Summary
Den nåværende protokollen oppdaterer tidligere protokoller og inkorporerer relativt enkle tilnærminger for dyrking av høykvalitets cochlea-eksplanter. Dette gir pålitelig datainnsamling og høyoppløselig avbildning i levende og faste celler. Denne protokollen støtter den pågående trenden med å studere indre øreceller.
Abstract
Ubehandlet hørselstap påfører det globale helsevesenet betydelige kostnader og svekker enkeltpersoners livskvalitet. Sensorinevralt hørselstap er preget av kumulativt og irreversibelt tap av sensoriske hårceller og hørselsnerver i cochlea. Hele og vitale cochleaeksplanter er et av de grunnleggende verktøyene i hørselsforskning for å oppdage tap av hårceller og for å karakterisere molekylære mekanismer i de indre ørecellene. For mange år siden ble det utviklet en protokoll for neonatal cochleaisolasjon, og selv om den har blitt modifisert over tid, har den fortsatt potensial for forbedring.
Denne artikkelen presenterer en optimalisert protokoll for isolering og dyrking av hele neonatale cochlea-eksplanter i flerbrønnskulturkamre som muliggjør studier av hårceller og spiralganglionnevronceller langs hele lengden av sneglehuset. Protokollen ble testet ved hjelp av cochlea-eksplanter fra mus og rotter. Friske cochlea-eksplanter ble oppnådd for å studere samspillet mellom hårceller, spiralganglionnevronceller og de omkringliggende støttecellene.
En av hovedfordelene med denne metoden er at den forenkler orgelkulturtrinnene uten at det går ut over kvaliteten på eksplantene. Alle tre svingene på Corti-organet er festet til bunnen av kammeret, noe som letter in vitro-eksperimenter og den omfattende analysen av eksplantene. Vi gir noen eksempler på cochleabilder fra ulike eksperimenter med levende og faste eksplanter, og viser at eksplantene beholder sin struktur til tross for eksponering for ototoksiske stoffer. Denne optimaliserte protokollen kan brukes mye til integrativ analyse av pattedyrscochlea.
Introduction
De fleste tilfeller av sensorinevralt hørselstap skyldes degenerasjon av sensoriske hårceller, auditive nerveceller og/eller auditive synapser1. Denne degenerative prosessen i sanseceller er progressiv og vanligvis irreversibel, noe som resulterer i hørselstap2. Derfor er informasjon om sanseceller levedyktighet og endringer i signalveier under stressforhold avgjørende for å beskytte cellene mot skade og dermed tap. Undersøkelsen av cochleære eksplanter i kultur tillater rekapitulering av vevskomplekset og vedlikehold av et normalt celle-cellenettverk, noe som muliggjør en bedre beskrivelse av signaleringsprosessene. For å etablere eksperimentelle modeller for ototoksisitet har antibiotikumet gentamicin og kjemoterapeutisk middel cisplatin ofte blitt brukt, fordi de er kjent for å ha ototoksiske bivirkninger3.
In vitro-dyrkningssystemer av cochlea-eksplanter har blitt utviklet og modifisert over tid. Imidlertid mangler en beskrivelse av den trinnvise protokollen for kulturen til hele cochlea-eksplanter ofte i flere publikasjoner. En av de første videoprotokollene for primærkulturen til murinorganet Corti ble publisert av Parker et al., der forfatterne beskrev trinnene for isolering av sensorisk epitel, dyrking på glassdeksel og elektroporering av eksplanter for transfeksjonseksperimenter4. En annen protokoll ved bruk av glassdeksel ble også tidligere publisert, der organisering av cellulær struktur i det indre øret ble vurdert5. En alternativ protokoll som bruker Millicell-membran for kulturen av museeksplanter av organet Corti og vestibulært organ er rapportert6. Disse videorapportene har bidratt til å forbedre metoden, men det er fortsatt utfordringer som må løses. For å løse en rekke problemer som oppstår ved bruk av glassdeksler og innsatser, tar denne protokollen sikte på å strømlinjeforme orgelkulturtrinnene og dyrke organer av høy kvalitet for pålitelige data. Dette oppnås ved å minimere den direkte håndteringen av orgelet under eksperimentelle prosedyrer og unngå organoverføring før man oppnår høyoppløselige bilder av levende og faste celler.
