Posizionamento di elettrodi stimolanti extracranici e misurazione del flusso sanguigno cerebrale e dei campi elettrici intracranici in topi anestetizzati

Summary

Descriviamo un protocollo per la valutazione delle curve dose-risposta per la stimolazione extracranica in termini di misurazioni del campo elettrico cerebrale e di un rilevante biomarcatore-flusso sanguigno cerebrale. Poiché questo protocollo prevede il posizionamento invasivo di elettrodi nel cervello, è necessaria l’anestesia generale, con la respirazione spontanea preferita alla respirazione controllata.

Abstract

Il rilevamento delle risposte del flusso sanguigno cerebrale (CBF) a varie forme di attivazione neuronale è fondamentale per comprendere la funzione cerebrale dinamica e le variazioni nell’apporto di substrato al cervello. Questo documento descrive un protocollo per misurare le risposte del CBF alla stimolazione transcranica a corrente alternata (tACS). Le curve dose-risposta sono stimate sia dalla variazione del CBF che si verifica con il tACS (mA) che dal campo elettrico intracranico (mV/mm). Stimiamo il campo elettrico intracranico in base alle diverse ampiezze misurate dai microelettrodi di vetro all’interno di ciascun lato del cervello. In questo articolo, descriviamo la configurazione sperimentale, che prevede l’utilizzo di sonde laser Doppler (LD) bilaterali o di imaging laser speckle (LSI) per misurare il CBF; Di conseguenza, questa configurazione richiede l’anestesia per il posizionamento e la stabilità dell’elettrodo. Presentiamo una correlazione tra la risposta CBF e la corrente in funzione dell’età, mostrando una risposta significativamente maggiore a correnti più elevate (1,5 mA e 2,0 mA) negli animali di controllo giovani (12-14 settimane) rispetto agli animali più anziani (28-32 settimane) (differenza p < 0,005). Dimostriamo anche una significativa risposta CBF a intensità di campo elettrico <5 mV/mm, che è una considerazione importante per eventuali studi sull'uomo. Queste risposte CBF sono anche fortemente influenzate dall'uso dell'anestesia rispetto agli animali svegli, dal controllo della respirazione (cioè respirazione intubata vs. respirazione spontanea), dai fattori sistemici (cioè CO₂ ) e dalla conduzione locale all’interno dei vasi sanguigni, che è mediata da periciti e cellule endoteliali. Allo stesso modo, tecniche di imaging/registrazione più dettagliate possono limitare la dimensione del campo dall’intero cervello solo a una piccola regione. Descriviamo l’uso di elettrodi extracranici per l’applicazione della stimolazione tACS, compresi i progetti di elettrodi fatti in casa e commerciali per i roditori, la misurazione simultanea del CBF e del campo elettrico intracranico utilizzando elettrodi di registrazione CC bilaterali in vetro e gli approcci di imaging. Attualmente stiamo applicando queste tecniche per implementare un formato a circuito chiuso per aumentare il CBF in modelli animali di malattia di Alzheimer e ictus.

