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Neuroscience

Colocação de eletrodos estimuladores extracranianos e mensuração do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos intracranianos em camundongos anestesiados

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65195

Summary

Descrevemos um protocolo para avaliação de curvas dose-resposta para estimulação extracraniana em termos de medidas de campo elétrico cerebral e um biomarcador relevante de fluxo sanguíneo cerebral. Como esse protocolo envolve a colocação invasiva de eletrodos no cérebro, a anestesia geral é necessária, com respiração espontânea preferida em vez de respiração controlada.

Abstract

A detecção de respostas do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) a várias formas de ativação neuronal é crítica para a compreensão da função cerebral dinâmica e das variações no fornecimento de substrato para o cérebro. Este trabalho descreve um protocolo para medir as respostas do FSC à estimulação transcraniana por corrente alternada (tACS). As curvas dose-resposta são estimadas tanto a partir da alteração do FSC ocorrida com a tACS (mA) quanto do campo elétrico intracraniano (mV/mm). Estimamos o campo elétrico intracraniano com base nas diferentes amplitudes medidas por microeletrodos de vidro dentro de cada lado do cérebro. Neste trabalho, descrevemos o arranjo experimental, que envolve o uso de sondas bilaterais com laser Doppler (LD) ou laser speckle imaging (LSI) para medir o FSC; Como resultado, essa configuração requer anestesia para a colocação e estabilidade do eletrodo. Apresentamos uma correlação entre a resposta do FSC e a corrente em função da idade, mostrando uma resposta significativamente maior em correntes mais altas (1,5 mA e 2,0 mA) em animais controles jovens (12-14 semanas) em comparação com animais mais velhos (28-32 semanas) (p < diferença de 0,005). Também demonstramos uma resposta significativa do FSC em intensidades de campo elétrico <5 mV/mm, o que é uma consideração importante para estudos em humanos eventuais. Essas respostas do FSC também são fortemente influenciadas pelo uso de anestesia em comparação com animais acordados, pelo controle da respiração (i.e., respiração intubada vs. espontânea), fatores sistêmicos (i.e., CO2) e condução local dentro dos vasos sanguíneos, que é mediada por pericitos e células endoteliais. Da mesma forma, técnicas de imagem/gravação mais detalhadas podem limitar o tamanho do campo de todo o cérebro a apenas uma pequena região. Descrevemos o uso de eletrodos extracranianos para a aplicação da estimulação tACS, incluindo desenhos de eletrodos caseiros e comerciais para roedores, a medição concomitante do FSC e do campo elétrico intracraniano usando eletrodos de gravação DC de vidro bilateral e as abordagens de imagem. Atualmente, estamos aplicando essas técnicas para implementar um formato de circuito fechado para aumentar a FBC em modelos animais de doença de Alzheimer e acidente vascular cerebral.

Introduction

A estimulação elétrica transcraniana (tES; com estimulação por onda senoidal, tACS) é uma abordagem comum, externa e não invasiva da neuromodulação cerebral 1,2. Previamente, levantamos a hipótese de que, em determinadas doses, a tES (e particularmente a tACS) poderia aumentar o fluxo sanguíneo cerebral (FSC) nas regiões cerebraissubjacentes 3. Além disso, pode existir uma relação dose-resposta entre a corrente externa aplicada ou o campo elétrico intracraniano e as respostas resultantes do FSC. No entanto, a maioria dos protocolos de estimulação clínica tem focado em um nível máximo de estimulação confortável da pele (i.e., ~ 2 mA) por períodos de tempo programados (i.e., 30-45 min) como um protocolo de tratamento 4,5. Em roedores, é possível utilizar eletrodos cerebrais extracranianos invasivos aplicados diretamente no crânio para investigar os campos elétricos no cérebro induzidos pelaEET6. Assim, o objetivo desta abordagem é determinar os efeitos da intensidade da tACS em frequências relevantes sobre as mudanças do FSC em termos da relação dose-resposta. Essa curva dose-resposta baseia-se em um biomarcador fisiológico de curto prazo - medidas diretas do FSC - em relação ao campo elétrico imposto ao cérebro3. Mostramos anteriormente que, em amplitudes maiores, tipicamente além da faixa de campos elétricos dentro do cérebro induzidos clinicamente pela tACS, existe uma correlação quase linear entre o campo elétrico induzido e o FSC no córtex3. No entanto, a estimulação de campo menor (ou seja, intensidade de 1-5 mV/mm) pode ser mais relevante e viável para uso em humanos; portanto, modificamos nossas técnicas para detectar alterações menores no FSC.

