Colocação de eletrodos estimuladores extracranianos e mensuração do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos intracranianos em camundongos anestesiados

Summary

Descrevemos um protocolo para avaliação de curvas dose-resposta para estimulação extracraniana em termos de medidas de campo elétrico cerebral e um biomarcador relevante de fluxo sanguíneo cerebral. Como esse protocolo envolve a colocação invasiva de eletrodos no cérebro, a anestesia geral é necessária, com respiração espontânea preferida em vez de respiração controlada.

Abstract

A detecção de respostas do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) a várias formas de ativação neuronal é crítica para a compreensão da função cerebral dinâmica e das variações no fornecimento de substrato para o cérebro. Este trabalho descreve um protocolo para medir as respostas do FSC à estimulação transcraniana por corrente alternada (tACS). As curvas dose-resposta são estimadas tanto a partir da alteração do FSC ocorrida com a tACS (mA) quanto do campo elétrico intracraniano (mV/mm). Estimamos o campo elétrico intracraniano com base nas diferentes amplitudes medidas por microeletrodos de vidro dentro de cada lado do cérebro. Neste trabalho, descrevemos o arranjo experimental, que envolve o uso de sondas bilaterais com laser Doppler (LD) ou laser speckle imaging (LSI) para medir o FSC; Como resultado, essa configuração requer anestesia para a colocação e estabilidade do eletrodo. Apresentamos uma correlação entre a resposta do FSC e a corrente em função da idade, mostrando uma resposta significativamente maior em correntes mais altas (1,5 mA e 2,0 mA) em animais controles jovens (12-14 semanas) em comparação com animais mais velhos (28-32 semanas) (p < diferença de 0,005). Também demonstramos uma resposta significativa do FSC em intensidades de campo elétrico <5 mV/mm, o que é uma consideração importante para estudos em humanos eventuais. Essas respostas do FSC também são fortemente influenciadas pelo uso de anestesia em comparação com animais acordados, pelo controle da respiração (i.e., respiração intubada vs. espontânea), fatores sistêmicos (i.e., CO₂) e condução local dentro dos vasos sanguíneos, que é mediada por pericitos e células endoteliais. Da mesma forma, técnicas de imagem/gravação mais detalhadas podem limitar o tamanho do campo de todo o cérebro a apenas uma pequena região. Descrevemos o uso de eletrodos extracranianos para a aplicação da estimulação tACS, incluindo desenhos de eletrodos caseiros e comerciais para roedores, a medição concomitante do FSC e do campo elétrico intracraniano usando eletrodos de gravação DC de vidro bilateral e as abordagens de imagem. Atualmente, estamos aplicando essas técnicas para implementar um formato de circuito fechado para aumentar a FBC em modelos animais de doença de Alzheimer e acidente vascular cerebral.

Introduction

A estimulação elétrica transcraniana (tES; com estimulação por onda senoidal, tACS) é uma abordagem comum, externa e não invasiva da neuromodulação cerebral ^1,2. Previamente, levantamos a hipótese de que, em determinadas doses, a tES (e particularmente a tACS) poderia aumentar o fluxo sanguíneo cerebral (FSC) nas regiões cerebrais^{subjacentes 3}. Além disso, pode existir uma relação dose-resposta entre a corrente externa aplicada ou o campo elétrico intracraniano e as respostas resultantes do FSC. No entanto, a maioria dos protocolos de estimulação clínica tem focado em um nível máximo de estimulação confortável da pele (i.e., ~ 2 mA) por períodos de tempo programados (i.e., 30-45 min) como um protocolo de tratamento ^4,5. Em roedores, é possível utilizar eletrodos cerebrais extracranianos invasivos aplicados diretamente no crânio para investigar os campos elétricos no cérebro induzidos pela^EET6. Assim, o objetivo desta abordagem é determinar os efeitos da intensidade da tACS em frequências relevantes sobre as mudanças do FSC em termos da relação dose-resposta. Essa curva dose-resposta baseia-se em um biomarcador fisiológico de curto prazo – medidas diretas do FSC – em relação ao campo elétrico imposto ao cérebro³. Mostramos anteriormente que, em amplitudes maiores, tipicamente além da faixa de campos elétricos dentro do cérebro induzidos clinicamente pela tACS, existe uma correlação quase linear entre o campo elétrico induzido e o FSC no córtex³. No entanto, a estimulação de campo menor (ou seja, intensidade de 1-5 mV/mm) pode ser mais relevante e viável para uso em humanos; portanto, modificamos nossas técnicas para detectar alterações menores no FSC.

Este trabalho descreve um protocolo para analisar os efeitos das correntes senoidais alternadas de tES de menor intensidade de campo (tACS) sobre o FSC (isto é, corrente de 0,5-2,0 mA, campo elétrico de 1-5 mV/mm), que pode ser tolerado por roedores acordados⁵. Esse protocolo envolve o uso de novas imagens de laser speckle durante a tACS, bem como eletrodos de vidro intracraniano duplos, para determinar tanto a disseminação de tACS ativa dentro do cérebro (como monitorado pelo FSC) quanto a intensidade do campo elétrico intracraniano, que é mostrado tanto como um diagrama quanto como uma fotografia experimental real (Figura 1). Existem muitos efeitos fisiológicos possíveis da EETt no cérebro, incluindo modulação neuronal direta, plasticidade neural e ativação de astrócitos ^7,8. Embora o FSC tenha sido medido com ETCC ^9,10, essas medidas foram lentas, indiretas e insuficientes para avaliar a função dose-resposta no cérebro. Portanto, usando biomarcadores apropriados de curto prazo (i.e., FSC, campos elétricos) e sequências rápidas de liga/desliga de tACS, podemos agora estimar a função dose-resposta com mais precisão. Além disso, podemos aplicar diferentes técnicas para medir o FSC, incluindo sondas focais laser Doppler (LD) e laser speckle imaging (LSI) com regiões de interesse definidas.

