Summary
Ici, nous démontrons l’utilisation de l’impédance électrique cellulaire (CEI) comme méthode très simple et directe pour étudier l’infection par le virus Zika et sa réplication dans les cellules humaines en temps réel. En outre, le test CEI est utile pour l’évaluation des composés antiviraux.
Abstract
La technologie d’impédance électrique à base de cellules (CEI) mesure les changements d’impédance causés par une monocouche de cellules adhérentes en croissance ou manipulée sur des puits de plaques de culture intégrés à des électrodes. La technologie peut être utilisée pour surveiller les conséquences de l’infection par le virus Zika (ZIKV) et de la réplication des cellules adhérentes en temps réel, car ce virus est hautement cytopathogène. Il s’agit d’un test simple qui ne nécessite pas l’utilisation d’étiquettes ou de méthodes invasives et qui a l’avantage de fournir des données en temps réel. La cinétique de l’infection par le ZIKV dépend fortement de la lignée cellulaire utilisée, de la souche virale et de la multiplicité de l’infection (MOI), ce qui ne peut pas être facilement étudié avec les tests conventionnels. En outre, le test CEI peut également être utilisé pour l’évaluation et la caractérisation de composés antiviraux, qui peuvent également avoir des propriétés inhibitrices dynamiques au cours de l’infection. Cet article sur les méthodes donne une explication détaillée de l’exécution pratique du test CEI et de ses applications potentielles dans la recherche ZIKV et la recherche antivirale en général.
Introduction
Les flambées épidémiques du virus Zika (ZIKV) sont associées à de graves complications de la maladie, telles que la microcéphalie et le syndromede Guillain-Barré 1,2,3. Bien que les épidémies futures soient plausibles en raison de divers facteurs de risque tels que la propagation de la distribution de moustiques vecteurs et l’urbanisation croissante, à ce jour, aucun vaccin ou médicament antiviral n’a encore été mis sur le marché 3,4. Par conséquent, les méthodes traditionnelles de recherche sur le ZIKV devraient être complétées par de nouveaux outils pour étudier ce virus et ses composés antiviraux potentiels. La recherche antivirale est souvent basée sur des tests phénotypiques, où le critère d’évaluation est la présence d’un paramètre spécifique, tel que l’apparition d’un effet cytopathique induit par le virus (EPC) ou la production d’une protéine particulière induite par le virus au moyen d’un gène rapporteur 5,6,7. Cependant, ces méthodes ont des lectures de point de terminaison, nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et peuvent nécessiter une analyse complexe. Par conséquent, les méthodes basées sur l’impédance offrent une alternative attrayante.
L’impédance électrique cellulaire (IEC) est définie comme la résistance au flux de courant d’une électrode à une autre, causée par une couche cellulaire adhérente ensemencée sur des puits contenant des électrodes. La technologie CEI utilisée dans cette méthodologie est ECIS (Electric Cell-substrate Impedance Sensing), développée à l’origine par Giaever et Keese 8,9. Ceci est utilisé dans un large domaine de recherche biologique, tels que les métastases cancéreuses, la toxicologie et la cicatrisation des plaies10,11,12. Son principe repose sur un champ électrique qui est généré par un balayage continu des tensions de courant alternatif (AC) sur une gamme de fréquences13. Les cellules sont exposées à ces champs électriques non invasifs et, à des intervalles prédéterminés, les changements d’impédance causés par la croissance cellulaire ou les changements d’adhérence ou de morphologie cellulaires sont mesurés14. En outre, la viabilité cellulaire altérée entraîne également des changements d’impédance, ce qui fait de la technologie un outil utile pour surveiller l’infection par des virus cytopathogènes15,16,17. Comme les changements morphologiques de la couche cellulaire seront détectés à l’échelle nanométrique, la technologie offre un outil de détection très sensible. Le test CEI décrit dans cet article est une méthode simple, non invasive, en temps réel et sans marquage pour mesurer les changements d’impédance de la couche cellulaire au fil du temps.
