Summary
在这里，我们描述了一种用于量化视动反射的标准方案。它结合了虚拟鼓刺激和视频眼部成像，因此可以精确评估行为的特征选择性及其自适应可塑性。
Abstract
视动反射 （OKR） 是一种重要的先天性眼球运动，由视觉环境的整体运动触发，用于稳定视网膜图像。由于其重要性和稳健性，OKR 已被用于研究视觉运动学习并评估具有不同遗传背景、年龄和药物治疗的小鼠的视觉功能。在这里，我们介绍了一种高精度评估头部固定小鼠OKR响应的程序。头部固定可以排除前庭刺激对眼球运动的影响，从而可以测量仅由视觉运动触发的眼球运动。OKR 由虚拟鼓系统引发，其中三个计算机显示器上呈现的垂直光栅以振荡方式水平漂移或以恒定速度单向漂移。通过这个虚拟现实系统，我们可以系统地改变视觉参数，如空间频率、时间/振荡频率、对比度、亮度和光栅方向，并量化视觉特征选择性的调谐曲线。高速红外视频眼球造影可确保准确测量眼球运动的轨迹。对个体小鼠的眼睛进行校准，以提供比较不同年龄、性别和遗传背景的动物之间的OKR的机会。该技术的定量能力使其能够检测 OKR 的变化，当这种行为由于衰老、感官体验或运动学习而塑性地适应时;因此，它使该技术成为用于研究眼睛行为可塑性的工具库的宝贵补充。
Introduction
为了响应环境中的视觉刺激，我们的眼睛会移动以转移我们的视线、稳定视网膜图像、跟踪移动目标或将两只眼睛的中央凹与距离观察者不同距离的目标对齐，这对正常视力至关重要 1,2。动眼神经行为已被广泛用作有吸引力的感觉运动整合模型，以了解健康和疾病中的神经回路，至少部分原因是动眼神经系统的简单性3。在三对眼外肌的控制下，眼睛在眼眶中主要围绕三个相应的轴旋转：沿横轴的抬高和凹陷，沿垂直轴的内收和外展，以及沿前后轴的内收和外展1,2。这种简单的系统使研究人员能够在实验室环境中轻松准确地评估小鼠的动眼神经行为。
一种主要的动眼神经行为是视动反射 （OKR）。这种不自主的眼球运动是由视网膜上图像的缓慢漂移或滑动触发的，当动物的头部或其周围环境移动时，用于稳定视网膜图像2,4。OKR 作为一种行为范式，出于多种原因对研究人员来说很有趣。首先，它可以被可靠地刺激并准确量化5,6。其次，量化这种行为的程序相对简单和标准化，可用于评估大型动物群体的视觉功能7。第三，这种先天行为具有高度的可塑性5,8,9。当长时间重复性视网膜滑脱时，其振幅可以增强 5,8,9，或者当其工作伙伴前庭眼反射 （VOR）（由前庭输入2 触发的另一种稳定视网膜图像的机制）受损时5。这些OKR增强的实验范式使研究人员能够揭示动眼神经学习的电路基础。
在以前的研究中，主要使用两种非侵入性方法评估 OKR：（1） 视频眼部造影结合物理鼓 7,10,11,12,13 或 （2） 任意确定头部转动结合虚拟鼓6,14,15,16.尽管它们的应用在理解动眼神经可塑性的分子和电路机制方面取得了丰硕的发现，但这两种方法都存在一些缺点，限制了它们在定量检查OKR特性方面的能力。首先，带有黑白条纹或圆点印刷图案的物理鼓不允许轻松快速地改变视觉图案，这在很大程度上限制了 OKR 对某些视觉特征的依赖性的测量，例如移动光栅的空间频率、方向和对比度 8,17。相反，OKR 对这些视觉特征的选择性测试可以从计算机化的视觉刺激中受益，其中视觉特征可以方便地从试验到试验进行修改。通过这种方式，研究人员可以系统地研究多维视觉参数空间中的OKR行为。