Summary
Det nuvarande protokollet är en uppdatering av tidigare protokoll och innehåller relativt enkla metoder för att odla cochleaplantor av hög kvalitet. Detta ger tillförlitlig datainsamling och högupplöst avbildning i levande och fasta celler. Detta protokoll stöder den pågående trenden att studera celler i innerörat.
Abstract
Obehandlad hörselnedsättning medför betydande kostnader för det globala hälso- och sjukvårdssystemet och försämrar individers livskvalitet. Sensorineural hörselnedsättning kännetecknas av kumulativ och oåterkallelig förlust av sensoriska hårceller och hörselnerver i cochlean. Hela och vitala cochleaplantor är ett av de grundläggande verktygen inom hörselforskningen för att upptäcka hårcellsavfall och för att karakterisera de molekylära mekanismerna i innerörats celler. För många år sedan utvecklades ett protokoll för neonatal cochleaisolering, och även om det har modifierats med tiden har det fortfarande potential för förbättringar.
Denna artikel presenterar ett optimerat protokoll för isolering och odling av hela neonatala cochleaexplantat i odlingskammare med flera brunnar som möjliggör studier av hårceller och spiralganglieneuronceller längs hela cochleans längd. Protokollet testades med hjälp av cochlea-explantat från möss och råttor. Friska cochlea-explantat erhölls för att studera interaktionen mellan hårceller, spiralganglieneuronceller och de omgivande stödjecellerna.
En av de största fördelarna med denna metod är att den förenklar organodlingsstegen utan att kompromissa med kvaliteten på explantaten. Alla tre varven av Cortis organ är fästa vid botten av kammaren, vilket underlättar in vitro-experiment och omfattande analys av explantaten. Vi ger några exempel på cochleabilder från olika experiment med levande och fixerade explantat, som visar att explantaten behåller sin struktur trots exponering för ototoxiska läkemedel. Detta optimerade protokoll kan användas i stor utsträckning för integrativ analys av däggdjurets cochlea.
Introduction
De flesta fall av sensorineural hörselnedsättning beror på degeneration av sensoriska hårceller, hörselnervceller och/eller auditiva synapser1. Denna degenerativa process i sinnescellerna är progressiv och vanligtvis irreversibel, vilket resulterar i hörselnedsättning. Därför är information om sensoriska cellers livskraft och förändringar i signalvägar under stressförhållanden avgörande för att skydda cellerna från skador och därmed förluster. Undersökningen av cochlea-explantat i odling gör det möjligt att rekapitulera vävnadskomplexet och upprätthålla ett normalt cell-cellnätverk, vilket möjliggör en bättre beskrivning av signalprocesserna. För att etablera experimentella modeller av ototoxicitet har antibiotikumet gentamicin och det kemoterapeutiska medlet cisplatin ofta använts, eftersom de är kända för att ha ototoxiska biverkningar3.
In vitro-odlingssystem för explantat cochlear har utvecklats och modifierats med tiden. En beskrivning av det stegvisa protokollet för odling av hela cochleaplantor saknas dock ofta i flera publikationer. Ett av de första videoprotokollen för den primära odlingen av det murina organet Corti publicerades av Parker et al., där författarna beskrev stegen för isolering av det sensoriska epitelet, odling på glastäcken och elektroporering av explantat för transfektionsexperiment4. Ett annat protokoll som använder täckglas av glas har också tidigare publicerats, där organisationen av cellstrukturen i innerörat övervägdes5. Ett alternativt protokoll som använder Millicell-membran för odling av musexplantat av Corti-organet och vestibulära organ har rapporterats6. Dessa videorapporter har bidragit till att förbättra metoden, men det finns fortfarande utmaningar som måste lösas. För att ta itu med ett antal problem som uppstår i samband med användningen av täckglas och glasinlägg syftar detta protokoll till att effektivisera stegen för organodling och odling av organ av hög kvalitet för tillförlitliga data. Detta uppnås genom att minimera den direkta hanteringen av organet under de experimentella procedurerna och undvika organöverföring innan man får högupplösta bilder av de levande och fasta cellerna.
