Summary
O protocolo atual atualiza protocolos anteriores e incorpora abordagens relativamente simples para a cultura de explantes cocleares de alta qualidade. Isso fornece aquisição de dados confiável e imagens de alta resolução em células vivas e fixas. Este protocolo apoia a tendência contínua de estudar as células da orelha interna.
Abstract
A perda auditiva não tratada impõe custos significativos ao sistema de saúde global e prejudica a qualidade de vida dos indivíduos. A perda auditiva neurossensorial é caracterizada pela perda cumulativa e irreversível das células ciliadas sensoriais e dos nervos auditivos na cóclea. Explantes cocleares inteiros e vitais são uma das ferramentas fundamentais na pesquisa auditiva para detectar a perda de células ciliadas e caracterizar os mecanismos moleculares das células da orelha interna. Há muitos anos, foi desenvolvido um protocolo de isolamento coclear neonatal que, embora tenha sido modificado ao longo do tempo, ainda apresenta potencial de melhoria.
Este trabalho apresenta um protocolo otimizado para isolamento e cultura de explantes cocleares neonatais inteiros em câmaras de cultura multipoços que possibilita o estudo das células ciliadas e das células neurais do gânglio espiral ao longo de toda a extensão da cóclea. O protocolo foi testado utilizando explantes cocleares de camundongos e ratos. Explantes cocleares saudáveis foram obtidos para estudar a interação entre as células ciliadas, as células do gânglio espiral do neurônio e as células de suporte adjacentes.
Uma das principais vantagens desse método é que ele simplifica as etapas de cultura de órgãos sem comprometer a qualidade dos explantes. Todas as três voltas do órgão de Corti estão presas ao fundo da câmara, o que facilita os experimentos in vitro e a análise abrangente dos explantes. Apresentamos alguns exemplos de imagens cocleares de diferentes experimentos com explantes vivos e fixos, demonstrando que os explantes mantêm sua estrutura apesar da exposição a drogas ototóxicas. Este protocolo otimizado pode ser amplamente utilizado para a análise integrativa da cóclea de mamíferos.
Introduction
A maioria dos casos de perda auditiva neurossensorial é decorrente da degeneração das células ciliadas sensoriais, das células do nervo auditivo e/ou das sinapsesauditivas1. Este processo degenerativo nas células sensoriais é progressivo e geralmente irreversível, resultando em perdaauditiva2. Portanto, informações sobre a viabilidade das células sensoriais e alterações nas vias de sinalização sob condições de estresse são fundamentais para proteger as células de danos e, consequentemente, perdas. A pesquisa de explantes cocleares em cultura permite a recapitulação do complexo tecidual e a manutenção de uma rede célula-célula normal, o que possibilita uma melhor descrição dos processos de sinalização. Para estabelecer modelos experimentais de ototoxicidade, o antibiótico gentamicina e o quimioterápico cisplatina têm sido frequentemente utilizados, pois são conhecidos por apresentarem efeitos colateraisototóxicos3.
Sistemas de cultivo in vitro de explantes cocleares têm sido desenvolvidos e modificados ao longo do tempo; No entanto, uma descrição do protocolo stepwise para a cultura de explantes cocleares inteiros é frequentemente ausente em várias publicações. Um dos primeiros protocolos de vídeo para cultura primária do órgão murino de Corti foi publicado por Parker et al., no qual os autores descreveram os passos para o isolamento do epitélio sensorial, cultivo em lamínulas de vidro e eletroporação de explantes para experimentos de transfecção4. Outro protocolo utilizando lamínulas de vidro também foi publicado anteriormente, no qual foi considerada a organização da estrutura celular na orelhainterna5. Um protocolo alternativo utilizando membrana de Millicell para cultura de explantes murinos do órgão de Corti e órgão vestibular tem sidorelatado6. Essas reportagens em vídeo contribuíram para o aprimoramento do método, mas ainda há desafios que precisam ser resolvidos. Para resolver uma série de questões decorrentes do uso de lamínulas e insertos de vidro, o presente protocolo visa agilizar as etapas de cultura de órgãos e cultura de órgãos de alta qualidade para obter dados confiáveis. Isso é conseguido minimizando o manuseio direto do órgão durante os procedimentos experimentais e evitando a transferência de órgãos antes de obter imagens de alta resolução das células vivas e fixas.