Este trabalho descreve um protocolo para analisar os efeitos das correntes senoidais alternadas de tES de menor intensidade de campo (tACS) sobre o FSC (isto é, corrente de 0,5-2,0 mA, campo elétrico de 1-5 mV/mm), que pode ser tolerado por roedores acordados5. Esse protocolo envolve o uso de novas imagens de laser speckle durante a tACS, bem como eletrodos de vidro intracraniano duplos, para determinar tanto a disseminação de tACS ativa dentro do cérebro (como monitorado pelo FSC) quanto a intensidade do campo elétrico intracraniano, que é mostrado tanto como um diagrama quanto como uma fotografia experimental real (Figura 1). Existem muitos efeitos fisiológicos possíveis da EETt no cérebro, incluindo modulação neuronal direta, plasticidade neural e ativação de astrócitos 7,8. Embora o FSC tenha sido medido com ETCC 9,10, essas medidas foram lentas, indiretas e insuficientes para avaliar a função dose-resposta no cérebro. Portanto, usando biomarcadores apropriados de curto prazo (i.e., FSC, campos elétricos) e sequências rápidas de liga/desliga de tACS, podemos agora estimar a função dose-resposta com mais precisão. Além disso, podemos aplicar diferentes técnicas para medir o FSC, incluindo sondas focais laser Doppler (LD) e laser speckle imaging (LSI) com regiões de interesse definidas.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de estimulação transcraniana e exemplo fotográfico. (A) Diagrama do setup da estimulação transcraniana. O diagrama mostra um crânio de camundongo com pontos coronais e sagitais. Os eletrodos transcranianos são colocados lateral e simetricamente sobre o crânio e são montados com cola cirúrgica e pasta condutora entre os eletrodos e o crânio. Esses eletrodos são conectados a um dispositivo de estimulação de corrente constante compatível com humanos, que pode especificar a frequência, amplitude e duração da estimulação. Para a avaliação dos campos elétricos intracranianos, eletrodos de vidro bilaterais (~2 MΩ) são colocados no córtex cerebral (ou seja, dentro de 1 mm da face interna do crânio através de pequenos orifícios de rebarba), e estes são selados com óleo mineral e têm base de AgCl no músculo do pescoço (mostrados como fios maiores no centro enterrados no tecido cervical subcutâneo). Estes eletrodos de vidro são conectados a um amplificador DC, e suas saídas são gravadas através de um digitalizador com pelo menos quatro canais. Sondas laser Doppler bilaterais também são colocadas no crânio para registros. Todo o crânio também é fotografado com um dispositivo de imagem a laser speckle ou uma câmera resfriada de alta resolução (pelo menos 1.024 x 1.024 pixels, 12-14 bits de profundidade de pixel) para detecção de sinal óptico intrínseco. A frequência isosbestic da hemoglobina é tipicamente escolhida (isto é, 562 nm) para iluminação para imagens do fluxo sanguíneo. (B) Imagem em close-up de um experimento real, mostrando as sondas laser Doppler bilaterais (à esquerda), os microeletrodos de gravação de vidro intracraniano (bilateral) colocados através dos orifícios da broca e com os eletrodos estimuladores de tACS lateralmente. Abreviação: tACS = estimulação transcraniana por corrente alternada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como forma de avaliar os mecanismos, também podemos interrogar interações com outros processos fisiológicos que também alteram o FSC, como a despolarização disseminada induzida por K+11. Além disso, em vez de sessões agendadas em horários regulares, também é possível desenvolver um sistema de circuito fechado baseado em biomarcadores adicionais para uma variedade de doenças, como tem sido proposto para o tratamento da epilepsia12 (i.e., dispositivos clínicos Neuropace). Por exemplo, a estimulação cerebral em circuito fechado para a doença de Parkinson é comumente baseada nos potenciais de campo local (LFPs) intrínsecos e anormais intrínsecos a essa doença na ausência de dopamina suficiente (tipicamente LFPs de banda β)13.

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Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Duke University ou pela autoridade local equivalente que regulamenta pesquisas envolvendo animais. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, instrumentos e equipamentos utilizados neste protocolo.