此外，OKR 测定的第二种方法仅报告触发可识别 OKR 的视觉参数的阈值，而不报告眼睛或头部运动的幅度6、14、15、16。因此，缺乏定量能力无法分析调谐曲线的形状和首选的视觉特征，或检测正常和病理条件下个体小鼠之间的细微差异。为了克服上述局限性，在最近的研究中，视频眼部造影和计算机虚拟视觉刺激相结合来检测 OKR 行为 5,17,18,19,20。然而，这些先前发表的研究没有提供足够的技术细节或分步说明，因此研究人员为自己的研究建立这样的OKR测试仍然具有挑战性。
在这里，我们提出了一种协议，通过视频眼部造影和计算机化虚拟视觉刺激的组合，精确量化明视或暗视条件下OKR行为的视觉特征选择性。将小鼠头部固定以避免前庭刺激引起的眼球运动。高速摄像机用于记录观察具有变化视觉参数的移动光栅的小鼠的眼球运动。校准单个小鼠眼球的物理大小，以确保推导眼球运动角度的准确性21。这种定量方法允许比较不同年龄或遗传背景的动物之间的OKR行为，或监测其由药物治疗或视觉运动学习引起的变化。
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Protocol
本研究中进行的所有实验程序均已根据多伦多大学动物护理委员会和加拿大动物护理委员会制定的指南获得生物科学当地动物护理委员会的批准。
1. 在颅骨顶部植入头杆
注意：为避免 VOR 行为对眼球运动的贡献，在 OKR 测试期间固定鼠标头部。因此，通过手术将头杆植入颅骨顶部。
- 在气室中用4%异氟烷（v / v）和O 2的混合物麻醉小鼠（2-5 个月大的雌性和雄性C57BL / 6）。将小鼠转移到定制的手术平台上，将异氟醚的浓度降低到1.5%-2%。通过检查整个手术过程中的脚趾捏反应和呼吸频率来监测麻醉深度。
- 在动物身体下方放置加热垫以保持其体温。在双眼上涂上一层润滑眼膏，以保护它们免受干燥。用铝箔盖住眼睛，以保护它们免受光线照射。
- 皮下注射卡洛芬，剂量为 20 mg/kg，以减轻疼痛。用葡萄糖酸氯己定皮肤清洁剂润湿皮毛后，剃掉头骨顶部的皮毛。用70%异丙醇和氯己定酒精对暴露的头皮进行两次消毒。
- 在切口部位皮下注射布比卡因（8mg / kg），然后用剪刀去除头皮（~1cm2），露出颅骨背面，包括额后骨，顶骨和顶间骨。
- 在暴露的头骨上滴几滴 1% 利多卡因和 1：100,000 肾上腺素，以减轻局部疼痛和出血。用 Meyhoefer 刮匙刮除颅骨以去除筋膜并用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洁。
注意：颞肌与颅骨分离，以增加头杆连接的表面积。 - 轻轻向颅骨表面吹压缩空气，直到水分消失，骨头变白，擦干颅骨。在头骨的裸露表面（包括切开的头皮边缘）涂上一层薄薄的强力胶，然后涂上一层丙烯酸树脂。
注意：在使用强力胶之前，颅骨表面需要没有血液或水。 - 沿着颅骨顶部的中线放置一个不锈钢头杆（见 图1A）。涂抹更多的丙烯酸树脂，从头杆的边缘开始，直到头杆的底部完全嵌入丙烯酸树脂中。涂抹丙烯酸树脂两到三次以增加厚度。
- 等待约15分钟，直到丙烯酸树脂硬化。皮下注射 1 mL 乳酸林格氏液。然后，将鼠标放回放在加热垫上的笼子中，直到动物完全移动。
- 手术后让小鼠在家笼中恢复至少 5 天。一旦动物处于良好状态，将其头部在OKR设置中用头部杆固定15-30分钟，以使其熟悉头部固定和实验环境。每天重复一次熟悉，至少 3 天。
