Wullschlaegelia aphylla. (A) Øvre og (B) nedre aspekter av kolonien, (C) forsterket syn på lufthyfene (som sett i et stereomikroskop). Mikromorfologi av hyfer (D) uten flekk og farget med (E) LPCB og (F) TBO. Forkortelser: c = konidiofor, p = phialide, s = septum. Skala barer: A,B = 2 cm; C = 2 mm; D-F = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I figur 6 er en koloni isolert fra fusiforme røtter av mykoheterotrofisk orkidé Wullschlaegelia aphylla, ved bruk av den beskrevne metodikken, vist. Kolonien er hvitaktig til grå på oversiden (figur 6A) og brunlig på undersiden (figur 6B). Det er ugjennomsiktig, med verken diffusible pigmenter i mediet eller ekssudater. Myceliene er luftige og rikelige, marginene er uregelmessige og antenne, og kolonien har en fløyelsaktig tekstur og en rynket topografi (figur 6A). Makroskopiske strukturer er fraværende.

Lysbildekulturmetoden er tradisjonell og fordelaktig, og selv om den er tidkrevende, kan den brukes til å produsere permanente lysbilder som kan undersøkes etterpå. De forskjellige fargestoffene som presenteres her, kan brukes til å fremkalle viktige strukturer, og de krever tester i prøvene for å bestemme den mest adekvate inkubasjonstiden. Kongorød og TBO er generelle flekker. Kongorødt er tilstrekkelig til å demonstrere noen delikate strukturer (videre lesning: Malloch22). TBO flekker celleinnholdet mer intenst enn soppcelleveggen (figur 6F). Selv om det er et vanlig fargestoff for plantestrukturer og ikke så vanlig i soppmikroskopi, har TBO en viktig metakromatisk egenskap33, som favoriserer andre applikasjoner, for eksempel soppanalyse i plantevev10. LPCB er et kraftig påført fargestoff i soppanalyse, selv om det krever forsiktighet på grunn av fenol. Bomullsblå (synonym: metylblå) er flekken, melkesyre er et ryddemiddel, og fenol er et drapsmiddel21. LPCB har en affinitet for kitin og viser sporevegger og ornamenter23,24. Svampeseptaen er verken farget av LPCB (figur 6E) eller TBO (figur 6F), noe som letter identifiseringen av slike strukturer. Påføring av flekker er fordelaktig for å vise strukturer som ikke er lett å se når hyfer ikke er farget (figur 6D).

For DNA-ekstraksjon fra sopp- og rotprøver, må mengden jordprøve i flytende nitrogen som skal tilsettes ekstraksjonsbufferen respekteres, og ikke overstige den angitte mengden i protokollen. Vi bør fremheve at en stor mengde behandlet prøve ikke bare representerer obtention av en høy konsentrasjon av DNA uten store ulemper, da det kan kompromittere den endelige DNA-kvaliteten betydelig. Dette skjer når man metter følgende stadier av DNA-rensing. Dessuten kan konsentrering av antatte forbindelser produsert av planter eller sopp (f.eks. pigmenter, sekundære metabolitter), som er tilstede i den endelige løsningen med DNA, virke for å redusere DNA-kvaliteten og / eller hemme polymerasekjedereaksjon (PCR). Et annet problem som kan redusere DNA-kvaliteten betydelig, er å skrape kulturmediet helt med soppmycel og slipe det, noe som må unngås sterkt. Noen reagenser fra ekstraksjonsprosedyren (f.eks. fenol, etylalkohol, SDS) og andre stoffer (f.eks. sopppigmenter) kan være hemmere som forstyrrer PCR.

I DNA-rensingsstadiene, ved bruk av fenol og kloroform, må supernatanten alltid representere fasen med færre urenheter, og normalt forstå den klareste fasen. Under et slikt stadium må den nedre fasen ikke gjenopprettes når man aspirerer supernatanten som skal overføres til nye rør. Ved slutten av protokollen skal pelleten (utgjort av DNA) presentere en gjennomsiktig (svært ønskelig) til hvitaktig farge. I tørketrinnet er det grunnleggende å tørke DNA i en termoblokk for fullstendig fordampning av etanol. Etter 12 timer ved 4 °C skal pelleten ha eluert helt i den vandige oppløsningen som er tilsatt rørene, og ikke vært synlig etter det. Hvis elusjonen ikke er fullført, og DNA-konsentrasjonen er langt under den ideelle konsentrasjonen, er det mulig å holde løsningen nedkjølt i 12 timer mer, uten betydelige tap i kvaliteten.