1. Preparação do instrumento

  1. Certifique-se de que todos os itens necessários e instrumentos cirúrgicos estejam no lugar (Figura 2): solução de limpeza do couro cabeludo (compressas de álcool), fita, pinça, tesoura e uma broca para colocação dos pequenos orifícios de rebarba (0,5 mm).
  2. Prepare os eletrodos de superfície extracraniana para aplicação no crânio e certifique-se de que qualquer cola cirúrgica tenha sido limpa deles, caso tenham sido usados anteriormente.
  3. Verifique a impedância desses eletrodos tACS diretamente antes de aplicá-los no crânio. Para isso, use a função de medição embutida do estimulador tACS com ambos os eletrodos colocados em um banho de soro fisiológico.
    NOTA: A impedância preferida é de <5 KΩ por par de eletrodos para permitir que corrente suficiente seja passada através do crânio. O dispositivo estimulador verifica a impedância antes de fornecer pulsos de corrente constante e fornece o valor diretamente.

Figure 2
Figura 2: Fotografia da instrumentação necessária, incluindo instrumentos dissecadores e tesoura, para o preparo da estimulação extracraniana. 1. Tesoura microdissecante, 11,5 cm; 2. Pinças, 11,5 cm, leve curva, serrilhada; 3. Pinça Dumont #7, curva; 4. Pinça Dumont #5; 5. Micro cureta, 13 cm; 6. Q-dicas; 7. Fita cirúrgica; 8. Almofadas de álcool. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparo do animal para a cirurgia

NOTA: Para estes experimentos, foram utilizados 14 camundongos controle C57BL/6 entre 12 semanas e 33 semanas de idade, sendo cinco machos e nove fêmeas.

  1. Anestesiar o animal em câmara de indução com isoflurano emO2 a 30% a ~1,5 L/min, sendo ~4% inicialmente induzir e ~1,25%-1,5% manter em nível de anestesia com respiração espontânea e suficiente para eliminar a resposta de pinça caudal.
  2. Transfira o animal para o quadro estereotáxico após a indução e, em seguida, fixe a cabeça no cone nasal e nas barras auriculares para a subsequente aplicação do eletrodo e procedimento de furo da broca (Figura 1 e Figura 3).
  3. Conecte o cone do nariz da estrutura estereotáxica ao vaporizador através de uma entrada e a uma saída para remover qualquer resíduo de isoflurano através de um sistema de limpeza (por exemplo, carvão ou vácuo). Certifique-se de que não há vazamento de ar do cone nasal, tanto para manter o nível de anestesia com o isofluorano quanto para evitar vazamento acidental para o ar ambiente (Figura 3).
  4. Verificar a posição do camundongo no quadro estereotáxico, incluindo a posição do cone nasal, para permitir a respiração espontânea sem intubação, bem como a recuperação e o sequestro adequados da anestesia para proteger o pessoal da pesquisa (Figura 3).
  5. Colocar as sondas para medir o pulso, a saturação de oxigênio pulsada (pulso OX), a pressão arterial e a temperatura no animal; Certifique-se de que a oxigenação mínima do pulso seja de 90% e que o pulso seja de >450/min (o limite inferior do alarme é mostrado como 380 pulsos/min). Registrar esses parâmetros durante o procedimento em intervalos regulares ou contínuos, dependendo do sistema de registro (Figura 3).
  6. Antes de iniciar o procedimento, verifique o nível de sedação do animal usando (por exemplo) uma pinça do dedo do pé para verificar os reflexos. Se não houver reflexo, o nível de sedação é ótimo, desde que o animal mantenha a respiração espontânea e oxigenação de pulso adequada. Se houver um reflexo, aumente a administração de isoflurano para aprofundar o nível da anestesia e, em seguida, verifique novamente o reflexo. Observar e monitorar continuamente a frequência respiratória do animal e ajustar a administração de isoflurano de acordo.
  7. Raspe os cabelos do couro cabeludo ou remova os cabelos com creme depilatório (limpe o creme residual com passagens de almofada de álcool).
  8. Aplique pomada ocular e, em seguida, limpe assepticamente o couro cabeludo com três passagens de iodo e álcool antes da excisão usando tesoura.

