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Neuroscience

चूहों में ऑप्टोकाइनेटिक रिफ्लेक्स की दृश्य सुविधा चयनात्मकता का परिमाणीकरण

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65281
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biology, University of Toronto Mississauga, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Summary

यहां, हम ऑप्टोकाइनेटिक रिफ्लेक्स को निर्धारित करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह आभासी ड्रम उत्तेजना और वीडियो-ओकुलोग्राफी को जोड़ती है, और इस प्रकार व्यवहार की सुविधा चयनात्मकता और इसकी अनुकूली प्लास्टिसिटी के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देती है।

Abstract

ऑप्टोकाइनेटिक रिफ्लेक्स (ओकेआर) एक आवश्यक जन्मजात आंख आंदोलन है जो दृश्य वातावरण की वैश्विक गति से ट्रिगर होता है और रेटिना छवियों को स्थिर करने का कार्य करता है। इसके महत्व और मजबूती के कारण, ओकेआर का उपयोग दृश्य-मोटर सीखने का अध्ययन करने और विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, उम्र और दवा उपचार वाले चूहों के दृश्य कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है। यहां, हम उच्च सटीकता के साथ सिर-निश्चित चूहों के ओकेआर प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रक्रिया पेश करते हैं। सिर निर्धारण आंखों के आंदोलनों पर वेस्टिबुलर उत्तेजना के योगदान को खारिज कर सकता है, जिससे केवल दृश्य गति द्वारा ट्रिगर आंखों के आंदोलनों को मापना संभव हो जाता है। ओकेआर को एक आभासी ड्रम सिस्टम द्वारा प्राप्त किया जाता है, जिसमें तीन कंप्यूटर मॉनिटर पर प्रस्तुत एक ऊर्ध्वाधर झंझरी क्षैतिज रूप से एक ऑसिलेटरी तरीके से या एक स्थिर वेग पर यूनिडायरेक्शनल रूप से बहती है। इस आभासी वास्तविकता प्रणाली के साथ, हम स्थानिक आवृत्ति, अस्थायी / दोलन आवृत्ति, कंट्रास्ट, ल्यूमिनेंस और झंझरी की दिशा जैसे दृश्य मापदंडों को व्यवस्थित रूप से बदल सकते हैं, और दृश्य सुविधा चयनात्मकता के ट्यूनिंग वक्रों को निर्धारित कर सकते हैं। उच्च गति इन्फ्रारेड वीडियो-ओकुलोग्राफी आंखों के आंदोलनों के प्रक्षेपवक्र का सटीक माप सुनिश्चित करता है। अलग-अलग चूहों की आंखों को विभिन्न उम्र, लिंग और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के जानवरों के बीच ओकेआर की तुलना करने के अवसर प्रदान करने के लिए कैलिब्रेट किया जाता है। इस तकनीक की मात्रात्मक शक्ति इसे ओकेआर में परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति देती है जब यह व्यवहार उम्र बढ़ने, संवेदी अनुभव या मोटर सीखने के कारण प्लास्टिक रूप से अनुकूल होता है; इस प्रकार, यह इस तकनीक को ओकुलर व्यवहार की प्लास्टिसिटी की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरणों के प्रदर्शनों की सूची के लिए एक मूल्यवान अतिरिक्त बनाता है।

Introduction

पर्यावरण में दृश्य उत्तेजनाओं के जवाब में, हमारी आंखें हमारी दृष्टि को स्थानांतरित करने, रेटिना छवियों को स्थिर करने, चलती लक्ष्यों को ट्रैक करने, या पर्यवेक्षक से अलग-अलग दूरी पर स्थित लक्ष्यों के साथ दो आंखों के फोवे को संरेखित करने के लिए चलती हैं, जो उचित दृष्टि 1,2 के लिए महत्वपूर्ण हैं। स्वास्थ्य और बीमारी में तंत्रिका सर्किट को समझने के लिए सेंसरिमोटर एकीकरण के आकर्षक मॉडल के रूप में ओकुलोमोटर व्यवहार का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, कम से कम आंशिक रूप से ओकुलोमोटर सिस्टम3 की सादगी के कारण। एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशियों के तीन जोड़े द्वारा नियंत्रित, आंख सॉकेट में मुख्य रूप से तीन संबंधित अक्षों के आसपास घूमती है: अनुप्रस्थ अक्ष के साथ ऊंचाई और अवसाद, ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ जोड़ और अपहरण, और एंटेरोपोस्टरियर अक्ष 1,2 के साथ मरोड़ और एक्सटॉर्सन। इस तरह की एक सरल प्रणाली शोधकर्ताओं को प्रयोगशाला के वातावरण में आसानी से और सटीक रूप से चूहों के ओकुलोमोटर व्यवहार का मूल्यांकन करने की अनुमति देती है।

एक प्रमुख ओकुलोमोटर व्यवहार ऑप्टोकाइनेटिक रिफ्लेक्स (ओकेआर) है। यह अनैच्छिक आंख आंदोलन रेटिना पर छवियों के धीमे बहाव या फिसलन से शुरू होता है और रेटिना छवियों को स्थिर करने का कार्य करता है क्योंकि एक जानवर का सिर या उसके आसपास 2,4 चलते हैं। ओकेआर, एक व्यवहारिक प्रतिमान के रूप में, कई कारणों से शोधकर्ताओं के लिए दिलचस्प है। सबसे पहले, इसे मज़बूती से उत्तेजित किया जा सकता है और सटीक रूप से 5,6 निर्धारित किया जा सकता है। दूसरा, इस व्यवहार को निर्धारित करने की प्रक्रियाएं अपेक्षाकृत सरल और मानकीकृत हैंऔर जानवरों के एक बड़े समूह के दृश्य कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए लागू की जा सकती हैं। तीसरा, यह जन्मजात व्यवहार अत्यधिक प्लास्टिक 5,8,9 है। इसके आयाम को शक्तिशाली बनाया जा सकता है जब दोहराए जाने वाले रेटिना स्लिप लंबे समय तक 5,8,9 होते हैं, या जब इसके कामकाजी साथी वेस्टिबुलर ओकुलर रिफ्लेक्स (वीओआर), वेस्टिबुलर इनपुट2 द्वारा ट्रिगर रेटिना छवियों को स्थिर करने का एक और तंत्र, बिगड़ा हुआ है। ओकेआर प्रवर्धन के ये प्रयोगात्मक प्रतिमान शोधकर्ताओं को ओकुलोमोटर सीखने के अंतर्निहित सर्किट आधार का अनावरण करने के लिए सशक्त बनाते हैं।

