Plassering av ekstrakranielle stimulerende elektroder og måling av cerebral blodstrøm og intrakranielle elektriske felt hos anesteserte mus

Summary

Vi beskriver en protokoll for vurdering av dose-responskurver for ekstrakraniell stimulering med tanke på elektriske feltmålinger i hjernen og relevant biomarkør-cerebral blodstrøm. Siden denne protokollen innebærer invasiv elektrodeplassering i hjernen, er generell anestesi nødvendig, med spontan pust foretrukket i stedet for kontrollerte respirasjoner.

Abstract

Deteksjon av cerebral blodstrøm (CBF) responser på ulike former for nevronaktivering er avgjørende for å forstå dynamisk hjernefunksjon og variasjoner i substratforsyningen til hjernen. Denne artikkelen beskriver en protokoll for måling av CBF-responser på transkraniell vekselstrømstimulering (tACS). Dose-responskurver estimeres både fra CBF-endringen som forekommer med tACS (mA) og fra det intrakraniale elektriske feltet (mV/mm). Vi estimerer det intrakraniale elektriske feltet basert på de forskjellige amplitudene målt med glassmikroelektroder i hver side av hjernen. I dette papiret beskriver vi det eksperimentelle oppsettet, som innebærer å bruke enten bilaterale laserdopplerprober (LD) eller laserspeckle imaging (LSI) for å måle CBF; Som et resultat krever dette oppsettet anestesi for elektrodeplassering og stabilitet. Vi presenterer en korrelasjon mellom CBF-respons og strøm som funksjon av alder, og viser en signifikant større respons ved høyere strømmer (1,5 mA og 2,0 mA) hos unge kontrolldyr (12-14 uker) sammenlignet med eldre dyr (28-32 uker) (p < 0,005 forskjell). Vi demonstrerer også en signifikant CBF-respons ved elektriske feltstyrker <5 mV / mm, noe som er en viktig faktor for eventuelle menneskelige studier. Disse CBF-responsene er også sterkt påvirket av bruk av anestesi sammenlignet med våkne dyr, respirasjonskontrollen (dvs. intubert vs. spontan pust), systemiske faktorer (dvs. CO₂) og lokal ledning i blodkarene, som medieres av pericytter og endotelceller. På samme måte kan mer detaljerte bildebehandlings- / opptaksteknikker begrense feltstørrelsen fra hele hjernen til bare en liten region. Vi beskriver bruken av ekstrakranielle elektroder for påføring av tACS-stimulering, inkludert både hjemmelagde og kommersielle elektrodedesign for gnagere, samtidig måling av CBF og intrakranielt elektrisk felt ved bruk av bilaterale glass DC-opptakselektroder, og avbildningsmetodene. Vi bruker for tiden disse teknikkene for å implementere et lukket sløyfeformat for å forsterke CBF i dyremodeller av Alzheimers sykdom og hjerneslag.

Introduction

Transkraniell elektrisk stimulering (tES; med sinusbølgestimulering, tACS) er en vanlig, ekstern, ikke-invasiv tilnærming til hjernens nevromodulering ^1,2. Tidligere antydet vi at ved visse doser kan tES (og spesielt tACS) øke cerebral blodstrøm (CBF) i de underliggende hjernegruppene³. Videre kan det eksistere et dose-responsforhold mellom enten den påførte eksterne strømmen eller det intrakranielle elektriske feltet og de resulterende CBF-responsene. Imidlertid har de fleste kliniske stimuleringsprotokoller fokusert på et maksimalt komfortabelt hudnivå av stimulering (dvs. ~ 2 mA) i planlagte tidsperioder (dvs. 30-45 min) som en behandlingsprotokoll ^4,5. Hos gnagere er det mulig å bruke invasive, ekstrakranielle hjerneelektroder påført direkte på skallen for å undersøke de elektriske feltene i hjernen indusert av tES⁶. Derfor er målet med denne tilnærmingen å bestemme effekten av intensiteten av tACS ved relevante frekvenser på CBF-endringer når det gjelder dose-responsforholdet. Denne dose-responskurven er basert på en kortsiktig fysiologisk biomarkør-direkte målinger av CBF-i forhold til det elektriske feltet pålagt hjernen³. Vi har tidligere vist at ved større amplituder, typisk utenfor rekkevidden av elektriske felt i hjernen indusert av tACS klinisk, er det en nesten lineær korrelasjon mellom det induserte elektriske feltet og CBF i cortex³. Imidlertid kan stimulering av mindre felt (dvs. intensitet på 1-5 mV/mm) være mer relevant og gjennomførbart for bruk hos mennesker. Derfor har vi modifisert teknikkene våre for å oppdage mindre CBF-endringer.

Dette papiret beskriver en protokoll for å analysere effekten av tES alternerende sinusstrømmer (tACS) med lavere feltstyrke på CBF (dvs. 0,5-2,0 mA strøm, 1-5 mV / mm elektrisk felt), som kan tolereres av våkne gnagere⁵. Denne protokollen innebærer bruk av ny laserspeckle-avbildning under tACS, samt doble intrakranielle glasselektroder, for å bestemme både spredningen av aktiv tACS i hjernen (som overvåket av CBF) og den intrakranielle elektriske feltintensiteten, som vises både som et diagram og et faktisk eksperimentelt fotografi (figur 1). Det er mange mulige fysiologiske effekter av tES i hjernen, inkludert direkte nevronmodulering, nevral plastisitet og astrocytaktivering ^7,8. Selv om CBF har blitt målt med tDCS ^9,10, var disse målingene langsomme, indirekte og utilstrekkelige for å vurdere dose-respons-funksjonen i hjernen. Derfor, ved å bruke passende kortsiktige biomarkører (dvs. CBF, elektriske felt) og raske av / på-sekvenser av tACS, kan vi nå estimere dose-responsfunksjonen mer nøyaktig. Videre kan vi bruke forskjellige teknikker for å måle CBF, inkludert både fokal laser dopplerprober (LD) og laser speckle imaging (LSI) med definerte interesseområder.

