Summary
このプロトコルでは、画像解析、一過性の過剰発現に関する考察、ウェスタンブロットを用いたATG9Aのグリコシル化状態の調査など、免疫蛍光法の検討など、ATG9A生物学の研究に役立つさまざまな方法について説明します。
Abstract
オートファジーは、細胞が恒常性の維持、損傷した細胞小器官の分解、侵入する病原体との戦い、病理学的状態を生き延びるために使用する高度に保存された経路です。ATGタンパク質と呼ばれる一連のタンパク質は、オートファジーの中核機構を構成し、定義された階層で連携して働きます。近年の研究により、オートファジー経路に関する知識が向上しています。最近では、ATG9A小胞がオートファジーの心臓部であり、ファゴフォアと呼ばれるオルガネラの迅速な de novo 合成を制御していることが提唱されています。ATG9Aは膜貫通型タンパク質であり、異なる膜コンパートメントに存在するため、ATG9Aの研究は困難であることが証明されています。そのため、オートファジーの輸送を理解することは、オートファジーを理解する上で重要な要素です。ここでは、ATG9A、特に免疫蛍光法を用いたその局在を研究し、評価および定量化することができる詳細な方法を紹介します。一過性の過剰発現の落とし穴にも対処します。ATG9Aの機能の正しい特徴付けと、その輸送を解析する技術の標準化は、オートファジーの開始を支配するイベントをさらに特徴付けるために重要です。
Introduction
ATG9Aは、中核的なオートファジー機構の唯一の膜貫通タンパク質であり、ゴルジ体と細胞質ATG9A小胞区画の間を輸送され、エンドソーム区画1を通過します。長い間謎に包まれていたATG9Aは、膜二重層にわたって脂質を平衡化するため、脂質スクランブラーゼとして機能することが最近報告されています2,3。ATG9Aがオートファゴソーム形成のヒエラルキーの最上位に位置することが明らかになっており、オートファジーの理解にはATG9Aの研究が不可欠である4,5。そのため、ATG9A小胞はオートファゴソーム6,7の「シード」として最近提案されています。しかし、これまでの研究で、ATG9Aは成熟のさまざまな段階で形成中のオートファゴソームと一過性に相互作用するだけで、オートファジー膜には組み込まれないことが実証されています6,8,9,10,11。したがって、オートファゴソーム形成におけるATG9Aの役割と潜在的な複数の機能を完全に解明するには、さらなる研究が必要です。しかし、現在のモデルと以前のデータとの不一致は、検証済みの定量的アプローチと細胞内マーカーを使用してATG9Aの輸送に対処する標的実験によってのみ解決できます。
ATG9Aの研究には様々なツールが使われており、それぞれに長所と短所があり、これらのツールの使用は、ATG9Aの構造、その分子機能、および細胞輸送によって複雑になります2,8,12。ATG9Aはホモ三量体を形成し、グリコシル化され、細胞内をゴルジ体、エンドソーム、原形質膜などの区画に輸送される13,14。その複雑な旅程を考えると、特定の治療や刺激(栄養や血清の飢餓など)によるゴルジ体からのATG9Aの拡散など、読み出しの解釈にはいくつかの課題があります。ATG9Aは、小胞輸送に関して非常にダイナミックです。実際、ATG9Aを含む小胞は、飢餓誘発オートファジーの文脈でATG9Aコンパートメントとして定義されています。これらの動的小胞によって形成されるATG9Aコンパートメントは、いくつかの細胞内小器官と一過性に相互作用します8,15,16,17。ここで説明する手法は、免疫蛍光法、ライブイメージング法、糖鎖修飾アッセイなど、ATG9A生物学の検出と理解に役立つはずです。特に、本稿で説明するアプローチは、特定の細胞コンパートメントへの局在、および特定のタンパク質パートナーおよび/または膜コンパートメントとの相互作用に関する疑問に対処するのに役立ちます。ATG9A疎水性保存コアドメイン(PFAMドメインPF04109)は、独自のトポロジーを持ち、ATG9Aは複数の膜コンパートメント間を循環するため、研究者は、ATG9Aを一過性に過剰発現させる際に、小胞体(ER)の保持など、特定の落とし穴やアーチファクトに注意する必要があります。その他の考えられる問題は、タンパク質のミスフォールディング、通常の生育条件での人工的な凝集、または免疫蛍光の透過処理プロトコルが最適でないことによる小胞コンパートメントの不十分な検出によって発生する可能性があります。
内因性ATG9Aをイメージングする場合、その後の定量分析の品質とデータの正しい解釈を確保するために、サンプル調製と画像取得に注意を払う必要があります。本稿で紹介する手法を標準的な生化学的アプローチ(免疫沈降やプルダウン実験など)と組み合わせることで、ATG9Aの機能についての理解が深まるはずです。この実験ツールキットは、新しい研究者が生物学的システムにおけるATG9Aの機能を決定するために必要なアッセイのいくつかをナビゲートするのを支援することを目的としています。
Protocol
この研究で使用した試薬はすべて市販されていますが、ATG9A DNAコンストラクトと自家製STO-215抗体( 材料表を参照)はご要望に応じて入手可能です。ここで説明する分析ツールは、オープンソースソフトウェア(FIJI/ImageJ)18に基づいています。
