Summary
Vi presentiamo passo-passo le istruzioni per la generazione di chimere neonatale e la dissezione e la preparazione del timo per ex vivo imaging 2-Photon Microscopia.
Abstract
Microscopia a due fotoni (TPM) ci permette di immagine in profondità nel timo e documentare gli eventi che sono importanti per lo sviluppo timocita. Per seguire la migrazione degli individui in una folla di timociti, che generano chimere neonatale dove derivano meno dell'uno per cento dei timociti da un donatore che è transgenico per una proteina ubiquitariamente espressa fluorescente. Per generare queste chimere parziale ematopoietiche, i destinatari neonatale vengono iniettati con midollo osseo tra i 3-7 giorni di età. Dopo 4-6 settimane, il mouse è sacrificato ed il timo è attentamente sezionato e bissected preservando l'architettura del tessuto che verrà ripreso. Il timo è incollato su un vetrino in preparazione ex vivo di immagini da TPM. Durante l'imaging del timo è tenuto in DMEM senza rosso fenolo che è perfuso con il 95% di ossigeno e anidride carbonica del 5% e riscaldato a 37 ° C. Usando questo approccio, possiamo studiare gli eventi necessari per la generazione di un diverso repertorio delle cellule T.
Protocol
Trasferimento adottivi
Iniettare neonati con 50-100ul di midollo osseo con una siringa per insulina 2-4 volte durante i primi 3-7 giorni di vita, con un finale donatore-to-host rapporto di 1:1. Mirare a un sito di iniezione sotto lo sterno e la gabbia toracica, ma soprattutto l'intestino e lo stomaco. Inserire l'ago quanto basta per penetrare il peritoneo, attenzione a non forare il diaframma. Non è raro che per alcuni del midollo osseo per essere persi durante l'iniezione. È possibile ridurre la perdita allentando la presa sul cucciolo durante l'iniezione in modo da permettere alla pelle di espandersi e, poi, lentamente, togliere l'ago.
Dissezione di Timo
Fare un'incisione attraverso la linea mediana e tagliare o strappare via la pelle per rivelare la gabbia toracica. Hold on allo sterno e tagliare il peritoneo e il diaframma. Tagliate i lati della gabbia toracica per rivelare la cavità toracica. Il timo si trova sulla parte superiore del cuore. In modo da preservare la struttura del timo, mantenere il tessuto circostante, come si sezionare il timo. Lavare il timo con PBS per evitare che si secchi durante la dissezione. Delicatamente stuzzicare via dei tessuti in eccesso sulla superficie della capsula timica e tagliare i due lobi.
Preparazione del tessuto per l'imaging
Utilizzare un adesivo per incollare il tessuto veterinario il timo no a un coprioggetto piazza. Utilizzare un pipetteman per mettere una frazione di microlitro di adesivo. Stendere la colla per la lunghezza e la larghezza approssimativa del timo. Costante il timo contro il coprioggetto e trascinarlo in posizione.
Due-Photon Imaging
Il tessuto viene immerso in DMEM senza rosso fenolo che viene perfuso con il 95% di ossigeno e anidride carbonica del 5% e riscaldato a 37 ° C. Eccitazione a due fotoni è stato raggiunto utilizzando un Spectra-Physics Maitai laser sintonizzati 900nm, e CFP, GFP, YFP e Texas Red emissione luminosa è stata separata con una 495, 515, 560 specchi dicroici e raccolti utilizzando rilevatori di PMT.
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Discussion
Immagini a due fotoni nel timo ci consente di esaminare in vita, gli organi intatti le interazioni e le migrazioni che sono alla base eventi di selezione all'interno del timo.
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Acknowledgments
Ringraziamo Paolo Matt e Jimmy Wu di assistenza tecnica.
References
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- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
