Summary
Este protocolo descreve vários métodos que podem ajudar no estudo da biologia da ATG9A, incluindo imunofluorescência seguida de análise de imagem, considerações de superexpressão transitória e investigação do estado de glicosilação da ATG9A usando western blot.
Abstract
A autofagia é uma via altamente conservada que a célula usa para manter a homeostase, degradar organelas danificadas, combater patógenos invasores e sobreviver a condições patológicas. Um conjunto de proteínas, chamadas proteínas ATG, compõem a maquinaria de autofagia central e trabalham juntas em uma hierarquia definida. Estudos realizados nos últimos anos têm melhorado nosso conhecimento sobre a via da autofagia. Mais recentemente, foi proposto que as vesículas ATG9A estão no coração da autofagia, pois controlam a síntese rápida de novo de uma organela chamada fagóforo. O estudo da ATG9A tem se mostrado desafiador, uma vez que a ATG9A é uma proteína transmembrana e está presente em diferentes compartimentos da membrana. Como tal, compreender o seu tráfico é um elemento importante para a compreensão da autofagia. Aqui são apresentados métodos detalhados que podem ser usados para estudar a ATG9A e, em particular, sua localização usando técnicas de imunofluorescência, que podem ser avaliadas e quantificadas. As armadilhas da superexpressão transitória também são abordadas. A correta caracterização da função ATG9A e a padronização das técnicas de análise de seu tráfico são cruciais para caracterizar melhor os eventos que regem o início da autofagia.
Introduction
A ATG9A é a única proteína transmembrana da maquinaria central de autofagia e é trafegada entre o compartimento de Golgi e um compartimento citosólico da vesícula ATG9A, transitando pelo compartimento endossômico1. Por muito tempo enigmática, a ATG9A foi recentemente descrita como uma scramblase lipídica, pois equilibra lipídios através das bicamadas da membrana 2,3. Está claro que a ATG9A reside no topo da hierarquia na formação dos autofagossomos, e seu estudo é, portanto, vital para a compreensão daautofagia4,5. Assim, vesículas ATG9A foram recentemente propostas como a "semente" do autofagossomo 6,7. Entretanto, estudos prévios demonstraram que a ATG9A interage apenas transitoriamente com o autofagossomo em diferentes etapas de sua maturação e não se integra à membrana autofágica 6,8,9,10,11. Assim, mais investigações são necessárias para desvendar completamente o papel e as potenciais múltiplas funções do ATG9A na formação do autofagossomo. No entanto, a discrepância entre os modelos atuais e os dados anteriores só pode ser resolvida por meio de experimentos direcionados abordando o tráfego de ATG9A usando abordagens quantitativas validadas e marcadores intracelulares.
Existem várias ferramentas em uso para estudar a ATG9A, cada uma com vantagens e desvantagens, e o uso dessas ferramentas é complicado pela estrutura da ATG9A, sua função molecular e tráfego celular 2,8,12. A ATG9A forma um homotrímero, é glicosilada e trafegada por toda a célula para compartimentos como o Golgi, os endossomos e a membrana plasmática13,14. Dado seu itinerário complexo, há vários desafios na interpretação de leituras como a dispersão ATG9A do Golgi sobre tratamentos ou estímulos específicos (como a falta de nutrientes e soro). A ATG9A é extremamente dinâmica em termos de tráfego vesicular; de fato, vesículas contendo ATG9A têm sido definidas como o compartimento ATG9A no contexto da autofagia induzida pela fome. O compartimento ATG9A, formado por essas vesículas dinâmicas, interage transitoriamente com várias organelas intracelulares 8,15,16,17. As técnicas aqui descritas, incluindo imunofluorescência, imagens vivas e ensaios de glicosilação, devem auxiliar na detecção e compreensão da biologia da ATG9A. Em particular, as abordagens descritas neste artigo ajudarão a abordar questões sobre localização em compartimentos celulares específicos e interações com parceiros proteicos específicos e/ou compartimentos de membrana. Como o domínio central conservado hidrofóbico ATG9A (domínio PFAM PF04109) tem uma topologia única e ciclos ATG9A entre vários compartimentos de membrana, os pesquisadores devem estar cientes de certas armadilhas e artefatos ao superexpressar transitoriamente ATG9A, incluindo, mas não restrito a, retenção de retículo endoplasmático (RE). Outros possíveis problemas podem surgir devido ao enovelamento incorreto da proteína, agregação artefactual em condições normais de crescimento ou detecção insuficiente do compartimento vesicular devido a protocolos de permeabilização subótimos para imunofluorescência.