1. 細胞培養
- T150組織培養処理フラスコ内のHEK293A細胞を、10%FBS(ウシ胎児血清)および4 mM L-グルタミンを添加した高グルコースDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)中で80%〜90%のコンフルエントに維持します( 材料表を参照)。加湿した組織培養インキュベーター内で37°C、10%CO2で細胞をインキュベートします。
注:本研究で使用されたHEK293A細胞は、アミノ酸飢餓時に強力な標準オートファジー応答を示し、特に脂質化した膜関連LC3 1,9,19の増加によって検出され、イメージングに適しているためです。 - 血清ピペットを使用してフラスコから培地を吸引することにより、細胞を継代します。15 mLの1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)または同様の溶液で細胞を一度洗浄してから、2 mLのトリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液を加えて細胞を剥離します。分離した細胞を8 mLのDMEMで回収し、ここで説明する実験のために2日後に80%〜90%のコンフルエントに達するように、いくつかの細胞を播種します。
2. ATG9Aの内在性染色
- HEK293A細胞(または選択した細胞)を滅菌No.1.5ガラスカバーガラスに播種し、24ウェルプレートに入れ、翌日~80%のコンフルエントになるようにします。これにより、通常、500 μL の DMEM 中に 7 x 104 細胞/ウェルが得られます。
注:HEK293A細胞またはその他の緩く接着した細胞株の場合、カバーガラスは脱イオン水で0.1 mg/mLのポリ-D-リジンでコーティングする必要があります。ウェルに入れたカバーガラスの上部にポリ-D-リジン( 材料表を参照)500 μLを室温(室温)で10分間添加し、その後、脱イオン水で3回洗浄し、最後にDMEMで洗浄します。コーティング後に細胞の播種に進み、培養皿に均等に広がるように注意してください。 - 特定の実験条件(すなわち、EBSS[Earle's Balanced Salt Solution]中での2時間の飢餓)に従って細胞を処理します。
注:EBSS 組成は、蒸留水に溶解した 1 g/L D-グルコース、6.8 g/L NaCl、0.4 g/L KCl、0.151 g/L CaCl 2.2H 2 O、0.2 g/L mM MgSO 4.7H 2 O、0.124 g/L NaH 2 HPO4.2H 2 O、および 2.2 g/LNaHCO 3(材料表を参照)です。 - 培地を吸引し、0.1 mM CaCl 2 および 0.1 mM MgCl2 を添加した PBS 溶液 500 μL の 4% ホルムアルデヒド溶液と室温で 20 分間慎重に交換して細胞を固定します。
- 各ウェルから4%ホルムアルデヒド溶液を吸引し、500μLのPBSと交換します。この洗浄手順を3回繰り返します。カバーガラスを乾かしたり、液体なしで放置したりしないでください。
- 500 μL の 50 mM NH4Cl 溶液を PBS 溶液中で 10 分間室温で使用し、遊離アルデヒド基をクエンチします。
- PBSを吸引し、50 μLの50 μg/mLのPBS溶液(原液1 mg/mLの脱イオン水溶液、 材料表参照)と交換し、室温で5分間細胞を透過処理します。
- 各ウェルからジギトニン溶液を吸引し、500 μLのPBSと交換します。この洗浄手順を3回繰り返します。
- 各ウェルからPBSを吸引し、500 μLのブロッキング溶液(PBSで希釈した5% BSA[ウシ血清アルブミン])と室温で30分間交換します。
- ブロッキング溶液を吸引し、500 μLのPBSと交換します。
- ピンセットを使用してウェルからカバーガラスを回収し、薄い組織ワイプまたはセルロース濾紙を使用して余分なPBS溶液を慎重に除去し、各カバーガラスを細胞側を下にして、50 μL滴の一次抗体溶液(例:1% BSA/PBS溶液で0.9 μg/mLに希釈したアルメニアンハムスター14F2、 材料表を参照)に静かに置きます。室温で加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。
注:取り扱いを容易にするために、抗体溶液の滴は、固体表面に直接置くのではなく、別の容器内のセルフシール熱可塑性フィルムのシート( 材料表を参照)に置くことができます。 - ピンセットを使用してカバーガラスを回収し、薄い組織ワイプを使用して余分な一次抗体溶液を静かに排出した後、カバーガラス(細胞側を上にして)を24ウェルプレートに交換し、PBSで3回洗浄します。
- 手順 2.10 を繰り返します。ピンセットを使用して、薄い組織ワイプを使用して余分なPBSを慎重に排出し、各ウェルからカバーガラスを(細胞側を下にして)1%BSA/PBS溶液で1:1,000に希釈した50μLの二次抗体溶液に静かに置きます(例:Cy3ヤギ抗アルメニアハムスターIgG、ウシ、ヒト、 マウス、ウサギ、ラットの血清タンパク質、 材料表を参照)。室温で加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。