Bien que l’ICE n’ait pas été utilisée pour évaluer l’évolution de l’infection par le ZIKV ou ses antiviraux potentiels, son utilisation comme outil de diagnostic a été étudiée avant18 ans. Dans une étude récente, l’utilisation du test CEI pour déterminer l’activité antivirale de plusieurs inhibiteurs du ZIKV dans les cellules A549 a été validée pour la première fois19. Cet article sur les méthodes décrit ce test CEI plus en détail et l’étend à diverses lignées cellulaires adhérentes, ainsi qu’à une variété de souches ZIKV à différentes multiplicités d’infection (MOI). Ainsi, l’utilisation polyvalente de cette méthode dans la recherche antivirale sur les flavivirus est démontrée. La méthode présente l’avantage crucial de la surveillance cellulaire en temps réel, qui permet la détection de points temporels d’infection importants et l’activité inhibitrice dynamique par des composés antiviraux potentiels. Ensemble, la technologie CEI offre un outil puissant et précieux pour compléter la gamme actuelle de méthodologies antivirales.
Protocol
Toutes les étapes décrites sont effectuées dans des conditions stériles dans une armoire à flux laminaire d’un laboratoire de niveau de biosécurité 2. Tous les virus utilisés ont été obtenus et utilisés conformément aux règles d’une commission d’examen institutionnelle belge (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protocole CFF 219 2011/0011) et de la Commission de biosécurité de la KU Leuven.
1. Entretien de la culture cellulaire
REMARQUE: Ce protocole est réalisé avec une sélection de lignées cellulaires, mais peut bien sûr être adapté à toute lignée cellulaire adhérente, ne nécessitant qu’une optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire.
- Cultiver la lignée cellulaire de l’adénocarcinome pulmonaire humain A549, la lignée cellulaire de glioblastome malin humain U87 et les cellules de fibroblastes pulmonaires embryonnaires humains HEL 299 dans des flacons de culture T75 à 37 °C et 5% de CO2 dans un incubateur humidifié.
- Sous-culture des cellules à 80%-95% de confluence. Tous les réactifs doivent être à température ambiante (RT) avant la culture des cellules.
- Retirer le milieu de culture conditionné des cellules. Utilisez 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco pour laver la monocouche cellulaire une fois.
- Répartir 1 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % uniformément sur la monocouche cellulaire. Ensuite, incuber jusqu’à 3 minutes à 37 °C jusqu’à ce que les cellules commencent à se détacher.
- Ajouter 9 mL de milieu de croissance complet frais (voir le tableau des matières pour plus de détails). Pipeter doucement de haut en bas pour remettre les cellules en suspension.
- Transférer le volume désiré de suspension cellulaire dans une nouvelle fiole de culture T75 et ajouter un volume approprié de milieu de croissance frais pour obtenir un volume total de 15 mL.
NOTE: Les lignées cellulaires in vitro utilisées dans ce protocole sont sous-cultivées en dilutions de 1:4 à 1:10, selon la lignée cellulaire spécifique, pour permettre des conditions de croissance idéales. Les sous-cultures sont effectuées tous les 3-4 jours, de sorte que le volume de suspension cellulaire souhaité peut également varier en fonction du nombre de jours d’incubation.
2. Préparation de la plaque CEI
- Prenez une plaque de 96 puits avec des électrodes interdigitées (voir le tableau des matériaux) et remplissez tous les puits avec 100 μL de milieu de culture de croissance.
- Remplissez les espaces entre les puits avec DPBS.
REMARQUE: Ceci est fait pour réduire l’effet de bord dû à l’évaporation observée lors de la culture de cellules dans des plaques de 96 puits. - Incuber la plaque pendant 4 h à 37 °C dans un incubateur contenant 5% de CO2.
3. Ensemencement des cellules
- Détacher les cellules du ballon de culture, tel que décrit à la rubrique 1, et les remettre en suspension dans un milieu de croissance frais dans un tube de 50 mL.
- Comptez le nombre de cellules viables en utilisant la méthode de votre choix.
REMARQUE: Dans le cas des cellules A549, la viabilité atteint généralement ~100%. Pour déterminer le nombre de cellules, nous utilisons un système automatisé d’analyse cellulaire basé sur la coloration à l’orange d’acridine et à l’iodure de propidium (voir le tableau des matériaux). D’autres méthodes de comptage de cellules fonctionnent tout aussi bien. - Remettez les cellules en suspension dans un milieu de croissance frais pour obtenir la densité cellulaire désirée. Dans cette étude, la densité cellulaire optimale de l’A549 est de 0,15 × 106 cellules (viables)/mL.
