Summary
이 연구는 순수하고 실행 가능한 섬유아세포를 효과적이고 안정적으로 제공할 수 있는 켈로이드 조직으로부터 1차 섬유아세포를 확립하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
켈로이드 조직의 주요 세포 유형인 섬유아세포는 켈로이드의 형성과 발달에 필수적인 역할을 합니다. 켈로이드 조직에서 유래한 일차 섬유아세포의 분리 및 배양은 켈로이드의 생물학적 기능 및 분자 메커니즘에 대한 추가 연구와 이를 치료하기 위한 새로운 치료 전략의 기초입니다. 1차 섬유아세포를 얻는 전통적인 방법은 열악한 세포 상태, 다른 유형의 세포와의 혼합 및 오염에 대한 감수성과 같은 한계가 있습니다. 이 논문은 섬유아세포를 얻을 때 발생할 수 있는 문제의 발생을 줄일 수 있는 최적화되고 쉽게 재현 가능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에서 섬유아세포는 분리 후 5일 후에 관찰할 수 있으며 배양 10일 후에 거의 80% 밀도에 도달할 수 있습니다. 이어서, 면역형광 분석을 위한 PDGFRα 및 비멘틴 항체 및 유세포 분석을 위한 CD90 항체를 사용하여 섬유아세포를 계대배양하고 검증한다. 결론적으로, 켈로이드 조직의 섬유아세포는 이 프로토콜을 통해 쉽게 얻을 수 있으며, 이는 켈로이드 연구를 위한 실험실에서 풍부하고 안정적인 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.
Introduction
섬유증식성 질환인 켈로이드는 플라크가 지속적으로 증식하여 자가제한 없이 정상 피부 주변을 침범하는 경우가 많으며, 환자에게 다양한 정도의 가려움증, 통증, 미용적, 심리적 부담을 유발한다1. 켈로이드에 관여하는 일차 세포인 섬유아세포는 과도한 증식, 중복 세포외 기질 생성, 무질서한 콜라겐을 통해 이 질병의 형성과 발달에 필수적인 역할을 합니다 2,3. 그러나 근본적인 발병기전은 아직 불분명하며 켈로이드에 대한 효과적인 치료 방법은 여전히 부족합니다. 따라서 추가 연구가 시급히 필요합니다 4,5.
생체 내 켈로이드 연구를 위한 이상적인 동물 모델이 없기 때문에 6,7, 켈로이드 조직에서 1차 섬유아세포를 획득하여 시험관 내 모델을 구축하면 켈로이드 연구 2,6에 대한 타당성과 신뢰성을 제공할 수 있습니다. 일차 세포는 살아있는 조직에서 직접 유래한 세포이며, 이러한 세포는 세포주와 비교하여 여러 개체의 생리적 상태 및 유전적 배경과 더 유사할 수 있다는 것이 일반적으로 인식되고 있다 8,9. 일차 세포 배양은 세포의 성장과 대사뿐만 아니라 다른 세포 표현형을 연구하는 강력한 수단을 제공합니다.
현재, 1차 섬유아세포를 획득하는 두 가지 방법이 있다: 효소 소화 및 체외이식편 배양. 그러나, 다양한 박테리아 또는 곰팡이에 의한 오염의 위험성 , 쉽게 제거되지 않는 다른 유형의 세포와의 혼합, 배양 주기의 긴 기간, 원래 세포와 비교하여 세포 특성의 후속 변화 등과 같은 일차 섬유아세포를 얻는 데 몇 가지 장애물이 확인되었습니다9. 따라서 1차 섬유아세포를 얻기 위한 실현 가능하고 효과적인 공정을 개발하는 것이 추가 연구 및 적용을 위한 기초입니다. 이 연구는 순수하고 실행 가능한 섬유아세포를 효과적이고 안정적으로 제공할 수 있는 켈로이드 조직에서 일차 섬유아세포를 추출하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
이 연구는 Southern Medical University(2020081)의 Dermatology Hospital의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 개인으로부터 조직을 수집하기 전에 정보에 입각한 환자 동의를 얻었습니다.
1. 준비
알림: 다음 절차는 생물학적 안전 캐비닛 아래의 무균 환경에서 수행해야 합니다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용액(PSA)을 고혈당 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM)에 첨가하여 완전한 배양 배지를 준비합니다.
- 1x PBS에 1% PSA를 첨가하여 PSA로 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다. 1x PBS에 1% FBS를 추가하여 FBS로 PBS를 준비합니다.
- 고압 증기 멸균으로 멸균 된 가위, 집게 및 메스를 여러 개 준비하십시오.