Det aktuella protokollet uppdaterar tidigare publicerade in vitro-odlingssystem och introducerar flera optimeringar i isoleringen av Corti-organet och överföringen till odlingskamrarna, samt integrationen av en ny glaskammare för att förbättra odlingsförhållandena och ytterligare analys. Detta optimerade protokoll minskar risken för skador på organet, vilket kan uppstå vid användning av täckglas under mediebytet eller under överföringen av organet från täckglas eller membran för vidare analys 4,5,6. Glastäckena har ett bättre reflekterande index än plasten; De är dock ömtåliga och kan lättare gå sönder. De flerbrunnskamrar som används här är fästa vid ett objektglas, som är väl lämpade för organodling och för högupplöst avbildning. Överföringen av de isolerade organen utförs med en spatel, vilket gör att organet kan föras i rätt riktning och skjutas in i kammaren, i stället för att använda kraft med en pipett som tidigare rekommenderats 4,5,6.
De poly-D-lysinbelagda flerbrunnskamrarna, som bör innehålla tillräckligt med medium, underlättar organöverföringen och korrekt positionering av explantaten utan att applicera adhesivt tryck och samtidigt undvika organöverlappning, som tidigare nämnts6. Dessutom löses oavsiktlig organöverlappning och ojämna strukturer med hjälp av en konfokal Z-stack. Detta protokoll har optimerats för olika tillämpningar, såsom explantation av mus och råtta, explantat av Cortis och cochleas organ, odling i serumhaltigt och serumfritt medium, ototoxiska bedömningar och allmänna läkemedelsresponsexperiment. Cochleaplantorna monteras och inkuberas i kammare med täckglasbotten, vilket underlättar vidhäftningen av cochleaplantorna till kamrarna för optimal hantering under in vitro-experimenten , efterbearbetningen av explantaten och avbildningen av levande och fixerade cochleaplantor. Visualiseringen av hela längden av Cortis organ och kvantifieringen av hårceller effektiviseras. Dessutom är bedömningarna av stödcellerna, spiralganglieneuroncellerna och neuriterna korrekta. Därför kan detta protokoll användas för en omfattande analys av cochleaceller hos däggdjur.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med riktlinjer och föreskrifter från djurskyddskommittén i kantonen Basel City, Schweiz. Postnatala C57BL/6JR-möss, Wistar-råttor och möss med STAT1-brist (blandade C57BL/6-129/SvEv)7 i åldern 3-5 dagar och av båda könen användes för experimenten.
1. Beläggning av kamrarna med flera brunnar
- Förbered ett komplett odlingsmedium.
- För organ av Corti explantat, förbered medium som innehåller Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10 % fetalt bovint serum (FBS), 25 mM HEPES och 30 U/ml penicillin.
- För organ av Corti explantat och cochlea-explantat, förbered ett medium som innehåller DMEM/F12, 1x N2-tillskott, 1x B27 minus antioxidanter och 30 E/ml penicillin.
- Bered en stamlösning av poly-D-lysin genom att tillsätta 10 ml cellodlingsvatten till 5 mg poly-D-lysin i en laminär huva. Den slutliga koncentrationen av poly-D-lysin är 0,5 mg/ml.
OBS: Skala upp den återstående stamlösningen och förvara vid −20 °C.- Bered arbetslösningar av poly-D-lysin genom att späda stamlösningen 1:10 i sterilt vatten.
- Bestryk en kammare med 8 brunnar med 150 μL/brunn poly-D-lysinarbetslösning och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Om en 4-hålskammare används, belägg med 300 μL/brunn poly-D-lysin arbetslösning. - Aspirera lösningen genom vakuum eller pipettering.
- Tvätta 2 gånger med 200 μl sterilt vatten och en gång med 200 μL komplett odlingsmedium eller DMEM.
- Tillsätt 150 μl helodlingsmedium till varje brunn.
OBS: Om en 4-hålskammare används, tillsätt 250 μL/brunn komplett odlingsmedium. - Placera kammaren i inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2 i minst 30 minuter innan en explantat.
2. Dissektion av tinningbenet
- Desinficera operationsbordet med 70 % etanol och sterilisera alla instrument i en sterilisator av glasmikrosfär.
- Placera en steril 60 mm petriskål på en hink med is.
- Häll några milliliter 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och lägg den på is.
OBS: Använd 30 U/ml penicillin i 1x PBS för att undvika bakteriell kontaminering. - Placera en steril dyna på en steril bricka och halshugg snabbt valpdjuret med en sax. Sänk ner huvudet i 70 % etanol i 5 sekunder, om kontaminering är en vanlig händelse.
OBS: Detta protokoll testades för möss och råttor i åldern P3-P5. Cochleavävnad är svårare att dissekera från äldre möss och råttor, och överlevnaden av explantat i odling är begränsad. - Placera djurhuvudet på en steril dyna. Ta bort underkäken. Lyft upp skinnet och dra tillbaka det från skallen.
