麻醉小鼠颅外刺激电极的放置和脑血流量和颅内电场的测量

Summary

我们描述了一种评估颅外刺激剂量反应曲线的方案，包括脑电场测量和相关的生物标志物-脑血流。由于该方案涉及将侵入性电极植入大脑，因此需要全身麻醉，首选自主呼吸而不是控制呼吸。

Abstract

检测脑血流 （CBF） 对各种形式的神经元激活的反应对于了解动态脑功能和大脑底物供应的变化至关重要。本文描述了一种测量 CBF 对经颅交流电刺激 （tACS） 反应的方案。剂量反应曲线是根据 tACS （mA） 和颅内电场 （mV/mm） 发生的 CBF 变化估计的。我们根据大脑两侧玻璃微电极测量的不同振幅来估计颅内电场。在本文中，我们描述了实验装置，其中包括使用双侧激光多普勒 （LD） 探头或激光散斑成像 （LSI） 来测量 CBF;因此，这种设置需要麻醉才能放置电极并保持稳定性。我们提出了CBF响应与电流之间的相关性作为年龄的函数，与老年动物（28-32周）相比，年轻对照动物（12-14周）在较高电流（1.5mA和2.0mA）下的反应明显更大（p < 0.005差异）。我们还证明了在电场强度 <5 mV/mm 下显着的 CBF 响应，这是最终人体研究的重要考虑因素。与清醒动物相比，麻醉的使用、呼吸控制（即插管与自主呼吸）、全身因素（即 CO₂）以及血管内的局部传导（由周细胞和内皮细胞介导）也强烈影响这些 CBF 反应。同样，更详细的成像/记录技术可能会将整个大脑的视野大小限制在一个小区域。我们描述了使用颅外电极进行 tACS 刺激，包括啮齿动物的自制和商业电极设计、使用双侧玻璃直流记录电极同时测量 CBF 和颅内电场以及成像方法。我们目前正在应用这些技术来实现一种闭环形式，用于在阿尔茨海默病和中风的动物模型中增强CBF。

Introduction

经颅电刺激（tES;正弦波刺激，tACS）是一种常见的、外部的、非侵入性的脑神经调控方法^1,2。之前，我们假设在某些剂量下，tES（尤其是 tACS）可能会增加潜在大脑区域的脑血流量 （CBF）³。此外，施加的外部电流或颅内电场与产生的CBF反应之间可能存在剂量反应关系。然而，大多数临床刺激方案都集中在预定时间段（即 30-45 分钟）的最大舒适皮肤刺激水平（即 ~ 2 mA）作为治疗方案 ^4,5。在啮齿动物中，可以使用直接施加在颅骨上的侵入性颅外脑电极来研究 tES⁶ 诱导的大脑电场。因此，该方法的目标是根据剂量-反应关系确定相关频率下 tACS 强度对 CBF 变化的影响。该剂量反应曲线基于CBF^与施加在大脑上的电场相关的短期生理生物标志物直接测量3。我们之前已经证明，在较大的振幅下，通常超出临床上由 tACS 诱导的大脑内电场范围，感应电场与皮层³ 中的 CBF 之间存在近线性相关性。然而，较小视野的刺激（即 1-5 mV/mm 强度）可能更适合用于人类;因此，我们修改了我们的技术来检测较小的CBF变化。

本文描述了一种方案，用于分析低场强 tES 交流正弦电流 （tACS） 对 CBF（即 0.5-2.0 mA 电流，1-5 mV/mm 电场）的影响，清醒的啮齿动物可以耐受⁵。该协议涉及在tACS期间使用新型激光散斑成像以及双颅内玻璃电极，以确定活性tACS在大脑内的扩散（由CBF监测）和颅内电场强度，其显示为图表和实际实验照片（图1）。tES 在大脑内有许多可能的生理效应，包括直接神经元调节、神经可塑性和星形胶质细胞激活 ^7,8。尽管 CBF 已使用 tDCS ^9,10 进行测量，但这些测量缓慢、间接且不足以评估大脑中的剂量反应功能。因此，通过使用适当的短期生物标志物（即 CBF、电场）和 tACS 的快速开/关序列，我们现在可以更准确地估计剂量反应函数。此外，我们可以应用不同的技术来测量 CBF，包括具有定义感兴趣区域的聚焦激光多普勒探头 （LD） 和激光散斑成像 （LSI）。