- Sortez la plaque à 96 puits avec des électrodes interdigitées de l’incubateur et retirez le milieu avec une pipette multicanal.
- Distribuer 100 μL de la suspension cellulaire (correspondant à 15 × 103 cellules dans ce cas) par puits dans la plaque de 96 puits.
- Laissez les cellules s’équilibrer pendant 15 minutes à température ambiante avant de les placer dans le dispositif CEI.
4. Mise en place et exécution du test CEI
- Placez l’incubateur qui abrite le porte-plaque CEI à 37 °C et 5% de CO2.
- Placez la plaque de 96 puits dans l’appareil.
- Ouvrez le logiciel de l’appareil et configurez une nouvelle expérience en cliquant sur Configuration dans le volet Collecter les données. Attendez que l’ordinateur portable se connecte à l’appareil ECIS et configurez la plaque en vérifiant les impédances des puits. Vérifiez si tous les puits sont correctement configurés, comme indiqué par une couleur verte. Si ce n’est pas le cas, répétez l’étape 4.2 jusqu’à ce que tous les puits soient verts.
- Dans le volet Configuration du puits, sélectionnez le type de tableau, en fonction de l’article de culture utilisé.
- Sélectionnez le mode Fréquence/Temps multiples.
REMARQUE: Dans ce mode, l’appareil mesure les changements d’impédance à une gamme de fréquences. - Démarrez la mesure en cliquant sur Démarrer.
REMARQUE: L’impédance en temps réel peut être surveillée sur l’interface du logiciel. Sélectionnez la fréquence souhaitée à afficher. Dans cet exemple, 16 kHz est choisi.
5. Préparation et incubation des composés
REMARQUE : À titre d’exemple de composé antiviral, la labyrinthopeptine A1 est utilisée (voir le tableau des matières). Étant donné que ce protocole peut être généralisé à tous les composés ayant une activité antivirale potentielle, nous l’appelons « le composé ».
- Laisser équilibrer le milieu de culture cellulaire complet sans ajout de sérum fœtal bovin (FBS) (appelé « tampon de dosage ») à la RT.
- Gardez les composés sur la glace.
- Préparer une dilution concentrée 10x de chaque composé dans un milieu d’essai dans des tubes en polypropylène de 5 mL.
- Diluer en série les composés dans un milieu d’essai dans des tubes en polypropylène de 5 mL pour obtenir les concentrations 10x souhaitées.
- Mettez en pause le périphérique CEI en cliquant sur Pause dans le volet Configuration de la collecte de données. Attendez que le point de temps actuel soit terminé et retirez la plaque de 96 puits.
- Vérifier l’adhérence et la formation de monocouches des cellules au microscope optique.
- Retirez 20 μL de chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal.
- Ajouter 20 μL de solution composée ou de véhicule dans les puits désirés. Préparez une mise en page avec les conditions spécifiques pour un pipetage approprié.
- Incuber la plaque pendant 15 min à 37 °C avec 5% de CO2.
REMARQUE: Un incubateur cellulaire normal est utilisé pour cette étape d’incubation au lieu d’un dispositif CEI. Les puits de contrôle cellulaire (CC) sont des puits traités par véhicule.
6. Préparation du virus et infection
- Décongeler un flacon de stock de virus. Dans cet exemple, ZIKV MR766 et ZIKV PRVABC59 sont utilisés.
- Préparer les dilutions virales à l’MOI désiré ou les dilutions dans le milieu d’essai dans un tube en polypropylène de 15 mL.
Remarque : Dans cet exemple représentatif, MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 et 0.00005 sont utilisés. - Ajouter 100 μL de dilution virale dans les puits assignés de la plaque de 96 puits. Ajouter le milieu d’essai aux puits CC.
- Décontaminez les contenants de virus utilisés.
- Remettez la plaque dans l’appareil CEI et continuez les mesures pendant 6 jours consécutifs en cliquant sur Reprendre l’expérience.
REMARQUE : Les puits de contrôle du virus (CV) sont des cellules infectées traitées par véhicule, tandis que dans les puits CC, le milieu de dosage est ajouté au lieu de la dilution du virus. Si la cytotoxicité des composés est évaluée, ajouter 100 μL de tampon d’essai au lieu de la dilution du virus.
