Mise en place d’électrodes de stimulation extracrânienne et mesure du débit sanguin cérébral et des champs électriques intracrâniens chez des souris anesthésiées

Summary

Nous décrivons un protocole d’évaluation des courbes dose-réponse pour la stimulation extracrânienne en termes de mesures du champ électrique cérébral et d’un biomarqueur-flux sanguin cérébral pertinent. Étant donné que ce protocole implique la mise en place invasive d’électrodes dans le cerveau, une anesthésie générale est nécessaire, la respiration spontanée étant préférée aux respirations contrôlées.

Abstract

La détection des réponses du flux sanguin cérébral (CBF) à diverses formes d’activation neuronale est essentielle pour comprendre le fonctionnement dynamique du cerveau et les variations de l’approvisionnement en substrat du cerveau. Cet article décrit un protocole de mesure des réponses CBF à la stimulation transcrânienne par courant alternatif (tACS). Les courbes dose-réponse sont estimées à la fois à partir de la variation du CBF survenant avec le tACS (mA) et du champ électrique intracrânien (mV/mm). Nous estimons le champ électrique intracrânien en fonction des différentes amplitudes mesurées par des microélectrodes en verre de chaque côté du cerveau. Dans cet article, nous décrivons le dispositif expérimental, qui implique l’utilisation de sondes Doppler laser bilatérales (LD) ou d’imagerie laser par chatoiement (LSI) pour mesurer le CBF ; Par conséquent, cette configuration nécessite une anesthésie pour le placement et la stabilité de l’électrode. Nous présentons une corrélation entre la réponse CBF et le courant en fonction de l’âge, montrant une réponse significativement plus importante à des courants plus élevés (1,5 mA et 2,0 mA) chez les jeunes animaux témoins (12-14 semaines) par rapport aux animaux plus âgés (28-32 semaines) (p < 0,005 différence). Nous démontrons également une réponse significative du CBF à des intensités de champ électrique <5 mV/mm, ce qui est une considération importante pour d’éventuelles études humaines. Ces réponses CBF sont également fortement influencées par l’utilisation de l’anesthésie par rapport aux animaux éveillés, le contrôle de la respiration (c’est-à-dire la respiration intubée par rapport à la respiration spontanée), les facteurs systémiques (c’est-à-dire le CO₂) et la conduction locale dans les vaisseaux sanguins, qui est médiée par les péricytes et les cellules endothéliales. De même, des techniques d’imagerie et d’enregistrement plus détaillées peuvent limiter la taille du champ de l’ensemble du cerveau à une petite région. Nous décrivons l’utilisation d’électrodes extracrâniennes pour l’application de la stimulation tACS, y compris des conceptions d’électrodes artisanales et commerciales pour les rongeurs, la mesure simultanée du CBF et du champ électrique intracrânien à l’aide d’électrodes d’enregistrement CC bilatérales en verre, et les approches d’imagerie. Nous appliquons actuellement ces techniques pour mettre en œuvre un format en boucle fermée afin d’augmenter le CBF dans des modèles animaux de la maladie d’Alzheimer et des accidents vasculaires cérébraux.