2. 虚拟鼓的设置和视频眼部成像
- 将三台显示器彼此垂直安装，形成一个方形外壳，覆盖视觉空间中~270°的方位角和63°的仰角（图1B左）。
- 使用独立显卡，将三台显示器合并到一个简单的显示器中，以确保所有显示器之间的同步。
- 如下所述校准显示器的亮度。
- 打开显示器所连接的计算机并等待 15 分钟。预热对于获得稳定的亮度至关重要。
- 以 0 为步长系统地将显示器上的亮度设置从 100 更改为 25。
- 对于每个亮度值，使用亮度计测量显示器在各种像素值（0-255，步长为 15）下的亮度。
- 使用线性回归拟合像素值 255 的亮度和亮度之间的关系，并估计产生 160 cd/m2 的亮度值。
- 对于亮度测量中使用的每个像素值（步骤 2.3.3），根据线性回归估计步骤 2.3.4 中派生的亮度值的亮度。使用幂函数 lum = A * pixel γ拟合一组新的亮度值（在 2.3.4 中派生的亮度值下）与其对应的像素值之间的关系，从而得出 gamma 因子 γ和系数 A。这些将用于生成所需亮度值的正弦光栅。
- 将所有三个显示器的亮度设置为步骤 2.3.4 中派生的值，以确保它们的亮度值对于相同的像素值相同。
- 使用视觉刺激工具包生成一个虚拟鼓，用于刺激 OKR 行为，如下所述。
- 在显示器上呈现垂直正弦光栅，并沿方位角调整周期（条纹之间的间距），以确保光栅在眼睛上的投影具有恒定的空间频率（鼓形光栅;图1B中右）。
- 确保动物头部固定在外壳的中心，以便它看到光栅在虚拟鼓的表面上具有恒定的空间频率。
- 修改视觉刺激码中移动光栅的参数，如振荡幅度、空间频率、时间/振荡频率、方向、对比度等。使用两种类型的视觉运动：（1）光栅在正弦函数之后以振荡方式顺时针或逆时针漂移：
这里，Amp 是鼓轨迹的振幅，f 是振荡频率，t 是时间（振荡幅度：5°;光栅空间频率：0.04-0.45 cpd;振荡频率：0.1-0.8 Hz，对应刺激的峰值速度为 3.14-25.12 °/s [鼓速度 = Amp x 2π x f x cos （2π x f x t）;对比度： 80%-100%;平均亮度：35-45 cd/m2;（2）光栅以恒定速度单向漂移：
（空间频率：0.04-0.64 cpd;时间频率：0.25-1 Hz;鼓速度=时间频率/空间频率。
- 如下所述设置视频眼部摄影。
- 为避免阻塞动物的视野，请在距中线 60° 的位置放置红外 （IR） 镜以形成右眼的图像。
- 将红外摄像头放在鼠标后面的右侧（图1C左）以捕获右眼的图像。
- 将高速红外摄像机安装在摄像机臂上，使摄像机围绕右眼图像旋转±10°（图1C右）。
- 使用连接到其中一个监视器的光电二极管提供电信号，以同步视频眼部成像和视觉刺激的时间。
- 将四个由鹅颈臂支撑的红外发光二极管 （LED） 放在右眼周围，以提供眼睛的红外照明。
- 在相机上放置两个红外 LED 以提供角膜反射 （CR） 参考：一个固定在相机上方 （X-CR），而另一个位于相机左侧 （Y-CR; 图1D）。
- 使用校准载玻片测量视频眼部成像系统的光学放大倍率。
注意：当根据旋转眼球运动计算眼角时，参考 CR 用于抵消平移眼球运动。
- 如下所述，将动物的头部固定在显示器形成的外壳的中心。
