Placering av extrakraniella stimulerande elektroder och mätning av cerebralt blodflöde och intrakraniella elektriska fält hos sövda möss

Summary

Vi beskriver ett protokoll för att bedöma dos-responskurvor för extrakraniell stimulering i termer av mätningar av hjärnans elektriska fält och ett relevant biomarkör-cerebralt blodflöde. Eftersom detta protokoll innebär invasiv elektrodplacering i hjärnan behövs generell anestesi, där spontan andning föredras snarare än kontrollerad andning.

Abstract

Detektion av cerebral blodflödesrespons (CBF) på olika former av neuronal aktivering är avgörande för att förstå dynamisk hjärnfunktion och variationer i substrattillförseln till hjärnan. Denna artikel beskriver ett protokoll för att mäta CBF-svar på transkraniell växelströmsstimulering (tACS). Dos-responskurvor uppskattas både från CBF-förändringen som sker med tACS (mA) och från det intrakraniella elektriska fältet (mV/mm). Vi uppskattar det intrakraniella elektriska fältet baserat på de olika amplituderna som mäts av glasmikroelektroder i varje sida av hjärnan. I den här artikeln beskriver vi den experimentella uppställningen, som innebär att man använder antingen bilaterala laserdopplerprober (LD) eller laserfläckavbildning (LSI) för att mäta CBF; Som ett resultat kräver denna inställning anestesi för elektrodplacering och stabilitet. Vi presenterar en korrelation mellan CBF-responsen och strömmen som en funktion av ålder, och visar en signifikant större respons vid högre strömmar (1,5 mA och 2,0 mA) hos unga kontrolldjur (12-14 veckor) jämfört med äldre djur (28-32 veckor) (p < 0,005 skillnad). Vi visar också en signifikant CBF-respons vid elektriska fältstyrkor <5 mV/mm, vilket är en viktig faktor för eventuella studier på människa. Dessa CBF-svar påverkas också starkt av användningen av anestesi jämfört med vakna djur, andningskontrollen (dvs. intuberad kontra spontan andning), systemiska faktorer (dvs. CO₂) och lokal ledning i blodkärlen, som medieras av pericyter och endotelceller. På samma sätt kan mer detaljerade avbildnings-/inspelningstekniker begränsa fältstorleken från hela hjärnan till endast ett litet område. Vi beskriver användningen av extrakraniella elektroder för applicering av tACS-stimulering, inklusive både hemmagjorda och kommersiella elektroddesigner för gnagare, samtidig mätning av CBF och intrakraniellt elektriskt fält med hjälp av bilaterala DC-inspelningselektroder av glas, och avbildningsmetoderna. Vi tillämpar för närvarande dessa tekniker för att implementera ett slutet format för att förstärka CBF i djurmodeller av Alzheimers sjukdom och stroke.

Introduction

Transkraniell elektrisk stimulering (tES; med sinusvågsstimulering, tACS) är en vanlig, extern, icke-invasiv metod för hjärnneuromodulering ^1,2. Tidigare antog vi att vid vissa doser kan tES (och särskilt tACS) öka det cerebrala blodflödet (CBF) i de underliggande hjärnregionerna³. Vidare kan det finnas ett dos-responsförhållande mellan antingen den tillförda externa strömmen eller det intrakraniella elektriska fältet och de resulterande CBF-responserna. De flesta kliniska stimuleringsprotokoll har dock fokuserat på en maximal bekväm hudstimuleringsnivå (dvs. ~ 2 mA) under schemalagda tidsperioder (dvs. 30-45 min) som ett behandlingsprotokoll ^4,5. Hos gnagare är det möjligt att använda invasiva, extrakraniella hjärnelektroder som appliceras direkt på skallen för att undersöka de elektriska fält i hjärnan som induceras av tES⁶. Målet med detta tillvägagångssätt är därför att bestämma effekterna av intensiteten av tACS vid relevanta frekvenser på CBF-förändringar i termer av dos-responsförhållandet. Denna dos-responskurva är baserad på en kortvarig fysiologisk biomarkör-direkt mätning av CBF i förhållande till det elektriska fält som hjärnan utsätts för^. Vi har tidigare visat att det vid större amplituder, vanligtvis utanför området för elektriska fält i hjärnan inducerade av tACS kliniskt, finns en nästan linjär korrelation mellan det inducerade elektriska fältet och CBF i cortex³. Stimulering av mindre fält (dvs. 1-5 mV/mm intensitet) kan dock vara mer relevant och genomförbar för användning på människor; därför har vi modifierat våra tekniker för att upptäcka mindre CBF-förändringar.

Denna artikel beskriver ett protokoll för att analysera effekterna av tES alternerande sinusströmmar (tACS) med lägre fältstyrka på CBF (dvs. 0,5-2,0 mA ström, 1-5 mV/mm elektriskt fält), som kan tolereras av vakna gnagare⁵. Detta protokoll involverar användning av ny laserspeckelavbildning under tACS, såväl som dubbla intrakraniella glaselektroder, för att bestämma både spridningen av aktiv tACS i hjärnan (som övervakas av CBF) och den intrakraniella elektriska fältintensiteten, som visas både som ett diagram och ett faktiskt experimentellt fotografi (figur 1). Det finns många möjliga fysiologiska effekter av tES i hjärnan, inklusive direkt neuronal modulering, neural plasticitet och astrocytaktivering ^7,8. Även om CBF har mätts med tDCS ^9,10 var dessa mätningar långsamma, indirekta och otillräckliga för att bedöma dos-responsfunktionen i hjärnan. Genom att använda lämpliga kortvariga biomarkörer (t.ex. CBF, elektriska fält) och snabba på/av-sekvenser av tACS kan vi nu uppskatta dos-responsfunktionen mer exakt. Vidare kan vi tillämpa olika tekniker för att mäta CBF, inklusive både fokallaserdopplerprober (LD) och laserspeckelavbildning (LSI) med definierade intresseområden.