Introduction

La stimulation électrique transcrânienne (tES ; avec stimulation par onde sinusoïdale, tACS) est une approche courante, externe et non invasive de la neuromodulation cérébrale ^1,2. Précédemment, nous avons émis l’hypothèse qu’à certaines doses, les tES (et en particulier les tACS) peuvent augmenter le flux sanguin cérébral (CBF) dans les régions cérébrales sous-jacentes³. De plus, il peut exister une relation dose-réponse entre le courant externe appliqué ou le champ électrique intracrânien et les réponses CBF qui en résultent. Cependant, la plupart des protocoles de stimulation clinique se sont concentrés sur un niveau maximal de stimulation cutanée confortable (c’est-à-dire ~ 2 mA) pendant des périodes de temps programmées (c’est-à-dire 30-45 min) en tant que protocole de traitement ^4,5. Chez les rongeurs, il est possible d’utiliser des électrodes cérébrales extracrâniennes invasives appliquées directement sur le crâne pour étudier les champs électriques dans le cerveau induits par tES⁶. Par conséquent, l’objectif de cette approche est de déterminer les effets de l’intensité de la tACS à des fréquences pertinentes sur les changements du CBF en termes de relation dose-réponse. Cette courbe dose-réponse est basée sur un biomarqueur physiologique à court terme – mesures directes du CBF – en relation avec le champ électrique imposé au cerveau³. Nous avons précédemment montré qu’à des amplitudes plus importantes, généralement au-delà de la gamme des champs électriques dans le cerveau induits cliniquement par le tACS, il existe une corrélation quasi linéaire entre le champ électrique induit et le CBF dans le cortex³. Cependant, la stimulation à plus petit champ (c.-à-d. une intensité de 1 à 5 mV/mm) peut être plus pertinente et réalisable pour une utilisation chez l’homme ; par conséquent, nous avons modifié nos techniques pour détecter les plus petits changements de CBF.

Cet article décrit un protocole permettant d’analyser les effets des courants sinusoïdaux alternatifs tES (tACS) à faible intensité de champ sur le CBF (c’est-à-dire un courant de 0,5 à 2,0 mA, un champ électrique de 1 à 5 mV/mm), qui peuvent être tolérés par des rongeurs éveillés⁵. Ce protocole implique l’utilisation d’une nouvelle imagerie laser par chatoiement pendant le tACS, ainsi que de deux électrodes intracrâniennes en verre, pour déterminer à la fois la propagation du tACS actif dans le cerveau (telle que surveillée par le CBF) et l’intensité du champ électrique intracrânien, qui est montrée à la fois sous forme de diagramme et de photographie expérimentale réelle (Figure 1). Il existe de nombreux effets physiologiques possibles de la tES dans le cerveau, notamment la modulation neuronale directe, la plasticité neuronale et l’activation des astrocytes ^7,8. Bien que le CBF ait été mesuré avec la tDCS ^9,10, ces mesures étaient lentes, indirectes et insuffisantes pour évaluer la fonction dose-réponse dans le cerveau. Par conséquent, en utilisant des biomarqueurs à court terme appropriés (c.-à-d. CBF, champs électriques) et des séquences marche/arrêt rapides de tACS, nous pouvons maintenant estimer la fonction dose-réponse avec plus de précision. De plus, nous pouvons appliquer différentes techniques pour mesurer le CBF, y compris les sondes Doppler laser focales (LD) et l’imagerie laser par chatoiement (LSI) avec des régions d’intérêt définies.