- 将动物的头部与头板固定在钻机的中心，并使其面朝前。调整头部的倾斜度，使左右眼水平，鼻角和颞角水平对齐（图1E）。
- 通过头部固定装置提供的粗略调整和 2D 平移台提供的微调水平移动动物的头部，并通过头部固定装置和柱/柱支架对垂直移动，直到动物的右眼出现在摄像机的实时视频中。在校准和测量眼球运动之前，将热镜反射的动物右眼图像与相机臂的枢轴点叠加（详见下面的步骤 3.4）。
- 在 OKR 钻机周围构建一个定制的外壳，以阻挡室内光线（图 1F）。
3. 眼球运动的校准
注意：旋转眼球运动是根据瞳孔的运动和瞳孔运动的轨道半径（Rp，从瞳孔中心到眼球中心的距离）计算的。对于每只小鼠，该半径通过实验测量21。
- 如步骤 2.6.1 所述，将动物的头部固定在由三个监视器形成的外壳的中心。
- 打开相机并调整右眼周围的四个 LED，以实现均匀的红外照明。
- 在视觉引导下，调整右眼的位置，直到它出现在视频的中心，如步骤 2.6.2 中所述。
- 将右眼的虚拟图像与相机臂的枢轴点对齐，如下所述。
- 手动将相机臂旋转到左端 （-10°）。通过微调2D平移台（图1C，绿色箭头），在垂直于光轴的水平面上手动移动动物的右眼位置，直到X-CR位于图像的水平中心。
- 手动将相机臂旋转到另一端 （+10°）。如果X-CR偏离图像中心，则沿光轴微调右眼移动，直到X-CR到达中心（图1C，蓝色箭头）。
- 重复步骤 3.4.1-3.4.2 几次，直到相机臂左右摆动时 X-CR 停留在中心。如果右眼在一次重复中移动，请重新开始调整过程。
- 将相机臂锁定在中心位置后，测量 Y-CR 和 X-CR 之间的垂直距离。打开 Y-CR LED 并记录其在视频上的位置，然后切换到 X-CR LED 并记录其位置。
注意： Y-CR 和 X-CR 之间的垂直距离将用于在仅打开 X-CR LED 的眼球运动测量期间推导出 Y-CR 的位置。 - 测量瞳孔旋转半径 Rp，如下所述。
- 将相机臂旋转到左端 （-10°） 并记录视频中瞳孔 （Pp1） 和 X-CR （PCR1） 的位置。
- 然后，将相机臂旋转到右端（+10°），并在视频上记录瞳孔（Pp2）和X-CR（PCR2）的位置。多次重复此步骤。
注意：动物的右眼在每次重复期间都需要保持静止，以便电影中的瞳孔运动量准确反映相机臂的摆动程度。 - 根据上面记录的值，用以下公式计算瞳孔旋转半径Rp （图2A）：
注意：物理空间中角膜反射和瞳孔中心之间的距离是根据它们在电影中的距离计算的：
PCR - Pp = 短片中的像素数 x 相机芯片的像素大小 x 放大倍率
- 发展Rp和瞳孔直径之间的关系，如下所述。当瞳孔扩张或收缩时，Rp 发生变化;近似地，其值与瞳孔大小成反比（图2B顶部）。
- 系统地将显示器的亮度从 0 更改为 160 cd/m2 以调节瞳孔大小。
- 对于每个亮度值，重复步骤 3.6 8-10 次并记录瞳孔的直径。
- 根据上面测量的值，将线性回归应用于Rp和瞳孔直径之间的关系，以得出斜率和截距（图2B底部）。
注意：在线性拟合之前，会删除由偶尔眼球运动引起的异常值。对于多个会话的重复测量，只需对一只动物进行一次校准，除非其眼睛在实验过程中变大。
4.记录OKR的眼球运动
- 按照步骤 3.1-3.4 将鼠标固定在装备中。如果在校准完成后立即进行记录，请跳过此步骤。将相机臂锁定在中心位置。