Den nåværende protokollen oppdaterer tidligere publiserte in vitro-kultursystemer og introduserer flere optimaliseringer i isolasjonen av Corti-organet og overføring til kulturkamrene, samt integrering av et nytt lysbildekammer for å forbedre kulturforholdene og videre analyse. Denne optimaliserte protokollen reduserer risikoen for å skade orgelet, noe som kan oppstå ved bruk av glassdeksler under mediumendringen eller under overføring av orgelet fra dekkslips eller membraner for videre analyse 4,5,6. Glassdekslene har en bedre reflekterende indeks enn plastene; De er imidlertid skjøre og kan bryte lettere. Flerbrønnskamrene som brukes her er festet til et mikroskopglass, som er godt egnet for orgelkultur og for høyoppløselig avbildning. Overføringen av de isolerte organene utføres med en slikkepott, som gjør at orgelet kan bringes i riktig retning og gli inn i kammeret, i stedet for å påføre kraft med en pipette som tidligere anbefalt 4,5,6.
De poly-D-lysinbelagte flerbrønnskamrene, som skal inneholde tilstrekkelig medium, letter organoverføringen og riktig posisjonering av eksplantene uten å påføre klebende trykk og samtidig unngå organoverlapping, som nevnt tidligere6. I tillegg løses utilsiktede organoverlappende og ujevne strukturer ved hjelp av en konfokal Z-stabel. Denne protokollen er optimalisert for ulike applikasjoner, for eksempel muse- og rotteplanter, eksplanter av organet til Corti og cochlea, kultur i serumholdig og serumfritt medium, ototoksiske vurderinger og generelle legemiddelresponseksperimenter. Cochlea-eksplantene monteres og inkuberes i kamre med dekkbunn, noe som letter vedheftingen av cochlea-eksplantene til kamrene for optimal håndtering under in vitro-eksperimentene , etterbehandlingen av eksplantene og avbildning av levende og faste cochleaeksplanter. Visualiseringen av hele lengden av Corti-organet og kvantifiseringen av hårceller er strømlinjeformet. I tillegg er vurderingene av støttecellene, spiral ganglionnevronceller og nevritter nøyaktige. Derfor kan denne protokollen brukes til en omfattende analyse av pattedyrs cochleaceller.
Protocol
Alle dyreprosedyrene ble utført i samsvar med retningslinjene og forskriftene fra dyrevelferdskomiteen i Canton Basel City, Sveits. Postnatale C57BL/6JR-mus, Wistar-rotter og STAT1-mangelfulle mus (blandet C57BL/6-129/SvEv)7 i alderen 3-5 dager og av begge kjønn ble brukt til forsøkene.
1. Belegg av flerbrønnskamrene
- Forbered komplett kultur medium.
- For organ av Corti explants, forberede medium som inneholder Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% føtal bovine serum (FBS), 25 mM HEPES, og 30 U / ml penicillin.
- For organ av Corti explants og cochlear explants, lag et medium som inneholder DMEM / F12, 1x N2 supplement, 1x B27 minus antioksidanter og 30 U / ml penicillin.
- Forbered en stamløsning av poly-D-lysin ved å tilsette 10 ml cellekulturvann til 5 mg poly-D-lysin i en laminær hette. Den endelige konsentrasjonen av poly-D-lysin er 0,5 mg / ml.
MERK: Aliquot den gjenværende stamoppløsningen, og oppbevar ved -20 °C.- Forbered arbeidsløsninger av poly-D-lysin ved å fortynne stamløsningen 1:10 i sterilt vann.
- Belegg et 8-brønns kammer med 150 μL / brønn av poly-D-lysin arbeidsløsning, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
MERK: Hvis et 4-brønns kammer brukes, belegg med 300 μL / brønn av poly-D-lysin arbeidsløsning. - Aspirer løsningen ved vakuum eller pipettering.
- Vask 2x med 200 μL sterilt vann og en gang med 200 μL komplett kulturmedium eller DMEM.
- Tilsett 150 μL komplett kulturmedium til hver brønn.
MERK: Hvis et 4-brønnkammer brukes, tilsett 250 μL / brønn av komplett kulturmedium. - Plasser kammeret i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2 i minst 30 minutter før du plasserer en eksplant.
2. Disseksjon av tinningbenet
- Desinfiser operasjonsbordet med 70% etanol, og steriliser alle instrumentene i en glassmikrosfæresterilisator.
- Legg en steril 60 mm petriskål på en bøtte som inneholder is.
- Hell noen milliliter 1x fosfatbufret saltvann (PBS), og hold det på is.
MERK: Bruk 30 U / ml penicillin i 1x PBS for å unngå bakteriell forurensning. - Plasser en steril pute på et sterilt brett og halshugg valpedyret raskt med en saks. Senk hodet i 70% etanol i 5s, hvis forurensning er en hyppig hendelse.
MERK: Denne protokollen ble testet for mus og rotter i alderen P3-P5. Cochlear vev er vanskeligere å dissekere fra eldre mus og rotter, og overlevelsen av eksplanter i kultur er begrenset. - Plasser dyrehodet på en steril pute. Fjern mandibelen. Løft huden og skrell den tilbake fra skallen.
