Summary
El protocolo actual actualiza los protocolos anteriores e incorpora enfoques relativamente sencillos para el cultivo de explantes cocleares de alta calidad. Esto proporciona una adquisición de datos fiable e imágenes de alta resolución en células vivas y fijas. Este protocolo apoya la tendencia actual de estudiar las células del oído interno.
Abstract
La pérdida de audición no tratada impone costes significativos al sistema sanitario mundial y perjudica la calidad de vida de las personas. La hipoacusia neurosensorial se caracteriza por la pérdida acumulativa e irreversible de células ciliadas sensoriales y nervios auditivos en la cóclea. Los explantes cocleares enteros y vitales son una de las herramientas fundamentales en la investigación auditiva para detectar la pérdida de células ciliadas y caracterizar los mecanismos moleculares de las células del oído interno. Hace muchos años, se desarrolló un protocolo para el aislamiento coclear neonatal y, aunque se ha modificado con el tiempo, todavía tiene potencial de mejora.
En este trabajo se presenta un protocolo optimizado para aislar y cultivar explantes cocleares neonatales enteros en cámaras de cultivo de pocillos múltiples que permite el estudio de las células ciliadas y las células de las neuronas ganglionares espirales a lo largo de toda la cóclea. El protocolo se probó utilizando explantes cocleares de ratones y ratas. Se obtuvieron explantes cocleares sanos para estudiar la interacción entre las células ciliadas, las células de las neuronas ganglionares espirales y las células de soporte circundantes.
Una de las principales ventajas de este método es que simplifica los pasos del cultivo de órganos sin comprometer la calidad de los explantes. Las tres vueltas del órgano de Corti están unidas al fondo de la cámara, lo que facilita los experimentos in vitro y el análisis exhaustivo de los explantes. Proporcionamos algunos ejemplos de imágenes cocleares de diferentes experimentos con explantes vivos y fijos, demostrando que los explantes conservan su estructura a pesar de la exposición a fármacos ototóxicos. Este protocolo optimizado puede ser ampliamente utilizado para el análisis integrador de la cóclea de mamíferos.
Introduction
La mayoría de los casos de pérdida auditiva neurosensorial se deben a la degeneración de las células ciliadas sensoriales, las células nerviosas auditivas y/o las sinapsisauditivas. Este proceso degenerativo en las células sensoriales es progresivo y suele ser irreversible, lo que provoca una pérdida de audición2. Por lo tanto, la información sobre la viabilidad de las células sensoriales y los cambios en las vías de señalización en condiciones de estrés es fundamental para proteger a las células del daño y, por lo tanto, de la pérdida. La investigación de explantes cocleares en cultivo permite la recapitulación del complejo tisular y el mantenimiento de una red célula-célula normal, lo que permite una mejor descripción de los procesos de señalización. Para establecer modelos experimentales de ototoxicidad, se han utilizado con frecuencia el antibiótico gentamicina y el agente quimioterapéutico cisplatino, ya que se sabe que tienen efectos secundarios ototóxicos3.
Los sistemas de cultivo in vitro de explantes cocleares se han desarrollado y modificado a lo largo del tiempo; Sin embargo, en varias publicaciones a menudo falta una descripción del protocolo escalonado para el cultivo de explantes cocleares completos. Uno de los primeros protocolos de video para el cultivo primario del órgano murino de Corti fue publicado por Parker et al., en el que los autores describieron los pasos para el aislamiento del epitelio sensorial, el cultivo en cubreobjetos de vidrio y la electroporación de explantes para experimentos de transfección4. También se publicó previamente otro protocolo con cubreobjetos de vidrio, en el que se consideró la organización de la estructura celular en el oído interno5. Se ha descrito un protocolo alternativo que utiliza la membrana Millicell para el cultivo de explantes de ratón del órgano de Corti y del órgano vestibular6. Estos reportajes en vídeo han contribuido a la mejora del método, pero todavía hay retos que deben resolverse. Con el fin de abordar una serie de cuestiones derivadas del uso de cubreobjetos e insertos de vidrio, el presente protocolo tiene por objeto racionalizar los pasos del cultivo de órganos y el cultivo de órganos de alta calidad para obtener datos fiables. Esto se logra minimizando la manipulación directa del órgano durante los procedimientos experimentales y evitando la transferencia de órganos antes de obtener imágenes de alta resolución de las células vivas y fijas.