पिछले अध्ययनों में ओकेआर का मूल्यांकन करने के लिए मुख्य रूप से दो गैर-इनवेसिव तरीकों का उपयोग किया गया है: (1) वीडियो-ओकुलोग्राफी एक भौतिक ड्रम 7,10,11,12,13 के साथ संयुक्त है या (2) वर्चुअल ड्रम 6,14,15,16 के साथ संयुक्त सिर मोड़ का मनमाना निर्धारण . यद्यपि उनके अनुप्रयोगों ने ओकुलोमोटर प्लास्टिसिटी के आणविक और सर्किट तंत्र को समझने में उपयोगी खोज की है, इन दो विधियों में से प्रत्येक में कुछ कमियां हैं जो ओकेआर के गुणों की मात्रात्मक जांच करने में उनकी शक्तियों को सीमित करती हैं। सबसे पहले, काले और सफेद धारियों या डॉट्स के मुद्रित पैटर्न के साथ भौतिक ड्रम, दृश्य पैटर्न के आसान और त्वरित परिवर्तन की अनुमति नहीं देते हैं, जो बड़े पैमाने पर कुछ दृश्य विशेषताओं पर ओकेआर की निर्भरता के माप को प्रतिबंधित करता है, जैसे कि स्थानिक आवृत्ति, दिशा और चलती झंझरीके विपरीत 8,17। इसके बजाय, इन दृश्य सुविधाओं के लिए ओकेआर की चयनात्मकता के परीक्षण कम्प्यूटरीकृत दृश्य उत्तेजना से लाभान्वित हो सकते हैं, जिसमें दृश्य सुविधाओं को परीक्षण से परीक्षण तक आसानी से संशोधित किया जा सकता है। इस तरह, शोधकर्ता बहु-आयामी दृश्य पैरामीटर स्थान में ओकेआर व्यवहार की व्यवस्थित रूप से जांच कर सकते हैं। इसके अलावा, ओकेआर परख की दूसरी विधि केवल दृश्य मापदंडों की सीमा की रिपोर्ट करती है जो प्रत्यक्ष ओकेआर को ट्रिगर करती है, लेकिन आंख या सिर के आंदोलनों के आयाम 6,14,15,16 नहीं। मात्रात्मक शक्ति की कमी इस प्रकार ट्यूनिंग वक्रों के आकार और पसंदीदा दृश्य विशेषताओं का विश्लेषण करने या सामान्य और रोग स्थितियों में व्यक्तिगत चूहों के बीच सूक्ष्म अंतर का पता लगाने से रोकती है। उपरोक्त सीमाओं को दूर करने के लिए, वीडियो-ओकुलोग्राफी और कम्प्यूटरीकृत आभासी दृश्य उत्तेजना को हालके अध्ययनों 5,17,18,19,20 में ओकेआर व्यवहार की परख के लिए जोड़ा गया था। हालांकि, इन पहले प्रकाशित अध्ययनों ने पर्याप्त तकनीकी विवरण या चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान नहीं किए, और परिणामस्वरूप शोधकर्ताओं के लिए अपने स्वयं के शोध के लिए इस तरह के ओकेआर परीक्षण को स्थापित करना अभी भी चुनौतीपूर्ण है।

यहां, हम वीडियो-ओकुलोग्राफी और कम्प्यूटरीकृत आभासी दृश्य उत्तेजना के संयोजन के साथ फोटोपिक या स्कोटोपिक स्थितियों के तहत ओकेआर व्यवहार की दृश्य सुविधा चयनात्मकता को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। वेस्टिबुलर उत्तेजना द्वारा उत्पन्न आंखों की गति से बचने के लिए चूहों को सिर पर लगाया जाता है। एक उच्च गति वाले कैमरे का उपयोग चूहों से ओकुलर आंदोलनों को रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है, जो बदलते दृश्य मापदंडों के साथ चलती झंझरी को देखते हैं। अलग-अलग चूहों के आंखों की पुतलियों के भौतिक आकार को आंखोंके आंदोलनों के कोण को प्राप्त करने की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए कैलिब्रेट किया जाता है। यह मात्रात्मक विधि विभिन्न उम्र या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के जानवरों के बीच ओकेआर व्यवहार की तुलना करने या औषधीय उपचार या दृश्य-मोटर सीखने के कारण इसके परिवर्तन की निगरानी करने की अनुमति देती है।

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Protocol

इस अध्ययन में की गई सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को जैविक विज्ञान स्थानीय पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, जो टोरंटो पशु देखभाल समिति विश्वविद्यालय और पशु देखभाल पर कनाडाई परिषद द्वारा स्थापित दिशानिर्देशों के अनुसार था।

1. खोपड़ी के शीर्ष पर एक हेड बार का आरोपण।

नोट: आंखों के आंदोलनों में वीओआर व्यवहार के योगदान से बचने के लिए, ओकेआर परीक्षण के दौरान माउस का सिर स्थिर हो जाता है। इसलिए, खोपड़ी के शीर्ष पर एक हेड बार को शल्य चिकित्सा द्वारा प्रत्यारोपित किया जाता है।

  1. एक गैस कक्ष में 4% आइसोफ्लुरेन (v/v) औरO2 के मिश्रण से एक माउस (2-5 महीने की महिला और पुरुष C57BL/6) को एनेस्थेटाइज करें। माउस को एक अनुकूलित सर्जरी प्लेटफॉर्म पर स्थानांतरित करें और आइसोफ्लुरेन की एकाग्रता को 1.5% -2% तक कम करें। सर्जरी के दौरान पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया और श्वसन दर की जांच करके संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी करें।
  2. अपने शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए जानवर के शरीर के नीचे एक हीटिंग पैड रखें। दोनों आंखों को सूखने से बचाने के लिए उन पर लुब्रिकेंट आई ऑइंटमेंट की परत लगाएं। आंखों को हल्की रोशनी से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी से कवर करें।
  3. दर्द को कम करने के लिए 20 मिलीग्राम / किलोग्राम की खुराक पर कारप्रोफेन को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें। क्लोरहेक्सिडिन ग्लूकोनेट स्किन क्लीनर के साथ फर को गीला करने के बाद, खोपड़ी के शीर्ष पर फर को शेव करें। उजागर खोपड़ी को 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल और क्लोरहेक्सिडाइन अल्कोहल के साथ दो बार कीटाणुरहित करें।
  4. चीरा की जगह पर चमड़े के नीचे बुपिवैकेन (8 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्ट करें, फिर खोपड़ी की पृष्ठीय सतह को उजागर करने के लिए कैंची के साथ खोपड़ी (~ 1 सेमी2) को हटा दें, जिसमें पीछे की ललाट हड्डी, पार्श्विका हड्डी और इंटरपेराइटल हड्डी शामिल हैं।
  5. स्थानीय दर्द और रक्तस्राव को कम करने के लिए उजागर खोपड़ी पर 1% लिडोकेन और 1: 100,000 एपिनेफ्रीन की कई बूंदें लागू करें। प्रावरणी को हटाने के लिए खोपड़ी को मेहोफर क्योरेट के साथ खुरचें और इसे फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से साफ करें।
    नोट: सिर पट्टी को संलग्न करने के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए अस्थायी मांसपेशी को खोपड़ी से अलग किया जाता है।
  6. खोपड़ी की सतह की ओर धीरे से संपीड़ित हवा को उड़ाकर खोपड़ी को सुखाएं जब तक कि नमी खत्म न हो जाए और हड्डी सफेद न हो जाए। खोपड़ी की उजागर सतह पर सुपरगोंद की एक पतली परत लागू करें, जिसमें कटी हुई खोपड़ी का किनारा भी शामिल है, इसके बाद ऐक्रेलिक राल की एक परत होती है।
    नोट: सुपरगोंद के आवेदन से पहले खोपड़ी की सतह को रक्त या पानी से मुक्त होना चाहिए।
  7. खोपड़ी के शीर्ष पर मध्य रेखा के साथ एक स्टेनलेस-स्टील हेड बार ( चित्रा 1 ए देखें) रखें। अधिक ऐक्रेलिक राल लागू करें, हेड बार के किनारे से शुरू करें जब तक कि हेड बार का आधार पूरी तरह से ऐक्रेलिक राल में एम्बेडेड न हो। मोटाई बनाने के लिए दो या तीन बार ऐक्रेलिक राल लागू करें।
  8. ऐक्रेलिक राल सख्त होने तक लगभग 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें। चमड़े के नीचे लैक्टेटेड रिंगर के घोल के 1 मिलीलीटर इंजेक्ट करें। फिर, माउस को हीटिंग पैड पर रखे पिंजरे में वापस करें जब तक कि जानवर पूरी तरह से मोबाइल न हो जाए।
  9. सर्जरी के बाद कम से कम 5 दिनों के लिए माउस को घर के पिंजरे में ठीक होने दें। एक बार जब जानवर अच्छे आकार में होता है, तो सिर निर्धारण और प्रयोगात्मक वातावरण से परिचित होने के लिए 15-30 मिनट के लिए ओकेआर सेटअप में हेड बार के साथ अपना सिर ठीक करें। कम से कम 3 दिनों के लिए दिन में एक बार परिचित होने को दोहराएं।