- 如下所述，为暗视 OKR 设置监视器和动物。跳过此步骤以获取明视 OKR。
- 用定制的滤镜覆盖每台显示器的屏幕，该滤镜由五层 1.2 中性密度 （ND） 薄膜制成。确保没有光线从过滤器和显示器之间的缝隙泄漏出来。
- 关闭房间灯。以下步骤是在红外护目镜的帮助下完成的。
- 将一滴毛果芸香碱溶液（2%的生理盐水）涂抹在右眼上，等待15分钟。确保滴剂留在眼睛上并且不会被鼠标擦掉。如果溶液被动物擦掉，则再滴一滴毛果芸香碱溶液。这会将瞳孔缩小到适当的大小，以便在暗视条件下进行眼动追踪。
注意：在暗视条件下，瞳孔显着扩张，使其边缘部分隐藏在眼睑后面。这会影响通过视频眼部摄影估计瞳孔中心的精度。从药理学上讲，右眼的瞳孔缩小会减少其视觉输入，因此视觉刺激会呈现给左眼。 - 用生理盐水冲洗右眼，彻底洗去毛果芸香碱溶液。拉下窗帘以完全密封外壳，从而防止杂散光干扰暗视。
- 在开始OKR测试之前，给动物5分钟以完全适应暗视环境。
- 运行视觉刺激软件和眼动追踪软件。对于明视OKR测量，确保鼓光栅以正弦轨迹水平振荡;对于暗视OKR测量，确保鼓光栅从左到右以恒定速度漂移，这是相对于左眼的颞鼻方向。
注意：当右眼的瞳孔而不是左眼的瞳孔在暗视条件下被毛果芸香碱缩小时，振荡鼓刺激引起的OKR是高度不对称的。因此，对于暗视 OKR 测量，左眼受到刺激，同时监测右眼的运动。 - 眼动追踪软件自动测量每帧的瞳孔大小、CR位置和瞳孔位置，并根据以下公式计算眼睛位置的角度（图2C）：
其中，P CR 是CR 位置，P p 是瞳孔位置，Rp 是瞳孔旋转半径。角膜反射和物理空间中瞳孔中心之间的距离是根据它们在电影中的距离计算的：
PCR - Pp = 短片中的像素数 x 相机芯片的像素大小 x 放大倍率
根据步骤3.7.3中的线性回归模型推导出相应瞳孔大小的Rp（图2B底部）。
5. 使用眼动分析软件分析OKR的眼球运动
- 使用中值滤波器（滤波器窗口 = 0.05 s）处理眼图迹线以消除高频噪声（图 3A 中间）。
- 如下所述去除扫视或眼球震颤。
- 通过计算眼球运动的一阶导数来估计眼速（图3A底部）。通过应用50°/ s的速度阈值来识别扫视或眼球震颤（图3A底部）。
- 通过基于线性回归从扫视或眼球震颤之前的节段推断这些快速眼球运动期间的眼睛位置来替换扫视或眼球震颤（图3B）。
- 如果鼓光栅振荡，则通过快速傅里叶变换（Goertzel算法）计算OKR眼球运动的幅度（图3C），或者如果鼓光栅在一个方向上以恒定速度移动，则计算视觉刺激期间眼球运动的平均速度（图3B底部）。
注：由傅里叶变换得出的振荡眼球运动的振幅类似于从具有正弦函数拟合的眼睛轨迹得出的振幅（图3D）。 - 计算 OKR 增益。对于振荡鼓运动，OKR增益定义为眼球运动的振幅与鼓运动振幅的比值（图3C右）。对于单向滚筒运动，OKR增益定义为眼速度与滚筒光栅速度之比（图3B底部）。
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Representative Results