注:オプション:二次抗体に加えて、細胞骨格マーカーをその後の画像解析に使用できます(例:Alexa Fluor 647 Phalloidin 1:1,000希釈、 材料表を参照)。取り扱いを容易にするために、抗体溶液の滴は、固体表面に直接置くのではなく、別の容器内のシーリングフィルムのシート上に置くことができます。 - ピンセットを使用してカバーガラスを回収し、余分な二次抗体溶液を排出した後、カバーガラスを24ウェルプレート(細胞側を上にして)に入れ、500 μLのPBSで3回洗浄します。
- ピンセットを使用してカバーガラスを回収し、薄い組織ワイプを使用して余分なPBSを慎重に排出し、各カバーガラス(細胞側を下にして)PBS中の1:4,000ヘキスト溶液(ヘキスト33342)の50 μL滴に静かに置きます。室温の湿度チャンバーで5分間インキュベートします。
注:取り扱いを容易にするために、抗体溶液の滴は、固体表面に直接置くのではなく、別の容器内のシーリングフィルムのシート上に置くことができます。 - ピンセットを使用してカバーガラスを回収し、薄い組織ワイプを使用して余分なヘキスト溶液を静かに排出した後、カバーガラスを24ウェルプレートに交換し、PBSで3回洗浄し、脱イオン水で1回洗浄します(洗浄あたり500μL)。
- 薄いティッシュワイプを使用して余分な脱イオン水を慎重に排出し、各カバーガラス(細胞側を下にして)を10〜20μLの封入液( 材料表を参照)に静かに置き、免疫蛍光用の顕微鏡スライドにスポットし、気泡の形成を防ぎます。
注:ここで使用する封入剤は、浸漬油と同じ屈折率を持ち、室温で数時間または4°Cで一晩後に硬化します。 非硬化性の取り付けソリューションを使用できますが、カバーガラスをマニキュアで密封するように注意する必要があります。 - 余分な封入液を吸引して除去し、スライドホルダーまたはアルミホイルで覆った状態で、暗所で一晩室温で平らに寝かせてサンプルを乾燥させます。
3. 画像取得
- 共焦点顕微鏡の電源を入れます。イメージングソフトウェア( 材料表を参照)を開き、画像取得のセットアップを開始します。
- [機能]タブで、Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27対物レンズを選択して、分析用の画像を撮影します。
- Acquisition Functionタブで、コントロールパネルのLaserゾーン(Argon、Diode-405-30、DPSS 561-10、およびHeNe633)で適切なレーザーをオンにします。
- コントロールパネルのImaging Setupゾーンで、4つのトラックを作成し、各トラックを1つのチャンネルに対応させて、シーケンシャルアクイジションを実行します。
- [ Acquisition Mode ] ウィンドウで画像の適切な解像度を設定します。解像度を 1,024 x 1,024 (フレーム サイズ) に設定し、[ビット 深度 ] で 16 ビットを選択します。
- 各チャンネルについて、レーザー出力とゲインを調整して、画像強度解析の妨げとなる飽和ピクセルのない良好な信号を取得します。 [Live ]ボタンを使用して、 レーザー出力レベル と ゲイン(マスター)を設定します。
注意: 範囲インジケーターオプションの使用は、飽和ピクセル検出に推奨されます。バックグラウンドノイズを避けるために、レーザー出力を1%から10%に保ち、ゲイン(マスター)を850未満に保ちます。 - コントロールパネルのチャンネルゾーンで、波長が最も高いチャンネルに1エアリーユニット(AU)を考慮して、各チャンネルに同じピンホールアパーチャを設定します。
- 同量のセルを含む10個のランダムフィールド(フィールドあたり20〜30個のセル)を取得します。条件ごとに100〜200個の細胞を取得すると、後の画像解析に十分な検出力が得られます。
4. ATG9A分散体の画像解析
- インターネットからFIJIソフトウェアをダウンロードします(材料表を参照)。[Plugins > Bio-Formats] > BioFormats Importer をクリックして、FIJI で画像を開きます。
- [ 分析]>[測定値の設定]をクリックし、強度分析の測定ウィンドウで 平均グレー値 を選択します。
- [Image > Color] > [Split Channels] をクリックし、チャンネルを 3 つの画像 (ゴルジマーカー、細胞骨格、ATG9A シグナル) に分離します。
- 「画像」>「>しきい値を調整」に移動し、ゴルジマーカーに対応するチャンネルのしきい値を定義します。
- [Edit > Selection] > [Create Selection] をクリックし、バイナリ画像から選択範囲を作成します。
- [Edit > Selection > Add to Manager > Rename (Golgi)] に移動し、ROI マネージャーで選択を保存し、名前を Golgi に変更します。
- Image > Adjust > Thresholdをクリックし、細胞骨格マーカーに対応するチャンネルに閾値を定義して、細胞の輪郭を定義します。
- [ Edit > Selection > Create Selection (選択範囲の編集)] に移動し、バイナリ イメージから選択範囲を作成します。
