In situ avbildning av Mouse Thymus Använda 2-Photon Mikroskopi
Summary
Vi presenterar steg-för-steg-instruktioner för generering av neonatal chimärer samt dissekering och förberedelse av bräss för ex vivo imaging med 2-Photon mikroskopi.
Abstract
Två-foton mikroskopi (TPM) ger oss möjlighet att bilden djupt in i tymus och dokumentera händelser som är viktiga för tymocyt utveckling. För att följa migrationen av individer i en folkmassa av tymocyter skapar vi neonatal chimärer där mindre än en procent av tymocyter kommer från en donator som är transgena för en ubiquitously uttrycka fluorescerande protein. För att generera dessa partiella hematopoetisk chimärer, är neonatal mottagare injiceras med benmärg mellan 3-7 dagars ålder. Efter 4-6 veckor är musen offras och bräss är noggrant dissekeras och bissected bevara arkitekturen i den vävnad som ska avbildas. Bräss är limmad på ett täckglas som förberedelse för ex vivo avbildning av TPM. Under avbildning bräss hålls i DMEM utan fenolrött som är perfusion med 95% syrgas och 5% koldioxid och uppvärmd till 37 ° C. Med denna metod kan vi studera de händelser som krävs för generering av en mängd T-cell repertoar.
Protocol
Discussion
Två-foton avbildning i tymus ger oss möjlighet att undersöka i levande, intakta organ interaktionen och migration som ligger bakom valet händelser inom bräss.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Matt Paul och Jimmy Wu för tekniskt stöd.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