通过上面详述的过程，我们评估了 OKR 对几个视觉特征的依赖性。此处显示的示例迹线是使用补充编码文件 1 中提供的分析代码得出的，示例迹线原始文件可在补充编码文件 2 中找到。当滚筒光栅以正弦轨迹（0.4 Hz）漂移时，动物的眼睛以类似的振荡方式自动跟随光栅的运动（图3B上图），这是OKR行为的特征2,5,8。通过快速傅里叶变换推导了水平轴上OKR眼球运动的幅度（图3C&D），并将OKR增益计算为眼球运动幅度与光栅运动幅度之比（图3C）。OKR增益随空间频率、振荡频率和光栅运动方向的变化而变化（图4A）。首先，OKR行为的空间频率调谐曲线呈倒V形，并在0.16 cpd的中间空间频率处达到峰值（图4A左）。其次，振荡频率调谐曲线随着鼓光栅振荡频率的增加而单调下降（图4A中），表明OKR行为在响应低速视觉运动时效果最好4。当呈现不同空间频率的光栅时，振荡频率调谐曲线的幅度和形状都不同17.第三，水平OKR也可能由光栅向不同方向移动引起（图4A右）。颞鼻运动（0°）引发了最强的水平OKR行为。当光栅以偏离颞鼻方向（向上和向下）的30°或60°斜角移动时，OKR增益下降到~80%，或最大值的~30%，当光栅垂直向上或向下移动（90°和270°）时，水平OKR消失。此外，调谐曲线的形状受亮度水平的影响。例如，动物在明视条件下对 0.16 和 0.32 cpd 的空间频率做出良好的 OKR 行为，但在暗视条件下，空间频率调谐曲线向左移动（图 4B）。为了分析调谐曲线的形状，我们用适当的数学函数拟合它们。例如，高斯函数用于估计空间频率调谐的峰值和带宽（图4C）。通过这种分析，我们发现与明视条件相比，暗视条件下的调谐曲线在首选空间频率下具有较低的值。上面详述的过程也可用于量化 OKR 行为的可塑性。连续 OKR 刺激 45 分钟后，OKR 行为的幅度显着增强（图 4D），与之前的报告一致。这些结果证明了该协议在检查动眼神经行为和理解这些行为所涉及的大脑回路中的潜力中的应用。
图 1：OKR 钻机的设置 。 （A） 顶杆的尺寸。（B） 后视图（左）和顶视图（中）的虚拟鼓系统。三台显示器彼此正交安装。鼠标的头部放置在方形外壳的中心并朝前。视觉刺激的周期（条纹之间的空间）根据动物眼睛的方位角而变化，以确保光栅在眼睛上的投影具有恒定的空间频率。换言之，光栅的空间频率在整个视野中被认为是恒定的，就好像光栅沿着虚拟鼓的表面漂移一样（右）。（C） 红外视频眼球的设置。左：OKR录制时摄像机固定在中心的位置。蓝色箭头：沿光轴。绿色箭头：垂直于光轴。右图：眼部校准期间相机的旋转。（D） 固定在相机上的 X-CR 和 Y-CR LED 的位置。（E） 左眼和右眼（左）的水平，以及分别通过旋转水平杆或头板适配器（红色箭头）水平（右）对齐。（F） OKR站照片。请注意，OKR 钻机放置在带有黑色窗帘的定制外壳内。缩写：IR = 红外线;CR = 角膜反射。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：视频眼部摄影中眼睛位置的校准和测量 。 （A） 校准示意图。通过将相机旋转到最左侧位置（-10°，左面板）和最右侧位置（10°，右面板）来估计瞳孔旋转半径 （Rp）。红点表示当相机放置在最左侧和最右侧位置时角膜反射 X-CR 的位置。蓝点表示瞳孔的中心。绿色条表示在相机视频中观看的角膜反射和瞳孔中心之间的距离（PCR - PP）。（B）Rp 对瞳孔大小的依赖性。上图：瞳孔小或大的眼球示意图。下图：Rp 与示例小鼠瞳孔直径之间的关系。通过改变鼠标的亮度（10-0 cd/m2 范围内的 160 个值）来改变瞳孔大小。黑点：用于线性拟合的数据。