- [Edit > Selection] > [ Add to Manager] > [Rename (Total)] をクリックし、ROI マネージャーに選択内容を保存し、名前を Total に変更します。
- ATG9A染色に対応する画像を選択します。
- [ 測定>分析] で、ROI ゴルジ 体位 をクリックして適用し、ゴルジ体の強度を測定します。
- [ Analyse > Measure] をクリックし、それをクリックして ROI Total を適用し、[Total] 領域の強度を測定します。
- すべての画像でこの手順を繰り返し、結果を .csv ファイルとして保存し、次の式を使用してデータを処理します。
ATG9A分散率=ゴルジ体強度/総強度
5. ATG9Aコンストラクトのライブセルイメージング
- HEK293A細胞(または選択した細胞)を2 mLの培地に60 mmの組織培養皿に播種し、翌日に65%~70%のコンフルエントに達するようにします。これにより、通常、1 x 10 6-2 x 106 セルが得られます。
- 翌日、Lipofectamine:DNA mixes(または適切な代替DNAトランスフェクション試薬、 材料表を参照)を以下のように調製します。
- コンストラクトの発現効率に応じて、0.5〜2 μgのプラスミドDNAを適切な無血清培地100 μLに希釈し、ピペッティングで上下させて溶液を穏やかに混合します。混合物を室温で5分間インキュベートします。
注:プラスミドDNAコンストラクトは実験特異的です。研究者は、自分でクローニングすることも、要求に応じて著者から入手することもできます。 - Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬をLipofectamine:DNAの3:1の比率で適切な無血清培地100 μLに希釈し、ピペッティングで上下させて溶液を穏やかに混合します。この混合物を室温で5分間インキュベートします。
- ピペッティングを静かに上下させ、室温で20分間インキュベートして、両方の溶液を混合します。
- コンストラクトの発現効率に応じて、0.5〜2 μgのプラスミドDNAを適切な無血清培地100 μLに希釈し、ピペッティングで上下させて溶液を穏やかに混合します。混合物を室温で5分間インキュベートします。
- 4 mLの増殖培地を含む各細胞培養プレートにLipofectamine:DNAミックスを添加し、プレートを前後に静かに揺らしてミックスを均等に分散させます。加湿した細胞培養インキュベーターで37°C、10%CO2で細胞をインキュベートします。
- トランスフェクションの4時間後に培地を新鮮な増殖培地と交換し、加湿した細胞培養インキュベーターで37°C、10%CO2 で一晩細胞をインキュベートします。
- 翌日、生細胞顕微鏡に適した培養皿(No.1.5ガラスカバーガラス付き培養皿、材料表参照)で細胞をトリプシン処理し、カウントし、再播種します。0.4 x 10 6-0.7 x 106個の細胞を皿に播種し、イメージング時にカバーガラスのコンフルエント度が~60%-75%に達するようにします。
注:ステップ2.1で説明したように、ポリ-D-リジンによるコーティングは、HEK293A細胞に推奨されます。 - 翌日(トランスフェクションの48時間後)に、細胞を画像化します。
6. ATG9Aの糖鎖化状態を調べる
- 通常、10 mLで1.5 x 10 6-2.5 x 106細胞を与える内因性ATG9Aを調査する場合は、10 cmの組織培養皿にHEK293A細胞(または選択した細胞)を播種し、翌日に~80%のコンフルエント度に達するようにします。あるいは、ATG9Aコンストラクトをトランスフェクションする場合、細胞が~65%-70%のコンフルエントに達するように播種すると、通常、10 mLで1 x 10 6-1.5 x 106細胞が得られます。
- 翌日、細胞を100 μg/mLのシクロヘキサミド(CHX、 材料表を参照)またはビヒクルで処理します。24時間(または希望の時点まで)インキュベートします。
- 細胞をインキュベーターから取り出し、培地を吸引し、氷上に置く。5 mLの氷冷1x PBSと交換します。細胞スクレーパーを使用して細胞を皿から物理的に剥離し、PBS細胞溶液を15 mLのコニカルボトムチューブにピペットで移します。800 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
- 上清を吸引し、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤( 材料表を参照)を添加した氷冷TNTE溶解バッファー(1%トリトン、150 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、pH 7.4、0.5 mM EDTA)に細胞を~100 μL(細胞ペレットのサイズに応じて)に再懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
- ライセートを氷上で15分間インキュベートします。この後、ライセートを20,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、核と不溶性デブリスを沈殿させ、上清を新しい微量遠心チューブに移します。
