Summary
Aquí, proponemos un protocolo para la administración de lipopolisacáridos intratraqueales (LPS) a través de la intubación endotraqueal orofaríngea no invasiva. Este método minimiza el trauma del procedimiento quirúrgico para el animal y administra LPS con precisión a la tráquea y luego a los pulmones.
Abstract
El modelo de ratón de lesión pulmonar aguda (ALI) inducido por lipopolisacárido (LPS) o endotoxina sigue siendo uno de los modelos más utilizados en estudios con animales de lesión pulmonar aguda o inflamación aguda. Los métodos actuales más utilizados en modelos de ratón con lesión pulmonar aguda son una inyección intraperitoneal de LPS y una traqueostomía para la infusión traqueal de LPS. Sin embargo, el primer método carece de orientación pulmonar y daña otros órganos, y el segundo método induce trauma operatorio, riesgo de infección y una baja tasa de supervivencia. Aquí, recomendamos un método no invasivo de intubación endotraqueal orofaríngea para la instilación de LPS en ratones. En este método, el LPS se introduce de forma no invasiva en la tráquea a través de la cavidad orofaríngea para ser instilado en el pulmón con la ayuda de un aparato para la intubación endotraqueal. Este método no solo asegura la orientación pulmonar, sino que también evita el daño y el riesgo de muerte en los animales. Esperamos que este enfoque se utilice ampliamente en el campo de la lesión pulmonar aguda.
Introduction
La lesión pulmonar aguda (LPA) es un síndrome clínico común. Bajo una variedad de factores patógenos, la ruptura de la barrera fisiológica de las células epiteliales pulmonares y las células endoteliales vasculares conduce a un aumento de la permeabilidad alveolar, causando así disminución de la distensibilidad pulmonar, edema pulmonar e hipoxemia grave1. El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es la forma más grave de LPA. La inflamación incontrolada y el daño por estrés oxidativo se consideran las principales causas de ALI y el SDRA más grave2. Cuando las células epiteliales alveolares se lesionan directamente debido a un traumatismo, se activa la cadena de respuesta inflamatoria de los macrófagos alveolares, lo que lleva a la inflamación en el pulmón3. A nivel mundial, hay más de 3 millones de pacientes con SDRA agudo por año, y representan aproximadamente el 10% de los ingresos en la unidad de cuidados intensivos; Además, la tasa de mortalidad en casos graves es tan alta como 46%4,5,6. Por lo tanto, existe la necesidad de establecer un modelo animal adecuado de ALI para estudiar su patogénesis. El ratón es el animal experimental más utilizado en el estudio de la ALI, ya que su tracto respiratorio puede simular bien el tracto respiratorio humano para estudios de ALI. Además, ALI se manifiesta como infiltración masiva de células inflamatorias, aumento de la permeabilidad vascular pulmonar y edema pulmonar. Los cambios en las citocinas inflamatorias en suero y la relación pulmón peso seco-húmedo reflejan el grado de ALI7.
En la actualidad, los principales métodos para modelar la ALI inducida por LPS en ratones incluyen la intubación traqueal intranasal y quirúrgica 8,9. Aquí, proponemos un nuevo método para administrar LPS en la tráquea a través de la intubación orofaríngea no invasiva. Este método utiliza un intubador iluminado para encontrar la tráquea del ratón y luego administra LPS en la tráquea y el pulmón. Este método administra LPS a los pulmones con mayor precisión que el método de administración intranasal. En comparación con la intubación traqueal quirúrgica, este método no requiere cirugía, evita causar heridas y reduce el dolor en ratones10. Por lo tanto, este método se puede utilizar para establecer un modelo de ratón más convincente de ALI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El protocolo de experimentación con animales fue revisado y aprobado por el Comité de Gestión de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Registro No. 2021-11). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57/BL (20-25 g, 6-8 semanas de edad). Los ratones se mantuvieron en una cámara de animales y fueron libres de beber y comer durante el experimento.
1. Preparación
- Asegúrese de que la plataforma de intubación consista en una base, un elevador, un clip, dos bandas elásticas y algunas cuerdas. Tome una cuerda, pase la cuerda a través de los dos orificios en la parte superior del elevador y ate los dos extremos de la cuerda, respectivamente, a las pequeñas protuberancias en la parte superior del elevador.
NOTA: Deje espacio para que la cabeza del ratón pase entre la cuerda y los dos agujeros. - Ate dos bandas elásticas a cada extremo del clip y pegue el clip con las bandas elásticas en la parte posterior del elevador. Finalmente, fije el elevador a la base a 90° (Figura 1).
- Seleccione una cánula del tamaño y la longitud adecuados. Para un ratón de 20-30 g, se puede usar un catéter de 22 G (2.5-3.8 cm de largo)11. Ensamble la cánula en un bolígrafo de cánula y encienda la luz de la pluma (Figura 2).
- Prepare pequeños fórceps quirúrgicos y una pipeta Pasteur desinfectándolos con alcohol al 70%.
2. Preparación del compuesto problema
- Pesar y disolver 3 mg de LPS en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.2) para formar una solución de LPS con una concentración de 3 mg/ml.
- Pesar y disolver 10 mg de pentobarbital sódico en 1 ml de solución salina normal para formar una solución de pentobarbital sódico al 1%. Filtre y esterilice la solución con un filtro de jeringa de 0,45 μm.
3. Instilación orofaríngea no invasiva
- Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 50 mg/kg12,13. Determinar la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al reflejo de enderezamiento.
- Coloque el ratón anestesiado en la plataforma de intubación. Fije los dientes frontales superiores con el hilo y los dos antepiés con las bandas elásticas (Figura 3).