2. 제거된 조직 얻기
- 수술을 통해 켈로이드 환자로부터 조직을 얻습니다. 멸균 포장 백 또는 멸균 원심 분리기 튜브에 신선한 켈로이드 조직을 수집하고 가능한 한 빨리 실험실의 생물학적 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
참고: 이 프로토콜에서 획득한 켈로이드 조직의 크기는 약 ~20 x 20 x 10mm3이며 크기는 수술에 따라 다를 수 있습니다.
3. 격리
- 멸균 핀셋을 사용하여 켈로이드 조직을 꺼내 1% PSA가 함유된 PBS 10-25mL가 들어 있는 50mL 멸균 원심분리기 튜브에 10분 동안 넣습니다. 그런 다음 6-웰 플레이트를 준비하고 1% PSA가 보충된 PBS 4mL를 각 웰에 추가합니다. 멸균 된 핀셋을 사용하여 티슈를 꺼내고 1 % PSA가 보충 된 PBS로 두 번 씻으십시오. 멸균 집게를 사용하여 조직을 한 우물에서 다음 우물로 순차적으로 옮깁니다.
- 수술용 가위나 수술용 메스를 사용하여 지방층과 표피층을 제거하고 진피층은 그대로 둡니다. 진피층을 가위로 3-5mm2 개로 다듬고 해부한 후 멸균 집게를 사용하여 이 조각을 다음 우물로 옮기고 PBS에서 1% PSA 용액으로 다시 세척합니다.
4. 문화
- 멸균 된 집게를 사용하여 페트리 접시에 진피 조직 조각을 놓습니다. 조각 수가 10에서 30 사이이고 각 조각 사이의 거리가 >5mm인지 확인하십시오. 페트리 접시를 5 ° C의 2 %CO2 인큐베이터에 37-30 분 동안 거꾸로 놓고 조직 조각이 약간 마르고 페트리 접시에 달라 붙을 때까지 놓습니다. 이어서, 10% FBS 및 1% PSA로 보충된 DMEM을 첨가하고, 페트리 접시를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 조심스럽게 넣는다.
참고: 섬유아세포는 형태학적으로나 기능적으로 이질적인 세포 집단입니다. 이러한 복잡성을 고려하여 분리 및 배양 단계는 주의해서 수행해야 합니다. 켈로이드 진피 조직 조각을 고르게 선택하고 이 조각을 잘 섞은 후 페트리 접시에 넣습니다. - 3 일 후, 상청액의 절반을 완전한 배양 배지로 교체하십시오. 2-3 일마다 배양 배지를 교체하십시오. 매일 40x 배율로 현미경으로 섬유아세포를 관찰합니다.
알림: 모든 단계는 부드럽게 수행해야 합니다. 티슈 조각이 페트리 접시에 달라붙는 데 시간이 걸리므로 분리 후 2일 동안은 페트리 접시를 움직이지 마십시오. - 조직 조각 주위에서 자라는 섬유아세포가 대략 90% 밀도에 도달하면, 조직 조각 및 배양 배지를 제거한다. 멸균 1x PBS로 섬유아세포를 세척하고 멸균 1x 트립신-EDTA 용액 2mL를 플레이트에 추가합니다. 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 약 ~3-5분 동안 세포를 배양합니다. 배양 접시를 가볍게 두드리고 현미경으로 관찰합니다. 대부분의 세포가 플레이트에서 분리되면 2mL의 완전 배지를 추가하여 소화 과정을 종료합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고, 튜브를 실온에서 3분 동안 300× g 에서 원심분리한다. 상청액을 조심스럽게 버리고 세포 펠릿을 완전한 배지에 재현탁합니다. 섬유아세포를 9 cm 세포 배양 접시에 시딩하고, 가습된 5%CO2 배양기에서 37°C에서 배양한다.
5. 유지 및 보존
- 약 3-4일 후, 섬유아세포가 80% 밀도로 성장하면 4.2-4.4단계를 반복하고 섬유아세포를 1:3의 비율로 계대시킵니다. 추가 실험을 위해 계대배양된 섬유아세포를 사용하십시오.
참고: 섬유아세포 배양은 세포가 원래 세포에 비해 변화된 특성을 보이기 시작할 수 있으므로 10 계대 후에 중단해야 합니다. - 추가 사용을 위해 P1-P3의 계대배양 세포를 액체 질소에 냉동 보존합니다.
- 4.2-4.3단계를 반복합니다. 세포 현탁액을 15 mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고, 튜브를 300 × g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 버리고 90% FBS와 10% DMSO를 함유한 세포 동결 배지 1mL에 세포 펠릿을 재현탁하고 현탁액을 세포 극저온 튜브로 옮깁니다.