El presente protocolo actualiza los sistemas de cultivo in vitro previamente publicados e introduce varias optimizaciones en el aislamiento del órgano de Corti y la transferencia a las cámaras de cultivo, así como la integración de una nueva cámara de portaobjetos para mejorar las condiciones de cultivo y su posterior análisis. Este protocolo optimizado reduce el riesgo de dañar el órgano, lo que puede ocurrir cuando se utilizan cubreobjetos de vidrio durante el cambio de medio o durante la transferencia del órgano desde cubreobjetos o membranas para su posterior análisis 4,5,6. Los cubreobjetos de vidrio tienen un mejor índice reflectante que los de plástico; Sin embargo, son frágiles y pueden romperse más fácilmente. Las cámaras de pocillos múltiples que se utilizan aquí están conectadas a un portaobjetos de microscopio, que son muy adecuadas para el cultivo de órganos y para la obtención de imágenes de alta resolución. La transferencia de los órganos aislados se realiza con una espátula, lo que permite que el órgano se coloque en la orientación correcta y se deslice hacia la cámara, en lugar de aplicar fuerza con una pipeta como se recomendó anteriormente 4,5,6.
Las cámaras multipocillos recubiertas de poli-D-lisina, que deben contener suficiente medio, facilitan la transferencia de órganos y el posicionamiento adecuado de los explantes sin aplicar presión adhesiva y evitando la superposición de órganos, como se mencionó anteriormente6. Además, la superposición accidental de órganos y las estructuras irregulares se resuelven utilizando una pila Z confocal. Este protocolo se ha optimizado para diversas aplicaciones, como explantes de ratones y ratas, explantes del órgano de Corti y la cóclea, cultivo en medios que contienen suero y sin suero, evaluaciones ototóxicas y experimentos generales de respuesta a fármacos. Los explantes cocleares se montan e incuban en cámaras con un fondo de cubreobjetos, lo que facilita la adhesión de los explantes cocleares a las cámaras para un manejo óptimo durante los experimentos in vitro , el posprocesamiento de los explantes y la obtención de imágenes de explantes cocleares vivos y fijos. La visualización de toda la longitud del órgano de Corti y la cuantificación de las células ciliadas se agilizan. Además, las evaluaciones de las células de soporte, las células de las neuronas ganglionares espirales y las neuritas son precisas. Por lo tanto, este protocolo se puede utilizar para un análisis exhaustivo de las células cocleares de mamíferos.
Protocol
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos del Comité de Bienestar Animal del Cantón de Basilea, Suiza. Para los experimentos se utilizaron ratones C57BL/6JR postnatales, ratas Wistar y ratones deficientes en STAT1 (mezcla C57BL/6-129/SvEv)7 de 3 a 5 días de edad y de ambos sexos.
1. Recubrimiento de las cámaras de pocillos múltiples
- Preparar el medio de cultivo completo.
- Para los explantes de órganos de Corti, prepare un medio que contenga el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS) al 10%, 25 mM de HEPES y 30 U/mL de penicilina.
- Para los explantes de órganos de Corti y los explantes cocleares, prepare un medio que contenga DMEM/F12, 1 suplemento de N2, 1 suplemento de B27 menos antioxidantes y 30 U/ml de penicilina.
- Prepare una solución madre de poli-D-lisina añadiendo 10 ml de agua de cultivo celular a 5 mg de poli-D-lisina en una campana laminar. La concentración final de poli-D-lisina es de 0,5 mg/mL.
NOTA: Alicuone la solución madre restante y guárdela a -20 °C.- Prepare las soluciones de trabajo de poli-D-lisina diluyendo la solución madre 1:10 en agua estéril.
- Cubra una cámara de 8 pocillos con 150 μL/pocillo de solución de trabajo de poli-D-lisina e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Si se utiliza una cámara de 4 pocillos, cubra con 300 μL/pocillo de solución de trabajo de poli-D-lisina. - Aspire la solución por vacío o pipeteo.
- Lavar 2 veces con 200 μL de agua estéril y una vez con 200 μL de medio de cultivo completo o DMEM.
- Añadir 150 μL de medio de cultivo completo a cada pocillo.
NOTA: Si se utiliza una cámara de 4 pocillos, agregue 250 μL/pocillo de medio de cultivo completo. - Coloque la cámara en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante al menos 30 minutos antes de colocar un explante.
2. Disección del hueso temporal
- Desinfecte la mesa quirúrgica con etanol al 70% y esterilice todos los instrumentos en un esterilizador de microesferas de vidrio.
- Coloque una placa de Petri estéril de 60 mm en un balde que contenga hielo.
- Vierta unos mililitros de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x y manténgala en hielo.
NOTA: Use 30 U/mL de penicilina en 1x PBS para evitar la contaminación bacteriana. - Coloque una almohadilla estéril en una bandeja estéril y decapite rápidamente al cachorro con unas tijeras de operación. Sumerja el cabezal en etanol al 70% durante 5 segundos, si la contaminación es un evento frecuente.