Figure 3
Figura 3: Imagem do animal no quadro estereotáxico, com o crânio exposto e apenas os eletrodos estimuladores tACS no local (antes da colocação da broca). Observe o aparelho de pressão arterial ao redor da cauda e o oxímetro de pulso na pata, com a leitura à esquerda. Existem tubos de remoção para o isoflurano ao redor do cone nasal. Abreviação: tACS = estimulação transcraniana por corrente alternada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Procedimento cirúrgico: Aplicar os eletrodos estimuladores e fazer os orifícios da broca

  1. Para um estudo terminal, remova o couro cabeludo com tesoura cirúrgica e exponha o crânio ~3 mm da sutura lambdoide caudalmente e ~3 mm frontal ao bregma para expor parte da sutura frontal posterior. Excisar parietalmente o couro cabeludo para expor a parte inicial do músculo temporal em ambos os lados (Figura 3).
  2. Remova todos os tecidos conjuntivos subcutâneos residuais para que o crânio esteja limpo e seco para a aplicação dos eletrodos estimulantes.
  3. Aplique gel condutor ou pasta na lateral dos eletrodos que estarão em contato com o crânio e fixe os eletrodos com supercola cirúrgica ao redor da borda em pontos intermitentes.
    NOTA: Não permita que o gel condutor interfira com a supercola cirúrgica para permitir uma melhor ligação à superfície do crânio. A superfície externa dos eletrodos também pode ser isolada (do couro cabeludo se este for fechado durante uma cirurgia de sobrevivência) usando supercola cirúrgica.
  4. Use eletrodos planos comerciais ou crie eletrodos internos usando fio isolado com diâmetro de 100 μm (soldado à placa) e uma placa de cobre flexível (em uma superfície) de 1 mm x 3 mm cortada de acordo com o tamanho do crânio.
  5. Aplicar pasta de lidocaína no músculo temporal e couro cabeludo em ambos os lados sem perturbar os eletrodos para reduzir a ativação muscular e nervosa periférica.
  6. Uma vez posicionados os eletrodos estimuladores extracranianos 4 mm lateralmente a cada lado do crânio (entre o bregma e o lambda), faça dois furos de broca de 0,5 mm para os eletrodos de vidro 2 mm de cada lado da linha média, distantes 4 mm um do outro, ortogonais à sutura sagital (Figura 1). Preencha esses orifícios de rebarba com óleo mineral estéril para evitar a entrada de corrente no crânio a partir dos eletrodos extracranianos.
  7. Se desejado para um experimento específico induzir depressão disseminada (isto é, depressão disseminada induzida por potássio [K+-SD]), adicione, no lado direito do crânio, um terceiro orifício de broca de 0,5 mm ~1,5 mm rostral à sutura coronal e ~1 mm lateral à sutura frontal posterior. Preencher este orifício da rebarba com soro fisiológico para posterior aplicação de KCl 1 M para induzir K+-SD.
  8. Testar a impedância dos eletrodos estimuladores extracranianos antes da colocação do orifício da broca (e em comparação com os mesmos eletrodos colocados em um banho de soro fisiológico) e após a colocação da broca para verificar se os orifícios da broca não interferem com o fluxo de corrente para o cérebro (ou seja, certifique-se de que a resistência não seja alterada).
    NOTA: A medida da impedância é fornecida diretamente pelo aparelho estimulador. Geralmente, descobrimos que a impedância geral do sistema (isto é, dos eletrodos extracranianos através da via crânio/cérebro, tipicamente ~3 KΩ) é relativamente constante, independentemente dos orifícios da broca e dos microeletrodos de vidro, indicando que há vazamento mínimo de corrente diretamente no cérebro através dos orifícios da rebarba.
  9. Coloque os eletrodos de estimulação transcraniana crônica para estimulação crônica de forma semelhante. Neste caso, isole a superfície externa dos eletrodos, feche o couro cabeludo e túnel os fios isolados através do couro cabeludo ou encaminhe-os para um estágio fixo da cabeça montado no crânio.