蓝点：从线性拟合中排除的异常值。红色曲线：线性回归中的最佳拟合线。请注意，Rp 与瞳孔直径成反比。（C） 当眼睛移动到视轴的右侧或左侧时，计算眼睛位置的角度。红点、蓝点和绿条的含义与 A 中的含义相同。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：OKR 增益的计算。 （A） 上图：OKR 刺激期间拍摄的鼻（N;左）和颞（T;右）眼位置的快照。红色椭圆：适合瞳孔轮廓。红十字：瞳孔中心。白色箭头：参考 LED 的角膜反射。中间：使用（黑色）或不使用（红色）中值滤波器（滤波器窗口 = 0.05 s）以消除高频噪声的眼球运动轨迹。下图：通过计算眼球运动的一阶导数来估计眼速。（B） 去除扫视/眼球震颤（黑色）后 OKR 缓慢眼球运动的轨迹，速度阈值为 50 °/s。上图：振幅为5°，振荡频率为0.4 Hz的振荡鼓运动。 下图：单向（颞鼻）鼓运动，恒定速度为6.25°/s。 （C）左图：B顶部眼球轨迹的周期平均值。右图：通过快速傅里叶变换对眼或鼓光栅运动的频率分析。应该注意的是，鼓光栅以 0.4 Hz 振荡，因此眼和鼓光栅运动的幅度在 0.4 Hz 处达到峰值（星标）。OKR增益是0.4 Hz时眼光和鼓光栅运动幅度的比值。 （D）顶部：B顶部具有正弦函数的眼睛轨迹曲线拟合。下图：通过快速傅里叶变换方法得出的眼球运动幅度与正弦曲线拟合得出的关系。黄点：顶部的示例。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：OKR 行为的视觉特征选择性和可塑性。 （A）明视条件下OKR增益的视觉特征选择性。左图：一只动物的空间频率调谐曲线（振荡频率：0.4 Hz;轨迹：水平振荡;平均亮度：40 cd/m2;n = 15）。中间：一只动物的振荡频率调谐曲线（空间频率：0.08或0.16 cpd;轨迹：水平振荡;平均亮度：40 cd/m2;n = 15）。右图：一只动物的方向调谐曲线（空间频率：0.16 cpd;时间频率：1 Hz;平均亮度：45 cd/m2;n = 24）。红色箭头和条形表示颞鼻方向。对于空间和时间/振荡频率调谐，三个监视器上的垂直鼓光栅以恒定速度或振荡方式水平移动。对于方向调谐，仅在右侧显示器上显示的光栅以恒定速度沿 12 个方向之一移动。厚度：平均值的标准误差 （SEM）。（B）暗视或明视条件下一只动物OKR增益的空间频率调谐曲线。照片：振荡运动;振荡频率：0.2 Hz;平均亮度：40 cd/m2;n = 15。暗视：匀速直线运动;时间频率：0.25 Hz;平均亮度：8 x 10-5 cd/m2;n = 16。暗视条件是通过用五层 Lee 滤波器 （299 1.2 ND） 覆盖显示器来实现的。厚度：SEM。 （C）明视和暗视条件下OKR增益空间频率调谐的高斯拟合。照片：振荡运动;振荡频率：0.2 Hz;平均亮度：40 cd/m2;n = 15。暗视：匀速直线运动;时间频率：0.25 Hz;平均亮度：8 x 10-5 cd/m2;n = 16。（D） 连续 45 分钟的 OKR 刺激诱导一只小鼠的 OKR 增强。空间频率：0.1 cpd;振荡频率：0.4 Hz;平均亮度：35 cd/m2;n = 40。顶部：OKR 增强前后的周期平均 OKR 轨迹。厚度： SEM. 请点击这里查看此图的较大版本.