2. वर्चुअल ड्रम और वीडियो-ओकुलोग्राफी का सेटअप

  1. एक वर्गाकार बाड़े को बनाने के लिए तीन मॉनिटरों को एक दूसरे से ऑर्थोगोनल रूप से माउंट करें जो दृश्य स्थान में ~ 270 ° और ऊंचाई के 63 ° को कवर करता है (चित्रा 1 बी बाएं)।
  2. एक असतत ग्राफिक कार्ड के साथ, सभी मॉनिटरों में सिंक्रनाइज़ेशन सुनिश्चित करने के लिए तीन मॉनिटर को एक साधारण डिस्प्ले में विलय करें।
  3. नीचे वर्णित मॉनिटर की चमक को कैलिब्रेट करें।
    1. उस कंप्यूटर को चालू करें जिससे मॉनिटर कनेक्ट हैं और 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें। स्थिर चमक के लिए वार्म-अप आवश्यक है।
    2. 25 के चरणों से मॉनिटर पर चमक सेटिंग को व्यवस्थित रूप से 0 से 100 तक बदलें।
    3. प्रत्येक चमक मान के लिए, ल्यूमिनेंस मीटर के साथ विभिन्न पिक्सेल मानों (0-255, 15 के चरण) के तहत मॉनिटर की चमक को मापें।
    4. रैखिक प्रतिगमन के साथ पिक्सेल मान 255 के लिए चमक और चमक के बीच संबंध फिट करें और चमक मूल्य का अनुमान लगाएं जो 160 सीडी / एम2 को जन्म देता है।
    5. ल्यूमिनेंस माप (चरण 2.3.3) में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक पिक्सेल मान के लिए, रैखिक प्रतिगमन के आधार पर चरण 2.3.4 में प्राप्त चमक मान के लिए चमक का अनुमान लगाएं। गामा फैक्टर γ और गुणांक ए प्राप्त करने के लिए ल्यूमिनेंस मानों के नए सेट (2.3.4 में प्राप्त चमक मान के तहत) और उनके संबंधित पिक्सेल मानों के बीच संबंध को फिट करने के लिए पावर फ़ंक्शन एलयूएम = ए * पिक्सेलγका उपयोग करें। इनका उपयोग वांछित ल्यूमिनेंस मूल्यों के साइनसॉइडल ग्रेटिंग उत्पन्न करने के लिए किया जाएगा।
    6. सभी तीन मॉनिटरों की चमक को चरण 2.3.4 में प्राप्त मानों पर सेट करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि उनके ल्यूमिनेंस मान समान पिक्सेल मान के लिए समान हैं।
  4. एक आभासी ड्रम उत्पन्न करें, जिसका उपयोग ओकेआर व्यवहार को उत्तेजित करने के लिए किया जाता है, दृश्य उत्तेजना टूलकिट के साथ, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. मॉनिटर पर एक ऊर्ध्वाधर साइनसॉइडल ग्रेटिंग प्रस्तुत करें और आंख पर झंझरी के प्रक्षेपण को सुनिश्चित करने के लिए अज़ीमुथ के साथ अवधि (धारियों के बीच अंतराल) को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आंख पर झंझरी के प्रक्षेपण में निरंतर स्थानिक आवृत्ति (ड्रम ग्रेटिंग; चित्र 1 बी मध्य और दाएं)।
    2. सुनिश्चित करें कि जानवर का सिर बाड़े के केंद्र में तय किया गया है ताकि यह देखे कि झंझरी में आभासी ड्रम की सतह पर एक निरंतर स्थानिक आवृत्ति है।
    3. दृश्य उत्तेजना कोड में गतिशील झंझरी के मापदंडों को संशोधित करें, जैसे कि ऑसिलेटरी आयाम, स्थानिक आवृत्ति, अस्थायी / दोलन आवृत्ति, दिशा, कंट्रास्ट, आदि। दो प्रकार की दृश्य गति का उपयोग करें: (1) साइनसॉइडल फ़ंक्शन के बाद एक ऑसिलेटरी तरीके से झंझरी बहाव घड़ी की दिशा में या प्रतिघड़ी की दिशा में होता है:
      Equation 1
      यहां, एएमपी ड्रम प्रक्षेपवक्र का आयाम है, एफ दोलन आवृत्ति है, और टी समय है (दोलन आयाम: 5 डिग्री; झंझरी स्थानिक आवृत्ति: 0.04-0.45 सीपीडी; दोलन आवृत्ति: 0.1-0.8 हर्ट्ज, 3.14-25.12 डिग्री /सेकंड की उत्तेजना के चरम वेग के अनुरूप[ ड्रम वेग = एम्प एक्स 2 : x f x cos (2 : x f x t); इसके विपरीत: 80%-100%; औसत ल्यूमिनेंस: 35-45 सीडी / (2) झंझरी एक स्थिर वेग पर यूनिडायरेक्शनल रूप से बहती है:
      Equation 2
      (स्थानिक आवृत्ति: 0.04-0.64 सीपीडी; अस्थायी आवृत्ति: 0.25-1 हर्ट्ज; ड्रम वेग = अस्थायी आवृत्ति / स्थानिक आवृत्ति।
  5. नीचे वर्णित के रूप में वीडियो-ओकुलोग्राफी सेट करें।
    1. जानवर के दृश्य क्षेत्र के अवरोध से बचने के लिए, दाईं आंख की छवि बनाने के लिए मध्य रेखा से 60 डिग्री इन्फ्रारेड (आईआर) दर्पण रखें।
    2. दाईं आंख की छवि को कैप्चर करने के लिए माउस (चित्रा 1 सी बाएं) के पीछे दाईं ओर एक आईआर कैमरा रखें।
    3. एक कैमरा आर्म पर हाई-स्पीड आईआर कैमरा माउंट करें जो कैमरे को दाईं आंख की छवि के चारों ओर ± 10 डिग्री तक घूमने की अनुमति देता है (चित्रा 1 सी दाएं)।
    4. वीडियो-ओकुलोग्राफी और दृश्य उत्तेजना के समय को सिंक्रनाइज़ करने के लिए विद्युत संकेत प्रदान करने के लिए मॉनिटर में से एक से जुड़े फोटोडायोड का उपयोग करें।
    5. आंख की आईआर रोशनी प्रदान करने के लिए दाईं आंख के चारों ओर हंसनेक बाहों द्वारा समर्थित चार आईआर प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) रखें।
    6. कॉर्नियल प्रतिबिंब (सीआर) संदर्भ प्रदान करने के लिए कैमरे पर दो आईआर एलईडी रखें: एक कैमरे (एक्स-सीआर) के ऊपर तय किया गया है, जबकि दूसरा कैमरे के बाईं ओर है (वाई-सीआर; चित्रा 1 डी)।
    7. एक अंशांकन स्लाइड के साथ वीडियो-ओकुलोग्राफी सिस्टम के ऑप्टिकल आवर्धन को मापें।
      नोट: संदर्भ सीआर का उपयोग ट्रांसलेशनल आंख आंदोलनों को रद्द करने के लिए किया जाता है जब घूर्णी आंख आंदोलनों के आधार पर आंख के कोण की गणना की जाती है।
  6. मॉनिटर द्वारा गठित बाड़े के केंद्र में जानवर के सिर को ठीक करें, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. रिग के केंद्र में हेड प्लेट के साथ जानवर के सिर को ठीक करें और इसे आगे की ओर करें। सिर के झुकाव को समायोजित करें ताकि बाईं और दाईं आंखें समतल हों, और आंखों के नाक और लौकिक कोनों को क्षैतिज रूप से संरेखित किया जाए (चित्रा 1 ई)।
    2. सिर-निर्धारण उपकरण द्वारा प्रदान किए गए मोटे समायोजन और 2 डी ट्रांसलेशनल चरण द्वारा प्रदान किए गए ठीक समायोजन द्वारा जानवर के सिर को क्षैतिज रूप से हिलाएं, और सिर-निर्धारण उपकरण और एक पोस्ट / पोस्ट धारक जोड़ी के माध्यम से लंबवत रूप से, जब तक कि जानवर की दाईं आंख कैमरे के लाइव वीडियो में दिखाई न दे। आंखों के आंदोलनों के अंशांकन और माप से पहले, कैमरे की बांह के धुरी बिंदु के साथ गर्म दर्पण द्वारा परिलक्षित जानवर की दाईं आंख की छवि को ओवरले करें (नीचे चरण 3.4 में विवरण देखें)।
  7. कमरे की रोशनी को अवरुद्ध करने के लिए ओकेआर रिग के चारों ओर एक अनुकूलित बाड़े का निर्माण करें (चित्रा 1 एफ)।