DNA-analysene i programvaren genererer en tabell, som representert i tabell 2, der data relatert til DNA-mengde og -kvalitet er indikert. DNA-kvantifiseringen er gitt ved konsentrasjonen av nukleinsyrer i nanogram per mikroliter av en prøve. Med tanke på molekylær identifikasjon av isolerte sopp, bør DNA-prøver ha ca. 200 ng / μL i konsentrasjon, ideell for PCR-stadier. I tilfeller av prøver med høyere konsentrasjoner av nukleinsyrer, bør en alikot fra prøven fortynnes, tilnærmet konsentrasjonen til den tidligere nevnte verdien. Prøver med for høye konsentrasjoner, som prøve 1 og 2 i tabell 2, kan tyde på falsk påvisning på grunn av forurensninger i løsningen. I mellomtiden kan prøver med lavere nukleinsyrekonsentrasjoner, som nummer 7 (tabell 2), fortsatt brukes til PCR, og er viktig for å påføre et høyere prøvevolum i reaksjonene. Når det gjelder kvalitetsparametrene, er det tilfredsstillende at kvotientene 260/280 og 260/230 er mellom 1,8 og 2,2, som angitt i prøve 3, 5 og 8 (tabell 2). Prøver som presenterer slike verdier (langt under eller over) bør sendes til nye DNA-ekstraksjoner, som angitt i prøve 9 og 10 fra tabell 2. I tilfeller av prøver med en tilstrekkelig mengde DNA og minimalt overskrider det ideelle kvalitetsområdet, som foreslått av 260/280- og 260/230-verdiene i nummer 4 og 6 (tabell 2), er fortynning den mest fordelaktige prosedyren for å gjøre nukleinsyrekonsentrasjonen tilstrekkelig for PCR og fortynne mulige hemmere, slik som vestigiale reagenser fra ekstraksjonsprosedyren, i prøvene.

Eksempel Nukleinsyre Conc. Enhet A260 A280 260/280 260/230 Eksempel Type
1 14491.7 ng/μL 289.833 141.175 2.05 1.8 DNA
2 13359.3 ng/μL 267.187 124.607 2.14 2.15 DNA
3 1137.6 ng/μL 22.751 10.574 2.15 2.13 DNA
4 1472.6 ng/μL 29.452 13.287 2.22 2.16 DNA
5 3464.8 ng/μL 69.295 33.329 2.08 1.88 DNA
6 1884.2 ng/μL 37.684 17.912 2.1 1.78 DNA
7 187.6 ng/μL 3.751 1.834 2.05 2.06 DNA
8 1580.3 ng/μL 31.607 15.281 2.07 1.98 DNA
9 923.3 ng/μL 18.466 9.196 2.01 1.37 DNA
10 2414.4 ng/μL 48.287 21.008 2.3 3.45 DNA

Tabell 2: Genererte resultater i programvaren fra sopp-DNA-prøver analysert i et spektrofotometer.

Forskjellig fra DNA-prøver fra isolerte endofytiske sopp, bør DNA-konsentrasjonen i prøver for metabarkodingsanalyser presentere massive mengder ekstraherte DNA-molekyler, med høy kvalitet og molekylvekt. Prøvene skal evalueres ved elektroforese i agarosegel, og oppnå maksimal integritet mulig, med liten eller ingen smøring i gelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den overfladiske desinfiseringen av planteprøver er et av de mest kritiske stadiene i den presenterte protokollen. Ingen forurensning i PDA-oppvasken med dråper fra siste vask er svært ønskelig. Bakterier observeres ofte som forurensninger i isolasjonsskålene, vanligvis mer enn luftbårne sporulerende sopp, med tanke på at endofytiske bakterier også er vanlige i plantevev 3,11. Dermed er tilsetning av antibiotika i kulturmediet ved installasjon av organfragmentene avgjørende. Bedre resultater oppnås når man kombinerer forskjellige antibiotikatyper, noe som resulterer i et bredere spekter av virkning. En annen viktig faktor er den iboende skjevheten i å isolere soppene, da bruk av PDA og AA uunngåelig vil velge visse arter og disfavorisere andre. Kombinasjonen av andre kulturmedier kan minimere skjevheten, men ikke fjerne slike begrensninger9.