4. Procedimento fisiológico

  1. Comece com os aspectos fisiológicos do experimento, uma vez que o animal esteja totalmente preparado para o experimento fisiológico de não sobrevivência. Manter o nível de anestesia suficiente para a respiração espontânea e níveis adequados de pulso, respiratório e de pulso.
  2. Medir o FSC resultante da estimulação extracraniana por um dos dois métodos a seguir.
    1. Coloque o mouse sob um dispositivo de imagem a laser speckle com ou sem eletrodos de registro intracraniano para medir o campo elétrico intracraniano durante os episódios de estimulação (Figura 3).
    2. Transferir o animal para um preparo fisiológico para a colocação de sondas laser Doppler bilaterais e eletrodos intracranianos para medir o campo elétrico intracraniano durante os episódios de estimulação (Figura 1).

5. Colocação bilateral de laser Doppler e eletrodos de vidro

  1. Transferir o animal para um estágio de microscópio para aplicação de sondas laser Doppler bilateralmente. Posicionar as sondas no topo da superfície do crânio entre os orifícios bilaterais da broca e a sutura coronal (Figura 1).
  2. Preencher microeletrodos de vidro tracionados (~0,1 μM, impedância de 2-6 MΩ) com NaCl 0,2 M e colocá-los com micromanipulador nos dois orifícios de broca colocados lateralmente à sutura sagital 3,14 (Figura 1).
    OBS: Esses orifícios de broca estão entre os dois eletrodos simétricos de estimulação extracraniana (Figura 1).
  3. Uma vez inseridos no cérebro, certifique-se de que esses microeletrodos de vidro estejam ~1 mm dentro do córtex cerebral. Execute perfis de profundidade em várias profundidades simétricas. Reencha os orifícios da rebarba com óleo mineral estéril para isolar este caminho para o fluxo de corrente.

6. Procedimento de estimulação e mensuração da intensidade da estimulação transcraniana por corrente alternada (tACS) ou estimulação transcraniana por corrente contínua (ETCC)

  1. Registrar dados contínuos das sondas duplas de laser Doppler no crânio e das duas saídas de microeletrodos intracranianos (gravadas usando um amplificador DC com headstages) usando um sistema de digitalização e software com pelo menos quatro canais (a uma taxa de amostragem de 1 KHz). Uma vez que todos os valores tenham sido registrados ao longo de uma duração basal suficientemente estável (ou seja, >10 min), teste a estimulação extracraniana.
    OBS: A Figura 4 mostra um exemplo dos quatro canais com os dois eletrodos de registro intracraniano nos canais superiores e a resposta do FSC nos canais inferiores.
  2. Aplicar breves períodos de estimulação liga/desliga em várias amplitudes (isto é, 20-30 s, 0,5-2,0 mA, na faixa tolerável) para obter uma linha de base clara antes e depois da estimulação (Figura 4). Aplicar a estimulação entre os dois eletrodos tACS do crânio em ambos os lados (Figura 1) usando um dispositivo de estimulação comercial, compatível com humanos, que fornece uma corrente constante.
  3. Observe atentamente o mouse para contrações musculares ou outras respostas ao tACS, como uma mudança no pulso ou respiração, para criar um limite superior de tolerabilidade (geralmente ~2 mA).
  4. Continue a monitorar a impedância através dos eletrodos com épocas de estimulação para garantir que isso seja constante.
  5. Adicionar uma pequena quantidade (2-3 μL) de KCl 1 M ao orifício anterior da broca14 para induzir eventos espontâneos de K+-SD. Estes geram uma grande resposta de FSC e interações entre a resposta de FSC induzida por K+-SD e a resposta de FSC. Estimar a resposta do tACS CBF, aplicando a estimulação tACS antes e após a ocorrência do DS.
  6. Ao final do experimento, realizar a eutanásia por meio de uma overdose de isoflurano (5%) e, em seguida, decapitar assim que as respirações e os batimentos cardíacos cessarem.

Figure 4
Figura 4: Dados mostrando quatro canais de dados brutos em resposta a tACS de baixa intensidade. Os dados são dispostos com as duas fileiras superiores como os registros elétricos CC diretos intracranianos (rotulados como Input 1 [IN0] e input 2 [IN1]) e as duas fileiras inferiores como os registros bilaterais do laser Doppler do fluxo sanguíneo cerebral. Note que as respostas são assimétricas entre os traços elétricos e cerebrais de fluxo sanguíneo direito (superior) e esquerdo (inferior). (A) Resposta pequena (aumento de 16% no fluxo sanguíneo) em resposta a um estímulo de 1,2 mV/mm 20 s (0,75 mA). (B) Maior resposta (aumento de 21% no fluxo sanguíneo) em resposta a um estímulo de 1,4 mV/mm (1,0 mA). Abreviação: tACS = estimulação transcraniana por corrente alternada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Cálculo do campo elétrico

  1. Medir a diferença na saída dos dois eletrodos intracranianos usando a diferença na meia-onda (um ciclo) das duas ondas senoidais registradas (os dois traços superiores na Figura 4). Divida essa diferença (mV) pela distância entre os dois eletrodos (mm, aqui ~4 mm, mas medida diretamente em cada caso) para chegar à intensidade de campo (mV/mm)3,6.