O presente protocolo atualiza os sistemas de cultivo in vitro publicados anteriormente e introduz diversas otimizações no isolamento do órgão de Corti e transferência para as câmaras de cultura, bem como a integração de uma nova câmara de lâminas para melhorar as condições de cultura e posterior análise. Esse protocolo otimizado reduz o risco de lesão do órgão, o que pode ocorrer com o uso de lamínulas de vidro durante a troca do meio ou durante a transferência do órgão de lamínulas ou membranas para análiseposterior4,5,6. As tampas de vidro têm um índice reflexivo melhor do que as de plástico; eles são, no entanto, frágeis e podem quebrar mais facilmente. As câmaras de poços múltiplos usadas aqui são anexadas a uma lâmina de microscópio, que são adequadas para cultura de órgãos e para imagens de alta resolução. A transferência dos órgãos isolados é realizada com uma espátula, que permite que o órgão seja trazido na orientação correta e deslizado para dentro da câmara, em vez de aplicar força com uma pipeta, como previamente recomendado 4,5,6.
As câmaras multipoços revestidas com poli-D-lisina, que devem conter meio suficiente, facilitam a transferência de órgãos e o posicionamento adequado dos explantes, sem aplicar pressão adesiva e evitando a sobreposição de órgãos, como mencionado anteriormente6. Além disso, sobreposições acidentais de órgãos e estruturas irregulares são resolvidas usando uma pilha Z confocal. Este protocolo tem sido otimizado para diversas aplicações, tais como explantes de camundongos e ratos, explantes do órgão de Corti e cóclea, cultivo em meio contendo e sem soro, avaliações ototóxicas e experimentos gerais de resposta a drogas. Os explantes cocleares são montados e incubados em câmaras com fundo de lamínula, o que facilita a adesão dos explantes cocleares às câmaras para o manuseio ideal durante os experimentos in vitro , o pós-processamento dos explantes e a obtenção de imagens de explantes cocleares vivos e fixos. A visualização de toda a extensão do órgão de Corti e a quantificação das células ciliadas são simplificadas. Além disso, as avaliações das células de suporte, células neurais do gânglio espiral e neuritos são precisas. Portanto, este protocolo pode ser utilizado para uma análise abrangente das células cocleares de mamíferos.
Protocol
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos do Comitê de Bem-Estar Animal do Cantão Basel City, Suíça. Camundongos C57BL/6JR pós-natais, ratos Wistar e camundongos deficientes em STAT1 (mistos C57BL/6-129/SvEv)7 com idade entre 3-5 dias e de ambos os sexos foram usados para os experimentos.
1. Revestimento das câmaras multipoços
- Preparar meio de cultura completo.
- Para órgão de explantes de Corti, preparar meio contendo meio de Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS), 25 mM de HEPES e 30 U/mL de penicilina.
- Para órgão de explantes de Corti e explantes cocleares, preparar um meio contendo DMEM/F12, 1x suplemento N2, 1x B27 menos antioxidantes e 30 U/mL de penicilina.
- Preparar uma solução-mãe de poli-D-lisina adicionando 10 mL de água de cultura celular a 5 mg de poli-D-lisina em um capuz laminar. A concentração final de poli-D-lisina é de 0,5 mg/mL.
NOTA: Aliquot a solução de estoque restante e armazenar a -20 °C.- Preparar soluções de trabalho de poli-D-lisina diluindo a solução-mãe 1:10 em água estéril.
- Revestir uma câmara de 8 poços com 150 μL/poço de solução de trabalho de poli-D-lisina e incubar por 30 min à temperatura ambiente.
NOTA: Se for utilizada uma câmara de 4 poços, revestimento com 300 μL/poço de solução de trabalho de poli-D-lisina. - Aspirar a solução por vácuo ou pipetagem.
- Lavar 2x com 200 μL de água estéril e uma vez com 200 μL de meio de cultura completo ou DMEM.
- Adicionar 150 μL de meio de cultura completo a cada poço.
NOTA: Se for utilizada uma câmara de 4 poços, adicionar 250 μL/poço de meio de cultura completo. - Colocar a câmara na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 durante, pelo menos, 30 minutos antes de colocar um explante.
2. Dissecção do osso temporal
- Desinfetar a mesa cirúrgica com etanol 70% e esterilizar todos os instrumentais em esterilizador de microesferas de vidro.
- Coloque uma placa de Petri estéril de 60 mm em um balde contendo gelo.
- Despeje alguns mililitros de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e mantenha-a no gelo.
NOTA: Use penicilina 30 U/mL em 1x PBS para evitar contaminação bacteriana. - Coloque uma almofada estéril em uma bandeja estéril e decapite rapidamente o filhote com uma tesoura de operação. Submergir a cabeça em etanol 70% por 5s, se a contaminação for um evento frequente.