Generelt presenterer sopp som produserer sporer mens de vokser i petriskåler høyere overlevelsesrater i konserveringsprotokoller, enten i lavere temperaturer eller ikke, og ikke-sporulerende isolater toler kanskje ikke Castellanis eller mineraloljekonservering34,35,36, så en kryopreserveringsmetode kan være avgjørende i slike tilfeller. I tillegg kan noen isolater være følsomme for frysing, og tilsetning av kryobeskyttelsesmidler hjelper bevaringen, som i den presenterte metoden ved bruk av vermikulitt18. Koloni- og hyphalegenskapene kan være nyttige for å gruppere isolatene med lignende egenskaper, noe som letter seleksjonen for bruk i symbiotiske spiringsbehandlinger (som beskrevet av Pena-Passos et al.10). Disse egenskapene bidrar også til å velge bevaringsmetodene som skal brukes, spesielt med tanke på sporulering eller fravær.

Morfologisk karakterisering av isolatene forbedrer og utfyller også morfologiske beskrivelser tilgjengelig i spesialisert litteratur, spesielt når de er forbundet med molekylær karakterisering. Til tross for at det er en utfordring med mange isolater, er morfologisk karakterisering av sopp tidkrevende og avhenger av publiserte data. Selv om bare molekylær karakterisering er planlagt å bli utført, anbefales det å opprettholde et fotografisk register over koloniens utseende (makromorfologi) og publisere det når det er mulig, for å bidra til fremtidige identifikasjonsprosedyrer. Det er også viktig å opprettholde bilder av oppvasken der fragmenter er installert, for å tillate sammenligning mellom de endelig oppnådde isolatene og morfotypene som observeres voksende i installasjonsskåler. I et slikt tilfelle må de sammenlignede soppene dyrkes i samme type medium. Ytterligere metoder finnes i Currah et al.16 for å evaluere vanlige orkidé mycorrhizal sopp, for eksempel kultur på garvesyremedium (TAM) for å skille Epulorhiza (teleomorph: Tulasnella) og Ceratorhiza (teleomorph: Ceratobasidium) slekter, og kultur på CMA for å stimulere monilioide celler for karakterisering av sopp fra Rhizoctonia-komplekset.

Tatt i betraktning de detaljerte metodene for å observere sopphyfer under et lysmikroskop, er teasemontering og tapemontering raskere enn lysbildekultur, selv om teasemonteringsmetoden ikke er tilstrekkelig for å analysere sporer og måle grenvinkler. Selvklebende tapefeste bevarer myceliets organisasjon bedre enn teasemonteringsteknikken, selv om bruk av tape ikke er like pålitelig som lysbildekultur for måling av grenvinkler (forfatternes observasjon). Lysbildekultur, til tross for at den er tidkrevende, er den mest tilstrekkelige teknikken for å produsere semi-permanente og permanente lysbilder. Makro- og mikromorfologi analyseres med tanke på litteraturen. Webster og Weber32 er en omfattende generell kilde til informasjon og tilleggsreferanser. Currah et al.16 og Zettler og Corey37 gir nyttig informasjon om orkidé mycorrhizal sopp. Selv om de beskriver sopp av medisinsk betydning, er Walsh et al.21 og McGinnis31 også nyttige på generelle egenskaper av filamentøse soppkolonier, visuell / beskrivende informasjon og ytterligere referanser for soppmikromorfologi.

Ifølge Yu et al.38 presenterer DNA-kvantifiseringsanalysene i et spektrofotometer stor presisjon og nøyaktighet, og er konsistente med kvantitative sanntids PCR-analyser. En viktig observasjon er at noen isolater kanskje ikke gir DNA-prøver tilstrekkelig rene for de påfølgende molekylære identifikasjonsstadiene, da mykoheterotrofers soppendofytter er ekstremt varierte, spesielt de som er forbundet med tropiske planter39, som er de produserte metabolittene. Spektrofotometeranalyser kan brukes til å evaluere slike tilfeller og forskjellige protokoller, eller kommersielle sett som brukes til DNA-rensing av prøvene. De foreslåtte påfølgende stadiene i molekylær identifikasjon av isolater er forsterkningen av det interne transkriberte avstandsstykket (ITS) -regionen og sekvensering. ITS-regionen er et ribosomalt RNA-avstands-DNA som er mye brukt i den spesialiserte litteraturen og formelt akseptert som hovedstrekkode for soppidentifikasjon 9,40. Det kan forsterkes ved PCR med primerne ITS1 og ITS441, deretter sekvensert i Sanger-plattformen42.