Figur 1: Transkraniell stimulering och fotografiskt exempel . (A) Diagram över den transkraniella stimuleringsinställningen. Diagrammet visar en musskalle med koronala och sagittala suturer. De transkraniella elektroderna placeras lateralt och symmetriskt på skallen och monteras med kirurgiskt lim och ledande pasta mellan elektroderna och skallen. Dessa elektroder är anslutna till en människokompatibel stimuleringsanordning med konstant ström, som kan specificera stimuleringens frekvens, amplitud och varaktighet. För bedömning av intrakraniella elektriska fält placeras bilaterala glaselektroder (~2 MΩ) i hjärnbarken (dvs. inom 1 mm från den inre aspekten av skallen genom små borrhål), och dessa är förseglade med mineralolja och har AgCl-jord i nackmuskeln (visas som större trådar i mitten begravda i den subkutana halsvävnaden). Dessa glaselektroder är anslutna till en DC-förstärkare och deras utgångar spelas in via en digitaliserare med minst fyra kanaler. Bilaterala laserdopplersonder placeras också på skallen för inspelningar. Hela skallen avbildas också med antingen en laserfläckavbildningsenhet eller en högupplöst (minst 1 024 x 1 024 pixlar, 12-14 bitars pixeldjup) kyld kamera för inbyggd optisk signaldetektering. Den isosbestiska hemoglobinfrekvensen väljs vanligtvis (dvs. 562 nm) för belysning för blodflödesavbildning. (B) En närbild av ett verkligt experiment, som visar de bilaterala laserdopplersonderna (till vänster), de (bilaterala) intrakraniella glasregistrerande mikroelektroderna placerade genom gradhålen, och med tACS-stimulerande elektroder i sidled. Förkortning: tACS = transkraniell växelströmsstimulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Som ett sätt att bedöma mekanismerna kan vi också undersöka interaktioner med andra fysiologiska processer som också förändrar CBF, såsom K⁺-inducerad spridningsdepolarisering¹¹. Vidare, snarare än schemalagda sessioner på regelbundna tider, är det också möjligt att utveckla ett slutet system baserat på ytterligare biomarkörer för en mängd olika sjukdomar, vilket har föreslagits för epilepsibehandling¹² (dvs. kliniska Neuropace-enheter). Till exempel är hjärnstimulering med sluten slinga för Parkinsons sjukdom vanligtvis baserad på de inneboende, onormala lokala fältpotentialerna (LFP) som är inneboende i denna sjukdom i frånvaro av tillräckligt med dopamin (vanligtvis β-bands-LFP)¹³.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Duke University eller motsvarande lokala myndighet som reglerar forskning som involverar djur. Se materialtabellen för detaljer om alla material, instrument och utrustning som används i detta protokoll. 1. Förberedelse av instrumentet Se till att alla nödvändiga föremål och kirurgiska instrument är på plats (Figur 2): rengöringslös…

Representative Results

Representativa resultat visas i figur 4, figur 5 och figur 6. Figur 4 visar ett exempel på de fyra kanalerna med de två intrakraniella inspelningselektroderna på de övre kanalerna och CBF-svaren på de nedre kanalerna. tACS är symmetrisk över skallen, men i allmänhet är den intrakraniella fältresponsen något asymmetrisk för applicerade växelströmmar, där den ena sidan visar en större resp…

Discussion

Detta protokoll fokuserar på in vivo, bedövad mätning av CBF-svaret som en biomarkör för att uppskatta hjärnans svar på tES¹⁴. Långsiktiga biomarkörer för tES-svaret inkluderar histologiska behandlingseffekter, såsom förebyggande av eller förändringar i amyloid plackbildning (dvs. med gammastimulering vid 40 Hz i flera AD-modeller)^16,17,18,19, men kortsiktiga…

Materials

Alcohol pads	HenryShein	112-6131
Baby mineral oil	Johnson & Johnson
BD 1 mL syringe	Becton Dikinson	REF 305699
C3 Flat Surface Electrodes	Neuronexus
C57BI mice			from NIH colonies
Copper skull electrods	In house preparation
Digidata 1440, Clampex	Axon Instruments
Dumont #5 forceps	FST	#5
Dumont #7 forceps curved	Dumont	RS-5047
Eye ointment	Major	LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter instrument Co.	Model P-87
Forceps 11.5 cm slight curve  serrated	Roboz	RS-8254
Intramedic needle 23 G	Becton Dikinson	REF 427565
KCl 1 M	In house preparation
Laser Doppler Probes	Moor Instruments	0.46 mm laser doppler probes
Laser Speckle Imaging Device	RWD	RFLSI-ZW
Micro curette 13 cm	FST	10080-05
Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm	Roboz	RS-5914
Mouse anesthesia fixation	Stoelting
Neuroconn-DS	Neurocare	DC-Stimulator Plus
PhysioSuite Monitoring	Kent Scientific
Q-tips	Fisherbrand	22363167
Saline 0.9% NaCl solution	Baxter	281322
Sensicam QE	PCO Instruments
Software	Axon Instruments Clampex
Surgical glue	Covetrus	31477
Surgical tape	3M Transpore	T9784