NOTA: Este protocolo foi testado para camundongos e ratos com idade P3-P5. Os tecidos cocleares são mais difíceis de dissecar de camundongos e ratos mais velhos, e a sobrevivência dos explantes em cultura é limitada. - Coloque a cabeça do animal em uma almofada estéril. Retire a mandíbula. Levante a pele e retire-a do crânio.
- Segure o crânio colocando a pinça nas cavidades orbitárias.
- Corte cuidadosamente o crânio ao longo da sutura sagital e, em seguida, corte na área de sutura coronal com uma lâmina de bisturi afiada sem danificar a cóclea.
OBS: Evite aplicar muita pressão, e evite movimentos para frente e para trás com o bisturi, pois isso pode danificar o osso coclear e, consequentemente, o ducto coclear. - Remova cuidadosamente o cérebro das duas metades do crânio.
- Transfira as metades do crânio para uma placa de Petri de 60 mm com o PBS gelado preparado na etapa 2.3.
3. Isolamento da cóclea
- Localizar a cóclea no osso temporal sob o microscópio. Coloque a pinça no canal semicircular superior.
- Solte o tecido circundante entre a cóclea e o osso temporal usando uma seringa de insulina (camundongos) ou pinça (ratos).
- Afastar cuidadosamente o osso temporal da cóclea, mantendo a cóclea aderida ao vestíbulo com o osso temporal. Certifique-se de que a cóclea está livre do tecido circundante antes de empurrar o osso temporal para o lado.
NOTA: Aplicar muita força danificará o ducto coclear. - Segure a cóclea em posição fixa e use a outra mão para remover cuidadosamente a cápsula cartilaginosa da cóclea. Insira cuidadosamente as pontas da pinça na região do ápice ou entre as espiras (visível como uma linha branca) e remova a cápsula peça por peça. Expor o ducto coclear.
- Coloque cuidadosamente a pinça sob a cóclea e a desconecte do órgão vestibular e do osso temporal.
- Transfira a cóclea para uma nova placa de 60 mm contendo PBS gelado.
- Ajustar a ampliação do microscópio para melhor visualização dos explantes.
- Siga os próximos passos para órgão de explantes de Corti:
- Segure o órgão na base com pinças. Remova suavemente o ducto coclear agarrando-o com pinça na região do gancho basal.
- Desenrole o ducto coclear do modíolo sem rasgá-lo.
- Remova cuidadosamente o ligamento espiral com a estria vascular, segurando o órgão na base e puxando-os para longe.
NOTA: A separação do tecido também pode ser obtida segurando a região do ápice em vez da região da base. Isso pode ser útil ao dissecar órgãos de ratos ou filhotes de camundongos mais velhos (>P5). - Remova cuidadosamente a membrana de Reissner, segurando o órgão na base e retirando-o peça por peça.
NOTA: Esta é uma etapa opcional, pois a membrana de Reissner não interfere na aquisição da imagem.
- Siga os próximos passos para os explantes cocleares:
- Separar o gânglio espiral da lâmina espiral óssea usando uma seringa de insulina (camundongos) ou pinça (ratos).
- Relaxe suavemente o modíolo durante o descolamento.
OBS: Os explantes podem ser divididos em duas partes para melhor manuseio. - Segure a região do gancho com pinças.
- Remova cuidadosamente o ligamento espiral com a estria vascular, puxando-o.
- Remova cuidadosamente a membrana de Reissner, segurando o órgão na base e retirando-o peça por peça.
NOTA: Esta etapa é recomendada, pois a membrana de Reissner geralmente dobra e cobre os filamentos dos neurônios e, portanto, pode afetar os experimentos.
4. Cultura de explantes cocleares
- Transfira os explantes da placa de Petri para as câmaras de poços múltiplos. Levante os explantes com as células ciliadas viradas para cima usando uma espátula de laboratório. Inclua alguns microlitros de 1x PBS para evitar que as amostras grudem na espátula.
NOTA: Explantes severamente danificados irão aderir à espátula. - Deixe os explantes deslizarem da espátula para a câmara, agitando suavemente a espátula no meio. Coloque um explante por poço de uma lâmina de câmara de 8 poços.
OBS: Se o explante grudar na espátula, segure a espátula no meio e use a pinça para desprender os explantes. Coloque sempre a pinça na borda interna do explante (longe das células ciliadas). - Verifique ao microscópio se os explantes foram transferidos na orientação correta e colocados no centro dos poços.