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Representative Results

Resultados representativos são mostrados na Figura 4, Figura 5 e Figura 6. A Figura 4 mostra um exemplo dos quatro canais com os dois eletrodos de registro intracraniano nos canais superiores e as respostas do FSC nos canais inferiores. A tACS é simétrica em todo o crânio, mas geralmente a resposta do campo intracraniano é ligeiramente assimétrica para as correntes AC aplicadas, com um lado apresentando uma resposta maior do que o outro (Figura 4). A resposta do FSC à estimulação elétrica tACS3 é geralmente fásica em amplitudes mais altas (i.e., 0,75-2,0 mA, Figura 4B) e mais constante em amplitudes mais baixas (0,5-0,75 mA, Figura 4A). Como os registros de FSC (com medidas de LSI ou DL) são ruidosos e mostram flutuações espontâneas, em amplitudes menores, tivemos uma média de 5-10 épocas de tACS para ajudar a reduzir as flutuações espontâneas (Figura 4).

A Figura 5 mostra a resposta do fluxo sanguíneo cerebral usando imagens speckle a laser. A imagem superior esquerda mostra uma visão não subtraída, enquanto as imagens subsequentes à esquerda são a saída direta do dispositivo de imagem pontilhado a laser. As imagens à direita são imagens de diferença comparando antes e depois da estimulação. A imagem do meio à direita mostra a diferença difusa no fluxo sanguíneo cerebral causada pela estimulação. O gráfico no canto superior direito mostra uma região de interesse entre os eletrodos estimuladores com um claro aumento de intensidade durante o tempo de estimulação.

Figure 5
Figura 5: Imagem de crânio pontilhado a laser do fluxo sanguíneo cerebral bilateralmente durante a tACS a 1,0 mA com uma série de imagens mostrando a extensão do realce do fluxo sanguíneo cerebral. A imagem superior esquerda mostra uma imagem colorida do crânio do mouse na linha de base; barra de escala = 5 mm. A série superior direita mostra a resposta à estimulação de 1,2 mV/mm ao longo do tempo; Observe a região de interesse bastante barulhenta entre as imagens. As imagens à esquerda são imagens de fluxo de cores direto da imagem de laser speckle. As imagens coloridas superiores são anteriores à estimulação, as imagens médias estão durante o pico da estimulação e as imagens inferiores são posteriores ao retorno à linha de base. As imagens à direita são imagens de diferença (com a linha de base subtraída) mostrando a natureza difusa do FSC aumentado em resposta à estimulação, que pode ser notada uniformemente em todo o córtex (vermelho na imagem do meio, +15%); O retorno subsequente à linha de base é mostrado nas imagens inferiores. A barra de escala de cores mostra mudanças de ±15% de diferença. Abreviação: tACS = estimulação transcraniana por corrente alternada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 6A mostra uma comparação das respostas do fluxo sanguíneo cerebral em função da idade, com uma resposta significativamente aumentada nos animais mais jovens. A Figura 6B mostra que isso é particularmente verdadeiro para as correntes maiores, para as quais os animais mais jovens mostram uma resposta muito mais robusta do que os animais mais velhos.

Figure 6
Figura 6: Respostas do fluxo sanguíneo cerebral. (A) As alterações no fluxo sanguíneo cerebral em função da idade do rato. Observe a resposta significativamente maior nos animais mais jovens (12-14 semanas) do que nos animais mais velhos (28-33 semanas). (B) Essas diferenças também se estendem aos níveis mais altos de corrente de estimulação tACS; de fato, a 1,5 e 2,0 mA, há uma resposta do fluxo sanguíneo cerebral muito maior nos animais mais jovens. O teste estatístico utilizado foi uma comparação não paramétrica (rank-sum; n = 13 experimentos representativos), com resultado de p < 0,005 para as diferenças entre os grupos mais jovens e mais velhos. Abreviações: tACS = estimulação transcraniana por corrente alternada; FSC = fluxo sanguíneo cerebral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A resposta do FSC baseada na frequência tACS também pode ser avaliada, com a frequência variando de 5-6 Hz a 40 Hz, como utilizado em muitos estudos de estimulação crônica; o pico de resposta do FSC ocorre em 10-20 Hz.