- Hold skallen ved å plassere tangen i banehulen.
- Klipp forsiktig skallen langs sagittal suturen, og kutt deretter i koronal suturområdet med et skarpt skalpellblad uten å skade cochlea.
MERK: Unngå å bruke for mye trykk, og unngå bevegelser forover og bakover med skalpellen, da dette kan skade cochleabenet og dermed cochleakanalen. - Fjern forsiktig hjernen fra de to hodeskallehalvdelene.
- Overfør hodeskallehalvdelene til en 60 mm petriskål med den iskalde PBS tilberedt i trinn 2.3.
3. Isolering av cochlea
- Lokaliser cochlea i temporal bein under mikroskopet. Plasser tangen i den øvre halvcirkelformede kanalen.
- Løsne det omkringliggende vevet mellom cochlea og tinningbenet ved hjelp av en insulinsprøyte (mus) eller tang (rotter).
- Trekk forsiktig det temporale beinet vekk fra cochlea, og hold cochlea festet til vestibylen med tinningbenet. Sørg for at sneglehuset er fritt for det omkringliggende vevet før du skyver tinningbenet til side.
MERK: Bruk av for mye kraft vil skade cochleakanalen. - Hold sneglehuset i en fast posisjon, og bruk den andre hånden til å fjerne bruskkapselen forsiktig. Sett forsiktig tuppene på tangen inn i toppunktet eller mellom svingene (synlig som en hvit linje), og fjern kapselen bit for bit. Utsett cochleakanalen.
- Legg tangen forsiktig under cochlea, og løsne den fra vestibulær organ og temporal bein.
- Overfør sneglehuset til et nytt 60 mm fat som inneholder iskald PBS.
- Juster forstørrelsen av mikroskopet for bedre å visualisere eksplantene.
- Følg de neste trinnene for organ av Corti explants:
- Hold orgelet i bunnen med tang. Fjern forsiktig cochleakanalen ved å ta tak i den med tang i basalkrokområdet.
- Slapp av cochleakanalen fra modiolusen uten å rive den.
- Fjern forsiktig spiralligamentet med stria vascularis ved å holde orgelet i bunnen og trekke dem bort.
MERK: Vevseparasjon kan også oppnås ved å holde apex-regionen i stedet for baseområdet. Dette kan være nyttig når du dissekerer rotteorganer eller eldre musevalper (>P5). - Fjern forsiktig Reissners membran ved å holde orgelet i bunnen og trekke det av bit for bit.
MERK: Dette er et valgfritt trinn da Reissners membran ikke forstyrrer oppkjøpet av avbildningen.
- Følg de neste trinnene for cochleaeksplanter:
- Løsne spiralganglion fra den osseøse spirallamina ved hjelp av en insulinsprøyte (mus) eller tang (rotter).
- Slapp forsiktig av modiolusen under løsningen.
MERK: Eksplantene kan deles i to deler for bedre håndtering. - Ta tak i krokregionen med tang.
- Fjern forsiktig spiralligamentet med stria vascularis ved å trekke det av.
- Fjern forsiktig Reissners membran ved å holde orgelet i bunnen og trekke det av bit for bit.
MERK: Dette trinnet anbefales, fordi Reissners membran vanligvis bretter og dekker nevronfilamenter og derfor kan påvirke forsøkene.
4. Kultur av cochlear explants
- Overfør eksplantene fra petriskålen til flerbrønnskamrene. Løft eksplantene med hårcellene vendt opp ved hjelp av en laboratoriespatel. Inkluder noen mikroliter 1x PBS for å forhindre at prøvene fester seg til slikkepotten.
NOTAT: Alvorlig skadede eksplanter vil feste seg til slikkepotten. - La eksplantene gli fra slikkepotten inn i kammeret ved å vifte forsiktig med slikkepotten i mediet. Plasser en eksplantasjon per brønn av et 8-brønns kammerlysbilde.
MERK: Hvis eksplanten fester seg til slikkepotten, hold slikkepotten i mediet, og bruk tangen til å løsne eksplantene. Plasser alltid tangen ved den indre kanten av eksplanten (vekk fra hårcellene). - Kontroller under mikroskopet at eksplantene er overført i riktig retning og plassert i midten av brønnene.
MERK: Feilorienterte eksplanter med hårceller vendt nedover har en tendens til å vise en U-form oppover langs bredden. Korriger orienteringen ved å flytte eksplantene til hjørnene av kamrene (mer medium er tilgjengelig) og lede dem til å rotere. - Fjern 80 μL av mediet med en 100 μL pipette, og kast det.