3. आंखों के आंदोलनों का अंशांकन

नोट: घूर्णी आंख आंदोलनों की गणना पुतली के आंदोलनों और पुपिलरी आंदोलनों की कक्षा की त्रिज्या के आधार पर की जाती है(आरपी, पुतली के केंद्र से नेत्रगोलक के केंद्र तक की दूरी)। प्रत्येक व्यक्तिगत माउस के लिए, इस त्रिज्या को प्रयोगात्मक रूप से21 मापा जाता है।

  1. चरण 2.6.1 में वर्णित तीन मॉनिटरों द्वारा गठित बाड़े के केंद्र में जानवर के सिर को ठीक करें।
  2. कैमरे को चालू करें और समान आईआर रोशनी प्राप्त करने के लिए दाईं आंख के आसपास के चार एलईडी को समायोजित करें।
  3. दृश्य मार्गदर्शन के तहत, दाईं आंख की स्थिति को तब तक समायोजित करें जब तक कि यह वीडियो के केंद्र में दिखाई न दे, जैसा कि चरण 2.6.2 में वर्णित है।
  4. दाईं आंख की आभासी छवि को कैमरा आर्म के धुरी बिंदु के साथ संरेखित करें, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. मैन्युअल रूप से कैमरा आर्म को बाएं चरम छोर (-10 °) पर घुमाएं। 2 डी ट्रांसलेशनल चरण (चित्रा 1 सी, हरा तीर) के ठीक समायोजन के साथ ऑप्टिकल अक्ष के लंबवत क्षैतिज विमान पर जानवर की दाईं आंख की स्थिति को मैन्युअल रूप से स्थानांतरित करें, जब तक कि एक्स-सीआर छवि के क्षैतिज केंद्र पर न हो।
    2. मैन्युअल रूप से कैमरा आर्म को दूसरे छोर (+10 °) पर घुमाएं। यदि एक्स-सीआर छवि के केंद्र से दूर भागता है, तो दाईं आंख को ऑप्टिकल अक्ष के साथ ठीक समायोजन के साथ ले जाएं जब तक कि एक्स-सीआर केंद्र में न आ जाए (चित्रा 1 सी, नीला तीर)।
    3. चरण 3.4.1-3.4.2 को कुछ बार दोहराएं जब तक कि एक्स-सीआर केंद्र में न रहे जब कैमरा आर्म बाईं और दाईं ओर झूलता है। यदि दाईं आंख एक पुनरावृत्ति के बीच में चलती है, तो समायोजन प्रक्रिया को पुनरारंभ करें।
  5. केंद्रीय स्थिति में कैमरा आर्म को लॉक करने के बाद वाई-सीआर और एक्स-सीआर के बीच ऊर्ध्वाधर दूरी को मापें। वाई-सीआर एलईडी चालू करें और वीडियो पर अपनी स्थिति रिकॉर्ड करें, और फिर एक्स-सीआर एलईडी पर स्विच करें और अपनी स्थिति रिकॉर्ड करें।
    नोट: वाई-सीआर और एक्स-सीआर के बीच ऊर्ध्वाधर दूरी का उपयोग आंखों के आंदोलनों के माप के दौरान वाई-सीआर की स्थिति प्राप्त करने के लिए किया जाएगा जिसमें केवल एक्स-सीआर एलईडी चालू है।
  6. पुतली रोटेशन आरपी की त्रिज्या को मापें, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. कैमरा आर्म को बाएं छोर (-10 °) पर घुमाएं और वीडियो पर पुतली (पीपी 1) और एक्स-सीआर (पीसीआर 1) की स्थिति रिकॉर्ड करें।
    2. फिर, कैमरा आर्म को दाएं छोर (+10 °) पर घुमाएं और वीडियो पर छात्र (पीपी 2) और एक्स-सीआर (पीसीआर 2) की स्थिति रिकॉर्ड करें। इस चरण को कई बार दोहराएं।
      नोट: जानवर की दाईं आंख को प्रत्येक पुनरावृत्ति के दौरान स्थिर रहने की आवश्यकता होती है ताकि फिल्म में पुतली आंदोलनों की मात्रा कैमरे की बांह को झूलने की डिग्री को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करे।
    3. ऊपर दर्ज मूल्यों के आधार पर, निम्नलिखित सूत्र के साथ पुतली रोटेशन आरपी (चित्रा 2 ए) की त्रिज्या की गणना करें:
      Equation 3
      नोट: भौतिक स्थान में कॉर्नियल प्रतिबिंब और पुतली केंद्र के बीच की दूरी की गणना फिल्म में उनकी दूरी के आधार पर की जाती है:
      PCR - P= फिल्म में पिक्सेल की संख्या x पिक्सेल कैमरा चिप x आवर्धन का आकार
  7. आरपी और पुतली व्यास के बीच संबंध विकसित करें, जैसा कि नीचे वर्णित है। जब पुतली फैलती है या संकुचित होती है तो आरपी बदल जाता है; अनुमानित रूप से, इसका मान पुतली के आकार (चित्रा 2 बी शीर्ष) के व्युत्क्रमानुपाती है।
    1. पुतली के आकार को विनियमित करने के लिए मॉनिटर की चमक को व्यवस्थित रूप से 0 से 160 सीडी / एम2 तक बदलें।
    2. प्रत्येक ल्यूमिनेंस मान के लिए, चरण 3.6 8-10 बार दोहराएं और पुतली के व्यास को रिकॉर्ड करें।
    3. ढलान और अवरोध (चित्रा 2 बी नीचे) प्राप्त करने के लिए ऊपर मापे गए मूल्यों के आधार पर आरपी और पुतली व्यास के बीच संबंध के लिए रैखिक प्रतिगमन लागू करें।
      नोट: रैखिक फिटिंग से पहले कभी-कभी आंखों के आंदोलनों के कारण होने वाले आउटलायर्स को हटा दिया जाता है। कई सत्रों में दोहराए जाने वाले माप के लिए, अंशांकन केवल एक जानवर के लिए एक बार किया जाना चाहिए, जब तक कि प्रयोग के दौरान उसकी आंख बड़ी न हो जाए।