图 1：经颅刺激图和摄影示例。 （A） 经颅刺激装置示意图。该图显示了带有冠状缝合线和矢状缝合线的小鼠头骨。经颅电极横向对称放置在颅骨上，并在电极和颅骨之间安装有手术胶和导电膏。这些电极连接到与人体兼容的恒流刺激装置，该装置可以指定刺激的频率、幅度和持续时间。为了评估颅内电场，将双侧玻璃电极（~2 MΩ）放置在大脑皮层中（即，在颅骨内侧1mm以内，通过小毛刺孔），并用矿物油密封，并在颈部肌肉中具有AgCl基础（显示为中心埋入皮下颈部组织的较大电线）。这些玻璃电极连接到直流放大器，其输出通过至少具有四个通道的数字化仪进行记录。双侧激光多普勒探头也被放置在颅骨上进行记录。整个头骨还使用激光散斑成像设备或高分辨率（至少 1,024 x 1,024 像素，12-14 位像素深度）冷却相机进行成像，以进行固有光信号检测。通常选择血红蛋白等吸收频率（即 562 nm）作为血流成像的照明。（B） 实际实验的特写图像，显示双侧激光多普勒探头（左侧）、通过毛刺孔放置的（双侧）颅内玻璃记录微电极以及横向放置 tACS 刺激电极。缩写：tACS=经颅交流电刺激。请点击这里查看此图的较大版本.

作为评估机制的一种方式，我们还可以询问与其他也改变 CBF 的生理过程的相互作用，例如 K⁺ 诱导的扩散去极化¹¹。此外，除了定期安排的会议外，还可以开发基于各种疾病的额外生物标志物的闭环系统，正如为癫痫治疗¹² （即临床Neuropace设备）所建议的那样。例如，在缺乏足够的多巴胺（通常是β波段 LFP）的情况下，帕金森病的闭环脑刺激通常基于该疾病固有的固有异常局部场电位 （LFP）¹³。

Protocol

所有动物程序均由杜克大学机构动物护理和使用委员会或同等的地方当局批准，以规范涉及动物的研究。有关本协议中使用的所有材料、仪器和设备的详细信息，请参阅 材料表 。 1. 仪器准备 确保所有必需的物品和手术器械都已到位（图 2）：头皮清洁液（酒精棉）、胶带、镊子、剪刀和用于放置小 （0.5 毫米） 毛刺孔?…

Representative Results

代表性结果如图4、图5和图6所示。图 4 显示了四个通道的示例，其中两个颅内记录电极位于上通道，CBF 响应位于下通道。tACS在颅骨上是对称的，但一般来说，对于施加的交流电流，颅内视野响应略有不对称，一侧的响应比另一侧大（图4）。CBF对tACS电刺激3的反应在较高</…

Discussion

该协议侧重于 CBF 反应的体内麻醉测量，作为估计大脑对 tES¹⁴ 反应的生物标志物。tES 反应的长期生物标志物包括组织学治疗效果，例如预防或改变淀粉样斑块的形成（即，在几种 AD 模型中以 40 Hz 进行伽马刺激）^{16,17,18,19，}但短期生物标志物也有助于估计即时生理效应和计算剂量反应?…

Materials

Alcohol pads	HenryShein	112-6131
Baby mineral oil	Johnson & Johnson
BD 1 mL syringe	Becton Dikinson	REF 305699
C3 Flat Surface Electrodes	Neuronexus
C57BI mice			from NIH colonies
Copper skull electrods	In house preparation
Digidata 1440, Clampex	Axon Instruments
Dumont #5 forceps	FST	#5
Dumont #7 forceps curved	Dumont	RS-5047
Eye ointment	Major	LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter instrument Co.	Model P-87
Forceps 11.5 cm slight curve  serrated	Roboz	RS-8254
Intramedic needle 23 G	Becton Dikinson	REF 427565
KCl 1 M	In house preparation
Laser Doppler Probes	Moor Instruments	0.46 mm laser doppler probes
Laser Speckle Imaging Device	RWD	RFLSI-ZW
Micro curette 13 cm	FST	10080-05
Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm	Roboz	RS-5914
Mouse anesthesia fixation	Stoelting
Neuroconn-DS	Neurocare	DC-Stimulator Plus
PhysioSuite Monitoring	Kent Scientific
Q-tips	Fisherbrand	22363167
Saline 0.9% NaCl solution	Baxter	281322
Sensicam QE	PCO Instruments
Software	Axon Instruments Clampex
Surgical glue	Covetrus	31477
Surgical tape	3M Transpore	T9784