NOTA: Explantes mal orientados com células ciliadas voltadas para baixo tendem a mostrar uma forma de U para cima ao longo de sua largura. Corrija sua orientação movendo os explantes para os cantos das câmaras (mais meio disponível) e direcione-os para girar. - Retire 80 μL do meio usando uma pipeta de 100 μL e elimine-o.
- Verifique ao microscópio se as células ciliadas e as células do gânglio espiral estão visíveis. Se necessário, use pinças para afastar suavemente algum tecido sobreposto.
- Retire o restante do meio e aguarde ~10 s.
- Pipetar o meio para trás. Adicione uma ou duas gotas do meio junto ao explante e o resto do meio a alguma distância do explante para evitar que o explante se desprenda.
NOTA: Mesmo que os explantes estejam aderidos às câmaras, o meio deve ser sempre adicionado primeiro, pipetando-se uma a duas gotas junto aos explantes. Desta forma, os explantes não serão levantados quando a mídia completa restante for adicionada. - Retorne a câmara para a incubadora e incube por 2 h para permitir que os órgãos se fixem firmemente ao fundo da câmara.
- Retire o meio e adicione cuidadosamente 300 μL de meio completo pré-aquecido fresco usando uma pipeta de 100 μL ou 200 μL. Não utilize uma pipeta de 1 ml.
NOTA: Se um pré-tratamento for desejado, após 2 h de fixação, adicionar 300 μL de meio completo contendo a substância de interesse. Se for usada uma câmara de 4 poços, use até 500 μL/poço. - Devolva as câmaras à incubadora.
5. Teste de agentes ototóxicos
- Deixe os explantes durante a noite para se adaptar às condições de cultivo e se recuperar.
- Preparar diferentes concentrações de agentes ototóxicos para encontrar a concentração adequada para estabelecer um modelo ototóxico com aproximadamente 50% de perda de células ciliadas. Utilizar entre 50 μM e 250 μM para gentamicina e entre 40 μM e 320 μM para cisplatina. Prepare as soluções de cisplatina frescas e proteja-as da luz.
- Retire o meio e adicione cuidadosamente 300 μL do meio contendo a droga ototóxica desejada.
- Incubar os explantes com gentamicina e cisplatina a 37 °C por 24 h a 48 h para determinar a sobrevivência das células ciliadas.
NOTA: As concentrações do medicamento e o tempo de exposição são escolhidos dependendo do objetivo do estudo. A preservação dos explantes foi aqui testada até 72 h. Não use soro se estiver planejando realizar uma cultura de longo prazo. - Siga a próxima seção para manchar as células cocleares.
6. Fixação e imunofluorescência
- Eliminar o meio ao final do experimento e lavar imediatamente os explantes com 200 μL de PBS 1x pré-aquecido.
- Fixar os explantes com 200 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% durante 15 minutos sob um exaustor químico.
CUIDADO: PFA é um produto químico perigoso; leia a ficha de dados de segurança do material (MSDS) antes de trabalhar com a PFA pela primeira vez. - Lavar os explantes duas vezes com 200 μL de 1x PBS. Conservar os explantes em 1x PBS a 4 °C caso os procedimentos de coloração precisem ser adiados.
- Preparar a solução de permeabilização composta por 1x PBS e 1%-5% Triton-X100.
- Descarte o PBS 1x, adicione 200 μL de solução de permeabilização e incube os explantes por 15 min.
- Prepare a solução de bloqueio.
- Para órgão de explantes de Corti, preparar solução de bloqueio consistindo de 1x PBS, 10% de soro de cabra normal (NGS, para anticorpos secundários de cabra, ou outro soro da mesma espécie que os anticorpos secundários). Alternativamente, use 1%-5% de albumina de soro bovino (BSA) se as células forem coradas apenas com faloidina.
- Para explantes cocleares, prepare uma solução de bloqueio composta por 1x PBS, 10% NGS e fragmento Fab (Fab fragment cabra-anti camundongo IgG H+L, diluição 1:200) se usar anticorpos primários de camundongo (por exemplo, anti-TuJ1 de camundongo) para corar as células do gânglio espiral.
- Adicionar 200 μL de solução de bloqueio e incubar os explantes por 1 h.
- Descarte a solução de bloqueio. Aos explantes incubados com fragmento de Fab, adicionar 200 μL de PFA a 4% e incubar por 5 min.
- Lave os explantes com 1x PBS por 5 min.
- Preparar uma solução de anticorpos composta por 1x PBS, 5% NGS e 0,1%-0,25% Triton-X100.
- Diluir o anticorpo primário em solução de anticorpos - MYO7A (ab3481 na diluição de 1:500 ou MYO7A 138-1 em 1:100) - para marcar as células ciliadas e TuJ1 (1:400) para marcar os neurônios do gânglio espiral.