NOTA: Este protocolo se probó en ratones y ratas de P3 a P5. Los tejidos cocleares son más difíciles de diseccionar en ratones y ratas más viejos, y la supervivencia de los explantes en cultivo es limitada. - Coloque la cabeza del animal sobre una almohadilla estéril. Retira la mandíbula. Levanta la piel y retírala del cráneo.
- Sostenga el cráneo colocando las pinzas en las cavidades orbitarias.
- Corta con cuidado el cráneo a lo largo de la sutura sagital y luego corta en el área de la sutura coronal con una hoja de bisturí afilada sin dañar la cóclea.
NOTA: Evite aplicar demasiada presión y evite los movimientos hacia adelante y hacia atrás con el bisturí, ya que esto puede dañar el hueso coclear y, por lo tanto, el conducto coclear. - Retire con cuidado el cerebro de las dos mitades del cráneo.
- Transfiera las mitades del cráneo a una placa de Petri de 60 mm con el PBS helado preparado en el paso 2.3.
3. Aislamiento de la cóclea
- Localice la cóclea en el hueso temporal bajo el microscopio. Coloque las pinzas en el canal semicircular superior.
- Afloje el tejido circundante entre la cóclea y el hueso temporal con una jeringa de insulina (ratones) o fórceps (ratas).
- Tire con cuidado del hueso temporal para separarlo de la cóclea, manteniendo la cóclea unida al vestíbulo con el hueso temporal. Asegúrese de que la cóclea esté libre del tejido circundante antes de empujar el hueso temporal hacia un lado.
NOTA: Aplicar demasiada fuerza dañará el conducto coclear. - Sostenga la cóclea en una posición fija y use la otra mano para retirar con cuidado la cápsula coclear cartilaginosa. Inserte con cuidado las puntas de las pinzas en la región del ápice o entre las vueltas (visible como una línea blanca) y retire la cápsula pieza por pieza. Exponga el conducto coclear.
- Coloque con cuidado las pinzas debajo de la cóclea y sepárelas del órgano vestibular y del hueso temporal.
- Transfiera la cóclea a un nuevo plato de 60 mm que contenga PBS helado.
- Ajuste el aumento del microscopio para visualizar mejor los explantes.
- Siga los siguientes pasos para el órgano de los explantes de Corti:
- Sostenga el órgano en la base con fórceps. Retire suavemente el conducto coclear agarrándolo con pinzas en la región del gancho basal.
- Desenrolle el conducto coclear del modiolo sin romperlo.
- Retire con cuidado el ligamento espiral con la estría vascular sosteniendo el órgano en la base y tirando de él.
NOTA: La separación de tejidos también se puede lograr sosteniendo la región del ápice en lugar de la región de la base. Esto puede ser útil cuando se diseccionan órganos de ratas o crías de ratón mayores (>P5). - Retire con cuidado la membrana de Reissner sosteniendo el órgano en la base y tirando de él pieza por pieza.
NOTA: Este es un paso opcional ya que la membrana de Reissner no interfiere con la adquisición de las imágenes.
- Siga los siguientes pasos para los explantes cocleares:
- Separe el ganglio espiral de la lámina espiral ósea con una jeringa de insulina (ratones) o fórceps (ratas).
- Desenrolle suavemente el modiolo durante el desprendimiento.
NOTA: Los explantes se pueden dividir en dos piezas para un mejor manejo. - Sujete la región del gancho con fórceps.
- Retire con cuidado el ligamento espiral con la estría vascular tirando de él.
- Retire con cuidado la membrana de Reissner sosteniendo el órgano en la base y tirando de él pieza por pieza.
NOTA: Se recomienda este paso, porque la membrana de Reissner generalmente se pliega y cubre los filamentos de la neurona y, por lo tanto, podría afectar los experimentos.
4. Cultivo de explantes cocleares
- Transfiera los explantes de la placa de Petri a las cámaras de pocillos múltiples. Levante los explantes con las células ciliadas hacia arriba con una espátula de laboratorio. Incluya unos microlitros de 1x PBS para evitar que las muestras se peguen a la espátula.
NOTA: Los explantes severamente dañados se pegarán a la espátula. - Deje que los explantes se deslicen de la espátula hacia la cámara agitando suavemente la espátula en el medio. Coloque un explante por pocillo de un portaobjetos de cámara de 8 pocillos.
NOTA: Si el explante se pega a la espátula, sostenga la espátula en el medio y use las pinzas para separar los explantes. Coloque siempre las pinzas en el borde interno del explante (lejos de las células ciliadas). - Verifique bajo el microscopio que los explantes hayan sido transferidos en la orientación correcta y colocados en el centro de los pocillos.