- ブラッドフォード法20 と波長595nmで測定できる分光光度計を使用して、ライセートのタンパク質濃度を定量します。
- タンパク質量を正規化し、1 μLのPNGase F酵素を添加する前に、メーカーの指示に従って16 μLのライセート(合計100 μg以下のタンパク質を含む)を5x PNGase F(ペプチド:N-グリコシダーゼF)バッファーと組み合わせます( 材料表を参照)。PNGase Fメーカーの指示に従ってインキュベートします。
- 3倍のLaemmliサンプルバッファーを添加して1倍の濃度にし、65°Cで5分間インキュベートしてから、トリスアセテートゲルを使用して電気泳動にロードし、タンパク質の分離を最大化します。タンパク質をゲルから適切なメンブレン(すなわち、PVDF[ポリフッ化ビニリデン])に標準的なウェスタンブロットプロトコル21 を用いて転写します( 材料表を参照)。
注:サンプルを95°Cで沸騰させると、ATG9Aが凝集するため、ATG9Aの検出が減少します。 - ATG9A特異的抗体(STO-215抗体、自社製1)を用いてウェスタンブロットを実施します( 材料表参照)。メンブレンの高分子量切片をカットせずに、高分子量ATG9A分子種を可視化します。
Representative Results
ATG9Aは、いくつかの細胞内膜コンパートメント8,17,22,23,24に関連する膜貫通タンパク質である。基礎疾患では、ATG9Aは、内因性タンパク質の免疫蛍光およびシス-ゴルジマーカーであるGM130との重複(図1A)によって示されるように、主にトランスゴルジネットワーク(TGN)に局在し、エンドサイトーシスリサイクルコンパートメント(ERC)と部分的に重複する小胞にも局在する23。ゴルジ体におけるATG9Aの局在は、異なる免疫蛍光プロトコールを用いて検出することができる。しかし、ATG9Aの小胞画分、およびその局在の変化、特に栄養および血清飢餓などの特定の刺激に応答する小胞プールの増加は、強度がかなり変動し、従来のイメージングアプローチでは視覚化が困難である可能性があります。ゴルジ体に局在するATG9Aと小胞画分に局在するATG9Aの比をATG9A分散率と呼ぶ。例えば、血清とアミノ酸の両方を枯渇させるために使用されるEBSS処理時のATG9A分散速度の変化を検出するには、GM130やTGN46などのゴルジマーカーや、細胞輪郭を染色するファロイジンなどの細胞骨格マーカー25が、ATG9A分散を容易に定量するのに有用です(図1B)。重要なことは、平均蛍光比分析は、一定の分散率としてではなく、条件間の比較尺度としてのみ解釈できることです。コンパートメント間の比率は、使用する細胞株、染色品質、適用する閾値法などの生物学的要因と非生物学的要因に大きく依存します(図1B)。このため、研究者は、特定の実験条件でATG9Aゴルジ体濃縮を検出できるパイプラインを設定し、同じパラメータで分析するセット内のすべての画像に分析を拡張する必要があります。ATG9A 平均蛍光の分析用に選択した代表的なバイナリー画像と領域をガイドとして図 1B に示します。
ATG9Aは、2つの比較的柔軟で非構造化されたN末端およびC末端ドメインに挟まれたいくつかの膜貫通ドメインを有しており、そのうちのC末端配列はタンパク質のほぼ半分を包含している12。重要なことは、過剰発現したATG9Aの局在パターンは、どのタンパク質末端がタグ付けされているかによって影響を受ける可能性があることです(図2A)。特に、一過性発現系を使用し、ATG9AのN末端に直接蛍光タグ(eGFP、mRFP、誘導体など)をタグ付けすると、ATG9A小胞が容易に見える一方で、ゴルジ体局在が部分的に損なわれ、基礎(摂食)条件で見られる濃縮度が低下する可能性があります(図2A)。ATG9AをC末端にタグ付けすると、凝集できるより大きなGFP陽性クラスターがわずかに誘発されるようです。最後に、mRFP-ATG9Aの単量体バージョンでも、小胞の同様の蛍光クラスターと、過剰発現細胞におけるゴルジ体染色がほとんど見られません(図2A)。
ATG9Aは、ゴルジ体およびATG9A小胞に輸送される前に小胞体膜で折り畳まれます。小胞体に常駐している間、ATG9Aはアスパラギン99のN-結合型糖鎖によって修飾され、ゴルジ体に到達すると、複雑で成熟したN-結合型糖鎖を獲得する1,14。グリコシル化によるこの修飾は、ダブルバンド14の出現によりウェスタンブロットで検出することができる。細胞内局在と一致して、ほとんどの内因性ATG9Aは複雑なN結合型糖鎖を保有しているため、高分子量バンドが優勢であり、かすかな低分子量バンドも見えます(図2B)。ダブルバンドの存在は、高分子量タンパク質の分離能を向上させるためにトリスアセテートゲルを使用する場合に最も容易に見られます(図2B、コントロール、t = 0)。内因性タンパク質をPNGase F(ペプチド:N-グリコシダーゼF)処理すると、複雑なN結合型糖鎖のほとんどが除去され、タンパク質はシングルバンドとして発現します(図2B、PNGase F、t = 0)。したがって、ATG9AのN-結合型グリコシル化状態は、小胞体からゴルジ体へのATG9Aの出口をモニターするためのプロキシとして使用でき、これは2つのバンド間の相対比によって反映されます。