Figure 1 : Schéma de stimulation transcrânienne et exemple photographique. (A) Schéma de l’installation de stimulation transcrânienne. Le schéma montre un crâne de souris avec des sutures coronales et sagittales. Les électrodes transcrâniennes sont placées latéralement et symétriquement sur le crâne et sont montées avec de la colle chirurgicale et de la pâte conductrice entre les électrodes et le crâne. Ces électrodes sont connectées à un dispositif de stimulation à courant constant compatible avec l’homme, qui peut spécifier la fréquence, l’amplitude et la durée de la stimulation. Pour l’évaluation des champs électriques intracrâniens, des électrodes de verre bilatérales (~ 2 MΩ) sont placées dans le cortex cérébral (c’est-à-dire à moins de 1 mm de la face interne du crâne à travers de petits trous de bavures), et celles-ci sont scellées avec de l’huile minérale et ont des motifs AgCl dans le muscle du cou (représentés par des fils plus gros au centre enfouis dans le tissu sous-cutané du cou). Ces électrodes de verre sont connectées à un amplificateur CC et leurs sorties sont enregistrées par un numériseur avec au moins quatre canaux. Des sondes Doppler laser bilatérales sont également placées sur le crâne pour les enregistrements. L’ensemble du crâne est également photographié à l’aide d’un dispositif d’imagerie par chatoiement laser ou d’une caméra refroidie à haute résolution (au moins 1 024 x 1 024 pixels, profondeur de pixel de 12 à 14 bits) pour la détection du signal optique intrinsèque. La fréquence isobestique de l’hémoglobine est généralement choisie (c’est-à-dire 562 nm) pour l’éclairage de l’imagerie du flux sanguin. (B) Une image en gros plan d’une expérience réelle, montrant les sondes Doppler laser bilatérales (à gauche), les microélectrodes d’enregistrement intracrâniennes (bilatérales) en verre placées à travers les trous de bavures, et avec les électrodes de stimulation tACS latéralement. Abréviation : tACS = stimulation transcrânienne à courant alternatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Afin d’évaluer les mécanismes, nous pouvons également interroger les interactions avec d’autres processus physiologiques qui modifient également le CBF, tels que la dépolarisation par propagation induite par K^{+ 11}. De plus, plutôt que de programmer des séances à des heures régulières, il est également possible de développer un système en boucle fermée basé sur des biomarqueurs supplémentaires pour une variété de maladies, comme cela a été proposé pour le traitement de l’épilepsie¹² (c’est-à-dire les dispositifs cliniques Neuropace). Par exemple, la stimulation cérébrale en boucle fermée pour la maladie de Parkinson est généralement basée sur les potentiels de champ local (LFP) intrinsèques et anormaux intrinsèques à cette maladie en l’absence d’une quantité suffisante de dopamine (généralement des LFP à bande β)¹³.

Protocol

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Duke ou par l’autorité locale équivalente réglementant la recherche sur les animaux. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et équipements utilisés dans ce protocole. 1. Préparation de l’instrument Assurez-vous que tous les art…

Representative Results

Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 4, à la figure 5 et à la figure 6. La figure 4 montre un exemple des quatre canaux avec les deux électrodes d’enregistrement intracrâniennes sur les canaux supérieurs et les réponses CBF sur les canaux inférieurs. Le tACS est symétrique sur l’ensemble du crâne, mais en général, la réponse du champ intracrânien est légèremen…

Discussion

Ce protocole se concentre sur la mesure in vivo et anesthésiée de la réponse CBF en tant que biomarqueur pour estimer la réponse cérébrale à tES¹⁴. Les biomarqueurs à plus long terme de la réponse tES comprennent les effets histologiques du traitement, tels que la prévention ou les changements dans la formation de plaques amyloïdes (c.-à-d. avec une stimulation gamma à 40 Hz dans plusieurs modèles de MA)^16,17,18,19<s…

Materials

Alcohol pads	HenryShein	112-6131
Baby mineral oil	Johnson & Johnson
BD 1 mL syringe	Becton Dikinson	REF 305699
C3 Flat Surface Electrodes	Neuronexus
C57BI mice			from NIH colonies
Copper skull electrods	In house preparation
Digidata 1440, Clampex	Axon Instruments
Dumont #5 forceps	FST	#5
Dumont #7 forceps curved	Dumont	RS-5047
Eye ointment	Major	LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter instrument Co.	Model P-87
Forceps 11.5 cm slight curve  serrated	Roboz	RS-8254
Intramedic needle 23 G	Becton Dikinson	REF 427565
KCl 1 M	In house preparation
Laser Doppler Probes	Moor Instruments	0.46 mm laser doppler probes
Laser Speckle Imaging Device	RWD	RFLSI-ZW
Micro curette 13 cm	FST	10080-05
Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm	Roboz	RS-5914
Mouse anesthesia fixation	Stoelting
Neuroconn-DS	Neurocare	DC-Stimulator Plus
PhysioSuite Monitoring	Kent Scientific
Q-tips	Fisherbrand	22363167
Saline 0.9% NaCl solution	Baxter	281322
Sensicam QE	PCO Instruments
Software	Axon Instruments Clampex
Surgical glue	Covetrus	31477
Surgical tape	3M Transpore	T9784