NOTA: Los explantes mal orientados con células ciliadas hacia abajo tienden a mostrar una forma de U hacia arriba a lo largo de su ancho. Corrija su orientación moviendo los explantes a las esquinas de las cámaras (hay más medio disponible) y diríjalos a girar. - Retire 80 μL del medio con una pipeta de 100 μL y deséchelo.
- Verifique bajo el microscopio si las células ciliadas y las células de la neurona ganglionar espiral son visibles. Si es necesario, use fórceps para separar suavemente algunos tejidos superpuestos.
- Retire el resto del medio y espere ~ 10 s.
- Pipetea la parte media hacia atrás. Agregue una o dos gotas del medio junto al explante y el resto del medio a cierta distancia del explante para evitar que el explante se desprenda.
NOTA: Incluso si los explantes están adheridos a las cámaras, el medio siempre debe agregarse primero pipeteando una o dos gotas junto a los explantes. De esta manera, los explantes no se levantarán cuando se agreguen los medios completos restantes. - Regrese la cámara a la incubadora e incube durante 2 h para permitir que los órganos se adhieran firmemente al fondo de la cámara.
- Retire el medio y agregue con cuidado 300 μL de medio completo fresco precalentado con una pipeta de 100 μL o 200 μL. No utilice una pipeta de 1 ml.
NOTA: Si se desea un pretratamiento, después de 2 h de fijación, añadir 300 μL de medio completo que contenga la sustancia de interés. Si se utiliza una cámara de 4 pocillos, utilice hasta 500 μL/pocillo. - Regrese las cámaras a la incubadora.
5. Ensayo de agentes ototóxicos
- Deje los explantes durante la noche para que se adapten a las condiciones de cultivo y se recuperen.
- Preparar diferentes concentraciones de agentes ototóxicos para encontrar la concentración adecuada para establecer un modelo ototóxico con aproximadamente un 50% de pérdida de células ciliadas. Utilizar entre 50 μM y 250 μM para gentamicina y entre 40 μM y 320 μM para cisplatino. Prepare las soluciones de cisplatino frescas y protéjalas de la luz.
- Retire el medio y agregue con cuidado 300 μL de medio que contenga el fármaco ototóxico deseado.
- Incubar los explantes con gentamicina y cisplatino a 37 °C durante 24 h a 48 h para determinar la supervivencia de las células ciliadas.
NOTA: Las concentraciones del fármaco y el tiempo de exposición se eligen en función del propósito del estudio. La conservación de los explantes se probó aquí hasta 72 h. No use suero si planea realizar un cultivo a largo plazo. - Siga la siguiente sección para teñir las células cocleares.
6. Fijación e inmunofluorescencia
- Deseche el medio al final del experimento e inmediatamente lave los explantes con 200 μL de PBS precalentado 1x.
- Fijar los explantes con 200 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 min bajo una campana de extracción química.
PRECAUCIÓN: El PFA es un producto químico peligroso; lea la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) antes de trabajar con PFA por primera vez. - Lavar los explantes dos veces con 200 μL de 1x PBS. Almacenar los explantes en 1x PBS a 4 °C en caso de que sea necesario posponer los procedimientos de tinción.
- Prepare la solución de permeabilización que consiste en 1x PBS y 1%-5% Triton-X100.
- Deseche el 1x PBS, agregue 200 μL de solución de permeabilización e incube los explantes durante 15 min.
- Prepare la solución de bloqueo.
- Para el órgano de los explantes de Corti, prepare una solución de bloqueo que consista en 1x PBS, suero de cabra normal al 10% (NGS, para anticuerpos secundarios de cabra, u otro suero de la misma especie que los anticuerpos secundarios). Alternativamente, use albúmina sérica bovina (BSA) al 1%-5% si las células se tiñen solo con faloidina.
- En el caso de los explantes cocleares, prepare una solución de bloqueo que consista en 1x PBS, 10 % de NGS y fragmento Fab (Fab fragment goat-anti mouse IgG H+L, dilución 1:200) si se utilizan anticuerpos primarios de ratón (p. ej., anti-TuJ1 de ratón) para teñir las células ganglionares espirales.
- Añadir 200 μL de solución de bloqueo e incubar los explantes durante 1 h.
- Deseche la solución de bloqueo. A los explantes incubados con el fragmento Fab, añadir 200 μL de PFA al 4%, e incubar durante 5 min.
- Lavar los explantes con 1x PBS durante 5 min.
- Prepare una solución de anticuerpos que consista en 1x PBS, 5% de NGS y 0,1%-0,25% de Triton-X100.
- Diluir el anticuerpo primario en una solución de anticuerpos, MYO7A (ab3481 a una dilución de 1:500 o MYO7A 138-1 a 1:100), para etiquetar las células ciliadas y TuJ1 (1:400) para etiquetar las neuronas ganglionares espirales.