Na obtenção de imagens de ATG9A endógeno, deve-se ter cuidado no preparo da amostra e na aquisição das imagens para garantir a qualidade da análise quantitativa subsequente e a correta interpretação dos dados. A combinação das técnicas descritas neste artigo com abordagens bioquímicas padrão (como experimentos de imunoprecipitação ou pull-down não descritos aqui) deve melhorar nossa compreensão da função ATG9A. Este kit de ferramentas experimentais destina-se a ajudar novos pesquisadores a navegar alguns dos ensaios necessários para determinar a função de ATG9A em seu sistema biológico.
Protocol
Todos os reagentes usados neste estudo estão disponíveis comercialmente, exceto as construções de DNA ATG9A e o anticorpo STO-215 caseiro (ver Tabela de Materiais), que estão disponíveis mediante solicitação. As ferramentas de análise aqui descritas são baseadas em software livre (FIJI/ImageJ)18.
1. Cultura celular
- Manter HEK293A células em um frasco tratado com cultura de tecidos T150 até 80%-90% de confluência em DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) suplementado com 10% de FBS (soro fetal bovino) e 4 mM de L-glutamina (ver Tabela de Materiais). Incubar as células a 37 °C em estufa de cultura de tecidos umidificada a 10% CO2.
NOTA: HEK293A células são utilizadas no presente estudo, pois apresentam uma resposta autofágica canônica robusta à inanição de aminoácidos, que é, em particular, detectada por um aumento da CL3 lipidada associada à membrana 1,9,19, e são adequadas para exames de imagem. - Passar as células aspirando o meio do frasco com pipeta sorológica. Lavar as células uma vez com 15 mL de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato) ou uma solução similar antes de adicionar 2 mL de solução de tripsina-EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) para desprender as células. Coletar as células destacadas com 8 mL de DMEM e semear de volta um número de células para que 80%-90% de confluência seja alcançada após 2 dias para os experimentos aqui descritos.
2. Coloração endógena de ATG9A
- Sementes HEK293A células (ou células de escolha) em tampas de vidro estéreis nº 1,5 colocadas em uma placa de 24 poços para que sejam ~80% confluentes no dia seguinte. Isso normalmente dá 7 x 104 células/poço em 500 μL de DMEM.
NOTA: Para células HEK293A ou outras linhagens celulares pouco aderentes, as lamínulas precisam ser revestidas com poli-D-lisina a 0,1 mg/mL em água deionizada. Adicionar 500 μL da poli-D-lisina (ver Tabela de Materiais) no topo das lamínulas colocadas nos poços durante 10 min à temperatura ambiente (TR), seguidas de três lavagens com água deionizada e uma última lavagem em DMEM. Prossiga para a semeadura das células após o revestimento e tome cuidado para que elas estejam uniformemente espalhadas no prato de cultura. - Tratar as células de acordo com as condições experimentais específicas (ou seja, fome por 2 h em EBSS [Earle's Balanced Salt Solution]).
NOTA: A composição do EBSS é de 1 g/L de D-glicose, 6,8 g/L de NaCl, 0,4 g/L de KCl, 0,151 g/L de CaCl 2,2H 2 O, 0,2 g/L mM de MgSO 4,7H 2 O, 0,124 g/L de NaH 2 HPO4,2H 2 O e 2,2 g/Lde NaHCO 3 (ver Tabela de Materiais) dissolvidos em água destilada. - Aspirar o meio e substituí-lo cuidadosamente por 500 μL de solução de formaldeído a 4% em PBS suplementado com CaCl2 0,1 mM e MgCl2 0,1 mM por 20 min no TR para fixar as células.