mRFP-ATG9Aコンストラクトを一過性にトランスフェクションすると、過剰発現したタンパク質が最初に小胞体に蓄積しますが、これはおそらく、輸送機構がすべてのATG9Aを折りたたんで輸送することができず、低分子量バンドが優勢であるためです(図2C、コントロールt = 0)。特に、mRFP-ATG9Aの発現から24時間後、上部バンドと下部バンドの間にほぼ均等な分布があり、mRFP-ATG9Aプールがゴルジ体に移動していることを示唆しています(図2C、コントロール、t = 24)。細胞をシクロヘキシミド(CHX)で処理すると、de novo タンパク質合成を阻害する26、ERからのATG9Aのフォールディングと出口を明らかにすることができます。内因性タンパク質が折りたたまれ、グリコシル化され、ゴルジ体に常駐しているため、CHXで処理しても低分子量バンドと高分子量バンドの比率は有意に変化しません(図2B、コントロール)。しかし、mRFP-ATG9Aの一過性発現を利用して、CHX処理は高分子量バンドの蓄積を促進します(図2C、コントロール、CHX t = 24)。高分子量の過剰発現mRFP-ATG9Aバンドは、PNGase Fで処理した後、より低いバンドに崩壊します(図2C、PNGase F、t = 24)。これらのデータは、高分子量バンドの優位性に反映されるように、内因性タンパク質が成熟糖鎖を急速に獲得し、CHXチェイスがダブルバンドの比率に影響を与えないことを示しています(図2B)。一過性に過剰発現したmRFP-ATG9Aの場合、CHX処理はアッパーバンドの蓄積を誘導し、小胞体プールが折りたたまれて小胞体からゴルジ体に出るにつれて、より成熟した糖鎖が獲得されることを示しています(図2C)。
ATG9A配列と蛍光タグの間にリンカーを付加することで、タンパク質の生理学的局在化と輸送を促進することができます。N末端蛍光色素とATG9Aの間で3x-FLAG配列(24アミノ酸)を融合させることで、過剰発現タンパク質は内因性タンパク質と同様に振る舞います(図3)。実際、過剰発現したmCherry-3xFLAG-ATG9Aは、摂食条件下でゴルジマーカーGM130と共局在します(図3A)。重要なことは、この局在とATG9A小胞コンパートメントが経時的に保存され、ATG9Aの輸送の時空間的研究を可能にすることです(図3B)。
図1:内因性ATG9A局在の画像解析 。 (A)内因性ATG9A(赤)、ゴルジ体マーカーとしてのGM130(緑)、アクチン細胞骨格を可視化するためのファロイジン(シアン)の代表的な免疫蛍光画像。スケールバー = 10 μm。(B)ゴルジ部に局在する内因性ATG9Aの割合を決定するための画像解析のワークフロー。スケールバー = 10 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:局在化とグリコシル化による蛍光標識 ATG9Aコンストラクトの分析。 (A)eGFP N末端タグ付きATG9Aはゴルジ体に局在しにくく、主に小胞に存在します。eGFP C末端でタグ付けされたATG9Aは、細胞内で凝集体を示す(いくつかの例は白い矢印でマークされ、eGFP-ATG9AおよびATG9A-eGFPは緑色で示されている)。mRFP N末端でタグ付けされたATG9Aは、ゴルジ体に局在しにくく、主に小胞に存在します。Nは細胞核のおおよその位置を示し、mRFP-ATG9Aは赤色です。スケールバー = 5 μm。(B)内因性ATG9Aは、ウェスタンブロット(矢印)で解析すると、アッパーバンド(複合N-結合型糖鎖)とロワーバンド(成熟N-結合型糖鎖なし)の2つのバンドとして現れます。シクロヘキサミド(CHX)による治療は、上下のバンドの比率に影響を与えません。PNGase Fによる処理により、上部バンドが消失します。(C)HEK293A細胞におけるmRFPタグ付きATG9Aの一過性トランスフェクション後、ウェスタンブロット(矢印)に2つの顕著なバンドが見られます。PNGase Fによる処理により、上部バンドが消失します。トランスフェクション後のCHXによる処理では、トランスフェクションされたATG9AのプールがERからゴルジ体に輸送されるため、グリコシル化が増加します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:免疫蛍光法とライブイメージングによるmCherry-3xFLAG-ATG9A局在の解析。 (A)mCherry-3xFLAG-ATG9Aを一過性に過剰発現し、ゴルジマーカーGM130で染色したHEK293A細胞の免疫蛍光実験。スケールバー = 10 μm。mCherry-3xFLAG-ATG9Aは赤、GM130ゴルジマーカーは緑です。(B)mCherry-3xFLAG-ATG9Aを一過性に過剰発現するHEK293A細胞におけるライブイメージング実験からのモンタージュ。Nは核のおおよその位置を示す。時間枠 = 1 fps。スケールバー = 10 μm。mCherry-3xFLAG-ATG9Aは赤です。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Discussion