Figur 1: Transkranielt stimuleringsdiagram og fotografisk eksempel. (A) Diagram over transkranielt stimuleringsoppsett. Diagrammet viser en museskalle med koronale og sagittale suturer. De transkraniale elektrodene er plassert lateralt og symmetrisk på skallen og er montert med kirurgisk lim og ledende pasta mellom elektrodene og skallen. Disse elektrodene er koblet til en menneskekompatibel, konstant strømstimuleringsenhet, som kan spesifisere frekvensen, amplituden og varigheten av stimuleringen. For vurdering av intrakranielle elektriske felt plasseres bilaterale glasselektroder (~ 2 MΩ) i hjernebarken (dvs. innen 1 mm fra det indre aspektet av skallen gjennom små burrhull), og disse er forseglet med mineralolje og har AgCl-grunnlag i nakkemuskelen (vist som større ledninger i midten begravet i det subkutane nakkevevet). Disse glasselektrodene er koblet til en DC-forsterker, og deres utganger registreres gjennom en digitaliserer med minst fire kanaler. Bilaterale laser Doppler-sonder er også plassert på skallen for opptak. Hele skallen er også avbildet med enten en laserspeckle-bildebehandlingsenhet eller et høyoppløselig (minst 1,024 x 1,024 piksler, 12-14 bit pikseldybde) avkjølt kamera for egen optisk signaldeteksjon. Hemoglobin isosbestisk frekvens er vanligvis valgt (dvs. 562 nm) for belysning for blodstrømsavbildning. (B) Et nærbilde av et faktisk eksperiment, som viser de bilaterale laserdopplerprobene (til venstre), de (bilaterale) intrakraniale glassopptaksmikroelektrodene plassert gjennom burrhullene, og med tACS-stimulerende elektroder lateralt. Forkortelse: tACS = transkraniell vekselstrømstimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Som en måte å vurdere mekanismene på, kan vi også forhøre interaksjoner med andre fysiologiske prosesser som også endrer CBF, for eksempel K ⁺ -indusert spredning av depolarisering¹¹. Videre, i stedet for planlagte økter til faste tider, er det også mulig å utvikle et lukket sløyfesystem basert på ytterligere biomarkører for en rekke sykdommer, som har blitt foreslått for epilepsibehandling¹² (dvs. kliniske Neuropace-enheter). For eksempel er hjernestimulering med lukket sløyfe for Parkinsons sykdom vanligvis basert på de iboende, unormale lokale feltpotensialene (LFP) som er iboende for denne sykdommen i fravær av tilstrekkelig dopamin (vanligvis LFP med β-bånd)¹³.

Protocol

Alle dyreprosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Duke University eller tilsvarende lokale myndigheter som regulerer forskning som involverer dyr. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, instrumenter og utstyr som brukes i denne protokollen. 1. Instrument forberedelse Forsikre deg om at alle nødvendige gjenstander og kirurgiske instrumenter er på plass (figur 2): reng…

Representative Results

Representative resultater er vist i figur 4, figur 5 og figur 6. Figur 4 viser et eksempel på de fire kanalene med de to intrakraniale registreringselektrodene på de øvre kanalene og CBF-responsene på de nedre kanalene. tACS er symmetrisk over skallen, men generelt er den intrakraniale feltresponsen litt asymmetrisk for påførte vekselstrømsstrømmer, der den ene siden viser større respons enn de…

Discussion

Denne protokollen fokuserer på in vivo, bedøvet måling av CBF-responsen som en biomarkør for å estimere hjernens respons på tES¹⁴. Langsiktige biomarkører for tES-responsen inkluderer histologiske behandlingseffekter, for eksempel forebygging av eller endringer i amyloidplakkdannelse (dvs. med gammastimulering ved 40 Hz i flere AD-modeller)^16,17,18,19, men kortsikti…

Materials

Alcohol pads	HenryShein	112-6131
Baby mineral oil	Johnson & Johnson
BD 1 mL syringe	Becton Dikinson	REF 305699
C3 Flat Surface Electrodes	Neuronexus
C57BI mice			from NIH colonies
Copper skull electrods	In house preparation
Digidata 1440, Clampex	Axon Instruments
Dumont #5 forceps	FST	#5
Dumont #7 forceps curved	Dumont	RS-5047
Eye ointment	Major	LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter instrument Co.	Model P-87
Forceps 11.5 cm slight curve  serrated	Roboz	RS-8254
Intramedic needle 23 G	Becton Dikinson	REF 427565
KCl 1 M	In house preparation
Laser Doppler Probes	Moor Instruments	0.46 mm laser doppler probes
Laser Speckle Imaging Device	RWD	RFLSI-ZW
Micro curette 13 cm	FST	10080-05
Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm	Roboz	RS-5914
Mouse anesthesia fixation	Stoelting
Neuroconn-DS	Neurocare	DC-Stimulator Plus
PhysioSuite Monitoring	Kent Scientific
Q-tips	Fisherbrand	22363167
Saline 0.9% NaCl solution	Baxter	281322
Sensicam QE	PCO Instruments
Software	Axon Instruments Clampex
Surgical glue	Covetrus	31477
Surgical tape	3M Transpore	T9784