- Aspirar a solução de formaldeído a 4% de cada poço, substituindo-a por 500 μL de PBS. Repita esta etapa de lavagem três vezes. Não deixe as tampas secarem ou ficarem sem líquido.
- Eliminar os grupos de aldeídos livres usando 500 μL de solução de NH4Cl 50 mM em PBS por 10 min em TR.
- Aspirar o PBS e substituí-lo por 500 μL de uma solução de digitonina de 50 μg/mL em PBS (solução-estoque de 1 mg/mL em água deionizada, ver Tabela de Materiais) por 5 min na RT para permeabilizar as células.
- Aspirar a solução de digitonina de cada poço e substituí-la por 500 μL de PBS. Repita esta etapa de lavagem três vezes.
- Aspirar o PBS de cada poço e substituí-lo por 500 μL de solução de bloqueio (BSA [albumina de soro bovino] a 5% diluída em PBS) por 30 min no TR.
- Aspirar a solução de bloqueio e substituí-la por 500 μL de PBS.
- Usando pinças, colete as lamínulas do poço, remova cuidadosamente o excesso de solução de PBS usando lenços finos de tecido ou papel de filtro de celulose e coloque suavemente cada lamínula, de lado da célula para baixo, em uma gota de 50 μL de solução de anticorpos primários (por exemplo, Hamster Armênio 14F2 diluído a 0,9 μg/mL em solução de BSA/PBS a 1%, consulte Tabela de Materiais). Incubar em câmara umidificada por 1 h no TR.
NOTA: Para facilitar o manuseio, as gotas de solução de anticorpos podem ser colocadas em uma folha de filme termoplástico auto-selante (consulte a Tabela de Materiais) dentro de outro recipiente em vez de diretamente em uma superfície sólida. - Recolher as lamínulas usando uma pinça e, depois de drenar suavemente o excesso de solução de anticorpos primários usando lenços finos de tecido, substitua as lamínulas (lado da célula para cima) na placa de 24 poços e lave-as três vezes com PBS.
- Repita a etapa 2.10. Usando pinças, colete as lamínulas de cada poço, drenando cuidadosamente o excesso de PBS usando lenços finos de tecido, e coloque suavemente cada lamínula (lado da célula para baixo) em uma gota de 50 μL de solução de anticorpos secundários diluída 1:1.000 em solução de BSA/PBS a 1% (por exemplo, Cy3 Goat Anti-Armenian Hamster IgG, que tem mínima reatividade cruzada com bovinos, humanos, proteínas séricas de camundongos, coelhos e ratos, ver Tabela de Materiais). Incubar em câmara umidificada por 1 h no TR.
NOTA: Opcional: Um marcador de citoesqueleto pode ser usado além do anticorpo secundário para a análise de imagem subsequente (ou seja, Alexa Fluor 647 Faloidina diluída 1:1.000, consulte Tabela de Materiais). Para facilitar o manuseio, as gotas de solução de anticorpos podem ser colocadas em uma folha de filme de vedação dentro de outro recipiente em vez de diretamente em uma superfície sólida. - Recolher as lamínulas com uma pinça e, depois de drenar o excesso de solução de anticorpos secundários, colocar as lamínulas na placa de 24 poços (lado da célula para cima) e lavá-las três vezes com 500 μL de PBS.
- Usando pinças, colete as lamínulas, drenando cuidadosamente o excesso de PBS usando lenços finos de tecido, e coloque suavemente cada lamínula (lado da célula para baixo) em uma gota de 50 μL de solução Hoechst 1:4.000 (Hoechst 33342) em PBS. Incubar em uma câmara de umidade por 5 min em TR.
NOTA: Para facilitar o manuseio, as gotas de solução de anticorpos podem ser colocadas em uma folha de filme de vedação dentro de outro recipiente em vez de diretamente em uma superfície sólida. - Recolher as lamínulas com uma pinça e, depois de drenar suavemente o excesso de solução Hoechst com lenços finos de tecido, substitua as lamínulas na placa de 24 poços e lave três vezes com PBS e uma vez com água desionizada (500 μL por lavagem).