- Saque la lengua con pinzas y sosténgala con la mano izquierda. Empuje la cánula lentamente, a lo largo de la boca, con la mano derecha hacia arriba, hacia la epiglotis. Use la luz de la pluma de la cánula para encontrar la tráquea e insértela lentamente en la tráquea (Figura 4).
- Después de insertar la cánula en la tráquea, retire la pluma de intubación lentamente y deje la cánula dentro. Inserte la pipeta Pasteur en la junta de la cánula y presione el cabezal (figura 5).
NOTA: Si el pecho del ratón sobresale, entonces la intubación es exitosa (Figura 6). - Después de una intubación endotraqueal exitosa, instilar a los ratones 3 mg/ml de LPS a 3 mg/kg a través de la cánula utilizando una microjeringa de cabeza plana14,15 (Figura 7).
- Una vez hecho esto, retire la cánula y la microjeringa. Retire el ratón del andamio y colóquelo en una jaula por separado para recuperarse. Observar el estado respiratorio del ratón hasta que se haya recuperado y recuperado la conciencia.
NOTA: A las 12 h después de la instilación traqueal de LPS, eutanasia a los ratones siguiendo el procedimiento aprobado por el comité de ética animal. Los ensayos séricos de TNF-α y las mediciones de peso pulmonar seco-húmedo se realizaron mediante procedimientos estándar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El método propuesto para la instilación de LPS en ratones se verificó evaluando la expresión de la citoquina inflamatoria TNF-α y la relación de peso seco-húmedo del pulmón 12 h después de la instilación de LPS. Hubo cuatro grupos en el experimento: control en blanco (sin ningún tratamiento), intubación quirúrgica16, intranasal17,18 e intubación orofaríngea no invasiva (n = 6). En comparación con el grupo control en blanco, los niveles séricos de TNF-α en el grupo de intubación orofaríngea no invasiva aumentaron significativamente (Figura 8A). La relación pulmón peso seco-húmedo también aumentó (Figura 8B), alcanzando el mismo nivel que en el grupo de intubación traqueal quirúrgica. Los conjuntos de datos se analizaron estadísticamente con un ANOVA no apareado y pruebas post-hoc de comparaciones múltiples de Tukey Kramer. Todos los datos se presentan como media ± SEM, y un nivel de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Figura 1: Accesorios y montaje de la plataforma de intubación. La plataforma consta de una base, un elevador, un clip, dos bandas de goma y algunas cuerdas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Kit de intubación. Esta figura muestra el kit de intubación y su montaje. Esto incluye una lámpara de lápiz, una fibra óptica y una cánula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Fijación del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Localización de la tráquea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Verificación de la bomba de pipeta Pasteur. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imagen de antes y después del tórax que muestra una intubación exitosa. (A) Tórax antes de la intubación. (B) Tórax después de la intubación; El área que muestra el abultamiento del pecho está marcada con un círculo rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Micromuestreador de cabeza plana para la entrega de LPS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Evaluación de la validez de la instilación no invasiva de LPS . (A) Expresión de TNF-α en el suero de ratones C57BL/6 12 h después de una inyección endotraqueal de LPS. (B) Análisis de datos de la relación tejido pulmonar en peso seco-húmedo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inicialmente, miramos dentro de la cavidad oral para encontrar la ubicación de la tráquea19. Sin embargo, durante este proceso, descubrimos que la tráquea de los ratones C57 / BL es estrecha, lo que dificulta encontrar la ubicación correcta por este método sin la ayuda de equipos como un endoscopio20. Tras una exploración adicional, descubrimos que la luz de la lámpara del intubador podría penetrar en la superficie del cuerpo, lo que permite al operador determinar la posición de la cánula21.
Para comprobar si el tubo había entrado en la tráquea, inicialmente, intentamos usar un pequeño espejo, que se enfrió colocándolo sobre hielo. Después de la intubación, utilizamos un espejo para acercarnos a la abertura de la cánula. Si aparecía niebla en el espejo, la intubación se consideraba exitosa. Sin embargo, encontramos que este método de examen no pudo determinar con precisión si la cánula había entrado en la tráquea. Primero, la cabeza de la cánula estaba cerca de la boca del ratón, y no se pudo determinar si la niebla que apareció en el espejo fue causada por el gas exhalado de la boca. En segundo lugar, el espejo necesitaba ser enfriado. Tras el uso constante, el tiempo requerido para enfriar el espejo también condujo a un aumento en el tiempo de experimento. Luego usamos una pipeta Pasteur para bombear aire a la tráquea; El pecho del ratón se hincharía si la cánula se insertara en la tráquea, y si se insertara en el esófago, la parte inferior derecha del abdomen se hincharía22. Por lo tanto, utilizamos este método como base para juzgar si la intubación fue exitosa.
En comparación con la intubación traqueal quirúrgica, la intubación orofaríngea no invasiva evita las heridas quirúrgicas y mejora la tasa de supervivencia de los animales de experimentación23. En comparación con la intubación intranasal, la intubación orofaríngea no invasiva conduce a una entrada más precisa de la cánula en el bronquio y los pulmones24. Sin embargo, dominar estas habilidades técnicas requiere mucha práctica. En el caso de ratones con tamaños corporales pequeños, insertar la cánula en la tráquea es difícil, y uno puede rascar fácilmente la tráquea durante la operación. Por lo tanto, sugerimos que los ratones con tamaños corporales más grandes deben ser seleccionados para el experimento.
El método también puede ser utilizado para administrar otros fármacos líquidos al bronquio y al pulmón, lo que significa que tiene un amplio potencial de aplicación25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.: 81903902), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No.: 2019M663457), el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (No.: 2020YJ0172) y el Proyecto de Premoción de Investigación Académica Xinglin de la Universidad de Chengdu de TCM (No.: QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S.
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530 (2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