Estes são os resultados iniciais de 13 experimentos que avaliaram um dispositivo estimulador tACS de corrente constante e um dispositivo de imagem speckle a laser com camundongos de duas faixas etárias diferentes (12-14 semanas vs. 28-33 semanas). Esses dados destacam melhoras significativas em relação aos resultados apresentados por Turner et al.3. Em amostras clínicas (isto é, humanos), a força de campo possível é muito pequena (i.e., <0,2-0,5 mV/mm) devido às limitações e desconforto da corrente do couro cabeludo, enquanto em roedores, tipicamente 1-5 mV/mm tem sido estimada como uma resposta ativa e tolerável (Figura 5).

Esses resultados incluem as respostas mais sensíveis do FSC do ISL (Figura 5), incluindo as respostas transitórias do FSC ao tACS. A Figura 4 mostra a resposta à tACS quando se utilizam eletrodos intracranianos duplos para medir a resposta cerebral direta (medindo gradientes de campo elétrico), bem como as respostas de FSC pequeno e grande. Atualmente, estamos experimentando com tACS de força de baixo campo e comparando nosso modelo preferido de camundongo para doença de Alzheimer (modelo15 de CVN-AD) com animais controle.

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Discussion

Este protocolo concentra-se na medida in vivo e anestesiada da resposta do FSC como um biomarcador para estimar a resposta cerebral à tES14. Biomarcadores de longo prazo da resposta à tES incluem efeitos histológicos do tratamento, como a prevenção ou alterações na formação de placa amiloide (isto é, com estimulação gama a 40 Hz em vários modelos de DA)16,17,18,19, mas biomarcadores de curto prazo também são úteis para estimar os efeitos fisiológicos imediatos e calcular uma curva dose-resposta 3. Esse mesmo protocolo também pode ser usado para estimulação crônica de EETs em todo o crânio, mas os fios estimulantes precisariam ser encaminhados para uma conexão conveniente e intermitente para estimulação acordada.

O primeiro passo crítico dentro do protocolo envolve a manutenção da baixa impedância dos eletrodos estimuladores bilaterais e a mensuração dessa impedância a cada época de estimulação. A baixa impedância pode ser alcançada usando pasta condutora suficiente, isolamento em todo o crânio e óleo mineral para quaisquer orifícios de rebarba (para evitar caminhos alternativos para o crânio). Experimentamos várias versões de eletrodos estimulantes comerciais e caseiros, e a abordagem caseira permite mais controle sobre a impedância. Um dispositivo estimulador de corrente constante é crítico para a reprodutibilidade através dos eletrodos. Etapas críticas adicionais incluem manter os registros DC com deriva mínima ao longo do tempo a distâncias medidas dentro do cérebro em uma profundidade fixa para estimar o campo intracraniano dentro do córtex cerebral, bem como avaliar o fluxo sanguíneo cerebral usando sondas laser Doppler ou o sistema de imagem baseado em pontilhas a laser.

Para a medição concomitante da força do campo elétrico e dos campos elétricos intracranianos, também adicionamos a técnica de inserção de microeletrodos para o dispositivo de imagem speckle laser usando manipuladores angulados. O dispositivo laser speckle permite uma visão mais abrangente de todo o crânio, enquanto as sondas laser Doppler são altamente focais e podem não fornecer medidas representativas, particularmente diretamente sobre um vaso sanguíneo.

Embora esses experimentos mais invasivos sejam realizados em camundongos anestesiados, nosso plano é realizar tACS programada ou em circuito fechado em animais acordados na extremidade inferior da amplitude de estimulação (ou seja, 0,5-1,0 mA; 1-3 mV/mm de força de campo). Embora a tES clínica tenha sido tipicamente realizada com eletrodos cutâneos, o nível de estimulação é severamente limitado por efeitos colaterais cutâneos e dores de cabeça a ~2 mA 4. Os eletrodos equivalentes em humanos seriam eletrodos subgaleais com menor estimulação direta da pele.