NOTA: Se as células ciliadas forem marcadas apenas com faloidina, diluir a faloidina a 1:150 em 1x PBS, incubar por 40 min a 1 h à temperatura ambiente e prosseguir para o passo 6.22. - Incluir um controle para a ligação inespecífica do anticorpo secundário omitindo o anticorpo primário.
- Adicionar 170 μL da solução de anticorpos com o anticorpo primário ao poço correspondente e incubar durante a noite a 4 °C com agitação suave (40-60 rpm).
- Lave os explantes 4x por 5 min cada com 1x PBS.
- Diluir o anticorpo secundário em solução de anticorpos (por exemplo, Alexa Fluor 488 anticoelho de cabra ou Alexa Fluor 568 IgG anti-rato de cabra numa diluição de 1:500).
- Adicionar 170 μL da solução de anticorpos com o anticorpo secundário e incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
NOTA: A partir desta etapa, proteja os explantes da exposição prolongada à luz. - Lave os explantes 2x por 5 min cada com 1x PBS.
- Prossiga para a próxima etapa para a dupla marcação sequencial dos explantes. Incubar com um segundo anticorpo primário de interesse (por exemplo, MYO7A para células ciliadas) durante a noite a 4 °C com agitação suave (40-60 rpm). Alternativamente, incubar com faloidina (1:150) durante 40 min a 1 h à temperatura ambiente e prosseguir para o passo 6.22.
NOTA: Execute a marcação sequencial se os anticorpos primários forem da mesma espécie hospedeira. Realizar marcação de faloidina no final para imunofluorescência multiplex. - Lave os explantes 4x por 5 min cada com 1x PBS.
- Diluir o anticorpo secundário em solução de anticorpos (por exemplo, Alexa Fluor 488 anticoelho de cabra ou Alexa Fluor 568 IgG anti-rato de cabra numa diluição de 1:500).
- Adicionar 170 μL do anticorpo secundário e incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
- Lave os explantes 2x por 5 min cada com 1x PBS.
- Preparar uma solução-mãe DAPI de 1 mg/ml e conservar a -20 °C. Diluir a solução-mãe DAPI 1:10 para preparar soluções de trabalho de 0,1 mg/ml e conservar a 4 °C.
Observação : ignore a etapa 23 e vá para a etapa 26 se a mídia de montagem que contém DAPI é usada. - Diluir a solução de trabalho DAPI 1:100 em 1x PBS e incubar os explantes com 200 μL de solução DAPI por 5 min.
- Lave os explantes 2x por 5 min cada com 1x PBS.
- Remova o PBS 1x tanto quanto possível para permitir que o fundo da câmara seque. Não deixe o explante secar.
- Aguarde 2-5 s e adicione uma gota de meio de montagem diretamente no explante.
NOTA: O meio de montagem no explante permanecerá no local devido à tensão superficial. O meio de montagem de endurecimento pode ser usado. - Conservar as câmaras a 4°C até à obtenção de imagens.
7. Imunofluorescência de células vivas de explantes
- Utilizar os explantes isolados após incubação noturna.
- Retire o meio e adicione cuidadosamente 300 μL de meio contendo 125 μM de cisplatina.
- Incubar os explantes por 18 h para medir o superóxido mitocondrial nos explantes vivos.
- Descarte o meio no final da exposição à droga.
- Adicionar 300 μL de uma sonda permeável para detectar as ROS celulares (por exemplo, 250 nM de mito-hidroetidina) e/ou Caspase-3 (por exemplo, peptídeo DEVD de 2 μM conjugado a um corante ligante de ácido nucleico).
- Incubar a 37 °C durante 30 min.
- Lavar os explantes duas vezes suavemente com 200 μL de solução salina balanceada de Hank (HBSS) quente ou um tampão apropriado.
- Imagem das células dentro de 2 h com excitação por fluorescência a 400 nm e detecção de emissão a 590 nm.
- Eliminar o meio ao final do experimento e lavar imediatamente os explantes com 200 μL de PBS 1x pré-aquecido.
- Corrigir os explantes e manchar as células cocleares como descrito acima.
8. Visualização por imagem confocal
- Obtenha imagens dos explantes usando um microscópio equipado com uma unidade confocal de disco giratório ou um microscópio confocal equipado com uma unidade confocal de varredura de pontos.
- Adquira as imagens usando um disco giratório com uma objetiva de ar de 20x (abertura numérica: 0,75) para contagem de células. Alternativamente, adquira as imagens usando um microscópio confocal de varredura pontual com objetiva de ar de 40x (abertura numérica: 0,95) ou uma objetiva de óleo de 100x (abertura numérica: 1,45) para visualizar e contar as sinapses ou imagear os estereocílios.