- 세포를 냉동 상자로 옮긴 다음 냉동 상자를 -80°C 냉동고에 넣습니다. 1 일 후, 장기 보존을 위해 세포를 액체 질소로 옮깁니다.
6. 면역형광염색에 의한 섬유아세포 동정
- 둥근 커버슬립을 24웰 플레이트에 넣고 계대배양된 섬유아세포를 1 ×10 4 세포/웰의 농도로 배양합니다. 섬유아세포가 60% 밀도에 도달하면 배양 배지를 제거합니다. 4% 파라포름알데히드 1mL를 넣어 섬유아세포를 실온에서 20분간 고정시킨 후 PBS로 매번 1분간 3회 세척한다.
알림: 현미경 또는 자동 세포 계수기에서 혈구계 슬라이드를 사용하여 세포 수를 계산합니다. - PBS를 제거하고, 세포막의 투과화를 위해 0.5% Triton X-100과 함께 20분 동안 배양한 다음, 매번 PBS로 1분 동안 3x 세척하였다. PBS에 0.5% 소 혈청 알부민을 넣고 30분 동안 담가둡니다. 그런 다음 제거하고 항체 희석액에 희석한 PDGFR-α/vimentin 항체를 1:1,000으로 첨가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 다음날, 1차 항체를 제거하고, 세포를 PBS로 3분 동안 3x 세척하고, 항체 희석제로 희석한 2차 항체 Alexa Fluor-555 염소 항-토끼 IgG를 1:200에서 1시간 동안 담가두었다.
- 2차 항체를 제거하고, 세포를 PBS로 3x 세척하였다. 집게를 사용하여 둥근 커버슬립을 꺼내 유리 슬라이드에 놓고 5μg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 용액 50μL를 추가하여 세포핵을 염색합니다. 샘플을 젖은 어두운 상자에 보관하고 레이저 컨포칼 형광 현미경으로 관찰합니다.
참고: 1차 항체는 없지만 2차 항체가 있는 음성 대조군을 추가하여 비특이적 염색을 배제합니다.
7. 유세포 분석에 의한 섬유아세포 동정
- 세포 펠릿을 1.5mL 멸균 원심분리기 튜브에 수집하고 1% FBS가 포함된 PBS 50μL로 재현탁합니다. 암실에서 30분 동안 항-CD90과 함께 배양하고 항-IgG 이소타입 대조군을 대조군에 추가합니다. 이어서, 1% FBS를 함유하는 PBS 200 μL를 첨가하고, 튜브를 4°C에서 300 × g 에서 10분 동안 원심분리한다.
- 상청액을 제거하고, 1% FBS를 함유하는 PBS 200 μL를 첨가한다. 현탁액을 다시 중단하고 셀 스트레이너(70메쉬)를 통해 여과합니다. 여과액에 1:100의 DAPI 원액 5μg/mL를 첨가한 후 유세포 분석으로 결과를 얻습니다. 전방 산란(FSC)을 가로축으로, 측면 산란(SSC)을 세로좌표로 설정하고 주 세포 집단에 원을 그립니다. 세포 집단을 선택하고 분석을 위해 phycoerythrin을 가로좌표로 설정하고 count를 세로좌표로 설정합니다.
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Representative Results
프로토콜의 타임라인은 그림 1A에 요약되어 있습니다. 격리 프로세스의 일부 대표 이미지는 그림 2에 나와 있습니다. 표피층과 지방층을 조심스럽게 제거하고, 진피층을 3-4mm2의 작은 조각으로 분리하여 페트리 접시에 접종하였다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, 조직 조각의 여러 섬유아세포 성장을 처리 5일 후에 현미경으로 관찰하였다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포는 높은 증식 속도를 나타내었고, 10일 후에 높은 수준의 밀도에 도달하였다. 이 섬유아세포는 길쭉한 방추형 세포체를 가지고 있었고 높은 수준의 밀도에 도달했을 때 다발로 정렬되었습니다. 이 프로토콜에 따라, 섬유아세포를 계대배양하고, 2-3주 이내에 원하는 양으로 확장시켰다.
섬유아세포의 정체와 순도를 확인하기 위해 섬유아세포 특이적 마커인 PDGFRα10 및 비멘틴을 검출하기 위해 면역형광 염색 분석법을 사용했습니다. 예상한 바와 같이, 도 4A 및 도 4C는 모든 섬유아세포가 PDGFRα/비멘틴 항체에 의해 양성으로 염색되었고, 세포핵에서 적색 면역형광 및 청색 면역형광을 갖는 것을 보여준다. 도 4C에서 입증된 바와 같이, 유세포 분석 분석은 또한 거의 모든 섬유아세포에서 CD90 양성을 나타내었다.