NOTA: Si las células ciliadas solo están marcadas con faloidina, diluya la faloidina a 1:150 en 1x PBS, incube durante 40 minutos a 1 hora a temperatura ambiente y continúe con el paso 6.22. - Incluir un control de la unión inespecífica del anticuerpo secundario omitiendo el anticuerpo primario.
- Añadir 170 μL de la solución de anticuerpos con el anticuerpo primario al pocillo correspondiente, e incubar durante la noche a 4 °C con una suave agitación (40-60 rpm).
- Lave los explantes 4 veces durante 5 minutos cada uno con 1 PBS.
- Diluya el anticuerpo secundario en una solución de anticuerpos (p. ej., Alexa Fluor 488 anti-conejo de cabra o Alexa Fluor 568 IgG anti-ratón de cabra a una dilución de 1:500).
- Añadir 170 μL de la solución de anticuerpos con el anticuerpo secundario e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: A partir de este paso, proteja los explantes de la exposición prolongada a la luz. - Lave los explantes 2 veces durante 5 minutos cada uno con 1 PBS.
- Continúe con el siguiente paso para el doble etiquetado secuencial de los explantes. Incubar con un segundo anticuerpo primario de interés (por ejemplo, MYO7A para células ciliadas) durante la noche a 4 °C con una agitación suave (40-60 rpm). Alternativamente, incubar con faloidina (1:150) durante 40 min a 1 h a temperatura ambiente, y continuar con el paso 6.22.
NOTA: Realice el marcaje secuencial si los anticuerpos primarios son de la misma especie huésped. Realice el marcaje de faloidina al final para la inmunofluorescencia multiplex. - Lave los explantes 4 veces durante 5 minutos cada uno con 1 PBS.
- Diluya el anticuerpo secundario en una solución de anticuerpos (p. ej., Alexa Fluor 488 anti-conejo de cabra o Alexa Fluor 568 IgG anti-ratón de cabra a una dilución de 1:500).
- Añadir 170 μL del anticuerpo secundario e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave los explantes 2 veces durante 5 minutos cada uno con 1 PBS.
- Preparar una solución madre DAPI de 1 mg/ml y conservar a -20 °C. Diluir la solución madre DAPI 1:10 para preparar soluciones de trabajo de 0,1 mg/ml y almacenar a 4 °C.
NOTA: Omita el paso 23 y vaya al paso 26 si se utiliza el medio de montaje que contiene DAPI. - Diluir la solución de trabajo DAPI 1:100 en 1x PBS, e incubar los explantes con 200 μL de solución DAPI durante 5 min.
- Lave los explantes 2 veces durante 5 minutos cada uno con 1 PBS.
- Retire el 1x PBS tanto como sea posible para permitir que el fondo de la cámara se seque. No dejes que el explante se seque.
- Espere de 2 a 5 segundos y agregue una gota de medio de montaje directamente sobre el explante.
NOTA: El medio de montaje en el explante permanecerá en su lugar debido a la tensión superficial. Se puede utilizar un medio de montaje de endurecimiento. - Almacene las cámaras a 4 ° C hasta la obtención de imágenes.
7. Inmunofluorescencia de células vivas a partir de explantes
- Utilice los explantes aislados después de la incubación durante la noche.
- Retire el medio y agregue con cuidado 300 μL de medio que contenga 125 μM de cisplatino.
- Incubar los explantes durante 18 h para medir el superóxido mitocondrial en los explantes vivos.
- Deseche el medio al final de la exposición al medicamento.
- Agregue 300 μL de una sonda permeable para detectar las ROS celulares (p. ej., 250 nM de mitohidroetidina) y/o Caspasa-3 (p. ej., 2 μM de péptido DEVD conjugado con un colorante de unión a ácidos nucleicos).
- Incubar a 37 °C durante 30 min.
- Lavar los explantes dos veces suavemente con 200 μL de solución salina balanceada de Hank tibia (HBSS) o un tampón adecuado.
- Obtenga imágenes de las células en 2 h con excitación de fluorescencia a 400 nm y detección de emisiones a 590 nm.
- Deseche el medio al final del experimento e inmediatamente lave los explantes con 200 μL de PBS precalentado 1x.
- Fije los explantes y tiña las células cocleares como se ha descrito anteriormente.
8. Visualización por imagen confocal
- Tome imágenes de los explantes utilizando un microscopio equipado con una unidad confocal de disco giratorio o un microscopio confocal equipado con una unidad confocal de barrido puntual.