4. ओकेआर के आंखों के आंदोलनों को रिकॉर्ड करें

  1. चरण 3.1-3.4 का पालन करते हुए रिग में एक माउस को हेड-फिक्स करें। यदि अंशांकन पूरा होने के ठीक बाद रिकॉर्डिंग होती है, तो इस चरण को छोड़ दें। कैमरा आर्म को सेंट्रल पोजिशन पर लॉक करें।
  2. नीचे वर्णित स्कोटोपिक ओकेआर के लिए मॉनिटर और जानवर सेट करें। फोटोपिक ओकेआर के लिए इस चरण को छोड़ दें।
    1. प्रत्येक मॉनिटर की स्क्रीन को एक अनुकूलित फ़िल्टर के साथ कवर करें, जो 1.2 तटस्थ घनत्व (एनडी) फिल्म की पांच परतों से बना है। सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर और मॉनिटर के बीच के अंतराल के माध्यम से कोई प्रकाश लीक न हो।
    2. कमरे की लाइट बंद कर दें। आईआर चश्मे की सहायता से निम्नलिखित कदम उठाए जाते हैं।
    3. दाईं आंख पर पिलोकार्पिन घोल की एक बूंद (खारा में 2%) लागू करें और 15 मिनट प्रतीक्षा करें। सुनिश्चित करें कि बूंद आंख पर रहती है और माउस द्वारा मिटाई नहीं जाती है। यदि घोल जानवर द्वारा मिटा दिया जाता है, तो पिलोकार्पिन समाधान की एक और बूंद लागू करें। यह स्कोटोपिक स्थिति के तहत आंख ट्रैकिंग के लिए पुतली को उचित आकार तक सिकोड़ता है।
      नोट: स्कोटोपिक स्थिति के तहत, पुतली काफी हद तक फैल जाती है ताकि इसका किनारा आंशिक रूप से पलक के पीछे छिपा हो। यह वीडियो-ओकुलोग्राफी द्वारा छात्र केंद्र का अनुमान लगाने की सटीकता को प्रभावित करता है। औषधीय रूप से दाईं आंख की पुतली को सिकोड़ने से इसके दृश्य इनपुट कम हो जाते हैं, और इस प्रकार दृश्य उत्तेजनाओं को बाईं आंख में प्रस्तुत किया जाता है।
    4. पिलोकार्पिन घोल को अच्छी तरह से धोने के लिए खारा से दाईं आंख को धो लें। बाड़े को पूरी तरह से सील करने के लिए पर्दे को नीचे खींचें, जो आवारा प्रकाश को स्कोटोपिक दृष्टि में हस्तक्षेप करने से रोकता है।
    5. ओकेआर परीक्षण शुरू करने से पहले जानवर को स्कोटोपिक वातावरण में पूरी तरह से समायोजित करने के लिए 5 मिनट दें।
  3. दृश्य उत्तेजना सॉफ्टवेयर और आंख ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर चलाएँ। फोटोपिक ओकेआर माप के लिए, सुनिश्चित करें कि ड्रम ग्रेटिंग साइनसॉइडल प्रक्षेपवक्र के साथ क्षैतिज रूप से झूलता है; स्कोटोपिक ओकेआर माप के लिए, सुनिश्चित करें कि ड्रम ग्रेटिंग बाएं से दाएं निरंतर वेग से बहती है, जो बाईं आंख के संदर्भ में टेम्पोरो-नाक दिशा है।
    नोट: जब दाईं आंख की पुतली, लेकिन बाईं आंख की नहीं, स्कोटोपिक स्थिति के तहत पिलोकार्पिन द्वारा सिकुड़ जाती है, तो ऑसिलेटरी ड्रम उत्तेजना द्वारा प्राप्त ओकेआर अत्यधिक असममित होता है। इस प्रकार, स्कोटोपिक ओकेआर माप के लिए, बाईं आंख को उत्तेजित किया जाता है जबकि दाईं आंख की गति की निगरानी की जाती है।
  4. आंख ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से प्रत्येक फ्रेम के लिए पुतली के आकार, सीआर स्थिति और पुतली की स्थिति को मापता है, और निम्नलिखित सूत्र (चित्रा 2 सी) के आधार पर आंख की स्थिति के कोण की गणना करता है:
    Equation 4
    यहां, पी सीआरसीआर स्थिति है, पी पी छात्र स्थिति है, और आरपी छात्र रोटेशन की त्रिज्या है। भौतिक स्थान में कॉर्नियल प्रतिबिंब और पुतली केंद्र के बीच की दूरी की गणना फिल्म में उनकी दूरी के आधार पर की जाती है:
    PCR - P= फिल्म में पिक्सेल की संख्या x पिक्सेल कैमरा चिप x आवर्धन का आकार
    संबंधित छात्र आकार का आरपी चरण 3.7.3 (चित्रा 2 बी नीचे) में रैखिक प्रतिगमन मॉडल के आधार पर प्राप्त किया गया है।

5. आंख विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ ओकेआर के आंखों के आंदोलनों का विश्लेषण

  1. उच्च आवृत्ति शोर (चित्रा 3 ए मध्य) को हटाने के लिए एक औसत फिल्टर (फ़िल्टर विंडो = 0.05 एस) का उपयोग करके आंखों के निशान को संसाधित करें।
  2. नीचे वर्णित के रूप में लेंस या निस्टागमस को हटा दें।
    1. आंखों के आंदोलनों के पहले क्रम व्युत्पन्न की गणना करके आंखों के वेग का अनुमान लगाएं (चित्रा 3 ए नीचे)। 50 °/s (चित्र 3A तल) की वेग सीमा लागू करके निस्टागमस या निस्टागमस की पहचान करें।
    2. रैखिक प्रतिगमन (चित्रा 3 बी) के आधार पर इन तेज आंख आंदोलनों के दौरान आंखों की स्थिति को लेंस या निस्टागमस से पहले खंड से निकालकर आंखों की स्थिति को प्रतिस्थापित करें।
  3. यदि ड्रम ग्रेटिंग (चित्रा 3 सी) घटता-बढ़ता है, तो फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म (गोएर्टजेल एल्गोरिदम) द्वारा ओकेआर आंख आंदोलनों के आयाम की गणना करें, या दृश्य उत्तेजना के दौरान आंखों के आंदोलनों के औसत वेग की गणना करें यदि ड्रम ग्रेटिंग एक दिशा में निरंतर वेग से चलता है (चित्रा 3 बी नीचे)।
    नोट: फूरियर ट्रांसफॉर्म से प्राप्त ऑसिलेटरी आंख आंदोलनों का आयाम साइनसॉइडल फ़ंक्शन (चित्रा 3 डी) के साथ आंख प्रक्षेपवक्र की फिटिंग से प्राप्त आयाम के समान है।
  4. ओकेआर लाभ की गणना करें। ऑसिलेटरी ड्रम गति के लिए, ओकेआर लाभ को ड्रम आंदोलनों के आयाम के लिए आंखों के आंदोलनों के आयाम के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है (चित्रा 3 सी दाएं)। यूनिडायरेक्शनल ड्रम गति के लिए, ओकेआर लाभ को ड्रम ग्रेटिंग वेग (चित्रा 3 बी नीचे) के लिए आंख वेग के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है।