NOTA: Ajuste a intensidade do laser e o tempo de exposição para cada canal para evitar a saturação excessiva e insuficiente das imagens. Aplicar as mesmas configurações a todos os explantes do mesmo experimento. - Configure o microscópio para capturar uma imagem 3D de todo o explante coclear usando uma objetiva de ar de 20x, z-stack e ferramentas de costura automáticas. Use 3 x 3 campos adjacentes com 15% de sobreposição para explantes de camundongos e 4 x 4 campos adjacentes para explantes de ratos a serem costurados.
- Ajuste as imagens usando o software do microscópio ou o software livre de código aberto FIJI8.
NOTA: A deconvolução, uma técnica de processamento de imagens, pode ser aplicada a imagens confocais para melhorar seu contraste e resolução 9-11.
Representative Results
O presente protocolo foi testado na cóclea de camundongos e ratos neonatais. Este trabalho apresenta imagens de explantes de diferentes experimentos. Os explantes do órgão de Corti foram expostos à gentamicina ou cisplatina, e a perda de células ciliadas foi visível. Os explantes do órgão de Corti mantiveram sua estrutura e comprimento total em condições normais e de estresse (Figura 1 e Figura 2). As células ciliadas sobreviventes ao longo de toda a extensão dos explantes de ratos previamente expostos à cisplatina foram detectáveis individualmente (Figura 1). Além da detecção de células ciliadas sobreviventes, também foram detectadas células ciliadas em apoptose (Figura 2). Essa abordagem facilita a visualização e contagem das células sobreviventes, que pode ser realizada por meio de uma abordagem de aprendizado profundo, como descritoanteriormente12. Também foi possível detectar os processos biológicos em células cocleares vivas utilizando sondas apropriadas permeáveis a células (Figura 3).
No caso de explantes cocleares contendo neurônios do gânglio espiral, os explantes podem ser cortados em dois pedaços, ou a região do ápice pode ser cortada para proporcionar melhores condições de cultivo. Aqui optamos por separar a região do ápice, por ser menos afetada em condições de estresse. A Figura 4 mostra as regiões base e medial dos explantes cocleares. Células ciliadas marcadas com o marcador de células ciliadas MYO7A foram detectadas. Da mesma forma, corpos celulares ganglionares espirais saudáveis e danificados e neuritos marcados com o marcador neuronal TuJ1 foram identificados. A análise das regiões do gânglio espiral pode ser realizada manualmente ou utilizando softwares de código aberto como o FIJI com o plugin NeuronJ para traçado de neuritos13 ou extensões como TrackMate e Cellpose para segmentação morfológica14,15. O exame mais detalhado dos explantes de camundongos revelou alta resolução das células cocleares e dos estereocílios das células ciliadas (Figura 5).
Figura 1: Explantes do órgão de Corti de ratos expostos à gentamicina. Imagens representativas (projeção de intensidade máxima) de (A) explantes de controle e (B) expostos à gentamicina (200 μM por 24 h). As células ciliadas são marcadas com faloidina e podem ser visualizadas ao longo de todo o comprimento da cóclea. Para melhor ilustração, a imagem é em tons de cinza. As imagens foram adquiridas utilizando-se microscópio confocal de disco giratório com objetiva de 20x (abertura numérica: 0,75). Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Explantes do órgão de Corti de camundongos expostos à cisplatina. Imagens representativas (projeção de intensidade máxima) de (A) explantes de controle e (B) expostos à cisplatina (160 μM por 48 h). As células ciliadas são marcadas com faloidina (vermelha), e as células ciliadas apoptóticas são marcadas com fluorescina. As imagens foram adquiridas utilizando-se microscópio confocal de varredura pontual e objetiva de 20x (abertura numérica: 0,75). Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Explantes do órgão de Corti de experimentos de imagem ao vivo. Imagens representativas (projeção de intensidade máxima) de explantes de camundongos selvagens mostrando (A) explantes controle e (B) explantes com exposição a cisplatina 125 μM por 18 h. As células ciliadas são marcadas com mito-hidroetidina e caspase-3. As imagens foram adquiridas utilizando-se microscópio confocal de disco giratório e objetiva de 20x (abertura numérica: 0,75). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Explantes cocleares de camundongos knockout STAT1 expostos à cisplatina. Imagens representativas (projeção de intensidade máxima) de (A) explantes controle e (D) explantes expostos a cisplatina 40 μM por 48 h. Os corpos das células ciliadas são marcados com o anticorpo MYO7A (verde), e as células do gânglio espiral com o anticorpo TuJ1 (vermelho) e a marcação nuclear DAPI (azul). As imagens foram adquiridas utilizando-se microscópio confocal de varredura pontual e objetiva de 20x (abertura numérica: 0,75) com zoom adicional de 2,15 (B,C,E,F). Barra de escala = (B,C,E,F) 50 μm e (A,D) 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Órgão de camundongo de explantes de Corti. (A-D) Imagens representativas (projeção de intensidade máxima) de explantes de comprimento total de camundongos selvagens. (A,B) Os explantes foram marcados com o anticorpo MYO7A, faloidina e marcação nuclear DAPI. (B) Na visão ampliada, os corpos celulares das células ciliadas marcadas com o anticorpo MYO7A (verde) são claramente visíveis. (C,D) A faloidina marca os estereocílios e a placa cuticular das células ciliadas. Os explantes foram marcados com faloidina. (D) Na visão ampliada, imagens descomplicadas de estereocílios de células ciliadas internas individuais são bem identificadas (fileira inferior), enquanto estereocílios de células ciliadas externas individuais são mais difíceis de delinear (fileira superior). As imagens dos painéis A e C foram adquiridas com microscópio confocal de disco giratório com objetiva de 20x (abertura numérica: 0,75). A imagem no painel B foi adquirida com o mesmo microscópio, porém com objetiva de ar de 40x (abertura numérica: 0,95). A imagem no painel D foi adquirida com microscópio confocal de varredura por pontos e objetiva de óleo de 100x (abertura numérica: 1,45) com zoom adicional de 3,46. As varreduras foram calculadas em média quatro vezes por corte XY, e o tamanho do pixel foi de 0,02 μm. Barras de escala = (D) 3 μm, (B) 100 μm e (A,C) 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O objetivo da atualização deste protocolo foi agilizar as etapas desde o isolamento dos explantes até a obtenção de imagens das células cocleares vivas e fixas. Aprimoramos algumas etapas durante o isolamento e introduzimos algumas ferramentas inovadoras com o objetivo de estabelecer um protocolo eficiente e de bom funcionamento para a obtenção de explantes de alta qualidade. O método descrito é um protocolo otimizado a partir de relatos anteriores 4,5. Além disso, alguns estudos atuais carecem de um protocolo atualizado passo a passo. Com etapas simplificadas de cultivo de explantes, este protocolo proporciona o fácil manuseio de explantes bem preservados, o que é essencial para dados reprodutíveis. A introdução de câmaras multipoços com lamínula polimérica para explantes da orelha interna melhora a fixação do órgão e a preservação dos explantes intactos. Aqui, apresentamos vários exemplos de experimentos sob condições de estresse para demonstrar que os órgãos em cultura mantêm sua organização celular apesar da perda de células ciliadas e danos aos neuritos.
Um dos desafios na cultura dos órgãos da orelha interna é evitar o descolamento e a flutuação dos órgãos, pois isso afeta a integridade dos explantes, a resposta ao tratamento e os exames subsequentes. Previamente, os explantes foram cultivados em lamínulas de vidro 4,5. Embora a cultura em superfícies de vidro pareça ser uma boa alternativa, o revestimento do vidro é demorado, e as próprias lamínulas são frágeis e delicadas. Um protocolo alternativo usando cultura de células milicelulares insere tentativas de resolver esse problema6. No entanto, cortar e transferir a membrana com os explantes parece ser uma etapa delicada nesse protocolo. Além disso, os explantes podem ser danificados durante a montagem e vedação da lamínula. Em nossa abordagem proposta, uma vez que os explantes são transferidos para as câmaras revestidas de poli-D-lisina e colocados na posição correta, nenhuma transferência adicional ou cobertura com lamínulas é necessária. Outra vantagem deste protocolo é o uso de câmaras com uma fina lamínula polimérica permeável a gás que proporciona condições ideais de cultura para os explantes do órgão. Este polímero tem uma qualidade óptica semelhante ao vidro, tornando-o adequado para imagens celulares em microscopia de alta resolução.