- Sjekk under mikroskopet om hårcellene og spiral ganglion neuron celler er synlige. Bruk om nødvendig tang for å forsiktig skyve fra hverandre noe overlappende vev.
- Fjern resten av mediet, og vent til ~ 10 s.
- Pipet middels rygg. Tilsett en eller to dråper av mediet ved siden av eksplanten og resten av mediet i noen avstand fra eksplanten for å forhindre at eksplanten løsner.
MERK: Selv om eksplantene er festet til kamrene, bør mediet alltid tilsettes først ved å pipetere en til to dråper ved siden av eksplantene. På denne måten vil ikke eksplantene løftes opp når det gjenværende komplette mediet er tilsatt. - Sett kammeret tilbake til inkubatoren, og inkuber i 2 timer for å la organene feste seg fast til bunnen av kammeret.
- Fjern mediet, og tilsett forsiktig 300 μL ferskt forvarmet komplett medium ved hjelp av en 100 μL eller 200 μL pipette. Ikke bruk en 1 ml pipette.
MERK: Hvis en forbehandling er ønsket, etter 2 timers vedlegg, tilsett 300 μL komplett medium som inneholder stoffet av interesse. Hvis et 4-brønns kammer brukes, bruk opptil 500 μL / brønn. - Sett kamrene tilbake til inkubatoren.
5. Test av ototoksiske midler
- La eksplantene stå over natten for å tilpasse seg kulturforholdene og for å komme seg.
- Forbered forskjellige konsentrasjoner av ototoksiske midler for å finne riktig konsentrasjon for å etablere en ototoksisk modell med ca. 50% hårcelletap. Bruk mellom 50 μM og 250 μM for gentamicin og mellom 40 μM og 320 μM for cisplatin. Forbered cisplatin-løsningene friske, og beskytt dem mot lys.
- Fjern mediet, og tilsett forsiktig 300 μL medium som inneholder det ønskede ototoksiske legemidlet.
- Inkuber eksplantene med gentamicin og cisplatin ved 37 °C i 24 timer til 48 timer for å bestemme hårcellenes overlevelse.
MERK: Legemiddelkonsentrasjoner og eksponeringstid velges avhengig av formålet med studien. Bevaringen av eksplantene ble her testet opp til 72 timer. Ikke bruk serum hvis du planlegger å utføre en langsiktig kultur. - Følg neste avsnitt for å farge cochleacellene.
6. Fiksering og immunfluorescens
- Kast mediet på slutten av forsøket, og vask straks eksplantene med 200 μL forvarmet 1x PBS.
- Fest eksplantene med 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter under en kjemisk avtrekkshette.
FORSIKTIG: PFA er et farlig kjemikalie; Les sikkerhetsdatabladet (MSDS) før du arbeider med PFA for første gang. - Vask eksplantene to ganger med 200 μL 1x PBS. Oppbevar eksplantene i 1x PBS ved 4 °C i tilfelle fargeprosedyrene må utsettes.
- Forbered permeabiliseringsløsningen bestående av 1x PBS og 1% -5% Triton-X100.
- Kast 1x PBS, tilsett 200 μL permeabiliseringsløsning, og inkuber eksplantene i 15 minutter.
- Forbered blokkeringsløsning.
- For organ av Corti explants, forberede blokkeringsløsning bestående av 1x PBS, 10% normalt geitserum (NGS, for geit sekundære antistoffer, eller et annet serum fra samme art som sekundære antistoffer). Alternativt kan du bruke 1% -5% bovint serumalbumin (BSA) hvis cellene bare er farget med phalloidin.
- For cochleære eksplanter, lag blokkeringsløsning bestående av 1x PBS, 10% NGS og Fab-fragment (Fab-fragment geit-anti-mus IgG H + L, fortynning 1: 200) hvis du bruker museprimære antistoffer (f.eks. mus anti-TuJ1) for å farge spiralganglioncellene.
- Tilsett 200 μL blokkeringsløsning, og inkuber eksplantene i 1 time.
- Forkast blokkeringsløsningen. Til de eksplantene som ruges med Fab-fragment, tilsett 200 μL 4% PFA, og inkuber i 5 minutter.
- Vask eksplantene med 1x PBS i 5 min.
- Forbered en antistoffoppløsning bestående av 1x PBS, 5% NGS og 0,1% -0,25% Triton-X100.
- Fortynn det primære antistoffet i antistoffløsning - MYO7A (ab3481 ved en fortynning på 1:500 eller MYO7A 138-1 ved 1:100) - for å merke hårcellene og TuJ1 (1:400) for å merke spiralganglionnevronene.