그림 1: 켈로이드 섬유아세포 분리 및 배양 절차의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 켈로이드 조직에서 섬유아세포의 분리 및 배양에 대한 대표적인 이미지 . (A) 조직을 씻으십시오. (B) 표피와 지방층을 제거합니다. (C) 진피를 3-4mm3 개로 해부하고 다시 PBS로 세척한다. (D) 조직 조각을 페트리 접시에 넣습니다. (E) 페트리 접시를 5°C에서 37%CO2 인큐베이터에 거꾸로 넣어 30-60분 동안 조직 조각을 약간 건조시키고 페트리 접시에 달라붙게 합니다. (f) 완전 배양 배지를 페트리 디쉬에 넣고,CO2 함유 세포 배양기에서 배양한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 켈로이드 조직 조각에서 나온 섬유아세포 성장의 대표 이미지 . (A) ~5일 이내에 조직 조각에서 섬유아세포가 파생됩니다. (B) 섬유아세포는 ~10일 만에 높은 수준의 밀도에 도달했습니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 면역형광 염색 및 유세포 분석에 의한 고도로 정제된 섬유아세포의 식별. (A) 항-PDGFRα에 의한 섬유아세포의 면역형광염색. (B) PDGFRα에 대한 1차 항체가 없는 음성 대조군. (C) 항-비멘틴에 의한 섬유아세포의 면역형광염색. (D) 비멘틴에 대한 1차 항체가 없는 음성 대조군. (e) 섬유아세포의 유세포 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
켈로이드 조직에서 일차 섬유아세포를 얻는 것은 추가 연구를 위한 중요한 기초입니다. 지금까지, 일차 섬유아세포를 획득하는 두 가지 방법이 있었다: 효소 소화 및 체외이식편 배양11,12,13,14. 그러나 두 가지 전통적인 방법 모두 오염에 대한 민감성, 다른 유형의 세포와의 혼합, 긴 배양 기간 및 낮은 성공률과 같은 한계가 있습니다15,16. 이 연구는 최적화된 방법을 설명하고 이러한 기존 문제를 해결하고 켈로이드 섬유아세포의 분리 및 배양에 대한 성공 가능성을 높이기 위한 명확한 지침을 제공했습니다.
미생물 오염의 가능성은 일차 섬유아세포를 얻는 데 있어 주요 문제 중 하나입니다. 모든 장비와 용액은 멸균되어야 하며 프로토콜의 모든 단계에서 표준 무균 기술을 구현해야 합니다. 프로토콜에는 오염 위험을 줄이기 위해 무균 상태를 유지하라는 알림이 포함되어 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 격리 프로세스입니다. 1 % PSA가 보충 된 PBS에 조직을 담그고 여러 번 세척하는 목적은 기존 미생물과 잔류 혈흔을 제거하는 것입니다. 오염 물질이 전염되는 것을 방지하려면 멸균 된 가위와 집게를 추가로 준비해야합니다. 이 기기는 다음 작업에서 사용하지 않는 기기로 교체할 수 있습니다. 또한 미생물의 번식을 방지하기 위해 PSA를 배양 배지에 첨가합니다. 켈로이드 섬유아세포의 분리 및 후속 배양 동안 마이코플라스마에 대한 주기적인 검사가 프로토콜에 통합되어야 합니다. 이러한 과정을 통해 미생물 오염 가능성을 크게 줄일 수 있습니다.
또 다른 문제는 각질 세포와 같은 다른 유형의 세포와 혼합하는 것입니다. 이 세포 유형은 또한 강렬한 증식 능력을 가지고 있어 제거하기가 어렵습니다. 섬유아세포의 순도는 분리 과정에 크게 의존합니다. 표피와 지방층은 다른 세포와 섞이지 않도록 완전히 제거해야합니다. PDGFR-α은 섬유아세포의 막 및 세포질에서 발현되는 섬유아세포 특이적 마커이다10,17,18. CD90 및 비멘틴은 또한 섬유아세포의 막에서 특이적으로 발현되는 특이적 중간엽 마커이다 19,20,21. 이 연구의 면역 형광 염색 분석은 모든 세포가 PDGFR-α 및 vimentin을 양성으로 발현한다는 것을 보여주었습니다. 유세포 분석 분석은 또한 거의 모든 섬유아세포에서 CD90 양성을 직접 입증하고 이소타입 대조군에 비해 더 큰 CD90 양성을 입증하여 이 프로토콜을 사용하여 상대적으로 고순도 섬유아세포를 얻었음을 확인했습니다.