Introduction

La stimolazione elettrica transcranica (tES; con stimolazione sinusoidale, tACS) è un approccio comune, esterno e non invasivo alla neuromodulazione cerebrale ^1,2. In precedenza, abbiamo ipotizzato che a determinate dosi, il tES (e in particolare il tACS) possa aumentare il flusso sanguigno cerebrale (CBF) nelle regioni cerebrali sottostanti³. Inoltre, può esistere una relazione dose-risposta tra la corrente esterna applicata o il campo elettrico intracranico e le risposte CBF risultanti. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli di stimolazione clinica si è concentrata su un livello massimo di stimolazione cutanea confortevole (cioè ~ 2 mA) per periodi di tempo programmati (cioè 30-45 minuti) come protocollo di trattamento ^4,5. Nei roditori, è possibile utilizzare elettrodi cerebrali extracranici invasivi applicati direttamente al cranio per studiare i campi elettrici nel cervello indotti da tES⁶. Pertanto, l’obiettivo di questo approccio è quello di determinare gli effetti dell’intensità del tACS a frequenze rilevanti sui cambiamenti del CBF in termini di relazione dose-risposta. Questa curva dose-risposta si basa su un biomarcatore fisiologico a breve termine – misurazioni dirette del CBF – in relazione al campo elettrico imposto al cervello³. Abbiamo precedentemente dimostrato che, ad ampiezze maggiori, tipicamente oltre la gamma di campi elettrici all’interno del cervello indotti clinicamente da tACS, esiste una correlazione quasi lineare tra il campo elettrico indotto e il CBF nella corteccia³. Tuttavia, la stimolazione a campo più piccolo (cioè un’intensità di 1-5 mV/mm) può essere più rilevante e fattibile per l’uso nell’uomo; quindi, abbiamo modificato le nostre tecniche per rilevare cambiamenti CBF più piccoli.

Questo articolo descrive un protocollo per analizzare gli effetti delle correnti sinusoidali alternate (tACS) tES a bassa intensità di campo sul CBF (cioè corrente 0,5-2,0 mA, campo elettrico 1-5 mV/mm), che può essere tollerato dai roditori svegli⁵. Questo protocollo prevede l’uso di un nuovo imaging a speckle laser durante la tACS, nonché di due elettrodi di vetro intracranico, per determinare sia la diffusione della tACS attiva all’interno del cervello (come monitorato dal CBF) che l’intensità del campo elettrico intracranico, che viene mostrata sia come diagramma che come una fotografia sperimentale reale (Figura 1). Ci sono molti possibili effetti fisiologici della tES all’interno del cervello, tra cui la modulazione neuronale diretta, la plasticità neurale e l’attivazione degli astrociti ^7,8. Sebbene il CBF sia stato misurato con tDCS ^9,10, queste misurazioni sono state lente, indirette e insufficienti per valutare la funzione dose-risposta nel cervello. Pertanto, utilizzando appropriati biomarcatori a breve termine (ad esempio, CBF, campi elettrici) e sequenze rapide on/off di tACS, possiamo ora stimare la funzione dose-risposta in modo più accurato. Inoltre, possiamo applicare diverse tecniche per misurare il CBF, tra cui sonde laser Doppler focali (LD) e imaging laser speckle (LSI) con regioni di interesse definite.