MERK: Hvis hårcellene bare er merket med phalloidin, fortynn phalloidin ved 1:150 i 1x PBS, inkuber i 40 minutter til 1 time ved romtemperatur, og fortsett til trinn 6.22. - Inkluder en kontroll for den uspesifikke bindingen av det sekundære antistoffet ved å utelate det primære antistoffet.
- Tilsett 170 μl av antistoffoppløsningen med det primære antistoffet til den tilsvarende brønnen, og inkuber over natten ved 4 °C med lett risting (40-60 rpm).
- Vask eksplantene 4x i 5 min hver med 1x PBS.
- Fortynn det sekundære antistoffet i antistoffoppløsning (f.eks. geitekanin Alexa Fluor 488 eller geitantimus Alexa Fluor 568 IgG ved en fortynning på 1:500).
- Tilsett 170 μl av antistoffoppløsningen med det sekundære antistoffet, og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
MERK: Beskytt eksplantene fra dette trinnet mot langvarig lyseksponering. - Vask eksplantene 2x i 5 min hver med 1x PBS.
- Fortsett til neste trinn for sekvensiell dobbeltmerking av eksplanter. Inkuber med et annet primært antistoff av interesse (f.eks. MYO7A for hårceller) over natten ved 4 °C med lett risting (40-60 rpm). Alternativt kan du ruge med falloidin (1:150) i 40 minutter til 1 time ved romtemperatur, og fortsette til trinn 6,22.
MERK: Utfør sekvensiell merking hvis de primære antistoffene er fra samme vertsart. Utfør phalloidinmerking på slutten for multiplex immunfluorescens. - Vask eksplantene 4x i 5 min hver med 1x PBS.
- Fortynn det sekundære antistoffet i antistoffoppløsning (f.eks. geitekanin Alexa Fluor 488 eller geitantimus Alexa Fluor 568 IgG ved en fortynning på 1:500).
- Tilsett 170 μL av det sekundære antistoffet, og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Vask eksplantene 2x i 5 min hver med 1x PBS.
- Tilbered en DAPI stamoppløsning på 1 mg/ml, og oppbevares ved -20 °C. Fortynn DAPI-oppløsningen 1:10 for å tilberede arbeidsløsninger på 0,1 mg/ml, og oppbevar ved 4 °C.
MERK: Hopp over trinn 23 og gå til trinn 26 hvis monteringsmediet som inneholder DAPI brukes. - Fortynn DAPI-arbeidsløsningen 1:100 i 1x PBS, og inkuber eksplantene med 200 μL DAPI-løsning i 5 minutter.
- Vask eksplantene 2x i 5 min hver med 1x PBS.
- Fjern 1x PBS så mye som mulig for å la bunnen av kammeret tørke. Ikke la eksplanten tørke.
- Vent i 2-5 s, og tilsett en dråpe monteringsmedium direkte på eksplanten.
MERK: Monteringsmediet på eksplanten vil forbli på plass på grunn av overflatespenning. Herdemonteringsmedium kan brukes. - Oppbevar kamrene ved 4 °C til avbildning.
7. Immunfluorescens av levende celler fra eksplanter
- Bruk de isolerte eksplantene etter inkubasjon over natten.
- Fjern mediet, og tilsett forsiktig 300 μL medium inneholdende 125 μM cisplatin.
- Inkuber eksplantene i 18 timer for å måle mitokondrielt superoksid i de levende eksplantene.
- Kast mediet ved slutten av legemiddeleksponeringen.
- Legg til 300 μL av en permeabel sonde for å oppdage cellulær ROS (f.eks. 250 nM mitohydroetidin) og / eller Caspase-3 (f.eks. 2 μM DEVD peptid konjugert til et nukleinsyrebindende fargestoff).
- Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
- Vask eksplantene to ganger forsiktig med 200 μL varm Hanks balanserte saltløsning (HBSS) eller en passende buffer.
- Se for deg cellene innen 2 timer med fluorescenseksitasjon ved 400 nm og utslippsdeteksjon ved 590 nm.
- Kast mediet på slutten av forsøket, og vask straks eksplantene med 200 μL forvarmet 1x PBS.
- Fest eksplantene, og flekk cochleacellene som beskrevet ovenfor.
8. Visualisering ved konfokal avbildning
- Bilde eksplantene ved hjelp av et mikroskop utstyrt med en spinndisk konfokal enhet eller et konfokalmikroskop utstyrt med en punktskanning konfokal enhet.
- Skaff bildene ved hjelp av en roterende disk med et 20x luftmål (numerisk blenderåpning: 0,75) for celletelling. Alternativt kan du ta bildene ved hjelp av et punktskanning konfokalmikroskop med et 40x luftmål (numerisk blenderåpning: 0,95) eller et 100x oljemål (numerisk blenderåpning: 1,45) for å visualisere og telle synapsene eller avbilde stereocilia.