この研究は、ATG9Aの局在化を調査するために使用できるさまざまなツールを示しています。まず、この研究では、ATG9Aを免疫蛍光法によって視覚化する方法と、これを定量化する方法について説明します。次に、ATG9Aを蛍光マーカーでタグ付けし、固定細胞または生細胞で可視化するために使用できる戦略を比較します。最後に、ATG9Aのグリコシル化状態を調査して使用し、ATG9AがERを出てゴルジ体を介して輸送されたかどうかを判断する方法について説明します。
免疫蛍光法による内因性ATG9A局在の特性評価に関しては、実験に用いる固定法と透過法に注意が必要です。ここで説明する標準的な手順によれば、パラホルムアルデヒド固定とジギトニン透過処理の組み合わせは、ゴルジ体関連ATG9AとATG9A陽性小胞の両方を可視化するのに良い条件です7。固定や透過処理とともに、一次抗体溶液とのインキュベーションのタイミングも重要です。一次抗体溶液の濃度が高く、インキュベーション時間が長くなると、ATG9Aのゴルジ体染色が誤って増加し、最終的に他の膜コンパートメントへのATG9A再分配の検出が損なわれる可能性があることが観察されていますが、文書化されていません。さらに、ATG9Aは多くの細胞内コンパートメント1,13,17,22,23,24,27,28に存在するため、ATG9Aが位置する場所を特定するために、ATG9Aとともに特定の膜マーカーを使用することが重要です。ATG9Aの局在化を定量化するために、過去には、ピアソンの共局在の相関係数29など、いくつかのアプローチが用いられてきた。しかし、ATG9Aがゴルジ体や異なる小胞区画と部分的に重なっているため、画素の外れ値が多くなり、相関係数の解釈に偏りが生じる可能性があります。このため、分析する2つのコンパートメントの平均蛍光の比に基づくより単純なアプローチが好まれ、このアプローチは細胞ごとの変動に対する感度が低くなります。顕微鏡による画像解析の詳細については、本書の第30章を参照してください。
ATG9Aのグリコシル化状態を調べる場合、ウェスタンブロットを実行するためのゲルの選択は重要です。このプロトコルのために、3%-8%のTrisアセテートのゲルはより大きい蛋白質のための最も高い決断を提供するが、高分子量の蛋白質のよい分離を提供する代わりとなるゲルの構成か連続した緩衝はまた使用することができるので好まれる。実験者は、電気泳動の時間を長くすることで、タンパク質の最大限の分離を確保できます。
ウェスタンブロットでATG9Aを可視化するためにサンプルを調製する場合は、Laemmliバッファーを添加した後にサンプルを沸騰させないように注意する必要があります。95°Cで沸騰すると、ATG9A凝集体の形成が誘導され、その後、ATG9Aはゲル1に効率的に移行しません。サンプルを65°Cで5分間加熱することが推奨されます27。
通常、高レベルのトランスフェクションはERへのATG9Aの蓄積を増加させますが、中程度の発現レベルはタンパク質の生理学的局在化を助けます。逸話として、インキュベーション時間を48時間ではなく72時間にすると、ERの局在化アーチファクトを減らすのに役立つことがよくあります。特に、mRFP-ATG9Aは、発現レベルまたは安定した細胞株8,9,22,27を用いてレベルを制御した場合、ATG9Aの輸送と機能を正確に報告することができます。
過剰発現したATG9Aの集団が成熟N-結合型糖鎖を獲得できないことは、ATG9Aの輸送の摂動の読み出しとして使用できます。ATG9Aの特定の領域を変異または欠失させると、小胞体保持が増加するリスクがあり、成熟したN結合型糖鎖の獲得に失敗し、ウェスタンブロットでのATG9Aバンドの移動が速くなる可能性があります。切断されたATG9Aコンストラクトを扱う研究者は、小胞体の保持、グリコシル化状態、およびゴルジ体局在を確認する必要があります。
ATG9Aの生細胞イメージングでは、高速Airyscan機能を利用したAiryscan顕微鏡が、通常約120 nmの最適な分解能を提供します。定位精度については、画像化するチャンネル数に応じて、超解像モードで約1〜2フレーム/秒(fps)のフレームレートが最適です。高速でイメージングできる同様の共焦点顕微鏡は、ATG9A小胞のイメージングにも使用できます。ただし、イメージング速度はイベントの検出に直接影響し、したがってデータの解釈に影響を与える可能性があることに注意する必要があります。
要約すると、提示されたプロトコルは、免疫蛍光法、生細胞顕微鏡検査、およびそのグリコシル化状態によってATG9A局在を定量化および特性評価する方法を説明しています。これらのプロトコルは、ATG9Aを扱う研究者を支援し、いくつかの落とし穴を回避するのに役立ちます。
Disclosures
S.A.T.は、Casma Therapeuticsの科学諮問委員会のメンバーです。
Acknowledgments
著者らは、原稿の側面を校正してくれたRocco D'Antuonoと、これらのプロトコルの改良につながった議論をしてくれたMolecular Cell Biology of Autophagy(MCBA)ラボの現在および過去のすべてのメンバーに感謝します。A. V.V.、S.D.T.、E.A.、S.A.T.は、英国がん研究協会(CC2134)、英国医学研究評議会(CC2134)から中核的な資金提供を受けているフランシス・クリック研究所の支援を受けました。この研究の全部または一部は、ウェルカム・トラスト(CC2134)から資金提供を受けました。オープンアクセスの目的で、著者は、この投稿から生じる著者が承認した原稿のバージョンにCC BYパブリック著作権ライセンスを適用しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
| 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 60 mm tissue culture dish | Thermofisher Scientific | 10099170 | For tissue culture |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofisher Scientific | A22287 | Actin stain |
| anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
| anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
| anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
| ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
| ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Bemis Parafilm | Thermofisher Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
| CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
| D-Glucose | / | For EBSS | |
| Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
| DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
| eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
| FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
| Hoechst | Thermofisher Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
| KCl | / | For EBSS | |
| L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
| LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
| MgCl2 | / | For PBS | |
| MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
| Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
| NaCl | / | For EBSS | |
| NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
| NaHCO3 | / | For EBSS | |
| NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofisher Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermofisher Scientific | 31985062 | For Cell Transfection |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
| pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
| PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
| Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
| Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
| RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Triton X-100 | Thermofisher Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
| Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
| Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |
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