Em comparação com o uso de eletrodos montados na pele, é mais fácil demonstrar melhoras em pacientes com AVC, por exemplo, usando estimulação sob demanda com eletrodos estimuladores do nervo vago implantados coordenados e atividade do braço20. De fato, o uso de alguma forma de eletrodo implantado mostra efeitos consistentes e reprodutíveis do tratamento no dia a dia; Além disso, a estimulação pode ser aplicada a qualquer momento (ou seja, não de forma programada, mas em relação à atividade), os efeitos colaterais podem ser reduzidos uma vez que possam ser previstos ou induzidos, e a estimulação pode ser prolongada pelo tempo necessário (ou seja, meses a anos). Esse é o caso de todos os tratamentos de estimulação cerebral profunda da doença de Parkinson, por exemplo, para os quais o implante a longo prazo é muito viável e bem tolerado21.

Outra opção para um eletrodo craniano implantado poderia ser a estimulação subgaleal (como estamos realizando em roedores); De fato, isso tem sido proposto para o monitoramento de longo prazo da epilepsia22,23. A estimulação subgaleal é mais focada no crânio e no cérebro, pode eliminar muitos efeitos colaterais da estimulação cutânea, pode permitir que uma gama maior de correntes (e, portanto, magnitudes de campo elétrico intracraniano) seja usada, é reprodutível no dia a dia (como qualquer eletrodo implantado) e apresenta baixa impedância (i.e., 500 Ω vs. 5-10 KΩ para eletrodos cutâneos). Assim, em termos de estimulação crônica da EETt, existem várias opções de EEt tipicamente implementadas em roedores e, clinicamente, ter um biomarcador fisiológico testável pode ser extremamente importante para permitir efeitos de tratamento de longa duração.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado pelos seguintes subsídios (para D.A.T.): NIA RO1 AG074999, NIA R21AG051103, VA I21RX002223 e VA I21 BX003023.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol pads HenryShein 112-6131
Baby mineral oil Johnson & Johnson
BD 1 mL syringe Becton Dikinson REF 305699
C3 Flat Surface Electrodes Neuronexus
C57BI mice from NIH colonies 
Copper skull electrods In house preparation
Digidata 1440, Clampex Axon Instruments
Dumont #5 forceps FST #5
Dumont #7 forceps curved Dumont RS-5047
Eye ointment Major LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38
Flaming/Brown micropipette puller Sutter instrument Co. Model P-87
Forceps 11.5 cm slight curve  serrated Roboz RS-8254
Intramedic needle 23 G Becton Dikinson REF 427565
KCl 1 M In house preparation
Laser Doppler Probes Moor Instruments 0.46 mm laser doppler probes
Laser Speckle Imaging Device RWD RFLSI-ZW
Micro curette 13 cm FST 10080-05
Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm Roboz RS-5914
Mouse anesthesia fixation Stoelting
Neuroconn-DS Neurocare DC-Stimulator Plus
PhysioSuite Monitoring Kent Scientific
Q-tips Fisherbrand 22363167
Saline 0.9% NaCl solution Baxter 281322
Sensicam QE PCO Instruments
Software Axon Instruments Clampex
Surgical glue Covetrus 31477
Surgical tape 3M Transpore T9784

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References

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Eletrodos Estimuladores Extracranianos Medição Fluxo Sanguíneo Cerebral Campos Elétricos Intracranianos Camundongos Anestesiados Estimulação Transcraniana por Corrente Alternada (tACS) Curvas de Dose-Resposta Microeletrodos de Vidro Sondas Bilaterais de Doppler (LD) Laser Speckle Imaging (LSI) Colocação de Eletrodos Estabilidade Corrente Idade Animais Controle Intensidade do Campo Elétrico Anestesia
Colocação de eletrodos estimuladores extracranianos e mensuração do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos intracranianos em camundongos anestesiados
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Degan, S., Feng, Y., Hoffmann, U.,More

Degan, S., Feng, Y., Hoffmann, U., Turner, D. A. Placement of Extracranial Stimulating Electrodes and Measurement of Cerebral Blood Flow and Intracranial Electrical Fields in Anesthetized Mice. J. Vis. Exp. (196), e65195, doi:10.3791/65195 (2023).

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