Metastrekkodingsanalyser, i tillegg til å tillate undersøkelse av mikroorganismers rikdom, overflod og taksonomiske sammensetning i miljø- og planteprøver, kan gi resultater av positive eller negative interaksjoner mellom disse mikroorganismene12. Maserasjonstrinnet ved bruk av flytende nitrogen tilsatt DNeasy PowerSoil standardprotokoll tar sikte på å bryte så mange soppceller som mulig i forhold til plantevev, noe som muliggjør bedre prøvetaking av soppsamfunnet i det masererte vevet11. Primervalg for soppsekvenser (strekkoder) i molekylær identifikasjon må vurdere interferens med plante-DNA. Vi anbefaler bruk av primere som forsterker variable regioner av sopp-18S-genet, for eksempel ITS1-5,8S-ITS243. Etter å ha oppnådd DNA-prøver, forbereder de påfølgende trinnene de metagenomiske bibliotekene, som avhenger av den valgte sekvenseringsplattformen, bakre sekvensering av bibliotekene og analyse av de oppnådde dataene ved hjelp av bioinformatiske verktøy. Vi anbefaler å bruke plattformen Illumina MiSeq, som representerer et rimeligere alternativ med høy effekt, og genererer 250 bp-sekvenser i korte tidsperioder 11,44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre og ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker finansiering fra FAPESP (2015/26479-6) og CNPq (447453/2014-9). JLSM takker CNPq for produktivitetstilskudd (303664/2020-7). MPP takker Capes (mastergradsstipend, prosess 88887.600591/2021-00) og CNPq.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive tape (from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses)
Ampicillin Sigma-Aldrich A5354 (for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1)
Autoclave (from any company, for materials sterilization in many steps)
Bacteriological agar Sigma-Aldrich A1296 (for many steps)
C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions Qiagen 12888-50 (purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Centrifuge   Merck/Eppendorf 5810 G (for total DNA extraction from fungal isolates)
Centrifuge tubes Merck CLS430828 (for samples collection)
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Congo red Supelco 75768 (for hyphae staining)
Cryotubes Merck BR114831 (for many steps)
Ethanol Supelco 100983 It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 3609 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Filter paper Merck WHA10010155 (for many steps)
Glass test tubes Merck CLS7082516 (for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glass wool Supelco 20411 (for cryopreservation in unhulled rice grains)
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite)
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB)
Isopropanol Sigma-Aldrich 563935 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Lactic acid Sigma-Aldrich 252476 (for preparing LPCB - hyphae staining)
Lactophenol blue solution (LPCB) Sigma-Aldrich 61335 (for hyphae staining)
Laminar flow hood (class I, from any company, for many steps)
Light microscope (from any company, for hyphae observation)
MB Spin Columns Qiagen 12888-50 (purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Methyl blue (cotton blue) Sigma-Aldrich M5528 (for preparing LPCB - hyphae staining)
Microcentrifuge tube (1.5 mL) Merck HS4323 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Microcentrifuge tube (2 mL) Merck BR780546 (for many steps)
Mineral oil (for preservation of fungal isolates)
Paper bags Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection)
Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm) Merck/Pyrex SLW1480/10D (autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones)
Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm) Merck/Aldrich Z740618 (for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm) Merck/Brand BR455732 (for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable)
Phenol Sigma-Aldrich P1037 (for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB)
Porcelain mortar Sigma-Aldrich Z247464 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Porcelain pestle Sigma-Aldrich Z247502 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Potato dextrose agar (PDA) Millipore P2182 (for many steps)
PowerBead tubes Qiagen 12888-50 (purchased with DNeasy PowerSoil kit)
Rapid mounting medium (Entellan) Sigma-Aldrich 1.0796 (for fungi slide culture)
Silica gel Supelco 717185 (for cryopreservation in unhulled rice grains)
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771 Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates)
Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine) (commercial product, for superficial desinfestation)
Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit) Qiagen 12888-50 (for total DNA extraction from plant organs)
Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP (for total DNA extraction from plant organs)
Stereomicroscope (=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses)
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660 (for installation of plant fragments)
Thermoblock Merck/Eppendorf EP5362000035 (or from other companies)
Tissue homogenizer and cell lyzer SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)
Toluidine blue O Sigma-Aldrich/Harleco 364-M (for hyphae staining)
Trehalose Sigma-Aldrich T9531 (for cryopreservation in vermiculite)
Tris Base Solution (Tris) Sigma-Aldrich T1699 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Unhulled rice grains (for cryopreservation)
U-shaped glass rod (or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture)
Vermiculite Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite)
Vortexer Sigma-Aldrich/BenchMixer BMSBV1000 (for total DNA extraction from fungal isolates)