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Representative Results

ऊपर दी गई प्रक्रिया के साथ, हमने कई दृश्य विशेषताओं पर ओकेआर की निर्भरता का मूल्यांकन किया। यहां दिखाए गए उदाहरण निशान पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 में प्रदान किए गए विश्लेषण कोड का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे, और उदाहरण ट्रेस कच्ची फ़ाइल पूरक कोडिंग फ़ाइल 2 में पाई जा सकती है। जब ड्रम ग्रेटिंग साइनसॉइडल प्रक्षेपवक्र (0.4 हर्ट्ज) में बह गया, तो जानवर की आंख स्वचालित रूप से एक समान ऑसिलेटरी तरीके (चित्रा 3 बी टॉप पैनल) में झंझरी की गति का पालन करती है, जो ओकेआर व्यवहार 2,5,8 की विशेषता है। क्षैतिज अक्ष में ओकेआर आंख आंदोलनों का आयाम तेजी से फूरियर ट्रांसफॉर्म (चित्रा 3 सी एंड डी) के साथ प्राप्त किया गया था, और ओकेआर लाभ की गणना आंखों के आंदोलनों के आयाम के अनुपात के रूप में की गई थी। ओकेआर लाभ स्थानिक आवृत्ति, दोलन आवृत्ति और आंदोलन झंझरी की दिशा के मूल्यों के साथ भिन्न होता है (चित्रा 4 ए)। सबसे पहले, ओकेआर व्यवहार के स्थानिक आवृत्ति ट्यूनिंग वक्र में एक उल्टा वी-आकार था और 0.16 सीपीडी (चित्रा 4 ए बाएं) की मध्यवर्ती स्थानिक आवृत्ति पर पहुंच गया। दूसरा, दोलन आवृत्ति ट्यूनिंग वक्र में गिरावट आई क्योंकि ड्रम ग्रेटिंग की दोलन आवृत्ति में वृद्धि हुई (चित्रा 4 ए मध्य), यह दर्शाता है कि ओकेआर व्यवहार कम गति दृश्य गति4 के जवाब में सबसे अच्छा काम करता है। दोलन आवृत्ति ट्यूनिंग वक्र के आयाम और आकार दोनों अलग-अलग स्थानिक आवृत्तियों के झंझरी प्रस्तुत करते समय भिन्न होतेहैं। तीसरा, क्षैतिज ओकेआर को विभिन्न दिशाओं में चलने वाले झंझरी द्वारा भी प्रेरित किया जा सकता है (चित्रा 4 ए दाएं)। सबसे मजबूत क्षैतिज ओकेआर व्यवहार टेम्पोरो-नाक गति (0 °) द्वारा प्राप्त किया गया था। ओकेआर लाभ ~ 80% या अधिकतम का ~ 30% तक गिर गया, जब झंझरी क्रमशः 30 ° या 60 ° तिरछे कोणों में टेम्पोरो-नाक दिशा (ऊपर और नीचे दोनों) से विचलित हो गई, और क्षैतिज OKR गायब हो गया जब झंझरी लंबवत ऊपर या नीचे (90° और 270°) चली गई। इसके अलावा, ट्यूनिंग वक्रों के आकार चमक के स्तर से प्रभावित थे। उदाहरण के लिए, जानवरों ने फोटोपिक स्थिति के तहत 0.16 और 0.32 सीपीडी की स्थानिक आवृत्तियों के जवाब में ओकेआर व्यवहार को अच्छी तरह से प्रदर्शन किया, लेकिन स्थानिक आवृत्ति ट्यूनिंग वक्र स्कोटोपिक स्थिति (चित्रा 4 बी) के तहत बाईं ओर स्थानांतरित हो गया। ट्यूनिंग कर्व्स के आकार का विश्लेषण करने के लिए, हम उन्हें उपयुक्त गणितीय कार्यों के साथ फिट करते हैं। उदाहरण के लिए, गॉसियन फ़ंक्शन का उपयोग स्थानिक आवृत्ति ट्यूनिंग (चित्रा 4 सी) के शिखर और बैंडविड्थ का अनुमान लगाने के लिए किया गया था। इस विश्लेषण के साथ, हमने पाया कि स्कोटोपिक स्थिति के तहत ट्यूनिंग वक्र का फोटोपिक स्थिति की तुलना में पसंदीदा स्थानिक आवृत्ति में कम मूल्य था। ऊपर वर्णित प्रक्रिया का उपयोग ओकेआर व्यवहार की प्लास्टिसिटी को मापने के लिए भी किया जा सकता है। 45 मिनट के निरंतर ओकेआर उत्तेजना के बाद, ओकेआर व्यवहार का आयाम काफी शक्तिशाली था (चित्रा 4 डी), पिछली रिपोर्टों के अनुरूप। ये परिणाम इन व्यवहारों में शामिल मस्तिष्क सर्किट को समझने में ओकुलोमोटर व्यवहार और क्षमता की जांच में इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोगों को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: ओकेआर रिग का सेटअप । (ए) हेड बार के आयाम। (बी) वर्चुअल ड्रम सिस्टम का बैक व्यू (बाएं) और शीर्ष दृश्य (मध्य)। तीन मॉनिटर एक दूसरे पर ऑर्थोगोनल रूप से लगाए जाते हैं। एक माउस का सिर चौकोर बाड़े के केंद्र में रखा जाता है और आगे की ओर होता है। दृश्य उत्तेजना (धारियों के बीच की जगह) की अवधि जानवर की आंख के अज़ीमुथ के आधार पर भिन्न होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आंख पर झंझरी के प्रक्षेपण में निरंतर स्थानिक आवृत्ति है। दूसरे शब्दों में, झंझरी की स्थानिक आवृत्ति को पूरे दृश्य क्षेत्र में स्थिर माना जाता है, जैसे कि झंझरी एक आभासी ड्रम (दाएं) की सतह के साथ बहती है। (ग) आईआर वीडियो-ओकुलोग्राफी की स्थापना। बाएं: ओकेआर रिकॉर्डिंग के दौरान केंद्र में तय होने पर कैमरे की स्थिति। नीला तीर: ऑप्टिकल अक्ष के साथ। हरा तीर: ऑप्टिकल अक्ष के लंबवत। दाएं: आंख अंशांकन के दौरान कैमरे का घूर्णन। (घ) कैमरे पर लगाए गए एक्स-सीआर और वाई-सीआर एलईडी की स्थिति। (ई) बाईं और दाईं आंखों (बाएं), और आंखों के नाक और लौकिक कोनों के स्तर क्रमशः क्षैतिज रॉड या हेडप्लेट एडाप्टर (लाल तीर) को घुमाकर क्षैतिज (दाएं) संरेखित होते हैं। (एफ) ओकेआर स्टेशन की तस्वीर। ध्यान दें कि ओकेआर रिग को काले पर्दे के साथ एक अनुकूलित बाड़े के अंदर रखा गया है। संक्षेप: आईआर = अवरक्त; सीआर = कॉर्नियल प्रतिबिंब। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वीडियो-ओकुलोग्राफी में आंखों की स्थिति का अंशांकन और माप । (ए) अंशांकन का योजनाबद्ध। पुतली रोटेशन(आरपी) की त्रिज्या का अनुमान कैमरे को बाईं ओर (-10 डिग्री, बाएं पैनल) और सबसे दाईं स्थिति (10 डिग्री, दाएं पैनल) पर घुमाकर लगाया जाता है। लाल बिंदु कॉर्नियल प्रतिबिंब एक्स-सीआर की स्थिति को इंगित करते हैं जब कैमरा सबसे बाईं और दाईं ओर रखा जाता है। नीले बिंदु विद्यार्थियों के केंद्रों को इंगित करते हैं। हरे रंग की पट्टियां कैमरा वीडियो (पीसीआर - पीपी) में देखे गए कॉर्नियल प्रतिबिंब और पुतली केंद्र के बीच की दूरी को इंगित करती हैं। (बी) पुतली के आकार पर आरपी की निर्भरता। शीर्ष: एक छोटी या बड़ी पुतली के साथ आंखों की पुतलियों की योजनाबद्धता। नीचे: आरपी और एक उदाहरण माउस के पुतली के व्यास के बीच संबंध। माउस में ल्यूमिनेंस (0-160 सीडी / एम2 की सीमा में 10 मान) को बदलकर पुतली का आकार बदल दिया जाता है। ब्लैक डॉट्स: डेटा जो रैखिक फिटिंग के लिए उपयोग किया जाता है। ब्लू डॉट्स: आउटलायर्स जिन्हें रैखिक फिटिंग से बाहर रखा गया है। लाल वक्र: रैखिक प्रतिगमन में सबसे अच्छी फिट रेखा। ध्यान दें कि आरपी पुतली व्यास के व्युत्क्रमानुपाती है। (सी) आंख की स्थिति के कोण की गणना जब आंख ऑप्टिक अक्ष के दाईं या बाईं ओर चली गई है। लाल बिंदु, नीले बिंदु और हरे रंग की सलाखों का अर्थ ए के समान है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ओकेआर लाभ की गणना। (ए) शीर्ष: ओकेआर उत्तेजना के दौरान ली गई नाक (एन; बाएं) और अस्थायी (टी; दाएं) आंखों की स्थिति के स्नैपशॉट। लाल दीर्घवृत्त: छात्र प्रोफ़ाइल के लिए फिटिंग। लाल क्रॉस: छात्र केंद्र। सफेद तीर: एक संदर्भ एलईडी का कॉर्नियल प्रतिबिंब। मध्य: उच्च आवृत्ति शोर को हटाने के लिए एक औसत फिल्टर (फ़िल्टर विंडो = 0.05 एस) के साथ (काले) या (लाल) के बिना आंखों के आंदोलनों का प्रक्षेपवक्र। नीचे: आंखों के आंदोलनों के पहले क्रम व्युत्पन्न की गणना करके आंखों के वेग का अनुमान। (बी) ड्रम प्रक्षेपवक्र22 के साथ लगाए गए छिद्रों/निस्टागमस (काले) को हटाने के बाद ओकेआर की धीमी आंखों की गति का प्रक्षेपवक्र। शीर्ष: 5° के आयाम और 0.4 हर्ट्ज की दोलन आवृत्ति के साथ ऑसिलेटरी ड्रम गति। नीचे: 6.25 °/सेकंड के निरंतर वेग के साथ यूनिडायरेक्शनल (टेम्पोरो-नाक) ड्रम गति। (C) बाएं: B शीर्ष में आंख प्रक्षेपवक्र का चक्र-औसत। दाएं: तेजी से फूरियर ट्रांसफॉर्म द्वारा आंख या ड्रम ग्रेटिंग आंदोलनों का आवृत्ति विश्लेषण। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ड्रम ग्रेटिंग 0.4 हर्ट्ज पर झूलता है, और इस प्रकार आंख और ड्रम ग्रेटिंग मूवमेंट के आयाम 0.4 हर्ट्ज (स्टार मार्क्स) पर चरम पर होते हैं। ओकेआर लाभ 0.4 हर्ट्ज पर आंख और ड्रम ग्रेटिंग आंदोलन के आयामों का अनुपात है। (डी) शीर्ष: साइनसॉइडल फ़ंक्शन के साथ बी टॉप में आंख प्रक्षेपवक्र की वक्र फिटिंग। नीचे: तेज फूरियर ट्रांसफॉर्म विधि द्वारा प्राप्त आंखों के आंदोलनों के आयाम का संबंध और साइनसॉइडल वक्र फिटिंग से प्राप्त। पीला बिंदु: शीर्ष में उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ओकेआर व्यवहार की दृश्य सुविधा चयनात्मकता और प्लास्टिसिटी। (ए) ओकेआर की दृश्य सुविधा चयनात्मकता फोटोपिक स्थिति के तहत लाभ प्राप्त करती है। बाएं: एक जानवर से स्थानिक आवृत्ति ट्यूनिंग वक्र (दोलन आवृत्ति: 0.4 हर्ट्ज; प्रक्षेपवक्र: क्षैतिज रूप से दोलन; औसत ल्यूमिनेंस: 40 सीडी / एम2; एन = 15)। मध्य: एक जानवर से दोलन आवृत्ति ट्यूनिंग वक्र (स्थानिक आवृत्ति: 0.08 या 0.16 सीपीडी; प्रक्षेपवक्र: क्षैतिज रूप से दोलन; औसत प्रकाश: 40 सीडी / एम2; एन = 15)। दाएं: एक जानवर से दिशा ट्यूनिंग वक्र (स्थानिक आवृत्ति: 0.16 सीपीडी; अस्थायी आवृत्ति: 1 हर्ट्ज; औसत ल्यूमिनेंस: 45 सीडी / एम2; एन = 24)। लाल तीर और पट्टी टेम्पोरो-नाक दिशा को इंगित करते हैं। स्थानिक और लौकिक/दोलन आवृत्ति ट्यूनिंग के लिए, तीन मॉनिटरों पर प्रस्तुत एक ऊर्ध्वाधर ड्रम ग्रेटिंग एक स्थिर वेग पर या एक ऑस्सिलेटरी तरीके से क्षैतिज रूप से चलती है। दिशा ट्यूनिंग के लिए, केवल सही मॉनिटर पर प्रस्तुत एक झंझरी स्थिर वेग से 12 दिशाओं में से एक में चलती है। मोटाई: माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि। (बी) ओकेआर की स्थानिक आवृत्ति ट्यूनिंग वक्र स्कोटोपिक या फोटोपिक स्थिति के तहत एक जानवर से प्राप्त होती है। फोटोपिक: ऑसिलेटरी गति; दोलन आवृत्ति: 0.2 हर्ट्ज; औसत ल्यूमिनेंस: 40 सीडी / n = 15. - स्कोटोपिक: एक निरंतर वेग के साथ रैखिक गति; अस्थायी आवृत्ति: 0.25 हर्ट्ज; औसत ल्यूमिनेंस: 8 x 10-5 सीडी / n = 16. ली फिल्टर (299 1.2 एनडी) की पांच परतों के साथ मॉनिटर को कवर करके स्कोटोपिक स्थिति प्राप्त की जाती है। (सी) गॉसियन फोटोपिक और स्कोटोपिक स्थितियों के तहत ओकेआर लाभ की स्थानिक आवृत्ति ट्यूनिंग की फिटिंग। फोटोपिक: ऑसिलेटरी गति; दोलन आवृत्ति: 0.2 हर्ट्ज; औसत ल्यूमिनेंस: 40 सीडी / n = 15. - स्कोटोपिक: एक निरंतर वेग के साथ रैखिक गति; अस्थायी आवृत्ति: 0.25 हर्ट्ज; औसत ल्यूमिनेंस: 8 x 10-5 सीडी / n = 16. (डी) 45 मिनट के निरंतर ओकेआर उत्तेजना द्वारा प्रेरित एक माउस का ओकेआर प्रवर्धन। स्थानिक आवृत्ति: 0.1 सीपीडी; दोलन आवृत्ति: 0.4 हर्ट्ज; औसत ल्यूमिनेंस: 35 सीडी / n = 40 शीर्ष: चक्र ओकेआर प्रवर्धन से पहले और बाद में ओकेआर प्रक्षेपपथ का औसत है। मोटाई: SEM. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: उदाहरण निशान उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाने वाला विश्लेषण कोड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: सॉफ्टवेयर के साथ उत्पन्न उदाहरण निशान। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां प्रस्तुत ओकेआर व्यवहार परख की विधि कई फायदे प्रदान करती है। सबसे पहले, कंप्यूटर-जनित दृश्य उत्तेजना भौतिक ड्रम के आंतरिक मुद्दों को हल करती है। इस मुद्दे से निपटते हुए कि भौतिक ड्रम स्थानिक आवृत्ति, दिशा या कंट्रास्ट ट्यूनिंग8 की व्यवस्थित परीक्षा का समर्थन नहीं करते हैं, वर्चुअल ड्रम इन दृश्य मापदंडों को परीक्षण-दर-परीक्षण आधार पर बदलने की अनुमति देता है, इस प्रकार ओकेआर व्यवहार की सुविधा चयनात्मकता के व्यवस्थित और मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है (चित्रा 4 ए); जबकि भौतिक ड्रम बाहरी प्रकाश स्रोत23 द्वारा एक गैर-समान रोशनी से पीड़ित हैं, आभासी ड्रम आसानी से अपनी सतह पर सजातीय चमक प्रदान कर सकता है; एनडी फिल्टर और ल्यूमिनेंस मीटर की मदद से, कंप्यूटर-जनित दृश्य उत्तेजना स्कोटोपिक से फोटोपिक (चित्रा 4 बी) तक विभिन्न अच्छी तरह से नियंत्रित ल्यूमिनेंस स्तरों पर ओकेआर माप की अनुमति देती है, जो भौतिक ड्रम के साथ किया जाना मुश्किल है। उनके जड़त्वीय द्रव्यमान के कारण भौतिक ड्रम के त्वरण में सीमा के बिना, आभासी दृश्य उत्तेजना आदर्श रूप से सटीक प्रक्षेपपथ प्राप्त कर सकती है, खासकर उच्च त्वरण और उच्च वेग पर। इसके अलावा, कंप्यूटर-जनित दृश्य उत्तेजना अन्य प्रकार के दृश्य उत्तेजना के रचनात्मक डिजाइन की अनुमति देती है, जैसे कि सुसंगत रूप से चलती बिंदु, जो विभिन्न ओकुलोमोटर व्यवहारों के तंत्र की जांच करने में मदद करता है। दूसरा, हमारी प्रक्रिया मानकीकृत है और इस प्रकार व्यवहार रिकॉर्डिंग की प्रगति की निगरानी के लिए न्यूनतम प्रयासों की आवश्यकता होती है, जो एक साथ कई चूहों की जांच करने का अवसर प्रदान करता है। इसलिए, यह जानवरों के एक बड़े समूह (दसियों से सैकड़ों जानवरों) को शामिल करने वाले अध्ययनों के लिए उपयुक्त है। तीसरा, उच्च परिशुद्धता और मात्रात्मक शक्ति अनुदैर्ध्य अध्ययन24 में एक ही चूहों के दोहराए जाने वाले ओकेआर माप ों की तुलना करना संभव बनाती है, विभिन्न औषधीय उपचार10 के तहत, या तंत्रिका सर्किट गड़बड़ी5 के तहत। अंत में, आवृत्ति डोमेन 5,7,9 में फूरियर ट्रांसफॉर्म-आधारित विश्लेषण अस्थायी डोमेन 12,25,26 (चित्रा 3 डी नीचे) में फिटिंग-आधारित विश्लेषण के लिए ऑसिलेटरी आंख आंदोलनों के आयाम में समकक्ष परिणाम देता है, यह दर्शाता है कि यहां प्रस्तुत विश्लेषण विधि सटीक और सटीक दोनों है।