7. Analyse des données
- Terminez l’expérience en cliquant sur Terminer et ajoutez des commentaires récapitulatifs facultatifs, tels que des informations sur les conditions expérimentales spécifiques dans la fenêtre qui apparaît. Cliquez sur OK lorsque la collecte des données est terminée.
- Sélectionnez la fréquence souhaitée dans le volet Graphique où la plus grande différence d’impédance entre CC et VC est mesurée à la fin de l’expérience.
- Pour déterminer la meilleure fréquence, exécutez une expérience pilote avec des cellules non infectées et infectées et choisissez la fréquence qui, au moment où l’impédance des cellules infectées a chuté à son niveau de base, conduit à la plus grande différence d’impédance observée entre les cellules non infectées et infectées. Dans le cas des cellules A549 infectées par le ZIKV, il s’agit de 16 kHz.
- Pour exporter toutes les données sous forme de feuille de calcul, assurez-vous que tous les puits sont sélectionnés dans le volet Configuration du puits , puis cliquez sur Fichier | Exporter des données | Données graphiques.
- Normalisez les données en soustrayant la valeur moyenne d’impédance VC mesurée à la fin de l’expérience de tous les points de données et en la divisant par la valeur moyenne d’impédance CC du dernier point temporel mesuré avant l’infection.
- Tracer les données normalisées en fonction du temps pour obtenir des graphiques de profil CEI.
- Calculer l’aire normalisée sous la courbe (ASCn) de chaque condition pour déterminer des paramètres tels que des concentrations inhibitrices de 50% (IC50).
- Calculez d’autres paramètres utiles, tels que CIT50, pour, par exemple, comparer l’infectiosité de diverses souches virales.
Representative Results
Dans cet article, l’utilisation du test CEI dans la recherche ZIKV est décrite en détail. Le déroulement de ce test est illustré à la figure 1. Nous démontrons la commodité de la surveillance en temps réel de l’infection par le ZIKV dans un type de cellule souhaité, ainsi que l’évaluation de l’inhibition de l’infection par un composé antiviral. À titre d’exemple antiviral, nous utilisons le peptide bien décrit labyrinthopeptine A1 (Laby A1); Nous appelons cela « le composé », car ses propriétés spécifiques dépassent le cadre de cet article sur les méthodes et sont discutées ailleurs20,21. Il convient de noter que la reproductibilité de la méthode n’est pas discutée dans la section des résultats, car nous voulons nous concentrer sur les profils d’impédance individuels obtenus à l’aide de la méthodologie. Cependant, cela a été décrit précédemment19.
Dans la première série d’expériences, nous démontrons l’importance de l’optimisation de la densité cellulaire lors de la réalisation de tests d’infection par ICE (Figure 2). Lorsque trop de cellules sont ensemencées, la monocouche cellulaire aura complètement grandi et ne pourra pas se propager davantage à travers les électrodes CEI. Cela conduit à une différence plus faible entre CC et VC, et donc à une résolution plus faible, diminuant la fenêtre de détection de l’activité antivirale. Ceci est bien illustré à la figure 2E. Pour certains types de cellules plus grandes, telles que les cellules U87, un ensemencement trop dense des cellules pourrait même entraîner un détachement complet de la monocouche cellulaire lors de la manipulation de la plaque, comme démontré ici (Figure 2F). Ceci est également observé au microscope.
La figure 2 démontre également que le test est très utile pour effectuer des études de sensibilité cellulaire. Il ressort clairement de la figure 2A,B que la cinétique de l’infection dépend fortement du type de cellule. La figure 2C montre que les cellules U87 ne sont sensibles à l’infection par le ZIKV qu’à des MOI élevés.