补充编码文件 1：用于生成示例跟踪的分析代码。请点击这里下载此文件。
补充编码文件2：使用软件生成的示例迹线。请点击这里下载此文件。
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Discussion
此处介绍的 OKR 行为测定方法具有几个优点。首先，计算机生成的视觉刺激解决了物理鼓的内在问题。针对物理鼓不支持空间频率、方向或对比度调谐的系统检查8的问题，虚拟鼓允许在逐个试验的基础上改变这些视觉参数，从而有助于对OKR行为的特征选择性进行系统和定量分析（图4A）;当物理鼓受到外部光源23的不均匀照明时，虚拟鼓可以很容易地在其表面上提供均匀的亮度;在ND滤镜和亮度计的帮助下，计算机生成的视觉刺激允许在从暗视到明视的各种良好控制的亮度水平下进行OKR测量（图4B），这是物理鼓难以做到的。由于惯性质量，物理鼓的加速度不受限制，虚拟视觉刺激可以实现理想的精确轨迹，尤其是在高加速度和高速度下。此外，计算机生成的视觉刺激允许创造性地设计其他类型的视觉刺激，例如连贯移动的点，这有助于研究各种动眼神经行为的机制。其次，我们的程序是标准化的，因此需要最少的努力来监测行为记录的进展，这提供了一个同时检查多只小鼠的机会。因此，它适用于涉及大量动物（数十至数百只动物）的研究。第三，高精度和定量能力使得在纵向研究24、不同药物治疗10 或神经回路扰动5 下比较相同小鼠的重复 OKR 测量成为可能。最后，基于傅里叶变换的频域分析5,7,9给出了与时间域12,25,26中基于拟合的分析相同的振荡眼球运动幅度结果（图3D底部），表明这里介绍的分析方法既准确又精确。
我们的方法还为研究OKR可塑性提供了机会，OKR可塑性是一种广泛使用的范式，用于研究动眼神经学习的机制。当对小鼠进行连续的OKR刺激或对其前庭器官进行手术损伤时，OKR的幅度可以增强8,9。这里介绍的OKR测定足够灵敏，可以捕获OKR增强中发生的眼球运动的微小变化（图4D）。这种方法的定量能力使得将行为变化与神经回路动力学相关联成为可能，这对于揭示动眼神经学习的潜在机制至关重要5,8,9,13。
为了保证OKR测量的准确性，有几个关键步骤。首先，在手术过程中，需要格外小心，避免强力胶和牙科丙烯酸接触眼睑，这可能会损坏角膜或部分遮挡眼口。其次，OKR的强度受小鼠27,28的行为状态影响。因此，建议进行几轮调整，以尽量减少压力对OKR测量的影响;此外，在录制过程中应防止由气味、噪音或光线引起的干扰。最后，小鼠的头部应正确定向，使连接两个眼角的线平行于水平轴。这保证了视觉运动的方向与内收和外展眼球运动的轴线对齐。第三，眼睛的均匀照明是生成清晰的瞳孔图像的关键，进而确保高质量的眼动追踪。
值得注意的是，这里介绍的方法存在一些局限性。首先，当动物的眼睛眨眼或不透明的眼分泌物阻挡瞳孔时，视频眼球会暂时或永久地失去对眼睛的跟踪。同样，当眼睑缝合时，它不能用于监测眼球运动。其次，视频眼部成像的时间分辨率受相机帧速率限制在4-20毫秒的范围内。最后，头部固定制剂不允许监测自由移动动物的眼部行为。
这里介绍的视频眼部造影和虚拟鼓已经成功地应用于表征视觉特征选择性和OKR行为的可塑性，并了解参与介导和适应性调节这种行为的视网膜和中枢回路。此外，它们还可以使其他眼部行为成为神经现象的主题甚至混杂因素的研究受益。例如，视频眼球造影可用于监测瞳孔散大29和扫视样眼球运动30,31，它们指示警觉性和大脑状态32,33,34,35。此外，这里概述的校准和测量程序普遍适用于使用头戴式摄像头监测自由移动小鼠的眼球运动。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢何颖天分享方向调整数据。这项工作得到了加拿大创新基金会和安大略省研究基金（CFI/ORF 项目编号 37597）、NSERC （RGPIN-2019-06479）、CIHR（项目资助 437007）和康诺特新研究员奖的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
References
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