- Håll skallen genom att placera pincetten i orbitalhåligheterna.
- Skär försiktigt skallen längs den sagittala suturen och skär sedan i det koronala suturområdet med ett vasst skalpellblad utan att skada cochlean.
OBS: Undvik att utöva för mycket tryck och undvik rörelser framåt och bakåt med skalpellen, eftersom det kan skada cochleabenet och därmed cochleagången. - Ta försiktigt bort hjärnan från de två skallhalvorna.
- Lägg dödskallehalvorna i en 60 mm petriskål med den iskalla PBS som tillagats i steg 2.3.
3. Isolering av cochlean
- Lokalisera cochlean i tinningbenet under mikroskopet. Placera pincetten i den överlägsna halvcirkelformade kanalen.
- Lossa den omgivande vävnaden mellan snäckan och tinningbenet med hjälp av en insulinspruta (möss) eller en pincett (råtta).
- Dra försiktigt bort tinningbenet från snäckan och håll kvar snäckan i vestibulen med tinningbenet. Se till att cochlean är fri från den omgivande vävnaden innan du skjuter tinningbenet åt sidan.
OBS: Om du använder för mycket kraft kommer cochleakanalen att skadas. - Håll cochlean i ett fast läge och använd den andra handen för att försiktigt ta bort brosksnäckan. För försiktigt in pincettens spetsar i apexområdet eller mellan varven (synligt som en vit linje) och ta bort kapseln bit för bit. Exponera cochleagången.
- Placera försiktigt pincetten under snäckan och lossa den från det vestibulära organet och tinningbenet.
- Lägg över cochlean i en ny 60 mm-skål med iskall PBS.
- Justera förstoringen av mikroskopet för att bättre visualisera explanteringen.
- Följ nästa steg för organ av Corti explantation:
- Håll orgeln vid basen med en pincett. Ta försiktigt bort cochleakanalen genom att ta tag i den med en pincett vid basalkroken.
- Rulla ut cochleakanalen från modiolus utan att riva sönder den.
- Ta försiktigt bort spiralligamentet med stria vascularis genom att hålla organet vid basen och dra bort dem.
OBS: Vävnadsseparation kan också uppnås genom att hålla apex-regionen istället för basregionen. Detta kan vara till hjälp vid dissekering av råttorgan eller äldre musungar (>P5). - Ta försiktigt bort Reissners membran genom att hålla orgeln vid basen och dra av den bit för bit.
OBS: Detta är ett valfritt steg eftersom Reissners membran inte stör insamlingen av avbildningen.
- Följ nästa steg för cochleaplantering:
- Lossa spiralgangliet från benspirallamina med hjälp av en insulinspruta (möss) eller pincett (råttor).
- Varva försiktigt ner modiolus under avlossningen.
OBS: Explantorna kan delas i två delar för bättre hantering. - Ta tag i krokområdet med pincett.
- Ta försiktigt bort spiralligamentet med stria vascularis genom att dra av det.
- Ta försiktigt bort Reissners membran genom att hålla orgeln vid basen och dra av den bit för bit.
OBS: Detta steg rekommenderas, eftersom Reissners membran vanligtvis viker sig och täcker neuronfilamenten och därför kan påverka experimenten.
4. Odling av cochleaplantor
- Överför explanterna från petriskålen till flerbrunnskamrarna. Lyft explanten med hårcellerna uppåt med hjälp av en laboratoriespatel. Inkludera några mikroliter 1x PBS för att förhindra att proverna fastnar på spateln.
OBS: Allvarligt skadade explantor kommer att fastna på spateln. - Låt explanten glida från spateln in i kammaren genom att försiktigt vifta spateln i mediet. Placera en explant per brunn på ett kammarglas med 8 brunnar.
OBS: Om explanten fastnar på spateln, håll spateln i mediet och använd pincetten för att lossa explanten. Placera alltid pincetten vid den inre kanten av explanten (bort från hårcellerna). - Kontrollera under mikroskopet att explanterna har överförts i rätt riktning och placerats i mitten av brunnarna.
OBS: Felaktigt orienterade explantat med hårceller vända nedåt tenderar att visa en U-form uppåt längs bredden. Korrigera deras orientering genom att flytta explantorna till hörnen av kamrarna (mer medium finns tillgängligt) och rikta dem att rotera. - Ta bort 80 μl av mediet med en 100 μL pipett och kassera det.
- Kontrollera i mikroskopet om hårcellerna och nervcellerna i spiralgangliet är synliga. Om det behövs, använd pincett för att försiktigt trycka isär lite överlappande vävnad.