Dans la deuxième série d’expériences, l’utilisation polyvalente du test d’infection CEI est mise en évidence à l’aide de diverses souches de ZIKV à différents MOI et en présence d’un composé antiviral bien décrit (Figure 3). Ces expériences sont réalisées avec des cellules A549, un modèle couramment utilisé dans la recherche sur les flavivirus22,23. Cette lignée cellulaire a également été utilisée dans d’autres études qui ont démontré sa pertinence dans les essais CEI24. Tout d’abord, la cinétique d’infection par une souche représentative du ZIKV de la lignée africaine MR766 est comparée à celle de la lignée asiatique PRVABC59. La figure 3A montre que les deux souches ont des profils CEI comparables, PRVABC59 ayant des propriétés induisant des CPE légèrement plus lentes. Cela se reflète également dans les valeurs CIT50 (figure 3B). Ce paramètre intéressant a été introduit pour la première fois par Fang et al.16 et prend en compte la cinétique des mesures CEI. Il est défini comme le temps nécessaire pour réduire l’impédance de 50% par rapport au contrôle cellulaire.
Ensuite, les cellules ont été infectées par trois MOI différents de ZIKV MR766 ou PRVABC59, en présence ou en l’absence de diverses concentrations de composés, et les profils d’impédance ont été surveillés. Comme on peut l’observer sur la figure 3C-H, certaines concentrations de composés inhibent ou retardent la chute d’impédance causée par l’infection par le ZIKV. Cela est également reflété lorsque les valeurs de l’ASC sont calculées. Les résultats du test CEI démontrent également visuellement que l’activité antivirale dépend de l’MOI et du moment de l’évaluation de la puissance. Les calculs del’ASC n peuvent être utilisés pour déterminer les valeurs IC50, comme le montre la figure 3I. Enfin, la figure 3H montre que les valeurs CIT50 peuvent également être utilisées pour déterminer et comparer les puissances des composés. Les composés inactifs ou les concentrations de composés sont caractérisés par des profils CEI, des valeurs ASC et CIT50 comparables à celles de CV.
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique du flux de travail du test. La chronologie et les différentes étapes de manipulation et d’incubation du test CEI sont représentées ici. Abréviations : IEC = impédance électrique à base de cellules; ZIKV = virus Zika; D = jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Profils normalisés d’IEC des cellules infectées par le ZIKV à différentes densités. Des cellules (A,D) A549, (B,E) HEL 299 ou (C,F) U87 ont été ensemencées à (A-C) 15 000-20 000 (« optimal ») ou (D-F) 75 000 cellules (« sous-optimales ») par puits dans une plaque CEI de 96 puits. Après 24 h de surveillance d’impédance, les cellules ont été infectées par dix dilutions MOI de ZIKV MR766. L’impédance a ensuite été surveillée pendant 5 jours consécutifs. Les profils CEI (moyenne ± plage de deux répétitions techniques) d’une expérience représentative sont présentés. Abréviations : IEC = impédance électrique à base de cellules; MOI = multiplicité de l’infection; ZIKV = virus Zika; Norme = normalisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Profils normalisés CEI des cellules A549 après infection par deux souches de ZIKV et inhibition par un composé antiviral. (A) Les cellules adhérentes A549 ont été infectées par divers MOI de ZIKV MR766 ou ZIKV PRVABC59, et l’impédance a été surveillée en permanence. La moyenne ± écart-type de trois répétitions techniques d’une expérience représentative est indiquée. (B) Les valeurs de l’IRS50 ont été calculées sur la base du profil CEI de A et comparées. La moyenne ± écart-type de trois répétitions techniques effectuées est indiquée. (C-H) Les cellules adhérentes A549 ont été traitées avec diverses concentrations de composés et infectées par la suite par un MOI spécifique de ZIKV MR766 (C-E) ou ZIKV PRVABC59 (F-H). L’impédance était surveillée en permanence. La moyenne ± plage de deux répliques techniques d’une expérience représentative est indiquée. (I) Pour comparer l’inhibition du composé à différentes souches et dilutions du ZIKV, l’ASC n a été calculée et les pourcentages inhibiteurs ont été déterminés en soustrayant toutes les conditions par l’ASCCC n et en divisant par l’ASCVC n. (J) Les valeurs CIT50 de l’expérience montrées dans C-H ont été calculées pour comparer les différentes souches ZIKV et MOI. La moyenne ± plage de deux répliques techniques est indiquée. Abréviations : IEC = impédance électrique à base de cellules; MOI = multiplicité de l’infection; ZIKV = virus Zika; Norme = normalisée; CIT 50 = temps auquel l’impédance a diminué de50 % par rapport au témoin non traité; ASC = aire sous la courbe; CC = contrôle cellulaire; VC = contrôle du virus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Cet article décrit l’utilisation du test CEI dans la recherche antivirale ZIKV. Le test présente l’avantage d’une surveillance en temps réel et peut donc être utilisé pour évaluer la cinétique de l’infection par le ZIKV et l’inhibition antivirale avec des composés sélectifs. Les données obtenues avec cette méthode permettent une observation objective et visuelle de l’EPC induite par le virus et de la puissance d’un composé antiviral potentiel.