Figura 1: Diagrama de estimulação transcraniana e exemplo fotográfico. (A) Diagrama do setup da estimulação transcraniana. O diagrama mostra um crânio de camundongo com pontos coronais e sagitais. Os eletrodos transcranianos são colocados lateral e simetricamente sobre o crânio e são montados com cola cirúrgica e pasta condutora entre os eletrodos e o crânio. Esses eletrodos são conectados a um dispositivo de estimulação de corrente constante compatível com humanos, que pode especificar a frequência, amplitude e duração da estimulação. Para a avaliação dos campos elétricos intracranianos, eletrodos de vidro bilaterais (~2 MΩ) são colocados no córtex cerebral (ou seja, dentro de 1 mm da face interna do crânio através de pequenos orifícios de rebarba), e estes são selados com óleo mineral e têm base de AgCl no músculo do pescoço (mostrados como fios maiores no centro enterrados no tecido cervical subcutâneo). Estes eletrodos de vidro são conectados a um amplificador DC, e suas saídas são gravadas através de um digitalizador com pelo menos quatro canais. Sondas laser Doppler bilaterais também são colocadas no crânio para registros. Todo o crânio também é fotografado com um dispositivo de imagem a laser speckle ou uma câmera resfriada de alta resolução (pelo menos 1.024 x 1.024 pixels, 12-14 bits de profundidade de pixel) para detecção de sinal óptico intrínseco. A frequência isosbestic da hemoglobina é tipicamente escolhida (isto é, 562 nm) para iluminação para imagens do fluxo sanguíneo. (B) Imagem em close-up de um experimento real, mostrando as sondas laser Doppler bilaterais (à esquerda), os microeletrodos de gravação de vidro intracraniano (bilateral) colocados através dos orifícios da broca e com os eletrodos estimuladores de tACS lateralmente. Abreviação: tACS = estimulação transcraniana por corrente alternada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como forma de avaliar os mecanismos, também podemos interrogar interações com outros processos fisiológicos que também alteram o FSC, como a despolarização disseminada induzida por K⁺¹¹. Além disso, em vez de sessões agendadas em horários regulares, também é possível desenvolver um sistema de circuito fechado baseado em biomarcadores adicionais para uma variedade de doenças, como tem sido proposto para o tratamento da epilepsia¹² (i.e., dispositivos clínicos Neuropace). Por exemplo, a estimulação cerebral em circuito fechado para a doença de Parkinson é comumente baseada nos potenciais de campo local (LFPs) intrínsecos e anormais intrínsecos a essa doença na ausência de dopamina suficiente (tipicamente LFPs de banda β)¹³.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Duke University ou pela autoridade local equivalente que regulamenta pesquisas envolvendo animais. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, instrumentos e equipamentos utilizados neste protocolo. 1. Preparação do instrumento Certifique-se de que todos os itens necessários e instrumentos cirúrgicos estej…

Representative Results

Resultados representativos são mostrados na Figura 4, Figura 5 e Figura 6. A Figura 4 mostra um exemplo dos quatro canais com os dois eletrodos de registro intracraniano nos canais superiores e as respostas do FSC nos canais inferiores. A tACS é simétrica em todo o crânio, mas geralmente a resposta do campo intracraniano é ligeiramente assimétrica para as correntes AC aplicadas, com um lado aprese…

Discussion

Este protocolo concentra-se na medida in vivo e anestesiada da resposta do FSC como um biomarcador para estimar a resposta cerebral à tES¹⁴. Biomarcadores de longo prazo da resposta à tES incluem efeitos histológicos do tratamento, como a prevenção ou alterações na formação de placa amiloide (isto é, com estimulação gama a 40 Hz em vários modelos de DA)^{16,17,18,19,<…}

Materials

Alcohol pads	HenryShein	112-6131
Baby mineral oil	Johnson & Johnson
BD 1 mL syringe	Becton Dikinson	REF 305699
C3 Flat Surface Electrodes	Neuronexus
C57BI mice			from NIH colonies
Copper skull electrods	In house preparation
Digidata 1440, Clampex	Axon Instruments
Dumont #5 forceps	FST	#5
Dumont #7 forceps curved	Dumont	RS-5047
Eye ointment	Major	LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter instrument Co.	Model P-87
Forceps 11.5 cm slight curve  serrated	Roboz	RS-8254
Intramedic needle 23 G	Becton Dikinson	REF 427565
KCl 1 M	In house preparation
Laser Doppler Probes	Moor Instruments	0.46 mm laser doppler probes
Laser Speckle Imaging Device	RWD	RFLSI-ZW
Micro curette 13 cm	FST	10080-05
Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm	Roboz	RS-5914
Mouse anesthesia fixation	Stoelting
Neuroconn-DS	Neurocare	DC-Stimulator Plus
PhysioSuite Monitoring	Kent Scientific
Q-tips	Fisherbrand	22363167
Saline 0.9% NaCl solution	Baxter	281322
Sensicam QE	PCO Instruments
Software	Axon Instruments Clampex
Surgical glue	Covetrus	31477
Surgical tape	3M Transpore	T9784