MERK: Juster laserintensiteten og eksponeringstiden for hver kanal for å unngå over- og undermetning av bildene. Bruk de samme innstillingene på alle eksplantene i det samme eksperimentet. - Sett opp mikroskopet til å ta et 3D-bilde av hele cochlea-eksplanten ved hjelp av et 20x luftmål, z-stack og automatiske sømverktøy. Bruk 3 x 3 tilstøtende felt med 15% overlapp for museplanter og 4 x 4 tilstøtende felt for rotteplanter som skal sys sammen.
- Juster bildene ved hjelp av mikroskopets programvare eller den gratis open source FIJI-programvaren8.
MERK: Deconvolution, en bildebehandlingsteknikk, kan brukes på konfokale bilder for å skjerpe kontrasten og oppløsningen 9-11.
Representative Results
Den nåværende protokollen er testet på cochlea av nyfødte mus og rotter. Denne artikkelen presenterer bilder av eksplanter fra forskjellige eksperimenter. Eksplantene i Corti-organet ble eksponert for gentamicin eller cisplatin, og hårcelletap var synlig. Eksplantene til Corti-organet opprettholdt sin struktur og totale lengde under både normale og stressforhold (figur 1 og figur 2). De overlevende hårcellene langs hele lengden av rotteplantene som tidligere var eksponert for cisplatin, kunne påvises individuelt (figur 1). I tillegg til påvisning av overlevende hårceller ble det også påvist hårceller som gjennomgikk apoptose (figur 2). Denne tilnærmingen letter visualisering og telling av overlevende celler, som kan utføres ved hjelp av en dyp læringsmetode, som beskrevet tidligere12. Det var også mulig å påvise de biologiske prosessene i levende cochleaceller ved hjelp av egnede cellepermeable prober (figur 3).
Når det gjelder cochlea-eksplanter som inneholder spiralganglionnevroner, kan eksplantene kuttes i to deler, eller apex-regionen kan kuttes bort for å gi bedre kulturforhold. Her valgte vi å skille toppregionen, fordi den er mindre påvirket under stressforhold. Figur 4 viser basen og mediale regioner av cochlea-eksplantene. Hårceller merket med hårcellemarkøren MYO7A ble påvist. På samme måte ble sunne og skadede spiralganglioncellelegemer og nevritter merket med nevronmarkøren TuJ1 identifisert. Analysen av spiralganglionregioner kan utføres manuelt eller ved hjelp av åpen kildekode-programvare som FIJI med NeuronJ-plugin for nevrittsporing13 eller utvidelser som TrackMate og Cellpose for morfologisk segmentering14,15. Den nærmere undersøkelsen av museeksplantene viste høy oppløsning i cochleacellene og hårcellestereociliene (figur 5).
Figur 1: Eksplanter av Corti-organet fra rotter eksponert for gentamicin. Representative bilder (maksimal intensitetsprojeksjon) av (A) kontroll og (B) gentamicineksponerte (200 μM i 24 timer) eksplanter. Hårcellene er merket med falloidin og kan visualiseres langs hele lengden av cochlea. For bedre illustrasjon er bildet i gråtoner. Bildene ble tatt ved hjelp av et spinnende disk konfokalmikroskop med et 20x objektiv (numerisk blenderåpning: 0,75). Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksplanter av Corti-organet fra mus eksponert for cisplatin. Representative bilder (projeksjon av maksimal intensitet) av (A) kontroll og (B) cisplatineksponert (160 μM i 48 timer) eksplanter. Hårcellene er merket med phalloidin (rød), og de apoptotiske hårcellene er merket med fluorescin. Bildene ble tatt ved hjelp av et punktskanning konfokalmikroskop og et 20x objektiv (numerisk blenderåpning: 0,75). Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksplanter av Corti-organet fra levende bildeeksperimenter. Representative bilder (maksimal intensitetsprojeksjon) av eksplanter fra villtypemus som viser (A) kontrolleksplanter og (B) eksplanter med eksponering for 125 μM cisplatin i 18 timer. Hårcellene er merket med mito-hydroetidin og caspase-3. Bildene ble tatt ved hjelp av et spinnende disk konfokalmikroskop og et 20x objektiv (numerisk blenderåpning: 0,75). Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Cochleaeksplanter fra STAT1 knockoutmus eksponert for cisplatin. Representative bilder (maksimal intensitetsprojeksjon) av (A) kontrolleksplanter og (D) eksplanter utsatt for 40 μM cisplatin i 48 timer. Hårcellelegemene er merket med MYO7A-antistoffet (grønt), og spiralganglioncellene med TuJ1-antistoffet (rødt) og DAPI nukleærmerking (blått). Bildene ble tatt ved hjelp av et punktskanning konfokalmikroskop og et 20x objektiv (numerisk blenderåpning: 0,75) med ytterligere 2,15 zoom (B, C, E, F). Skalastang = (B,C,E,F) 50 μm og (A,D) 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Museorgan for Corti-eksplanter. (A-D) Representative bilder (maksimal intensitetsprojeksjon) av eksplanter i full lengde fra villtypemus. (A,B) Eksplantene ble merket med MYO7A-antistoff, falloidin og DAPI kjernefysisk merking. (B) I den forstørrede oversikten er cellelegemene i hårcellene merket med MYO7A-antistoff (grønn) tydelig synlige. (C,D) Phalloidin merker stereocilia og kutikulær plate av hårcellene. Eksplantene ble merket med falloidin. (D) I den forstørrede oversikten er deconvoluted bilder av individuelle indre hårcellestereocilia godt identifisert (nedre rad), mens individuelle ytre hårcellestereocilia er vanskeligere å avgrense (øvre rad). Bildene i panel A og C ble tatt med et spinnende disk konfokalmikroskop med et 20x objektiv (numerisk blenderåpning: 0,75). Bildet i panel B ble tatt med samme mikroskop, men med et 40x luftobjektiv (numerisk blenderåpning: 0,95). Bildet i panel D ble tatt med et punktskanning konfokalmikroskop og et 100x oljeobjektiv (numerisk blenderåpning: 1,45) med ytterligere 3,46 zoom. Skanningene ble gjennomsnittlig fire ganger per XY-seksjon, og pikselstørrelsen var 0,02 μm. Skalastenger = (D) 3 μm, (B) 100 μm og (A,C) 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Hensikten med å oppdatere denne protokollen var å strømlinjeforme trinnene fra isolering av eksplantene til avbildning av levende og faste cochleaceller. Vi forbedret noen trinn under isolasjonen og introduserte noen innovative verktøy med sikte på å etablere en effektiv og jevn løpende protokoll for å oppnå eksplanter av høy kvalitet. Metoden som beskrives er en optimalisert protokoll fra tidligere rapporter 4,5. I tillegg mangler noen aktuelle studier en trinnvis oppdatert protokoll. Med forenklede eksplantkulturtrinn gir denne protokollen enkel håndtering av godt bevarte eksplanter, noe som er avgjørende for reproduserbare data. Innføringen av flerbrønnskamre med en polymerdeksel for indre øreeksplanter forbedrer organfestet og bevaring av intakte eksplanter. Her presenterer vi flere eksempler på eksperimenter under stressforhold for å demonstrere at organene i kultur opprettholder sin cellulære organisasjon til tross for tap av hårceller og skade på nevrittene.
En av utfordringene ved dyrking av indre øreorganer er å unngå løsrivelse og flyt av organene, da dette påvirker integriteten til eksplantene, responsen på behandlingen og de påfølgende undersøkelsene. Tidligere ble eksplanter dyrket på glassomslag 4,5. Selv om dyrkning på glassflater ser ut til å være et godt alternativ, er belegg av glasset tidkrevende, og selve dekslene er skjøre og delikate. En alternativ protokoll ved hjelp av Millicell cellekultur setter inn forsøk på å løse dette problemet6. Å kutte og overføre membranen med eksplantene ser imidlertid ut til å være et delikat skritt i den protokollen. I tillegg kan eksplantene bli skadet under montering og tetting av dekselet. I vår foreslåtte tilnærming, når eksplantene er overført til poly-D-lysinbelagte kamre og plassert i riktig posisjon, er det ikke nødvendig med ytterligere overføring eller tildekking med deksel. En annen fordel med denne protokollen er bruken av kamre med et tynt gasspermeabelt polymerdeksel som gir optimale kulturforhold for organeksplantene. Denne polymeren har en optisk kvalitet som ligner på glass, noe som gjør den egnet for celleavbildning i høyoppløselig mikroskopi.
Tilsetning av serum til mediet brukes i de fleste protokoller for celle- og vevskultur, inkludert kulturen av indre øreeksplanter med 1% -10% FBS 4,5,6,16. Tilstedeværelsen av serum påvirker kulturbetingelsene for forsøkene; I visse situasjoner foretrekkes derfor kultur uten serum. Fraværet av serum i kulturen av cochleære eksplanter ble erstattet enten ved tilsetning av N2 til DMEM eller ved tilsetning av N2 til Neurobasal-A medium 5,6. I den forbindelse testet vi dyrkningsforholdene til eksplantene med og uten serum. Under begge tilstandene var de indre ørecellene vitale og responderte på ototoksiske tilstander. Vi testet disse forholdene i 72 timer, men eksplantene kan opprettholdes i kultur enda lenger, spesielt når de inkuberes med serumfritt medium sammen med N2, B27 og vekstfaktorer, som foreslått i andre studier 5,16.