- Drene cuidadosamente o excesso de água deionizada usando lenços finos de tecido e coloque suavemente cada lamínula (lado da célula para baixo) em uma gota de 10-20 μL de solução de montagem (ver Tabela de Materiais) manchada em uma lâmina de microscópio para imunofluorescência, evitando a formação de bolhas de ar.
NOTA: O meio de montagem usado aqui tem o mesmo índice de refração que o óleo de imersão e endurece após algumas horas em RT ou durante a noite a 4 °C. Soluções de montagem sem endurecimento podem ser usadas, mas deve-se tomar cuidado para selar a tampa com esmalte. - Remova o excesso de solução de montagem por aspiração e deixe as amostras secarem enquanto estiverem deitadas no RT durante a noite no escuro, em um suporte deslizante ou coberto com papel alumínio.
3. Aquisição de imagens
- Ligue o microscópio confocal. Abra o software de imagem (consulte Tabela de Materiais) para iniciar a configuração de aquisição de imagem.
- Na guia Função , selecione a lente objetiva Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 para capturar as imagens para análise.
- Na guia Função de Aquisição , ligue os lasers apropriados na zona Laser do Painel de Controle (Argônio, Diodo-405-30, DPSS 561-10 e HeNe633).
- Na zona Configuração de Imagem do Painel de Controle, crie quatro faixas, com cada faixa correspondendo a um canal, para executar a aquisição sequencial.
- Defina a resolução apropriada das imagens na janela Modo de Aquisição . Defina a resolução em 1.024 x 1.024 (Tamanho do quadro) e selecione uma profundidade de bits de 16 bits.
- Para cada canal, ajuste a potência e ganho do laser para obter um bom sinal sem pixels saturados, o que impediria a análise da intensidade da imagem. Usando o botão Ativa, defina o nível de saída do laser e o ganho (mestre).
NOTA: O uso da opção de indicador de intervalo é recomendado para detecção de pixels saturados. Mantenha a potência do laser entre 1% e 10% e o Ganho (Master) abaixo de 850 para evitar ruído de fundo. - Na zona Canais do Painel de Controle, defina a mesma abertura de orifício para cada canal, considerando 1 Unidade Arejada (UA) para o canal com o maior comprimento de onda.
- Adquira 10 campos aleatórios contendo quantidades semelhantes de células (20-30 células por campo). A aquisição de 100-200 células por condição fornecerá um bom poder para a análise posterior das imagens.
4. Análise das imagens de dispersão de ATG9A
- Faça o download do software FIJI da internet (consulte a Tabela de Materiais). Abra a imagem com FIJI clicando em Plugins > Bio-Formats > BioFormats Importer.
- Clique em Analisar > Definir medidas e selecione o valor cinza médio na janela de medições para a análise de intensidade.
- Clique em Image > Color > Split Channels e separe os canais em três imagens (marcador de Golgi, citoesqueleto, sinal ATG9A).
- Vá para Image > Adjust > Threshold e defina um limite no canal correspondente ao marcador Golgi.
- Clique em Editar > Seleção > Criar Seleção e crie uma seleção a partir da imagem binária.
- Vá para Editar > Seleção > Adicionar ao Gerenciador > Renomear (Golgi), salve a seleção no gerenciador de ROI e renomeie-a para Golgi.
- Clique em Imagem > Ajustar > Limiar e defina um limiar no canal correspondente ao marcador do citoesqueleto para definir o contorno celular.
- Vá para Editar > Seleção > Criar Seleção e crie uma seleção a partir da imagem binária.
- Clique em Editar > Seleção > Adicionar ao Gerenciador > Renomear (Total), salve a seleção no gerenciador de ROI e renomeie-a como Total.
- Selecione a imagem correspondente à coloração ATG9A.
- Em Analisar > Medir, aplique o ROI Golgi clicando nele e meça a intensidade da região de Golgi .