Étant donné que l’IEC est une méthode très sensible, il faut faire très attention lors de la réalisation de ce test cellulaire. Il est crucial qu’un pipetage précis soit effectué pour éviter autant que possible les variations de pipetage. De plus, d’autres facteurs susceptibles d’influencer les résultats expérimentaux, tels que le nombre de cellules et le stock viral utilisé, doivent être maintenus constants entre les répétitions d’expériences. Ce sont des facteurs qui influencent fortement la cinétique de la croissance cellulaire et de l’infection et pourraient donc entraîner une variation des valeurs calculées du CIT50 et/ou d’autres paramètres.
Lors de la réalisation du test CEI en présence de composés antiviraux (potentiels), il est important de déterminer s’ils influencent l’impédance des cellules en l’absence de virus. La technique est si sensible que les changements d’impédance pourraient être mesurés bien en dessous des concentrations cytotoxiquesdu composé 19.
Bien que seules les données du ZIKV soient présentées dans cet article, le test peut être facilement appliqué à d’autres virus cytopathogènes (flavi), avec seulement un effort minimal d’optimisation, comme la détermination optimale de la fréquence de surveillance CEI. Des adaptations du test CEI ont été utilisées avec divers virus humains et animaux, tels que le chikungunya, la grippe A et les herpèsvirus humains et équins25,26,27,28. Ici, il est également utilisé comme méthode simple pour la quantification des titres viraux ou pour l’identification des composés antiviraux. Ces études ont utilisé l’analyse cellulaire en temps réel, une méthode alternative d’IEC.
L’utilisation de la technologie CEI est limitée aux types de cellules adhérentes, car le principe du test repose sur les propriétés des cellules adhérentes à se propager dans les puits intégrés à l’électrode. Les revêtements de surface de puits tels que la fibronectine peuvent être utilisés pour améliorer la fixation des cellules29. La méthodologie présente d’autres inconvénients, le premier étant lié à son coût. Outre l’investissement dans le dispositif de surveillance CEI et le matériel et les logiciels qui l’accompagnent, les consommables sont également quelque peu chers. De plus, comme le protocole exige une surveillance de l’infection virale pendant plusieurs jours, une plaque de 96 puits par semaine peut être évaluée. Avec le coût élevé, cela limite l’utilisation aux paramètres de débit faible à moyen.
En raison de ces problèmes de débit, la technologie ne convient pas aux paramètres de dépistage antiviral. Cependant, il est très attrayant dans les phases expérimentales initiales, par exemple, lors de l’évaluation de la susceptibilité cellulaire pour l’étude de l’infection par le ZIKV dans un certain contexte lié à la maladie. La technologie est également utile avec les lignées cellulaires transfectées ou knockout pour observer facilement les changements dans la cinétique d’infection, par exemple, en présence ou en l’absence de certains récepteurs d’entrée. Ceci est intéressant lors de l’étude de l’implication des facteurs cellulaires dans l’infection par le ZIKV. En outre, dans les phases précliniques ultérieures, lorsqu’un certain candidat principal a été sélectionné, le test CEI peut être utilisé pour une caractérisation plus approfondie d’un composé sélectionné. Les biocapteurs CEI peuvent également être modifiés en immobilisant certains éléments de bioreconnaissance, tels que les anticorps spécifiques aux virus, pour la détection des virus18. Dans l’ensemble, cela met en évidence l’utilisation polyvalente de l’IEC dans un contexte de virologie.
Disclosures
Les auteurs confirment qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Clément Heymann et Gorrit Lootsma pour la relecture du manuscrit. L’étude a été financée par des subventions internes du Laboratoire de virologie et de chimiothérapie (Institut Rega, KU Leuven).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
| Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
| Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
| Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
| Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
| Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
| HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
| Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
| Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
| Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
| Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
| Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
| U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
| Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
| Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
| ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |
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