I tillegg til de generelle kritiske trinnene i isoleringen av indre øreeksplanter, som varigheten av organisolasjonen og antibiotika som brukes, er det også noen kritiske trinn i denne protokollen, som imidlertid er håndterbare. Et av de kritiske trinnene i denne metoden er relatert til volumet av medium som forblir i kammeret etter at orgelet er satt inn. Dette er optimalisert for å holde eksplantene i live og festet til bunnflaten. Et annet kritisk skritt er relatert til inkubasjonstiden som kreves for å tillate eksplantene å feste seg til bunnen av kammeret. Inkubasjonstider lengre enn 2 timer med noen få mikroliter medium kan påvirke helsen til eksplantene. Kortere inkubasjonstider, for eksempel 1 time, kan også brukes, så lenge det tas hensyn til ikke å løsne eksplantene. Et annet viktig aspekt er rester av poly-D-lysin. Vasketrinnene av poly-D-lysin bør følges nøye, fordi rester av bromidsaltet av poly-D-lysin kan være giftig for cellene. Etter at vasketrinnene er fulgt nøyaktig, letter belegget med poly-D-lysin den jevne adhesjonen av eksplantene til kamrene slik at posisjonen kan korrigeres før de blir godt festet til bunnen av kammeret.
En av begrensningene ved denne metoden er avbildning av celler ved hjelp av oppreist mikroskopi. Dette kan være et viktig tema for de laboratoriene med inverterte mikroskoper. Glassglass med avtagbare silikonkamre kan brukes til oppreist og invertert mikroskopi; Imidlertid må våre beleggforhold med poly-D-lysin testes først. En ytterligere begrensning er lagringen av kamrene, fordi innsatsene ikke kan fjernes, og den totale høyden på ett kammer med lokket er nesten 11 mm sammenlignet med 1 mm høyden på et standard mikroskopglass. Imidlertid bruker 8-brønnskammeret mindre plass enn 4-brønnsplatene som ble foreslått før16.
Vi presenterer her bilder ervervet med to mikroskoper. Mens punktskanning konfokalmikroskop gir høyoppløselige bilder av vev på grunn av sin tynne optiske seksjon, gir spinndiskens konfokalmikroskop en raskere bildetid med god oppløsning. Stereocilia av indre hårceller (IHC) og ytre hårceller (OHC) visualiseres ved hjelp av konfokal mikroskopi. Siden stereocilia av IHC er større enn OHCs, ble de gjentatte ganger og godt visualisert i dette arbeidet. For OHC stereocilia, kan andre alternative mikroskoper forbedre visualiseringen, for eksempel super-oppløsning mikroskopi (SRM). Eksplantbildene som er tatt med spinnskivemikroskopet, er tilstrekkelige for enkel integrering av automatisert hårcelletelling ved hjelp av en dyp læringsmetode12. Videre er den korte innsamlingstiden viktig for eksperimenter med levende celler og vev. I tillegg er denne protokollen ikke begrenset til neonatale cochleaeksplanter. Med noen optimaliseringer kan andre eksplanter som vestibulære organer eller embryonale vev også dyrkes.
Kvantifiseringen av cochleaceller, som hårceller og nevroner, in vitro er viktig for å vurdere cellens levedyktighet og dermed prosentandelen skadede eller tapte celler. Undersøkelser av signalveier og cellefunksjoner bidrar til å avsløre mekanismene for død og overlevelse. Undersøkelser av embryonale og neonatale cochleære vev er nyttige for å undersøke utviklingsstadiene i cochlea. Derfor vil denne protokollen bidra til å optimalisere in vitro-studier av indre øreeksplanter, for eksempel for å etablere ototoksiske modeller, undersøke utviklingsstadier, evaluere signalveier og utføre legemiddelscreeningsstudier.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne dyreavdelingen ved Institutt for biomedisin ved Universitetet i Basel for deres støtte til dyrepleie, mikroskopikjernefasilitetene samt informasjonsteknologitjenesten ved Institutt for biomedisin for teknisk assistanse og Swiss National Science Foundation (SNSF) for økonomisk støtte (MD-PhD-stipend til MC, tilskuddsnummer 323530_191222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
- Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
- Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
- Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
- MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
- Sibarita, J. B.
- Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).