हमारी विधि ओकेआर प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने का अवसर भी प्रदान करती है, जो ओकुलोमोटर सीखने के तंत्र की जांच के लिए एक बेतहाशा उपयोग किया जाने वाला प्रतिमान है। माउस को निरंतर ओकेआर उत्तेजना पेश करते समय या शल्य चिकित्सा द्वारा अपने वेस्टिबुलर अंग को घाव करते समय, ओकेआर के आयाम को 8,9 शक्तिशाली किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत ओकेआर परख ओकेआर प्रवर्धन (चित्रा 4 डी) में होने वाले आंखों के आंदोलनों में छोटे बदलावों को पकड़ने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है। इस विधि की मात्रात्मक शक्ति तंत्रिका सर्किट गतिशीलता के साथ व्यवहार परिवर्तनों को सहसंबंधित करना संभव बनाती है, जो ओकुलोमोटर सीखने के अंतर्निहित तंत्रको प्रकट करने के लिए आवश्यक है 5,8,9,13.

ओकेआर माप की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, सर्जरी के दौरान, पलक को छूने वाले सुपरग्लू और दंत ऐक्रेलिक से बचने के लिए अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है, जो कॉर्निया को नुकसान पहुंचा सकती है या आंशिक रूप से आंख खोलने से रोक सकती है। दूसरा, ओकेआर की ताकत चूहों की व्यवहार स्थिति27,28 से प्रभावित होती है। इस प्रकार, ओकेआर माप पर तनाव के प्रभाव को कम करने के लिए आवास के कुछ दौर की सिफारिश की जाती है; इसके अलावा, रिकॉर्डिंग के दौरान गंध, शोर या प्रकाश के कारण होने वाली गड़बड़ी को रोका जाना चाहिए। अंत में, चूहों के सिर को ठीक से उन्मुख किया जाना चाहिए ताकि आंखों के दो कोनों को जोड़ने वाली रेखा क्षैतिज अक्ष के समानांतर हो। यह गारंटी देता है कि दृश्य गति की दिशा जोड़ और अपहरण आंख आंदोलनों की धुरी के साथ संरेखित है। तीसरा, आंख की समान रोशनी पुतली की एक तेज छवि उत्पन्न करने और बदले में उच्च गुणवत्ता वाली आंखों की ट्रैकिंग का आश्वासन देने के लिए महत्वपूर्ण है।

यह ध्यान देने योग्य है कि यहां प्रस्तुत विधियों की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, जब किसी जानवर की आंख झपकती है या अपारदर्शी आंख का निर्वहन पुतली को अवरुद्ध करता है, तो वीडियो-ओकुलोग्राफी क्षण भर में या स्थायी रूप से आंख का ट्रैक खो देती है। इसी तरह, पलकें झुकने पर आंखों के आंदोलनों की निगरानी के लिए इसका उपयोग नहीं किया जा सकता है। दूसरा, वीडियो-ओकुलोग्राफी का अस्थायी रिज़ॉल्यूशन कैमरों की फ्रेम दर द्वारा 4-20 एमएस की सीमा तक सीमित है। अंत में, सिर-निश्चित तैयारी स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों के ओकुलर व्यवहार की निगरानी की अनुमति नहीं देती है।

यहां प्रस्तुत वीडियो-ओकुलोग्राफी और वर्चुअल ड्रम को दृश्य सुविधा चयनात्मकता और ओकेआर व्यवहार की प्लास्टिसिटी को चिह्नित करने और इस व्यवहार को मध्यस्थता और अनुकूली रूप से संशोधित करने में शामिल रेटिना और केंद्रीय सर्किट को समझने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था। इसके अलावा, वे उन अध्ययनों को भी लाभ पहुंचा सकते हैं जिनमें अन्य ओकुलर व्यवहार या तो विषय हैं या तंत्रिका घटना के भ्रामक कारक भी हैं। उदाहरण के लिए, वीडियो-ओकुलोग्राफी का उपयोग पुतली के फैलाव29 और आंख जैसी आंखों के आंदोलनों30,31 की निगरानी के लिए किया जा सकता है, जो सतर्कता और मस्तिष्क की स्थिति32,33,34,35 का संकेत हैं। इसके अलावा, यहां उल्लिखित अंशांकन और माप प्रक्रियाएं स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में हेड-माउंटेड कैमरे के साथ आंखों के आंदोलनों की निगरानी के लिए सार्वभौमिक रूप से लागू होती हैं।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम दिशा ट्यूनिंग के डेटा को साझा करने के लिए यिंगटियन हे के आभारी हैं। इस काम को कैनेडियन फाउंडेशन ऑफ इनोवेशन एंड ओंटारियो रिसर्च फंड (सीएफआई / ओआरएफ प्रोजेक्ट नंबर 37597), एनएसईआरसी (आरजीपीआईएन -2019-06479), सीआईएचआर (प्रोजेक्ट ग्रांट 437007), और कनॉट न्यू रिसर्चर अवार्ड्स से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D translational stage Thorlabs XYT1
Acrylic resin Lang Dental B1356 For fixing headplate on skull and protecting skull
Bupivacaine STERIMAX ST-BX223 Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia
Carprofen RIMADYL 8507-14-1 Analgesia
Compressed air Dust-Off
Eye ointment Alcon Systane For maintaining moisture of eyes
Graphic card NVIDIA Geforce GTX 1650 or Quadro P620. For generating single screen among three monitors
Heating pad Kent Scientific HTP-1500 For maintaining body temperature
High-speed infrared (IR) camera Teledyne Dalsa G3-GM12-M0640 For recording eye rotation
IR LED Digikey PDI-E803-ND For CR reference and the illumination of the eye
IR mirror Edmund optics 64-471 For reflecting image of eye
Isoflurane FRESENIUS KABI CP0406V2
Labview National instruments version 2014 eye tracking
Lactated ringer BAXTER JB2324 Water and energy supply
Lidocaine and epinephrine mix Dentsply Sirona 82215-1 XYLOCAINE. Local anesthesia
Luminance Meter Konica Minolta LS-150 for calibration of monitors
Matlab MathWorks version xxx analysis of eye movements
Meyhoefer Curette World Precision Instruments 501773 For scraping skull and removing fascia
Microscope calibration slide Amscope MR095 to measure the magnification of video-oculography
Monitors Acer  B247W Visual stimulation
Neutral density filter Lee filters 299 to generate scotopic visual stimulation
Nigh vision goggle Alpha optics AO-3277 for scotopic OKR
Photodiode Digikey TSL254-R-LF-ND to synchronize visual stimulation and video-oculography
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich P6503
Post Thorlabs TR1.5
Post holder Thorlabs PH1
PsychoPy open source software version xxx visual stimulation toolkit
Scissor RWD S12003-09 For skin removal
Superglue Krazy Glue Type: All purpose. For adhering headplate on the skull

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References

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  2. Distler, C., Hoffmann, K. P. The Oxford Handbook of Eye Movement. , Oxford University Press. 65-83 (2011).
  3. Sereno, A. B., Bolding, M. S. Executive Functions: Eye Movements and Human Neurological Disorders. , Elsevier. (2017).
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Liu, J., Liu, B. h. Quantification… More

Liu, J., Liu, B. h. Quantification of Visual Feature Selectivity of the Optokinetic Reflex in Mice. J. Vis. Exp. (196), e65281, doi:10.3791/65281 (2023).

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