섬유아세포의 성장을 촉진하고 증식 효율을 향상시키기 위한 중요한 권장 단계는 다음과 같습니다. 첫째, 작은 조직 조각은 페트리 접시가 움직이는 동안 떠 있을 가능성이 더 높고 세포가 큰 조각을 쉽게 능가하지 않기 때문에 조직 조각을 3-5mm2의 적절한 크기로 절단해야 합니다. 둘째, 첫 번째 배지 변경은 조직 조각이 페트리 접시에 달라붙는 데 시간이 걸리기 때문에 3일 이후여야 합니다. 페트리 접시를 너무 일찍 움직이면 조직이 교란되고 섬유아세포가 증식할 가능성이 감소하는 경향이 있습니다. 셋째, 이 프로토콜의 모든 단계는 부드럽게 수행되어야 합니다. 부적절한 취급은 조직 조각의 불필요한 움직임을 유발하고 세포 성장을 손상시킵니다.
섬유아세포는 형태학적으로나 기능적으로 이질적인 세포 집단으로, 여러 하위 집단으로 나눌 수 있습니다. 이 연구의 한 가지 한계는 전체 켈로이드 조직에서 일반 섬유아세포를 얻을 수 있지만 섬유아세포의 다른 하위 집단에서는 얻을 수 없다는 것입니다. 우리는 앞으로 이 문제를 해결하기 위해 더 나은 방법을 찾기 위해 노력하고 있습니다.
RNA-seq의 이전 연구에서 입증된 바와 같이 켈로이드 섬유아세포와 정상 섬유아세포 사이에는 많은 차이점이 있습니다. 켈로이드 섬유아세포는 더 많은 콜라겐 I과 콜라겐 III을 생성합니다. 또한 켈로이드 섬유아세포는 무엇보다도 POSTN과 같은 특정 마커를 발현합니다. 계대시술 후에도 섬유아세포는 여전히 이러한 특성을 유지하며, 이는 일차 섬유아세포가 켈로이드 환자에서 발견되는 일부 특징을 나타낼 수도 있음을 증명합니다.
결론적으로, 본 연구는 미생물 오염, 다른 세포 유형과의 혼합, 긴 배양 기간 등 켈로이드 섬유아세포 추출의 기존 어려움을 해결하고 성공 가능성을 높이기 위한 최적화된 방법을 제공하고 명확한 지침을 제공합니다. 현재 연구는 켈로이드 일차 섬유아세포를 분리 및 배양하기 위한 간단하고 재현 가능한 방법을 제공하며, 이는 향후 연구 및 연구를 위한 풍부한 자원을 제공하거나 은행을 위해 액체 질소로 동결될 수 있습니다.
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Disclosures
선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81903189 및 82073418)과 광저우 과학 기술 재단 (보조금 번호 202102020025)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% polyformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | Cell fixation |
| 50 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8081 | Put keloid tissue |
| Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | second antibody for immunofluorescence staining assay |
| Anti human CD90 | BioLegend | B301002 | Identify the purity of fibroblasts |
| Antibody diluent | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 series A2 | Isolation and culture cells |
| Bovine serum albumin | aladdin | B265993 | Blocking for immunofluorescence staining assay |
| Carbon dioxide incubator | ESCO | CCL-170B-8 | Using for culturing cells |
| Cell cryotubes | Corning | 43513 | Store the cells in low temperature |
| centrifugal machine | Thermo Fisher | ST 16R | Discard supernatant |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Stain the cellular nucleus |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Using for preserving cells |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | C11995500BT | Culture medium solution |
| Fetal bovine serum | BI | 04-001-1A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCelesta | Observing the identity of cells |
| frozen box | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Laser confocal microscope | Nikon | AIR-HD25 | Observing the immunofluorescence staining assay |
| PDGFR-α antibody | CST | 3174T | First antibody for immunofluorescence staining assay |
| Penicillin-streptomycin-Am solution | Solarbio | P1410 | Add in culture medium solution to avoid contamination |
| petri dish | JETBIOFIL | 7556 | Culture fibroblasts |
| Phosphate buffered saline solution | Gibco | C10010500BT | Culture medium solution |
| Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Cell Signaling Technology | 5742S | As a control for flow cytometry |
| Round coverslip | Biosharp | 801007 | Cell culture |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Punch holes in the cell membrane |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Used for passaging cells |
| Vimentin antibody | Abcam | ab8978 | First antibody for immunofluorescence staining assay |
References
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