A adição de soro ao meio é utilizada na maioria dos protocolos de cultura de células e tecidos, incluindo o cultivo de explantes da orelha interna com SFB a 1%-10%4,5,6,16. A presença de soro afeta as condições de cultura dos experimentos; Assim, em determinadas situações, a cultura sem soro é preferida. A ausência de soro na cultura dos explantes cocleares foi substituída pela adição de N2 ao DMEM ou pela adição de N2 ao meio Neurobasal-A 5,6. Nesse sentido, foram testadas as condições de cultivo dos explantes com e sem soro. Em ambas as condições, as células da orelha interna foram vitais e responderam às condições ototóxicas. Testamos essas condições por 72 h, mas os explantes podem ser mantidos em cultura por ainda mais tempo, principalmente quando incubados com meio livre de soro juntamente com N2, B27 e fatores de crescimento, como sugerido em outros estudos 5,16.
Além das etapas críticas gerais no isolamento dos explantes da orelha interna, como a duração do isolamento do órgão e o antibiótico utilizado, existem também algumas etapas críticas nesse protocolo, que são, no entanto, manejáveis. Uma das etapas críticas desse método está relacionada ao volume de meio que permanece na câmara após a inserção do órgão. Isso foi otimizado para manter os explantes vivos e presos à superfície inferior. Outra etapa crítica está relacionada ao tempo de incubação necessário para permitir que os explantes se fixem ao fundo da câmara. Tempos de incubação superiores a 2 h com alguns microlitros de meio podem afetar a saúde dos explantes. Tempos de incubação mais curtos, como 1 h, também podem ser utilizados, desde que se tome cuidado para não desprender os explantes. Outro aspecto importante são os resíduos de poli-D-lisina. As etapas de lavagem da poli-D-lisina devem ser rigorosamente seguidas, porque os resíduos do sal de brometo de poli-D-lisina podem ser tóxicos para as células. Após as etapas de lavagem terem sido seguidas com precisão, o revestimento com poli-D-lisina facilita a adesão suave dos explantes às câmaras para que a posição possa ser corrigida antes que eles fiquem firmemente presos ao fundo da câmara.
Uma das limitações deste método é a obtenção de imagens de células usando microscopia vertical. Esta poderia ser uma questão importante para os laboratórios com microscópios invertidos. Lâminas de vidro com câmaras de silicone removíveis podem ser usadas para microscopia vertical e invertida; no entanto, nossas condições de revestimento com poli-D-lisina precisam ser testadas primeiro. Outra limitação é o armazenamento das câmaras, pois as pastilhas não são removíveis, e a altura total de uma câmara com a tampa é de quase 11 mm em comparação com a altura de 1 mm de uma lâmina de microscópio padrão. No entanto, a câmara de 8 poços usa menos espaço do que as placas de 4 poços sugeridas antes de16.
Apresentamos aqui imagens adquiridas com dois microscópios. Enquanto o microscópio confocal de varredura pontual fornece imagens de alta resolução dos tecidos devido à sua fina seção óptica, o microscópio confocal de disco giratório fornece um tempo de imagem mais rápido com boa resolução. Os estereocílios das células ciliadas internas (CCI) e das células ciliadas externas (CCEs) são visualizados por microscopia confocal. Como os estereocílios das CCH são maiores que os das CCEs, elas foram repetidamente e bem visualizadas neste trabalho. Para os estereocílios de CCE, outros microscópios alternativos podem melhorar a visualização, como a microscopia de super-resolução (SRM). As imagens de explante adquiridas com o microscópio de disco giratório são suficientes para a fácil integração da contagem automatizada de células ciliadas usando uma abordagem de aprendizado profundo12. Além disso, o curto tempo de aquisição é importante para experimentos com células e tecidos vivos. Além disso, este protocolo não se limita aos explantes cocleares neonatais. Com algumas otimizações, outros explantes, como órgãos vestibulares ou tecidos embrionários, também podem ser cultivados.
A quantificação in vitro de células cocleares, como células ciliadas e neurônios, é importante para avaliar a viabilidade celular e, consequentemente, o percentual de células danificadas ou perdidas. Investigações de vias de sinalização e funções celulares ajudam a revelar os mecanismos de morte e sobrevivência. Exames de tecidos cocleares embrionários e neonatais são úteis para investigar os estágios de desenvolvimento da cóclea. Portanto, este protocolo ajudará a otimizar estudos in vitro de explantes da orelha interna, por exemplo, para estabelecer modelos ototóxicos, investigar estágios de desenvolvimento, avaliar vias de sinalização e realizar estudos de triagem de drogas.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Animal Facility do Departamento de Biomedicina da Universidade de Basileia por seu apoio no cuidado animal, às Microscopy Core Facilities, bem como ao Serviço de Tecnologia da Informação do Departamento de Biomedicina por sua assistência técnica, e à Swiss National Science Foundation (SNSF) pelo apoio financeiro (bolsa MD-PhD para M.C., Processo nº 323530_191222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
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