- Adquiera las imágenes utilizando un disco giratorio con un objetivo de aire de 20x (apertura numérica: 0,75) para el recuento de células. Alternativamente, adquiera las imágenes utilizando un microscopio confocal de barrido puntual con un objetivo de aire de 40x (apertura numérica: 0,95) o un objetivo de aceite de 100x (apertura numérica: 1,45) para visualizar y contar las sinapsis o obtener imágenes de los estereocilios.
NOTA: Ajuste la intensidad del láser y el tiempo de exposición para cada canal para evitar la sobresaturación o la subsaturación de las imágenes. Aplique la misma configuración a todos los explantes del mismo experimento. - Configure el microscopio para capturar una imagen en 3D de todo el explante coclear utilizando un objetivo de aire de 20x, una pila en Z y herramientas de costura automáticas. Utilice campos adyacentes de 3 x 3 con un 15% de superposición para los explantes de ratón y 4 x 4 campos adyacentes para los explantes de ratas que se van a coser.
- Ajuste las imágenes utilizando el software del microscopio o el software gratuito de código abierto FIJI8.
NOTA: La deconvolución, una técnica de procesamiento de imágenes, se puede aplicar a imágenes confocales para agudizar su contraste y resolución 9-11.
Representative Results
El presente protocolo ha sido probado en la cóclea de ratones y ratas neonatos. En este trabajo se presentan imágenes de explantes de diferentes experimentos. Los explantes del órgano de Corti fueron expuestos a gentamicina o cisplatino, y la pérdida de células ciliadas fue visible. Los explantes del órgano de Corti mantuvieron su estructura y longitud total tanto en condiciones normales como de estrés (Figura 1 y Figura 2). Las células ciliadas supervivientes a lo largo de toda la longitud de los explantes de rata previamente expuestos al cisplatino fueron detectables individualmente (Figura 1). Además de la detección de células ciliadas supervivientes, también se detectaron células ciliadas en apoptosis (Figura 2). Este enfoque facilita la visualización y el recuento de las células supervivientes, lo que puede realizarse utilizando un enfoque de aprendizaje profundo, como se ha descrito anteriormente12. También fue posible detectar los procesos biológicos en células cocleares vivas utilizando sondas permeables a las células apropiadas (Figura 3).
En el caso de los explantes cocleares que contienen neuronas ganglionares espirales, los explantes se pueden cortar en dos pedazos, o se puede cortar la región del ápice para proporcionar mejores condiciones de cultivo. Aquí elegimos separar la región del ápice, porque se ve menos afectada en condiciones de estrés. La figura 4 muestra las regiones base y medial de los explantes cocleares. Se detectaron células ciliadas marcadas con el marcador de células ciliadas MYO7A. Del mismo modo, se identificaron cuerpos de células ganglionares espirales sanos y dañados y neuritas marcadas con el marcador neuronal TuJ1. El análisis de las regiones ganglionares espirales se puede realizar manualmente o utilizando software de código abierto como FIJI con el plugin NeuronJ para el trazado de neuritas13 o extensiones como TrackMate y Cellpose para la segmentación morfológica14,15. El examen más detallado de los explantes de ratón reveló la alta resolución de las células cocleares y los estereocilios de las células ciliadas (Figura 5).
Figura 1: Explantes del órgano de Corti de ratas expuestas a gentamicina. Imágenes representativas (proyección de máxima intensidad) de (A) explantes control y (B) expuestos a gentamicina (200 μM durante 24 h). Las células ciliadas están marcadas con faloidina y se pueden visualizar a lo largo de toda la cóclea. Para una mejor ilustración, la imagen está en tonos grises. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con un objetivo de 20x (apertura numérica: 0,75). Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Explantes del órgano de Corti de ratones expuestos al cisplatino. Imágenes representativas (proyección de máxima intensidad) de (A) explantes control y (B) expuestos al cisplatino (160 μM durante 48 h). Las células ciliadas están marcadas con faloidina (rojo) y las células ciliadas apoptóticas están marcadas con fluorescina. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal de barrido puntual y un objetivo de 20x (apertura numérica: 0,75). Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Explantes del órgano de Corti a partir de experimentos de imagen en vivo. Imágenes representativas (proyección de máxima intensidad) de explantes de ratones silvestres que muestren (A) explantes control y (B) explantes con exposición a 125 μM de cisplatino durante 18 h. Las células ciliadas están marcadas con mito-hidroetidina y caspasa-3. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio y un objetivo de 20x (apertura numérica: 0,75). Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Explantes cocleares de ratones knockout STAT1 expuestos al cisplatino. Imágenes representativas (proyección de máxima intensidad) de (A) explantes control y (D) explantes expuestos a 40 μM de cisplatino durante 48 h. Los cuerpos de las células ciliadas están marcados con el anticuerpo MYO7A (verde) y las células ganglionares espirales con el anticuerpo TuJ1 (rojo) y el marcado nuclear DAPI (azul). Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal de barrido puntual y un objetivo de 20x (apertura numérica: 0,75) con un zoom adicional de 2,15 (B, C, E, F). Barra de escala = (B,C,E,F) 50 μm y (A,D) 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Órgano de ratón de explantes de Corti. (A-D) Imágenes representativas (proyección de máxima intensidad) de explantes de cuerpo entero de ratones de tipo salvaje. (A,B) Los explantes se marcaron con el anticuerpo MYO7A, la faloidina y el marcado nuclear DAPI. (B) En la descripción ampliada, los cuerpos celulares de las células ciliadas marcadas con el anticuerpo MYO7A (verde) son claramente visibles. (C,D) La faloidina marca los estereocilios y la placa cuticular de las células ciliadas. Los explantes fueron marcados con faloidina. (D) En la descripción general, las imágenes deconvoneadas de los estereocilios individuales de las células ciliadas internas están bien identificadas (fila inferior), mientras que los estereocilios individuales de las células ciliadas externas son más difíciles de delinear (fila superior). Las imágenes de los paneles A y C se adquirieron con un microscopio confocal de disco giratorio con un objetivo de 20x (apertura numérica: 0,75). La imagen del panel B fue adquirida con el mismo microscopio pero con un objetivo de aire de 40x (apertura numérica: 0,95). La imagen del panel D se adquirió con un microscopio confocal de barrido puntual y un objetivo de aceite de 100x (apertura numérica: 1,45) con un zoom adicional de 3,46. Los escaneos se promediaron cuatro veces por sección XY y el tamaño de píxel fue de 0,02 μm. Barras de escala = (D) 3 μm, (B) 100 μm y (A,C) 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El propósito de la actualización de este protocolo fue agilizar los pasos desde el aislamiento de los explantes hasta la obtención de imágenes de las células cocleares vivas y fijas. Mejoramos algunos pasos durante el aislamiento e introdujimos algunas herramientas innovadoras con el objetivo de establecer un protocolo eficiente y fluido para obtener explantes de alta calidad. El método descrito es un protocolo optimizado de informes anteriores 4,5. Además, algunos estudios actuales carecen de un protocolo actualizado paso a paso. Con pasos simplificados de cultivo de explantes, este protocolo proporciona un fácil manejo de explantes bien conservados, lo cual es esencial para obtener datos reproducibles. La introducción de cámaras multipocillos con un cubreobjetos de polímero para los explantes del oído interno mejora la unión de los órganos y la preservación de los explantes intactos. Aquí, presentamos varios ejemplos de experimentos en condiciones de estrés para demostrar que los órganos en cultivo mantienen su organización celular a pesar de la pérdida de células ciliadas y el daño a las neuritas.
Uno de los retos en el cultivo de los órganos del oído interno es evitar el desprendimiento y la flotación de los órganos, ya que esto afecta a la integridad de los explantes, a la respuesta al tratamiento y a los exámenes posteriores. Anteriormente, los explantes se cultivaban en cubreobjetos de vidrio 4,5. Aunque el cultivo en superficies de vidrio parece ser una buena alternativa, el recubrimiento del vidrio lleva mucho tiempo y los cubreobjetos en sí son frágiles y delicados. Un protocolo alternativo que utiliza insertos de cultivo celular Millicell intenta resolver este problema6. Sin embargo, cortar y transferir la membrana con los explantes parece ser un paso delicado en ese protocolo. Además, los explantes pueden dañarse durante el montaje y sellado del cubreobjetos. En nuestro enfoque propuesto, una vez que los explantes se transfieren a las cámaras recubiertas de poli-D-lisina y se colocan en la posición correcta, no se requiere más transferencia ni recubrimiento con cubreobjetos. Otra ventaja de este protocolo es el uso de cámaras con un cubreobjetos de polímero fino permeable al gas que proporciona condiciones óptimas de cultivo para los explantes de órganos. Este polímero tiene una calidad óptica similar al vidrio, lo que lo hace adecuado para la obtención de imágenes celulares en microscopía de alta resolución.
La adición de suero al medio se utiliza en la mayoría de los protocolos para el cultivo de células y tejidos, incluido el cultivo de explantes del oído interno con 1%-10% de FBS 4,5,6,16. La presencia de suero afecta las condiciones de cultivo de los experimentos; Por lo tanto, en ciertas situaciones, se prefiere el cultivo sin suero. La ausencia de suero en el cultivo de explantes cocleares fue reemplazada por la adición de N2 al DMEM o por la adición de N2 al medio Neurobasal-A 5,6. En este sentido, se probaron las condiciones de cultivo de los explantes con y sin suero. En ambas condiciones, las células del oído interno fueron vitales y respondieron a condiciones ototóxicas. Probamos estas condiciones durante 72 h, pero los explantes pueden mantenerse en cultivo por más tiempo, especialmente cuando se incuban con medio libre de suero junto con N2, B27 y factores de crecimiento, como se sugiere en otros estudios 5,16.
Además de los pasos críticos generales en el aislamiento de los explantes del oído interno, como la duración del aislamiento del órgano y el antibiótico utilizado, también hay algunos pasos críticos en este protocolo, que, sin embargo, son manejables. Uno de los pasos críticos en este método está relacionado con el volumen de medio que permanece en la cámara después de insertar el órgano. Esto se ha optimizado para mantener los explantes vivos y adheridos a la superficie inferior. Otro paso crítico está relacionado con el tiempo de incubación requerido para permitir que los explantes se adhieran al fondo de la cámara. Los tiempos de incubación superiores a 2 h con unos pocos microlitros de medio podrían afectar a la salud de los explantes. También se pueden utilizar tiempos de incubación más cortos, como 1 h, siempre que se tenga cuidado de no desprender los explantes. Otro aspecto importante son los residuos de poli-D-lisina. Los pasos de lavado de la poli-D-lisina deben seguirse estrictamente, porque los residuos de la sal de bromuro de la poli-D-lisina pueden ser tóxicos para las células. Después de que los pasos de lavado se hayan seguido con precisión, el recubrimiento con poli-D-lisina facilita la adhesión suave de los explantes a las cámaras para que la posición pueda corregirse antes de que se adhieran firmemente al fondo de la cámara.
Una de las limitaciones de este método es la obtención de imágenes de las células mediante microscopía vertical. Esto podría ser un problema importante para aquellos laboratorios con microscopios invertidos. Los portaobjetos de vidrio con cámaras de silicona extraíbles se pueden utilizar para microscopía vertical e invertida; sin embargo, nuestras condiciones de recubrimiento con poli-D-lisina deben probarse primero. Otra limitación es el almacenamiento de las cámaras, ya que los insertos no son extraíbles y la altura total de una cámara con tapa es de casi 11 mm en comparación con la altura de 1 mm de un portaobjetos de microscopio estándar. Sin embargo, la cámara de 8 pocillos utiliza menos espacio que las placas de 4 pocillos sugeridas antes de16.
Presentamos aquí imágenes adquiridas con dos microscopios. Mientras que el microscopio confocal de barrido puntual proporciona imágenes de alta resolución de los tejidos debido a su delgada sección óptica, el microscopio confocal de disco giratorio proporciona un tiempo de obtención de imágenes más rápido con buena resolución. Los estereocilios de las células ciliadas internas (IHC) y las células ciliadas externas (OHC) se visualizan mediante microscopía confocal. Dado que los estereocilios de las IHC son mayores que los de las OHC, se visualizaron repetidamente y bien en este trabajo. En el caso de los estereocilios OHC, otros microscopios alternativos pueden mejorar la visualización, como la microscopía de superresolución (SRM). Las imágenes de explante adquiridas con el microscopio de disco giratorio son suficientes para la fácil integración del recuento automatizado de células ciliadas utilizando un enfoque de aprendizaje profundo12. Además, el corto tiempo de adquisición es importante para los experimentos con células y tejidos vivos. Además, este protocolo no se limita a los explantes cocleares neonatales. Con algunas optimizaciones, también se pueden cultivar otros explantes como órganos vestibulares o tejidos embrionarios.
La cuantificación in vitro de las células cocleares, como las células ciliadas y las neuronas, es importante para evaluar la viabilidad celular y, por tanto, el porcentaje de células dañadas o perdidas. Las investigaciones de las vías de señalización y las funciones celulares ayudan a revelar los mecanismos de muerte y supervivencia. Los exámenes de los tejidos cocleares embrionarios y neonatales son útiles para investigar las etapas de desarrollo de la cóclea. Por lo tanto, este protocolo ayudará a optimizar los estudios in vitro de explantes del oído interno, por ejemplo, para establecer modelos ototóxicos, investigar etapas de desarrollo, evaluar vías de señalización y realizar estudios de cribado de fármacos.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al Animalario del Departamento de Biomedicina de la Universidad de Basilea por su apoyo en el cuidado de los animales, a las Instalaciones Centrales de Microscopía, así como al Servicio de Tecnología de la Información del Departamento de Biomedicina por su asistencia técnica, y a la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNSF) por su apoyo financiero (beca MD-PhD a M.C., Número de subvención 323530_191222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
- Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
- Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
- Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
- MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
- Sibarita, J. B.
- Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).