- Ta bort resten av mediet och vänta i ~10 s.
- Pipettera tillbaka mediet. Tillsätt en eller två droppar av mediet bredvid explantan och resten av mediet på ett visst avstånd från explantan för att förhindra att explantan lossnar.
OBS: Även om explantorna är fästa vid kamrarna, bör mediet alltid tillsättas först genom att pipettera en till två droppar bredvid explanteringen. På så sätt kommer explantorna inte att lyftas upp när det återstående kompletta mediet tillsätts. - Sätt tillbaka kammaren i inkubatorn och inkubera i 2 timmar så att organen kan fästa ordentligt i botten av kammaren.
- Ta bort mediet och tillsätt försiktigt 300 μl färskt förvärmt komplett medium med en 100 μL eller 200 μL pipett. Använd inte en 1 ml pipett.
OBS: Om en förbehandling önskas, efter 2 timmars fastsättning, tillsätt 300 μL komplett medium som innehåller ämnet av intresse. Om en kammare med 4 brunnar används, använd upp till 500 μL/brunn. - Sätt tillbaka kamrarna i inkubatorn.
5. Test av ototoxiska medel
- Låt explantorna stå över natten för att anpassa sig till odlingsförhållandena och för att återhämta sig.
- Förbered olika koncentrationer av ototoxiska medel för att hitta lämplig koncentration för att etablera en ototoxisk modell med cirka 50 % hårcellsförlust. Använd mellan 50 μM och 250 μM för gentamicin och mellan 40 μM och 320 μM för cisplatin. Bered cisplatinlösningarna färska och skydda dem från ljus.
- Ta bort mediet och tillsätt försiktigt 300 μL medium som innehåller det önskade ototoxiska läkemedlet.
- Inkubera explantaten med gentamicin och cisplatin vid 37 °C i 24 till 48 timmar för att fastställa hårcellernas överlevnad.
OBS: Läkemedelskoncentrationerna och exponeringstiden väljs beroende på syftet med studien. Konserveringen av explantorna testades här upp till 72 timmar. Använd inte serum om du planerar att utföra en långtidsodling. - Följ nästa avsnitt för att färga cochleacellerna.
6. Fixering och immunofluorescens
- Kassera mediet i slutet av experimentet och tvätta omedelbart explantaten med 200 μL förvärmd 1x PBS.
- Fixera explantaten med 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minuter under ett kemiskt dragskåp.
VARNING: PFA är en farlig kemikalie; läs säkerhetsdatabladet (MSDS) innan du arbetar med PFA för första gången. - Tvätta explantorna två gånger med 200 μL 1x PBS. Förvara explantaten i 1x PBS vid 4 °C om färgningsprocedurerna behöver skjutas upp.
- Bered permeabiliseringslösningen bestående av 1x PBS och 1%-5% Triton-X100.
- Kassera 1x PBS, tillsätt 200 μL permeabiliseringslösning och inkubera explantorna i 15 minuter.
- Förbered blockeringslösning.
- För organ av Corti explantation, bered blockerande lösning bestående av 1x PBS, 10 % normalt getserum (NGS, för sekundära getantikroppar, eller annat serum från samma art som de sekundära antikropparna). Alternativt kan du använda 1%-5% bovint serumalbumin (BSA) om cellerna endast är färgade med falloidin.
- För cochleaexplantat, bered blockerande lösning bestående av 1x PBS, 10 % NGS och Fab-fragment (Fab fragment get-anti mus IgG H+L, spädning 1:200) om primära antikroppar från möss (t.ex. anti-TuJ1 från möss) används för att färga de spiralformade gangliecellerna.
- Tillsätt 200 μl blockerande lösning och inkubera explantaten i 1 timme.
- Kassera den blockerande lösningen. Tillsätt 200 μl 4 % PFA till de explantor som inkuberats med Fab-fragment och inkubera i 5 minuter.
- Tvätta explantorna med 1x PBS i 5 min.
- Bered en antikroppslösning bestående av 1x PBS, 5% NGS och 0,1%-0,25% Triton-X100.
- Späd den primära antikroppen i antikroppslösning - MYO7A (ab3481 vid en spädning av 1:500 eller MYO7A 138-1 vid 1:100) - för att märka hårcellerna och TuJ1 (1:400) för att märka spiralganglieneuronerna.
OBS: Om hårcellerna endast är märkta med falloidin, späd falloidinet vid 1:150 i 1x PBS, inkubera i 40 minuter till 1 timme vid rumstemperatur och fortsätt till steg 6.22. - Inkludera en kontroll av den sekundära antikroppens ospecifika bindning genom att utelämna den primära antikroppen.
- Tillsätt 170 μl av antikroppslösningen med den primära antikroppen till motsvarande brunn och inkubera över natten vid 4 °C med lätt skakning (40–60 varv/min).
- Tvätta explantorna 4 gånger i 5 minuter vardera med 1 x PBS.
- Späd den sekundära antikroppen i en antikroppslösning (t.ex. get-anti-rabbit Alexa Fluor 488 eller get-anti-mouse Alexa Fluor 568 IgG i en spädning av 1:500).
- Tillsätt 170 μl av antikroppslösningen med den sekundära antikroppen och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
OBS: Från och med detta steg, skydda explantorna från långvarig ljusexponering. - Tvätta explantorna 2x i 5 min vardera med 1x PBS.
- Gå vidare till nästa steg för sekventiell dubbelmärkning av explantaten. Inkubera med en andra primär antikropp av intresse (t.ex. MYO7A för hårceller) över natten vid 4 °C med lätt skakning (40-60 rpm). Alternativt, inkubera med falloidin (1:150) i 40 minuter till 1 timme vid rumstemperatur och fortsätt till steg 6.22.
OBS: Utför sekventiell märkning om de primära antikropparna kommer från samma värdart. Utför falloidinmärkning i slutet för multiplex immunofluorescens. - Tvätta explantorna 4 gånger i 5 minuter vardera med 1 x PBS.
- Späd den sekundära antikroppen i en antikroppslösning (t.ex. get-anti-rabbit Alexa Fluor 488 eller get-anti-mouse Alexa Fluor 568 IgG i en spädning av 1:500).
- Tillsätt 170 μl av den sekundära antikroppen och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta explantorna 2x i 5 min vardera med 1x PBS.
- Bered en stamlösning av DAPI på 1 mg/ml och förvara vid −20 °C. Späd stamlösningen av DAPI 1:10 för att bereda arbetslösningar på 0,1 mg/ml och förvara vid 4 °C.
OBS: Hoppa över steg 23 och gå till steg 26 om monteringsmediet som innehåller DAPI används. - Späd DAPI-arbetslösningen 1:100 i 1x PBS och inkubera explantaten med 200 μl DAPI-lösning i 5 minuter.
- Tvätta explantorna 2x i 5 min vardera med 1x PBS.
- Ta bort 1x PBS så mycket som möjligt så att kammarens botten kan torka. Låt inte explantan torka.
- Vänta i 2-5 s och tillsätt en droppe monteringsmedium direkt på explantan.
OBS: Monteringsmediet på explanteringen kommer att förbli på plats på grund av ytspänningen. Härdande monteringsmedium kan användas. - Förvara kamrarna vid 4°C fram till avbildning.
7. Immunofluorescens av levande celler från explantat
- Använd de isolerade explantorna efter inkubation över natten.
- Ta bort mediet och tillsätt försiktigt 300 μl medium som innehåller 125 μM cisplatin.
- Inkubera explantaten i 18 timmar för att mäta mitokondriesuperoxiden i de levande explantaten.
- Kassera mediet i slutet av läkemedelsexponeringen.
- Tillsätt 300 μl permeabel sond för att detektera cellulär ROS (t.ex. 250 nM mitohydroetidin) och/eller Caspase-3 (t.ex. 2 μM DEVD-peptid konjugerad till ett nukleinsyrabindande färgämne).
- Inkubera vid 37 °C i 30 min.
- Tvätta explantorna två gånger försiktigt med 200 μL varm Hank's balanced salt solution (HBSS) eller en lämplig buffert.
- Avbilda cellerna inom 2 timmar med fluorescensexcitation vid 400 nm och emissionsdetektion vid 590 nm.
- Kassera mediet i slutet av experimentet och tvätta omedelbart explantaten med 200 μL förvärmd 1x PBS.
- Fixera explanten och färga cochleacellerna enligt beskrivningen ovan.
8. Visualisering med konfokal avbildning
- Avbilda explantaten med hjälp av ett mikroskop utrustat med en konfokal enhet med snurrande skiva eller ett konfokalmikroskop utrustat med en konfokalenhet med punktskanning.
- Hämta bilderna med hjälp av en snurrande skiva med ett 20x luftobjektiv (numerisk bländare: 0,75) för cellräkning. Alternativt kan du ta bilderna med hjälp av ett punktskannande konfokalmikroskop med ett 40x luftobjektiv (numerisk bländare: 0,95) eller ett 100x oljeobjektiv (numerisk bländare: 1,45) för att visualisera och räkna synapserna eller avbilda stereocilierna.
OBS: Justera laserintensiteten och exponeringstiden för varje kanal för att undvika över- och undermättnad av bilderna. Tillämpa samma inställningar på alla explantor i samma experiment. - Ställ in mikroskopet för att ta en 3D-bild av hela cochleaplantan med hjälp av ett 20x luftobjektiv, z-stack och automatiska sömnadsverktyg. Använd 3 x 3 intilliggande fält med 15 % överlappning för musexplantat och 4 x 4 intilliggande fält för råttexplantat som ska sys ihop.
- Justera bilderna med hjälp av mikroskopets programvara eller den kostnadsfria FIJI-programvaran med öppen källkod8.
OBS: Deconvolution, en bildbehandlingsteknik, kan tillämpas på konfokala bilder för att skärpa deras kontrast och upplösning 9-11.
Representative Results
Det nuvarande protokollet har testats på cochlean hos neonatala möss och råttor. Denna artikel presenterar bilder av explantat från olika experiment. Explantaten av Cortis organ exponerades för gentamicin eller cisplatin, och hårcellsförlust var synlig. Explantationerna av Cortis organ bibehöll sin struktur och totala längd under både normala förhållanden och stressförhållanden (Figur 1 och Figur 2). De överlevande hårcellerna längs hela längden av råttans explantat som tidigare exponerats för cisplatin kunde detekteras individuellt (Figur 1). Förutom detektion av överlevande hårceller detekterades även hårceller som genomgår apoptos (Figur 2). Detta tillvägagångssätt underlättar visualisering och räkning av överlevande celler, vilket kan utföras med hjälp av en djupinlärningsmetod, som beskrivits tidigare12. Det var också möjligt att detektera de biologiska processerna i levande cochleaceller med hjälp av lämpliga cellpermeabla prober (Figur 3).
När det gäller cochlea-explantat som innehåller spiralganglieneuroner kan explantaten skäras i två delar, eller så kan apex-regionen skäras bort för att ge bättre odlingsförhållanden. Här valde vi att separera apex-regionen, eftersom den påverkas mindre under stressförhållanden. Figur 4 visar bas- och mediala områden för cochleaplantorna. Hårceller märkta med hårcellsmarkören MYO7A upptäcktes. På liknande sätt identifierades friska och skadade spiralgangliecellkroppar och neuriter märkta med den neuronala markören TuJ1. Analysen av spiralganglieregioner kan utföras manuellt eller med hjälp av programvara med öppen källkod som FIJI med NeuronJ-plugin för neuritspårning13 eller tillägg som TrackMate och Cellpose för morfologisk segmentering14,15. En närmare undersökning av musexplantaten avslöjade den höga upplösningen hos cochleacellerna och hårcellernas stereocilier (Figur 5).
Figur 1: Explantation av Cortis organ från råttor som exponerats för gentamicin. Representativa bilder (projektion med maximal intensitet) av (A) kontroll och (B) gentamicinexponerade (200 μM under 24 timmar) explantat. Hårcellerna är märkta med falloidin och kan visualiseras längs hela cochleans längd. För bättre illustration är bilden i grå toner. Bilderna togs med hjälp av ett konfokalmikroskop med en snurrskiva med ett 20x objektiv (numerisk bländare: 0,75). Skalstapel = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Explantat av Cortis organ från möss som exponerats för cisplatin. Representativa bilder (projektion med maximal intensitet) av (A) kontroll och (B) cisplatinexponerade (160 μM under 48 timmar) explantat. Hårcellerna är märkta med falloidin (röd) och de apoptotiska hårcellerna är märkta med fluorescecin. Bilderna togs med hjälp av ett punktskannande konfokalmikroskop och ett 20x objektiv (numerisk bländare: 0,75). Skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Explantation av Cortis organ från levande avbildningsexperiment. Representativa bilder (projektion med maximal intensitet) av explantat från vildtypsmöss som visar A) kontrollexplantat och B) explantat med exponering för 125 μM cisplatin under 18 timmar. Hårcellerna är märkta med mito-hydroetidin och kaspas-3. Bilderna togs med hjälp av ett konfokalmikroskop med snurrande skiva och ett 20x objektiv (numerisk bländare: 0,75). Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Cochlear explanterar från STAT1-knockoutmöss som exponerats för cisplatin. Representativa bilder (projektion med maximal intensitet) av (A) kontrollexplantat och (D) explantat exponerade för 40 μM cisplatin under 48 timmar. Hårcellskropparna är märkta med MYO7A-antikroppen (grön) och spiralgangliecellerna med TuJ1-antikroppen (röd) och DAPI-kärnmärkningen (blå). Bilderna togs med hjälp av ett konfokalmikroskop med punktskanning och ett 20x objektiv (numerisk bländare: 0,75) med ytterligare 2,15 zoom (B,C,E,F). Skalstapel = (B,C,E,F) 50 μm och (A,D) 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Musorgan av Corti explanterar. (A-D) Representativa bilder (projektion med maximal intensitet) av fullängdsexplantat från vildtypsmöss. (A,B) Explantaten märktes med MYO7A-antikropp, falloidin och DAPI-kärnmärkning. (B) I den förstorade översikten är cellkropparna i hårcellerna märkta med MYO7A-antikropp (grön) tydligt synliga. (C,D) Falloidin märker hårcellernas stereocilier och nagelbandsplatta. Explantaten märktes med falloidin. (D) I den förstorade översikten är dekonvolerade bilder av enskilda inre hårcellsstereocilier väl identifierade (nedre raden), medan enskilda yttre hårcellsstereocilier är svårare att avgränsa (övre raden). Bilderna i panelerna A och C togs med ett konfokalmikroskop med snurrande skiva och 20x objektiv (numerisk bländare: 0,75). Bilden i panel B togs med samma mikroskop men med ett 40x luftobjektiv (numerisk bländare: 0,95). Bilden i panel D togs med ett punktskannande konfokalmikroskop och ett 100x oljeobjektiv (numerisk bländare: 1,45) med ytterligare 3,46 zoom. Skanningarna gjordes i genomsnitt fyra gånger per XY-sektion och pixelstorleken var 0,02 μm. Skalstreck = (D) 3 μm, (B) 100 μm och (A,C) 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Syftet med att uppdatera detta protokoll var att effektivisera stegen från isolering av explantat till avbildning av levande och fixerade cochleaceller. Vi förbättrade några steg under isoleringen och introducerade några innovativa verktyg i syfte att etablera ett effektivt och smidigt protokoll för att få explantat av hög kvalitet. Metoden som beskrivs är ett optimerat protokoll från tidigare rapporter 4,5. Dessutom saknar vissa aktuella studier ett stegvis uppdaterat protokoll. Med förenklade explanteringssteg ger detta protokoll enkel hantering av välbevarade explantat, vilket är avgörande för reproducerbara data. Införandet av flerbrunnskammare med ett polymertäckglas för explantat i innerörat förbättrar organbindningen och bevarandet av intakta explantat. Här presenterar vi flera exempel på experiment under stressförhållanden för att visa att organen i odling bibehåller sin cellulära organisation trots förlust av hårceller och skador på neuriterna.
En av utmaningarna med att odla organ i innerörat är att undvika att organen lossnar och flyter, eftersom detta påverkar explantens integritet, svaret på behandlingen och de efterföljande undersökningarna. Tidigare odlades explantat på täckglas 4,5. Även om odling på glasytor verkar vara ett bra alternativ, är beläggning av glaset tidskrävande, och täckglasen i sig är ömtåliga och ömtåliga. Ett alternativt protokoll som använder Millicell-cellodlingsinsatser försöker lösa detta problem6. Att skära och överföra membranet med explantaten verkar dock vara ett känsligt steg i det protokollet. Dessutom kan explanterna skadas under montering och tätning av täckglaset. I vårt föreslagna tillvägagångssätt, när explanterna väl har överförts till poly-D-lysinbelagda kammare och placerats i rätt position, krävs ingen ytterligare överföring eller täckning med täckglas. En ytterligare fördel med detta protokoll är användningen av kammare med en tunn gasgenomsläpplig polymertäckglas som ger optimala odlingsförhållanden för organexplantaten. Denna polymer har en optisk kvalitet som liknar glas, vilket gör den lämplig för cellavbildning i högupplöst mikroskopi.
Tillsats av serum till mediet används i de flesta protokoll för cell- och vävnadsodling, inklusive odling av explantat i innerörat med 1%-10% FBS 4,5,6,16. Förekomsten av serum påverkar odlingsförhållandena för experimenten; I vissa situationer är därför kultur utan serum att föredra. Frånvaron av serum i odlingen av cochleaexplantat ersattes antingen genom tillsats av N2 till DMEM eller genom tillsats av N2 till neurobasal-A-medium 5,6. I detta avseende testade vi odlingsförhållandena för explantaten med och utan serum. Under båda förhållandena var cellerna i innerörat vitala och reagerade på ototoxiska förhållanden. Vi testade dessa förhållanden i 72 timmar, men explantorna kan bibehållas i odling ännu längre, särskilt när de inkuberas med serumfritt medium tillsammans med N2, B27 och tillväxtfaktorer, som föreslagits i andra studier 5,16.