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625 (for cryopreservation in vermiculite)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. de Azevedo, J. L. Endophytic microorganisms. Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).
  2. Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
  3. Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes. Microbial Root Endophytes. , Springer-Verlag. Berlin. 1-13 (2006).
  4. Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. , Elsevier Science Academic Press. London. (2008).
  5. Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
  6. Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
  7. Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids. Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).
  8. Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship. Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).
  9. Sun, X., Guo, L. -D. Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques. Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).
  10. Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds. Journal of Visualized Experiments. (183), e63777 (2022).
  11. Araújo, W. L., et al. Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed. 1, Santarém: UFOPA. 257 (2014).
  12. de Souza, R. S. C., et al. Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome. Scientific Reports. 6, 28774 (2016).
  13. Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).
  14. Araújo, W. L., et al. Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks. Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).
  15. Castellani, A. Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water. Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).
  16. Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A. Fungi from orchid mycorrhizas. Orchid Biology: Reviews and Perspectives, VII. , 117-170 (1997).
  17. Freitas, E. F. S., et al. Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species. Scientific Reports. 10 (1), 7069 (2020).
  18. Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes. Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).
  19. Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Araújo, E. F. D. Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil. Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).
  20. Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
  21. Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification. , ASM Press. (2018).
  22. Malloch, D. Moulds: Isolation, Cultivation, Identification. , Available from: http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Moulds.html (1997).
  23. Smith, P. Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society. , Available from: https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents (2022).
  24. Senanayake, I. C., et al. Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation. Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).
  25. Slifkin, M., Cumbie, R. Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
  26. Raeder, U., Broda, P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).
  27. Martins, M. K., et al. Molecular characterization of endophytic microorganisms. Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition. , Santarém: UFOPA. 189-211 (2014).
  28. Rayner, R. W. A Mycological Colour Chart. Commonwealth Mycological Institute. , (1970).
  29. Kornerup, A., Wanscher, J. H. Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour. , Methuen & Co. Ltd. London. (1967).
  30. Ridgway, R. Color Standards and Color Nomenclature. , Washington, DC. Published by the author (1912).
  31. McGinnis, M. R. Laboratory Handbook of Medical Mycology. , Elsevier Science. (2012).
  32. Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  33. Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).
  34. Smith, D., Onions, A. H. S. A comparison of some preservation techniques for fungi. Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).
  35. Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).
  36. Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).
  37. Zettler, L. W., Corey, L. L. Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).
  38. Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer. Optik. 145, 555-560 (2017).
  39. Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
  40. Schoch, C. L., et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).
  41. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  42. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  43. Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability. Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).
  44. Metzker, M. L. Sequencing technologies-the next generation. Nature Reviews Genetics. 11 (1), 31-46 (2010).

Tags

Isolasjon karakterisering total DNA-ekstraksjon endofytiske sopp mykoheterotrofe planter mykorrhizaavhengighet autotrofisk kapasitet assosierte sopp røtter underjordiske organer kulturavhengige teknikker kulturuavhengige teknikker morfologisk identifikasjon mangfoldsanalyse vedlikehold av inokula symbiotisk spiring av orkidéfrø ikke-dyrkbare sopp molekylære identifikasjonsteknikker artsmangfold og overflod
Isolering, karakterisering og total DNA-ekstraksjon for å identifisere endofytiske sopp i mykoheterotrofe planter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sisti, L. S., Pena-Passos, M.,… More

Sisti, L. S., Pena-Passos, M., Lishcka Sampaio Mayer, J. Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. J. Vis. Exp. (195), e65135, doi:10.3791/65135 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter