Summary
يقوم البروتوكول الحالي بتحديث البروتوكولات السابقة ويتضمن مناهج مباشرة نسبيا لزراعة نباتات القوقعة عالية الجودة. يوفر هذا الحصول على بيانات موثوقة وتصويرا عالي الدقة في الخلايا الحية والثابتة. يدعم هذا البروتوكول الاتجاه المستمر لدراسة خلايا الأذن الداخلية.
Abstract
يفرض فقدان السمع غير المعالج تكاليف كبيرة على نظام الرعاية الصحية العالمي ويضعف نوعية حياة الأفراد. يتميز فقدان السمع الحسي العصبي بفقدان تراكمي لا رجعة فيه لخلايا الشعر الحسية والأعصاب السمعية في قوقعة الأذن. تعد نباتات القوقعة الكاملة والحيوية إحدى الأدوات الأساسية في أبحاث السمع للكشف عن فقدان خلايا الشعر وتوصيف الآليات الجزيئية لخلايا الأذن الداخلية. منذ سنوات عديدة، تم تطوير بروتوكول لعزل قوقعة الأذن لحديثي الولادة، وعلى الرغم من أنه تم تعديله بمرور الوقت، إلا أنه لا يزال يحمل إمكانية التحسن.
يقدم هذا البحث بروتوكولا محسنا لعزل وزراعة نباتات القوقعة الصناعية الكاملة لحديثي الولادة في غرف زراعة متعددة الآبار تمكن من دراسة خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية على طول القوقعة بالكامل. تم اختبار البروتوكول باستخدام نباتات القوقعة من الفئران والجرذان. تم الحصول على نباتات قوقعة صحية لدراسة التفاعل بين خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية والخلايا الداعمة المحيطة.
واحدة من المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تبسط خطوات زراعة الأعضاء دون المساس بجودة النباتات. يتم إرفاق جميع المنعطفات الثلاثة لعضو كورتي بأسفل الغرفة ، مما يسهل التجارب في المختبر والتحليل الشامل للنباتات. نقدم بعض الأمثلة على صور القوقعة من تجارب مختلفة مع النباتات الحية والثابتة، مما يدل على أن النباتات تحتفظ ببنيتها على الرغم من التعرض للعقاقير السامة للأذن. يمكن استخدام هذا البروتوكول الأمثل على نطاق واسع للتحليل التكاملي لقوقعة الثدييات.
Introduction
ترجع معظم حالات فقدان السمع الحسي العصبي إلى تنكس خلايا الشعر الحسية والخلايا العصبية السمعية و / أو نقاط الاشتباك العصبي السمعي1. هذه العملية التنكسية في الخلايا الحسية تقدمية وعادة لا رجعة فيها ، مما يؤدي إلى فقدان السمع2. لذلك ، فإن المعلومات حول صلاحية الخلايا الحسية والتغيرات في مسارات الإشارات في ظل ظروف الإجهاد أمر محوري لحماية الخلايا من التلف ، وبالتالي الخسارة. يسمح التحقيق في زراعة قوقعة الأذن في المستنبتة بإعادة تلخيص مجمع الأنسجة والحفاظ على شبكة خلايا خلوية طبيعية ، مما يتيح وصفا أفضل لعمليات الإشارة. لإنشاء نماذج تجريبية للسمية الأذنية ، غالبا ما يتم استخدام الجنتاميسين المضاد الحيوي وعامل العلاج الكيميائي سيسبلاتين ، لأنه من المعروف أن لهما آثارا جانبية سامة للأذن3.
تم تطوير وتعديل أنظمة الاستزراع في المختبر لنباتات القوقعة بمرور الوقت. ومع ذلك، غالبا ما يكون وصف البروتوكول التدريجي لاستزراع نباتات القوقعة بأكملها مفقودا في العديد من المنشورات. تم نشر أحد بروتوكولات الفيديو الأولى للثقافة الأولية لعضو الفئران في كورتي بواسطة Parker et al. ، حيث وصف المؤلفون خطوات عزل الظهارة الحسية ، والزراعة على أغطية زجاجية ، والتثقيب الكهربائي للنباتات لتجارب النقل4. كما تم نشر بروتوكول آخر باستخدام قسائم الغطاء الزجاجي سابقا ، حيث تم اعتبار تنظيم البنية الخلوية في الأذن الداخلية5. تم الإبلاغ عن بروتوكول بديل باستخدام غشاء Millicell لثقافة نباتات الفئران في عضو Corti والعضو الدهليزي6. ساهمت تقارير الفيديو هذه في تحسين الطريقة ، ولكن لا تزال هناك تحديات تحتاج إلى حل. لمعالجة عدد من القضايا الناشئة عن استخدام أغطية زجاجية وإدخالات ، يهدف هذا البروتوكول إلى تبسيط خطوات زراعة الأعضاء وزراعة الأعضاء عالية الجودة للحصول على بيانات موثوقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تقليل التعامل المباشر مع العضو أثناء الإجراءات التجريبية وتجنب نقل الأعضاء قبل الحصول على صور عالية الدقة للخلايا الحية والثابتة.
يقوم البروتوكول الحالي بتحديث أنظمة الاستزراع المختبري المنشورة سابقا ويقدم العديد من التحسينات في عزل جهاز Corti ونقله إلى غرف الثقافة ، بالإضافة إلى دمج غرفة منزلقة جديدة لتحسين ظروف الثقافة والمزيد من التحليل. يقلل هذا البروتوكول الأمثل من خطر إتلاف العضو ، والذي يمكن أن يحدث عند استخدام أغطية زجاجية أثناء التغيير المتوسط أو أثناء نقل العضو من أغطية أو أغشية لمزيد من التحليل4،5،6. تحتوي أغطية الغطاء الزجاجي على مؤشر عاكس أفضل من تلك البلاستيكية ؛ ومع ذلك ، فهي هشة ويمكن أن تنكسر بسهولة أكبر. الغرف متعددة الآبار المستخدمة هنا متصلة بشريحة مجهرية ، وهي مناسبة تماما لزراعة الأعضاء والتصوير عالي الدقة. يتم نقل الأعضاء المعزولة باستخدام ملعقة ، مما يسمح بإحضار العضو في الاتجاه الصحيح والانزلاق إلى الغرفة ، بدلا من استخدام القوة باستخدام ماصة كما هو موصى به سابقا4،5،6.
تسهل الغرف متعددة الآبار المطلية ب poly-D-lysine ، والتي يجب أن تحتوي على وسيط كاف ، نقل الأعضاء وتحديد المواقع المناسبة للنباتات الخارجية دون ممارسة ضغط لاصق مع تجنب تداخل الأعضاء ، كما ذكرنا سابقا6. بالإضافة إلى ذلك ، يتم حل الهياكل المتداخلة وغير المستوية للأعضاء العرضية باستخدام مكدس Z متحد البؤر. تم تحسين هذا البروتوكول لتطبيقات مختلفة ، مثل نباتات الفئران والفئران ، وزراعة أعضاء كورتي والقوقعة ، والزراعة في وسط يحتوي على المصل وخالي من المصل ، والتقييمات السامة للأذن ، وتجارب الاستجابة العامة للأدوية. يتم تركيب نباتات القوقعة الصناعية وحضنها في غرف ذات قاع غطاء، مما يسهل التصاق نباتات القوقعة بالغرف من أجل المعالجة المثلى أثناء التجارب في المختبر ، والمعالجة اللاحقة للنباتات، وتصوير نباتات القوقعة الحية والثابتة. يتم تبسيط تصور كامل طول عضو كورتي وقياس خلايا الشعر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تقييمات الخلايا الداعمة والخلايا العصبية العقدية الحلزونية والخلايا العصبية دقيقة. لذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء تحليل شامل لخلايا قوقعة الثدييات.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الصادرة عن لجنة رعاية الحيوان في كانتون بازل سيتي ، سويسرا. تم استخدام الفئران C57BL / 6JR بعد الولادة ، وفئران Wistar ، والفئران التي تعاني من نقص STAT1 (C57BL / 6-129 / SvEv المختلط) 7 الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أيام ومن أي من الجنسين في التجارب.
1. طلاء الغرف متعددة الآبار
- إعداد وسط ثقافة كامل.
- بالنسبة لأعضاء نباتات كورتي ، قم بإعداد وسط يحتوي على وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، ومصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، و 25 mM HEPES ، و 30 U / mL من البنسلين.
- بالنسبة لأعضاء نباتات كورتي ونباتات القوقعة ، قم بإعداد وسيط يحتوي على DMEM / F12 ، ومكمل 1x N2 ، و 1x B27 ناقص مضادات الأكسدة ، و 30 U / mL من البنسلين.
- تحضير محلول مخزون من poly-D-lysine عن طريق إضافة 10 مل من ماء زراعة الخلايا إلى 5 ملغ من poly-D-lysine في غطاء رقائقي. التركيز النهائي لبولي-د-ليسين هو 0.5 ملغم / مل.
ملاحظة: قم بقسمة محلول المخزون المتبقي ، وقم بتخزينه في -20 درجة مئوية.- تحضير حلول العمل من بولي D-ليسين عن طريق تخفيف محلول الأسهم 1:10 في الماء المعقم.
- قم بتغطية غرفة ذات 8 آبار ب 150 ميكرولتر / بئر من محلول عمل بولي-D-lysine ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: إذا تم استخدام غرفة ذات 4 آبار ، فقم بتغطيتها ب 300 ميكرولتر / بئر من محلول عمل poly-D-lysine. - نضح الحل عن طريق الفراغ أو الماصة.
- اغسل 2x ب 200 ميكرولتر من الماء المعقم ومرة واحدة ب 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل أو DMEM.
- أضف 150 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل لكل بئر.
ملاحظة: إذا تم استخدام غرفة ذات 4 آبار ، أضف 250 ميكرولتر / بئر من وسط الاستزراع الكامل. - ضع الحجرة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل وضع الزرع.
2. تشريح العظم الصدغي
- تطهير الطاولة الجراحية مع 70 ٪ من الإيثانول ، وتعقيم جميع الأدوات في معقم المجهرية الزجاجية.
- ضع طبق بتري معقم 60 مم على دلو يحتوي على ثلج.
- صب بضعة ملليلتر من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، واحتفظ به على الجليد.
ملاحظة: استخدم 30 وحدة / مل من البنسلين في 1x PBS لتجنب التلوث البكتيري. - ضع وسادة معقمة على صينية معقمة وقطع رأس الجرو بسرعة بمقص التشغيل. اغمر الرأس في 70٪ إيثانول لمدة 5 ثوان ، إذا كان التلوث حدثا متكررا.
ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول للفئران والجرذان الذين تتراوح أعمارهم بين P3-P5. يصعب تشريح أنسجة القوقعة من الفئران والجرذان الأكبر سنا ، كما أن بقاء النباتات في الثقافة محدود. - ضع رأس الحيوان على وسادة معقمة. إزالة الفك السفلي. ارفع الجلد وقشره مرة أخرى من الجمجمة.
- امسك الجمجمة عن طريق وضع الملقط في التجاويف المدارية.
- قطع بعناية الجمجمة على طول خياطة السهمي ، ثم قطع في منطقة خياطة الإكليل بشفرة مشرط حاد دون الإضرار بقوقعة الأذن.
ملاحظة: تجنب الضغط أكثر من اللازم، وتجنب الحركات الأمامية والخلفية باستخدام المشرط، لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف عظم القوقعة، وبالتالي قناة القوقعة. - إزالة الدماغ بعناية من نصفي الجمجمة.
- انقل نصفي الجمجمة إلى طبق بتري 60 مم باستخدام برنامج تلفزيوني بارد تم إعداده في الخطوة 2.3.
3. عزل القوقعة
- توطين القوقعة في العظم الصدغي تحت المجهر. ضع الملقط في القناة نصف الدائرية العلوية.
- قم بفك الأنسجة المحيطة بين قوقعة الأذن والعظم الصدغي باستخدام حقنة الأنسولين (الفئران) أو ملقط (الجرذان).
- اسحب العظم الصدغي بعناية بعيدا عن قوقعة الأذن ، مع إبقاء القوقعة متصلة بالدهليز مع العظم الصدغي. تأكد من خلو قوقعة الأذن من الأنسجة المحيطة قبل دفع العظم الصدغي جانبا.
ملاحظة: سيؤدي استخدام الكثير من القوة إلى إتلاف قناة القوقعة. - أمسك القوقعة في وضع ثابت، واستخدم اليد الأخرى لإزالة كبسولة القوقعة الغضروفية بعناية. أدخل أطراف الملقط بعناية في منطقة القمة أو بين المنعطفات (مرئية كخط أبيض) ، وقم بإزالة الكبسولة قطعة قطعة. كشف قناة القوقعة.
- ضع الملقط بعناية تحت القوقعة ، وافصله عن العضو الدهليزي والعظم الصدغي.
- انقل القوقعة إلى طبق جديد مقاس 60 مم يحتوي على برنامج تلفزيوني بارد مثلج.
- اضبط تكبير المجهر لتصور النباتات بشكل أفضل.
- اتبع الخطوات التالية لزرع الجهاز من كورتي:
- امسك العضو في القاعدة بالملقط. قم بإزالة قناة القوقعة برفق عن طريق إمساكها بالملقط في منطقة الخطاف القاعدي.
- قم بفك قناة القوقعة من الموديولوس دون تمزيقها.
- قم بإزالة الرباط الحلزوني بعناية باستخدام الأوعية الدموية السطورية عن طريق تثبيت العضو في القاعدة وسحبها بعيدا.
ملاحظة: يمكن أيضا تحقيق فصل الأنسجة عن طريق الاحتفاظ بمنطقة القمة بدلا من المنطقة الأساسية. يمكن أن يكون هذا مفيدا عند تشريح أعضاء الفئران أو صغار الفئران الأكبر سنا (> P5). - قم بإزالة غشاء Reissner بعناية عن طريق إمساك العضو في القاعدة وسحبه قطعة قطعة.
ملاحظة: هذه خطوة اختيارية لأن غشاء رايسنر لا يتداخل مع الحصول على التصوير.
- اتبع الخطوات التالية لنباتات القوقعة الصناعية:
- افصل العقدة الحلزونية عن الصفيحة الحلزونية العظمية باستخدام حقنة الأنسولين (الفئران) أو الملقط (الفئران).
- الاسترخاء بلطف modiolus أثناء انفصال.
ملاحظة: يمكن تقسيم النباتات إلى قطعتين للتعامل معها بشكل أفضل. - فهم منطقة الخطاف بالملقط.
- قم بإزالة الرباط الحلزوني بعناية باستخدام الأوعية الدموية عن طريق سحبها.
- قم بإزالة غشاء Reissner بعناية عن طريق إمساك العضو في القاعدة وسحبه قطعة قطعة.
ملاحظة: يوصى بهذه الخطوة ، لأن غشاء رايسنر عادة ما يطوي ويغطي خيوط الخلايا العصبية ، وبالتالي قد يؤثر على التجارب.
4. ثقافة نباتات القوقعة
- نقل explants من طبق بتري إلى غرف متعددة الآبار. ارفع النباتات مع توجيه خلايا الشعر لأعلى باستخدام ملعقة مختبرية. قم بتضمين بضعة ميكرولترات من 1x PBS لمنع العينات من الالتصاق بالملعقة.
ملاحظة: سوف تلتصق النباتات التالفة بشدة بالملعقة. - اسمح للنباتات بالانزلاق من الملعقة إلى الحجرة عن طريق التلويح بالملعقة برفق في المنتصف. ضع نبتة واحدة لكل بئر من شريحة حجرة مكونة من 8 آبار.
ملاحظة: إذا التصقت الملعقة بالملعقة ، أمسك الملعقة في الوسط ، واستخدم الملقط لفصل النباتات. ضع الملقط دائما على الحدود الداخلية للنبات (بعيدا عن خلايا الشعر). - تحقق تحت المجهر من أن النباتات قد تم نقلها في الاتجاه الصحيح ووضعها في وسط الآبار.
ملاحظة: تميل النباتات الموجهة بشكل غير صحيح مع خلايا الشعر المتجهة لأسفل إلى إظهار شكل U لأعلى على طول عرضها. قم بتصحيح اتجاهها عن طريق تحريك النباتات إلى زوايا الغرف (يتوفر المزيد من الوسط) وتوجيهها للتدوير. - قم بإزالة 80 ميكرولتر من الوسط باستخدام ماصة 100 ميكرولتر ، وتخلص منها.
- تحقق تحت المجهر إذا كانت خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية مرئية. إذا لزم الأمر ، استخدم ملقط لدفع بعض الأنسجة المتداخلة برفق.
- قم بإزالة بقية الوسيط ، وانتظر ~ 10 ثوان.
- ماصة الظهر المتوسطة. أضف قطرة أو قطرتين من الوسط بجوار الزرع وبقية الوسط على مسافة ما بعيدا عن الزرع لمنع الزرع من الانفصال.
ملاحظة: حتى إذا كانت النباتات الخارجية متصلة بالغرف ، فيجب دائما إضافة الوسط أولا عن طريق سحب قطرة أو قطرتين بجوار النباتات. بهذه الطريقة ، لن يتم رفع النباتات عند إضافة الوسائط الكاملة المتبقية. - أعد الغرفة إلى الحاضنة ، واحتضانها لمدة 2 ساعة للسماح للأعضاء بالالتصاق بقوة بأسفل الغرفة.
- قم بإزالة الوسط ، وأضف بعناية 300 ميكرولتر من الوسط الكامل المسخن مسبقا باستخدام ماصة 100 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر. لا تستخدم ماصة 1 مل.
ملاحظة: إذا كانت المعالجة المسبقة مطلوبة ، بعد 2 ساعة من التعلق ، أضف 300 ميكرولتر من الوسط الكامل الذي يحتوي على المادة محل الاهتمام. إذا تم استخدام غرفة ذات 4 آبار ، فاستخدم ما يصل إلى 500 ميكرولتر / بئر. - إعادة الغرف إلى الحاضنة.
5. اختبار العوامل السامة للأذن
- اترك النباتات بين عشية وضحاها للتكيف مع ظروف الاستزراع والتعافي.
- تحضير تركيزات مختلفة من العوامل السامة للأذن للعثور على التركيز المناسب لإنشاء نموذج سام للأذن مع فقدان خلايا الشعر بنسبة 50٪ تقريبا. استخدم بين 50 ميكرومتر و 250 ميكرومتر للجنتاميسين وبين 40 ميكرومتر و 320 ميكرومتر للسيسبلاتين. تحضير حلول سيسبلاتين طازجة ، وحمايتها من الضوء.
- قم بإزالة الوسط ، وأضف بعناية 300 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على الدواء السام للأذن المطلوب.
- احتضان النباتات مع الجنتاميسين والسيسبلاتين عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة إلى 48 ساعة لتحديد بقاء خلايا الشعر.
ملاحظة: يتم اختيار تركيزات الدواء ووقت التعرض اعتمادا على الغرض من الدراسة. تم اختبار الحفاظ على النباتات هنا حتى 72 ساعة. لا تستخدم المصل إذا كنت تخطط لأداء ثقافة طويلة الأجل. - اتبع القسم التالي لتلطيخ خلايا القوقعة.
6. التثبيت والتألق المناعي
- تخلص من الوسط في نهاية التجربة ، واغسل النباتات على الفور ب 200 ميكرولتر من 1x PBS المسخن مسبقا.
- ثبت النباتات الخارجية ب 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) لمدة 15 دقيقة تحت غطاء دخان كيميائي.
تنبيه: PFA مادة كيميائية خطرة. اقرأ ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) قبل العمل مع PFA لأول مرة. - اغسل النباتات الخارجية مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS. قم بتخزين النباتات في 1x PBS عند 4 درجات مئوية في حالة الحاجة إلى تأجيل إجراءات التلطيخ.
- قم بإعداد محلول النفاذية الذي يتكون من 1x PBS و 1٪ -5٪ Triton-X100.
- تخلص من 1x PBS ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول النفاذية ، واحتضن النباتات لمدة 15 دقيقة.
- تحضير حل الحظر.
- بالنسبة لأعضاء نباتات Corti ، قم بإعداد محلول مانع يتكون من 1x PBS ، 10٪ مصل ماعز طبيعي (NGS ، للأجسام المضادة الثانوية للماعز ، أو مصل آخر من نفس النوع مثل الأجسام المضادة الثانوية). بدلا من ذلك ، استخدم 1٪ -5٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) إذا كانت الخلايا ملطخة فقط بالفالويدين.
- بالنسبة لنباتات القوقعة ، قم بإعداد محلول مانع يتكون من 1x PBS و 10٪ NGS وجزء Fab (Fab fragment goat-anti mouse IgG H + L ، التخفيف 1: 200) في حالة استخدام الأجسام المضادة الأولية للفأر (على سبيل المثال ، الفئران المضادة TuJ1) لتلطيخ خلايا العقدة الحلزونية.
- أضف 200 ميكرولتر من محلول الحجب ، واحتضان النباتات لمدة 1 ساعة.
- تجاهل حل الحظر. إلى تلك النباتات المحتضنة بجزء Fab ، أضف 200 ميكرولتر من 4٪ PFA ، واحتضنها لمدة 5 دقائق.
- اغسل النباتات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق.
- قم بإعداد محلول أجسام مضادة يتكون من 1x PBS و 5٪ NGS و 0.1٪ -0.25٪ Triton-X100.
- قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في محلول الأجسام المضادة - MYO7A (ab3481 عند تخفيف 1: 500 أو MYO7A 138-1 في 1: 100) - لتسمية خلايا الشعر و TuJ1 (1: 400) لتسمية الخلايا العصبية العقدية الحلزونية.
ملاحظة: إذا تم تمييز خلايا الشعر بالفالويدين فقط ، فقم بتخفيف القضيب عند 1: 150 في 1x PBS ، واحتضانه لمدة 40 دقيقة إلى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وانتقل إلى الخطوة 6.22. - قم بتضمين عنصر تحكم للارتباط غير المحدد للجسم المضاد الثانوي عن طريق حذف الجسم المضاد الأساسي.
- أضف 170 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة مع الجسم المضاد الأساسي إلى البئر المقابل ، واحتضن طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع اهتزاز لطيف (40-60 دورة في الدقيقة).
- اغسل النباتات 4x لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
- قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي في محلول الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 488 أو الماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 568 IgG بتخفيف 1: 500).
- أضف 170 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة مع الجسم المضاد الثانوي ، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، قم بحماية النباتات من التعرض للضوء لفترات طويلة. - اغسل النباتات 2x لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
- انتقل إلى الخطوة التالية لوضع العلامات المزدوجة المتسلسلة للنباتات. احتضان مع الجسم المضاد الأساسي الثاني من الفائدة (على سبيل المثال ، MYO7A لخلايا الشعر) طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هز لطيف (40-60 دورة في الدقيقة). بدلا من ذلك ، احتضن مع phalloidin (1: 150) لمدة 40 دقيقة إلى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وانتقل إلى الخطوة 6.22.
ملاحظة: قم بإجراء وضع العلامات المتسلسلة إذا كانت الأجسام المضادة الأولية من نفس النوع المضيف. أداء وضع العلامات phalloidin في نهاية لتألق المناعة متعددة. - اغسل النباتات 4x لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
- قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي في محلول الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 488 أو الماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 568 IgG بتخفيف 1: 500).
- أضف 170 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي ، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل النباتات 2x لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
- قم بإعداد محلول مخزون DAPI من 1 ملغ / مل ، وتخزينها في -20 درجة مئوية. قم بتخفيف محلول مخزون DAPI 1:10 لتحضير محاليل عمل تبلغ 0.1 مجم / مل ، وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: تخطي الخطوة 23 وانتقل إلى الخطوة 26 إذا تم استخدام وسيط التركيب الذي يحتوي على DAPI. - قم بتخفيف محلول عمل DAPI 1: 100 في 1x PBS ، واحتضان النباتات ب 200 ميكرولتر من محلول DAPI لمدة 5 دقائق.
- اغسل النباتات 2x لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام 1x PBS.
- قم بإزالة 1x PBS قدر الإمكان للسماح لقاع الحجرة بالجفاف. لا تدع النبات يجف.
- انتظر لمدة 2-5 ثوان ، وأضف قطرة واحدة من وسيط التركيب مباشرة على المنشأة.
ملاحظة: سيبقى وسيط التثبيت في المصنع في مكانه بسبب التوتر السطحي. يمكن استخدام وسط تركيب تصلب. - قم بتخزين الغرف في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.
7. التألق المناعي للخلايا الحية من النباتات
- استخدم النباتات المعزولة بعد الحضانة طوال الليل.
- قم بإزالة الوسط ، وأضف بعناية 300 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على 125 ميكرومتر سيسبلاتين.
- احتضان النباتات لمدة 18 ساعة لقياس أكسيد الميتوكوندريا الفائق في النباتات الحية.
- تخلص من الوسط في نهاية التعرض للمخدرات.
- أضف 300 ميكرولتر من مسبار نافذ للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية (على سبيل المثال ، 250 نانومتر من ميتو هيدرويثيدين) و / أو Caspase-3 (على سبيل المثال ، 2 ميكرومتر ببتيد DEVD مترافق مع صبغة ربط الحمض النووي).
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- اغسل النباتات مرتين برفق باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن الدافئ من هانك (HBSS) أو محلول مؤقت مناسب.
- تخيل الخلايا في غضون 2 ساعة مع إثارة مضان عند 400 نانومتر وكشف الانبعاثات عند 590 نانومتر.
- تخلص من الوسط في نهاية التجربة ، واغسل النباتات على الفور ب 200 ميكرولتر من 1x PBS المسخن مسبقا.
- إصلاح explants ، وصمة عار خلايا القوقعة كما هو موضح أعلاه.
8. التصور عن طريق التصوير متحد البؤر
- قم بتصوير النباتات باستخدام مجهر مزود بوحدة متحدة البؤر للقرص الدوار أو مجهر متحد البؤر مزود بوحدة متحدة البؤر لمسح النقاط.
- احصل على الصور باستخدام قرص دوار مع هدف هواء 20x (الفتحة العددية: 0.75) لعد الخلايا. بدلا من ذلك ، احصل على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر لمسح النقاط مع هدف هوائي 40x (الفتحة العددية: 0.95) أو هدف زيت 100x (الفتحة العددية: 1.45) لتصور وحساب نقاط الاشتباك العصبي أو تصوير الأهداب المجسمة.
ملاحظة: اضبط شدة الليزر ووقت التعرض لكل قناة لتجنب الإفراط في تشبع الصور ونقصها. قم بتطبيق نفس الإعدادات على جميع النباتات الخاصة بنفس التجربة. - قم بإعداد المجهر لالتقاط صورة 3D لمصنع القوقعة بالكامل باستخدام هدف هواء 20x ، ومكدس z ، وأدوات خياطة أوتوماتيكية. استخدم 3 × 3 حقول متجاورة مع تداخل بنسبة 15٪ لنباتات الفئران وحقول 4 × 4 متجاورة لزرع الفئران ليتم خياطتها معا.
- اضبط الصور باستخدام برنامج المجهر أو برنامج FIJI المجاني مفتوح المصدر8.
ملاحظة: يمكن تطبيق Deconvolution ، وهي تقنية معالجة الصور ، على الصور متحدة البؤر لزيادة تباينها ودقتها 9-11.
Representative Results
تم اختبار البروتوكول الحالي على قوقعة الفئران والجرذان الوليدية. تقدم هذه الورقة صورا لنباتات من تجارب مختلفة. تعرضت نباتات عضو كورتي للجنتاميسين أو سيسبلاتين ، وكان فقدان خلايا الشعر مرئيا. حافظت نباتات عضو كورتي على هيكلها وطولها الإجمالي في ظل الظروف العادية والإجهاد (الشكل 1 والشكل 2). كانت خلايا الشعر الباقية على طول كامل نباتات الفئران التي تعرضت سابقا للسيسبلاتين قابلة للاكتشاف بشكل فردي (الشكل 1). بالإضافة إلى الكشف عن خلايا الشعر الباقية ، تم الكشف أيضا عن خلايا الشعر التي تخضع لموت الخلايا المبرمج (الشكل 2). يسهل هذا النهج تصور الخلايا الباقية وعدها ، والتي يمكن إجراؤها باستخدام نهج التعلم العميق ، كما هو موضح سابقا12. كان من الممكن أيضا اكتشاف العمليات البيولوجية في خلايا القوقعة الحية باستخدام مجسات مناسبة منفذة للخلايا (الشكل 3).
في حالة نباتات القوقعة التي تحتوي على خلايا عصبية عقدية حلزونية ، يمكن تقطيع النباتات إلى قطعتين ، أو يمكن قطع منطقة القمة لتوفير ظروف استزراع أفضل. هنا اخترنا فصل منطقة القمة ، لأنها أقل تأثرا في ظل ظروف الإجهاد. يوضح الشكل 4 المناطق القاعدية والإنسية لنباتات القوقعة الصناعية. تم الكشف عن خلايا الشعر المسمى بعلامة خلايا الشعر MYO7A. وبالمثل ، تم تحديد أجسام خلايا العقدة الحلزونية السليمة والتالفة والخلايا العصبية الموسومة بعلامة الخلايا العصبية TuJ1. يمكن إجراء تحليل مناطق العقدة الحلزونية يدويا أو باستخدام برامج مفتوحة المصدر مثل FIJI مع المكون الإضافي NeuronJ لتتبع الخلايا العصبية13 أو ملحقات مثل TrackMate و Cellpose للتجزئة المورفولوجية14,15. كشف الفحص الدقيق لنباتات الفئران عن الدقة العالية لخلايا القوقعة والأهداب الفراغية لخلايا الشعر (الشكل 5).
الشكل 1: زرع عضو كورتي من الفئران المعرضة للجنتاميسين. صور تمثيلية (إسقاط أقصى شدة) ل (أ) التحكم و (ب) النباتات المعرضة للجنتاميسين (200 ميكرومتر لمدة 24 ساعة). توصف خلايا الشعر بالقضيب ويمكن تصورها على طول القوقعة بالكامل. للحصول على توضيح أفضل ، تكون الصورة بألوان رمادية. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار بهدف 20x (الفتحة العددية: 0.75). شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: زرع عضو كورتي من الفئران المعرضة للسيسبلاتين. صور تمثيلية (إسقاط أقصى كثافة) للتحكم (A) و (B) نباتات معرضة للسيسبلاتين (160 ميكرومتر لمدة 48 ساعة). يتم تمييز خلايا الشعر بالقضيب (الأحمر) ، ويتم تمييز خلايا الشعر المبرمج بالفلوريسين. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر لمسح النقاط وهدف 20x (الفتحة العددية: 0.75). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: زرع عضو كورتي من تجارب التصوير الحي. صور تمثيلية (إسقاط أقصى كثافة) للنباتات من الفئران البرية تظهر (أ) نباتات التحكم و (ب) النباتات مع التعرض ل 125 ميكرومتر سيسبلاتين لمدة 18 ساعة. يتم تمييز خلايا الشعر بميتو هيدرويثيدين وكاسباز -3. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار وهدف 20x (الفتحة العددية: 0.75). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: نباتات القوقعة من الفئران بالضربة القاضية STAT1 المعرضة للسيسبلاتين. صور تمثيلية (إسقاط أقصى كثافة) ل (A) نباتات التحكم و (D) النباتات المعرضة ل 40 ميكرومتر سيسبلاتين لمدة 48 ساعة. يتم تمييز أجسام الخلايا الشعرية بالجسم المضاد MYO7A (الأخضر) ، وخلايا العقدة الحلزونية بالجسم المضاد TuJ1 (الأحمر) ووضع العلامات النووية DAPI (الأزرق). تم التقاط الصور باستخدام مجهر متحد البؤر لمسح النقاط وهدف 20x (الفتحة العددية: 0.75) مع تكبير إضافي 2.15 (B ، C ، E ، F). شريط المقياس = (B ، C ، E ، F) 50 ميكرومتر و (A ، D) 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: عضو الفأر في نباتات كورتي. (A-D) صور تمثيلية (إسقاط أقصى كثافة) للنباتات كاملة الطول من الفئران البرية. (أ، ب) تم تمييز النباتات بالجسم المضاد MYO7A ، والبولويدين ، ووضع العلامات النووية DAPI. (ب) في النظرة العامة المكبرة، تكون أجسام خلايا الخلايا الشعرية المؤشر عليها بالجسم المضاد MYO7A (الأخضر) مرئية بوضوح. (ج، د) يصف Phalloidin الأهداب المجسمة والصفيحة الجلدية لخلايا الشعر. تم تصنيف النباتات الخارجية بالفالويدين. (د) في النظرة العامة المكبرة، يتم تحديد الصور غير الملتوية للأهداب المجسمة لخلايا الشعرة الداخلية الفردية بشكل جيد (الصف السفلي)، في حين يصعب تحديد الأهداب الفراغية لخلايا الشعر الخارجية الفردية (الصف العلوي). تم الحصول على الصور في اللوحتين A و C باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار بهدف 20x (الفتحة العددية: 0.75). تم الحصول على الصورة في اللوحة B بنفس المجهر ولكن بهدف هوائي 40x (الفتحة العددية: 0.95). تم الحصول على الصورة في اللوحة D باستخدام مجهر متحد البؤر لمسح النقاط وهدف زيت 100x (الفتحة العددية: 1.45) مع تكبير إضافي 3.46. تم حساب متوسط عمليات المسح أربع مرات لكل قسم XY ، وكان حجم البكسل 0.02 ميكرومتر. أشرطة المقياس = (D) 3 μm ، (B) 100 μm ، و (A ، C) 200 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Discussion
كان الغرض من تحديث هذا البروتوكول هو تبسيط الخطوات من عزل النباتات إلى تصوير خلايا القوقعة الحية والثابتة. قمنا بتحسين بعض الخطوات أثناء العزل وقدمنا بعض الأدوات المبتكرة بهدف إنشاء بروتوكول فعال وسلس التشغيل للحصول على نباتات عالية الجودة. الطريقة الموصوفة هي بروتوكول محسن من التقارير السابقة 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، تفتقر بعض الدراسات الحالية إلى بروتوكول محدث تدريجيا. من خلال خطوات زراعة الزرع المبسطة ، يوفر هذا البروتوكول سهولة التعامل مع النباتات المحفوظة جيدا ، وهو أمر ضروري للبيانات القابلة للتكرار. إن إدخال غرف متعددة الآبار مع غطاء بوليمر لنباتات الأذن الداخلية يحسن ارتباط العضو والحفاظ على النباتات السليمة. هنا ، نقدم العديد من الأمثلة على التجارب في ظل ظروف الإجهاد لإثبات أن الأعضاء في الثقافة تحافظ على تنظيمها الخلوي على الرغم من فقدان خلايا الشعر وتلف الخلايا العصبية.
أحد التحديات في زراعة أعضاء الأذن الداخلية هو تجنب انفصال الأعضاء وتعويمها ، لأن هذا يؤثر على سلامة النباتات الخارجية ، والاستجابة للعلاج ، والفحوصات اللاحقة. في السابق ، كانت النباتات المزروعة على أغطية زجاجية 4,5. على الرغم من أن الثقافة على الأسطح الزجاجية تبدو بديلا جيدا ، إلا أن طلاء الزجاج يستغرق وقتا طويلا ، كما أن أغطية الغطاء نفسها هشة وحساسة. بروتوكول بديل باستخدام ثقافة خلية ميليسيل يدرج محاولات لحل هذه المشكلة6. ومع ذلك ، يبدو أن قطع الغشاء ونقله مع النباتات الخارجية خطوة حساسة في هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتلف النباتات الخارجية أثناء تركيب وختم غطاء الغطاء. في نهجنا المقترح ، بمجرد نقل النباتات إلى الغرف المطلية ب poly-D-lysine ووضعها في الموضع الصحيح ، لا يلزم إجراء مزيد من النقل أو التغطية بأغطية الغطاء. ميزة أخرى لهذا البروتوكول هي استخدام الغرف ذات غطاء بوليمر رقيق منفذ للغاز يوفر ظروف استزراع مثالية لنباتات الأعضاء. يتميز هذا البوليمر بجودة بصرية مماثلة للزجاج ، مما يجعله مناسبا للتصوير الخلوي في الفحص المجهري عالي الدقة.
تستخدم إضافة المصل إلى الوسط في معظم بروتوكولات زراعة الخلايا والأنسجة ، بما في ذلك زراعة نباتات الأذن الداخلية بنسبة 1٪ -10٪ FBS4،5،6،16. يؤثر وجود المصل على ظروف ثقافة التجارب ؛ وبالتالي ، في حالات معينة ، يفضل الثقافة بدون مصل. تم استبدال غياب المصل في مزرعة نباتات القوقعة إما بإضافة N2 إلى DMEM أو بإضافة N2 إلى الوسط العصبي القاعديA 5,6. في هذا الصدد ، اختبرنا ظروف زراعة النباتات مع وبدون مصل. في كلتا الحالتين ، كانت خلايا الأذن الداخلية حيوية واستجابت للظروف السامة للأذن. اختبرنا هذه الظروف لمدة 72 ساعة ، ولكن يمكن الحفاظ على النباتات في الثقافة لفترة أطول ، خاصة عند حضنها بوسط خال من المصل مع N2 و B27 وعوامل النمو ، كما هو مقترح في دراسات أخرى 5,16.
بالإضافة إلى الخطوات الحرجة العامة في عزل نباتات الأذن الداخلية ، مثل مدة عزل الأعضاء والمضاد الحيوي المستخدم ، هناك أيضا بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول ، والتي يمكن التحكم فيها. ترتبط إحدى الخطوات الحاسمة في هذه الطريقة بحجم الوسط الذي يبقى في الغرفة بعد إدخال العضو. تم تحسين هذا للحفاظ على النباتات على قيد الحياة وتعلق على السطح السفلي. هناك خطوة مهمة أخرى تتعلق بوقت الحضانة اللازم للسماح للنباتات بالالتصاق بقاع الغرفة. أوقات الحضانة أطول من 2 ساعة مع بضعة ميكرولتر من الوسط يمكن أن تؤثر على صحة النباتات. يمكن أيضا استخدام أوقات حضانة أقصر ، مثل 1 ساعة ، طالما تم الحرص على عدم فصل النباتات. جانب آخر مهم هو بقايا بولي دي ليسين. يجب اتباع خطوات الغسيل من poly-D-lysine بدقة ، لأن بقايا ملح البروميد من poly-D-lysine يمكن أن تكون سامة للخلايا. بعد اتباع خطوات الغسيل بدقة ، يسهل الطلاء باستخدام poly-D-lysine الالتصاق السلس للنباتات الخارجية بالغرف بحيث يمكن تصحيح الموضع قبل أن تصبح متصلة بقوة بقاع الغرفة.
أحد قيود هذه الطريقة هو تصوير الخلايا باستخدام الفحص المجهري المستقيم. قد تكون هذه مشكلة مهمة لتلك المختبرات ذات المجاهر المقلوبة. يمكن استخدام الشرائح الزجاجية مع غرف السيليكون القابلة للإزالة للفحص المجهري المستقيم والمقلوب ؛ ومع ذلك ، يجب اختبار ظروف الطلاء الخاصة بنا مع poly-D-lysine أولا. هناك قيد آخر يتمثل في تخزين الغرف ، لأن الإدخالات غير قابلة للإزالة ، ويبلغ الارتفاع الإجمالي لغرفة واحدة مع الغطاء حوالي 11 مم مقارنة بارتفاع 1 مم لشريحة المجهر القياسية. ومع ذلك ، فإن الغرفة المكونة من 8 آبار تستخدم مساحة أقل من الألواح المكونة من 4 آبار المقترحة قبل16.
نقدم هنا الصور التي تم الحصول عليها باستخدام اثنين من المجاهر. بينما يوفر المجهر متحد البؤر لمسح النقاط صورا عالية الدقة للأنسجة بسبب قسمه البصري الرقيق ، يوفر المجهر البؤري للقرص الدوار وقت تصوير أسرع بدقة جيدة. يتم تصور الأهداب المجسمة لخلايا الشعر الداخلية (IHCs) وخلايا الشعر الخارجية (OHCs) باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. نظرا لأن الأهداب المجسمة للمدن الإنسانية العالمية أكبر من تلك الموجودة في OHCs ، فقد تم تصورها بشكل متكرر وجيد في هذا العمل. بالنسبة للأهداب المجسمة OHC ، يمكن للمجاهر البديلة الأخرى تحسين التصور ، مثل الفحص المجهري فائق الدقة (SRM). الصور الزرعية التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر القرص الدوار كافية لسهولة دمج عد خلايا الشعر الآلي باستخدام نهج التعلم العميق12. علاوة على ذلك ، فإن وقت الاستحواذ القصير مهم للتجارب على الخلايا والأنسجة الحية. بالإضافة إلى ذلك، لا يقتصر هذا البروتوكول على نباتات القوقعة الصناعية لحديثي الولادة. مع بعض التحسينات ، يمكن أيضا زراعة النباتات الأخرى مثل الأعضاء الدهليزية أو الأنسجة الجنينية.
يعد القياس الكمي لخلايا القوقعة ، مثل خلايا الشعر والخلايا العصبية ، في المختبر مهما لتقييم صلاحية الخلية ، وبالتالي النسبة المئوية للخلايا التالفة أو المفقودة. تساعد التحقيقات في مسارات الإشارات ووظائف الخلية على الكشف عن آليات الموت والبقاء على قيد الحياة. تعد فحوصات أنسجة القوقعة الجنينية وحديثي الولادة مفيدة للتحقيق في مراحل نمو قوقعة الأذن. لذلك ، سيساعد هذا البروتوكول على تحسين الدراسات في المختبر لنباتات الأذن الداخلية ، على سبيل المثال ، لإنشاء نماذج سامة للأذن ، والتحقيق في مراحل النمو ، وتقييم مسارات الإشارات ، وإجراء دراسات فحص الأدوية.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نود أن نعرب عن تقديرنا لمرفق الحيوانات التابع لقسم الطب الحيوي بجامعة بازل لدعمهم في رعاية الحيوان ، والمرافق الأساسية للفحص المجهري وكذلك خدمة تكنولوجيا المعلومات التابعة لقسم الطب الحيوي لمساعدتهم الفنية ، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF) للدعم المالي (منحة MD-PhD إلى MC ، رقم المنحة 323530_191222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
- Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
- Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
- Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
- MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
- Sibarita, J. B.
- Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).