Förutom de allmänna kritiska stegen i isoleringen av explantat i innerörat, såsom varaktigheten av organisoleringen och det antibiotikum som används, finns det också några kritiska steg i detta protokoll, som dock är hanterbara. Ett av de kritiska stegen i denna metod är relaterat till volymen av medium som finns kvar i kammaren efter att organet har satts in. Detta har optimerats för att hålla explantorna vid liv och fästs på bottenytan. Ett annat kritiskt steg är relaterat till den inkubationstid som krävs för att explanterna ska kunna fästa på botten av kammaren. Inkubationstider längre än 2 timmar med några mikroliter medium kan påverka explantans hälsa. Kortare inkubationstider, t.ex. 1 timme, kan också användas, så länge man är noga med att inte lossa explantorna. En annan viktig aspekt är resterna av poly-D-lysin. Tvättstegen för poly-D-lysin bör följas strikt, eftersom rester av bromidsaltet av poly-D-lysin kan vara giftiga för cellerna. Efter att tvättstegen har följts exakt, underlättar beläggningen med poly-D-lysin den smidiga vidhäftningen av explantorna till kamrarna så att positionen kan korrigeras innan de blir ordentligt fästa vid kammarens botten.
En av begränsningarna med denna metod är avbildning av celler med hjälp av upprätt mikroskopi. Detta kan vara en viktig fråga för de laboratorier som har inverterade mikroskop. Glasglas med avtagbara silikonkammare kan användas för upprätt och inverterad mikroskopi; Våra beläggningsförhållanden med poly-D-lysin måste dock testas först. En ytterligare begränsning är förvaringen av kamrarna, eftersom insatserna inte är avtagbara, och den totala höjden på en kammare med lock är nästan 11 mm jämfört med 1 mm höjd på ett vanligt mikroskopglas. Kammaren med 8 brunnar använder dock mindre utrymme än de plattor med 4 brunnar som föreslogs före16.
Vi presenterar här bilder tagna med två mikroskop. Medan det punktskannande konfokalmikroskopet ger högupplösta bilder av vävnader på grund av sin tunna optiska sektion, ger det snurrande skivkonfokalmikroskopet en snabbare bildtid med bra upplösning. Stereocilierna i de inre hårcellerna (IHC) och de yttre hårcellerna (OHC) visualiseras med hjälp av konfokalmikroskopi. Eftersom stereocilierna hos IHC är större än hos OHC, visualiserades de upprepade gånger och väl i detta arbete. För OHC-stereocilier kan andra alternativa mikroskop förbättra visualiseringen, såsom superupplösningsmikroskopi (SRM). Explantationsbilderna som tagits med det snurrande skivmikroskopet är tillräckliga för enkel integration av automatiserad hårcellsräkning med hjälp av en djupinlärningsmetod12. Dessutom är den korta insamlingstiden viktig för experiment med levande celler och vävnader. Dessutom är detta protokoll inte begränsat till neonatala cochleaexplantat. Med vissa optimeringar kan även andra explantat som vestibulära organ eller embryonala vävnader odlas.
Kvantifiering av cochleaceller, såsom hårceller och neuroner, in vitro är viktigt för att bedöma cellviabilitet och därmed andelen skadade eller förlorade celler. Undersökningar av signalvägar och cellfunktioner bidrar till att avslöja mekanismerna för död och överlevnad. Undersökningar av embryonal och neonatal cochleavävnad är användbara för att undersöka cochleans utvecklingsstadier. Därför kommer detta protokoll att bidra till att optimera in vitro-studier av explantat i innerörat, till exempel för att upprätta ototoxiska modeller, undersöka utvecklingsstadier, utvärdera signalvägar och utföra läkemedelsscreeningstudier.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Vi vill tacka Animal Facility vid Institutionen för biomedicin vid universitetet i Basel för deras stöd inom djurvård, Microscopy Core Facilities samt Information Technology Service vid Institutionen för biomedicin för deras tekniska assistans och Swiss National Science Foundation (SNSF) för ekonomiskt stöd (MD-PhD-stipendium till M.C., Bidragsnummer 323530_191222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
- Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
- Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
- Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
- MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
- Sibarita, J. B.
- Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).