Figura 1: Diagramma di stimolazione transcranica ed esempio fotografico . (A) Schema della configurazione della stimolazione transcranica. Il diagramma mostra un cranio di topo con suture coronali e sagittali. Gli elettrodi transcranici sono posizionati lateralmente e simmetricamente sul cranio e sono montati con colla chirurgica e pasta conduttiva tra gli elettrodi e il cranio. Questi elettrodi sono collegati a un dispositivo di stimolazione a corrente costante compatibile con l’uomo, che può specificare la frequenza, l’ampiezza e la durata della stimolazione. Per la valutazione dei campi elettrici intracranici, gli elettrodi di vetro bilaterali (~2 MΩ) vengono posizionati nella corteccia cerebrale (cioè entro 1 mm dall’aspetto interno del cranio attraverso piccoli fori di bava), e questi sono sigillati con olio minerale e hanno fondi di AgCl nel muscolo del collo (mostrati come fili più grandi al centro sepolti nel tessuto sottocutaneo del collo). Questi elettrodi di vetro sono collegati a un amplificatore CC e le loro uscite vengono registrate attraverso un digitalizzatore con almeno quattro canali. Sul cranio vengono posizionate anche sonde laser Doppler bilaterali per le registrazioni. L’intero cranio viene anche ripreso con un dispositivo di imaging a speckle laser o una telecamera raffreddata ad alta risoluzione (almeno 1.024 x 1.024 pixel, profondità pixel 12-14 bit) per il rilevamento del segnale ottico intrinseco. La frequenza isosbestica dell’emoglobina viene in genere scelta (cioè 562 nm) per l’illuminazione per l’imaging del flusso sanguigno. (B) Un’immagine ravvicinata di un esperimento reale, che mostra le sonde laser Doppler bilaterali (a sinistra), i microelettrodi di registrazione intracranica (bilaterale) in vetro posizionati attraverso i fori della bava e con gli elettrodi di stimolazione tACS lateralmente. Abbreviazione: tACS = stimolazione transcranica in corrente alternata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Come modo per valutare i meccanismi, possiamo anche interrogare le interazioni con altri processi fisiologici che alterano il CBF, come la depolarizzazione diffusa indotta da K^{+ 11}. Inoltre, piuttosto che sessioni programmate a orari regolari, è anche possibile sviluppare un sistema a circuito chiuso basato su biomarcatori aggiuntivi per una varietà di malattie, come è stato proposto per il trattamento dell’epilessia¹² (ad esempio, dispositivi clinici Neuropace). Ad esempio, la stimolazione cerebrale a circuito chiuso per la malattia di Parkinson si basa comunemente sui potenziali di campo locale (LFP) intrinseci e anormali intrinseci a questa malattia in assenza di una quantità sufficiente di dopamina (tipicamente LFP a banda β)¹³.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee della Duke University o dall’autorità locale equivalente che regola la ricerca sugli animali. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, gli strumenti e le attrezzature utilizzati in questo protocollo. 1. Preparazione dello strumento Assicurarsi che tutti gli elementi e gli strumenti chirurgici necessari siano a posto (<st…

Representative Results

I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 4, nella Figura 5 e nella Figura 6. La Figura 4 mostra un esempio dei quattro canali con i due elettrodi di registrazione intracranica sui canali superiori e le risposte CBF sui canali inferiori. Il tACS è simmetrico in tutto il cranio, ma generalmente la risposta del campo intracranico è leggermente asimmetrica per le correnti alternate applicate…

Discussion

Questo protocollo si concentra sulla misurazione in vivo e anestetizzata della risposta CBF come biomarcatore per stimare la risposta cerebrale a tES¹⁴. I biomarcatori a lungo termine della risposta tES includono gli effetti istologici del trattamento, come la prevenzione o i cambiamenti nella formazione della placca amiloide (ad esempio, con la stimolazione gamma a 40 Hz in diversi modelli di AD)^{16,17,18,19</sup…}

Materials

Alcohol pads	HenryShein	112-6131
Baby mineral oil	Johnson & Johnson
BD 1 mL syringe	Becton Dikinson	REF 305699
C3 Flat Surface Electrodes	Neuronexus
C57BI mice			from NIH colonies
Copper skull electrods	In house preparation
Digidata 1440, Clampex	Axon Instruments
Dumont #5 forceps	FST	#5
Dumont #7 forceps curved	Dumont	RS-5047
Eye ointment	Major	LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter instrument Co.	Model P-87
Forceps 11.5 cm slight curve  serrated	Roboz	RS-8254
Intramedic needle 23 G	Becton Dikinson	REF 427565
KCl 1 M	In house preparation
Laser Doppler Probes	Moor Instruments	0.46 mm laser doppler probes
Laser Speckle Imaging Device	RWD	RFLSI-ZW
Micro curette 13 cm	FST	10080-05
Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm	Roboz	RS-5914
Mouse anesthesia fixation	Stoelting
Neuroconn-DS	Neurocare	DC-Stimulator Plus
PhysioSuite Monitoring	Kent Scientific
Q-tips	Fisherbrand	22363167
Saline 0.9% NaCl solution	Baxter	281322
Sensicam QE	PCO Instruments
Software	Axon Instruments Clampex
Surgical glue	Covetrus	31477
Surgical tape	3M Transpore	T9784