- Clique em Analisar > Medir, aplique o ROI Total clicando nele e meça a intensidade da região Total.
- Repita o procedimento em todas as imagens, salve os resultados como arquivos .csv e processe os dados usando a seguinte fórmula:
Taxa de dispersão ATG9A = intensidade de Golgi/intensidade total
5. Imagem de células vivas de construções ATG9A
- Semear HEK293A células (ou células de escolha) em 2 mL de meio em uma placa de cultura de tecidos de 60 mm para que atinjam ~65%-70% de confluência no dia seguinte; Isso normalmente dá 1 x 10 6-2 x 106 células.
- No dia seguinte, prepare misturas de Lipofectamina:ADN (ou um reagente alternativo adequado para transfecção de ADN, ver Tabela de Materiais) da seguinte forma:
- Dependendo da eficiência de expressão da construção, diluir 0,5-2 μg de DNA plasmidial em 100 μL de um meio livre de soro adequado e misturar suavemente a solução pipetando para cima e para baixo. Incubar a mistura por 5 min no TR.
NOTA: A construção do DNA plasmidial é específica do experimento. Os pesquisadores podem clonar sozinhos ou obter dos autores mediante solicitação. - Diluir o reagente de transfecção Lipofectamina 2000 na proporção de 3:1 Lipofectamina:DNA em 100 μL de um meio adequado sem soro e misturar suavemente a solução pipetando para cima e para baixo. Incubar esta mistura por 5 min em TR.
- Misture ambas as soluções pipetando suavemente para cima e para baixo e incubando por 20 min no RT.
- Dependendo da eficiência de expressão da construção, diluir 0,5-2 μg de DNA plasmidial em 100 μL de um meio livre de soro adequado e misturar suavemente a solução pipetando para cima e para baixo. Incubar a mistura por 5 min no TR.
- Adicione a mistura Lipofectamina:DNA a cada placa de cultura celular contendo 4 mL de meio de crescimento e agite suavemente a placa para frente e para trás para distribuir a mistura uniformemente. Incubar as células a 37 °C em incubadora de cultura celular umidificada a 10% CO2.
- Substitua o meio por meio de crescimento fresco 4 h após a transfecção e incube as células a 37 °C em uma incubadora de cultura celular umidificada a 10% CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, tripsinize, conte e resemeie as células em placas de cultura adequadas para microscopia de células vivas (placas de cultura com uma tampa de vidro nº 1,5, ver Tabela de Materiais). Semeie 0,4 x 10 6-0,7 x 106 células nas placas para atingir ~60%-75% de confluência na folha de cobertura no momento da aquisição de imagens.
NOTA: O revestimento com poli-D-lisina, conforme explicado na etapa 2.1, é recomendado para células HEK293A. - No dia seguinte (48 h após a transfecção), fotografe as células.
6. Investigação do estado de glicosilação da ATG9A
- Semear HEK293A células (ou células de escolha) em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm para que elas atinjam ~80% de confluência no dia seguinte se planejarmos investigar ATG9A endógeno, que normalmente dá 1,5 x 10 6-2,5 x 106 células em 10 mL. Alternativamente, semeie as células para que elas atinjam ~65%-70% de confluência se transfectar construções ATG9A, o que normalmente dá 1 x 10 6-1,5 x 106 células em 10 mL.
- Tratar as células com 100 μg/ml de ciclohexamida (CHX, ver Tabela de Materiais) ou veículo no dia seguinte. Incubar por 24 h (ou até o horário desejado).
- Retire as células da incubadora, aspirar o meio e colocar gelo. Substitua-o por 5 mL de PBS 1x gelado. Separar fisicamente as células da placa usando um raspador de células e pipetar a solução de células PBS em um tubo de fundo cônico de 15 mL. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C para pellet das células.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em ~100 μL (dependendo do tamanho da pastilha celular) de tampão de lise TNTE gelado (1% Triton, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM EDTA) suplementado com comprimidos de coquetel inibidor de protease (ver Tabela de Materiais) e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Incubar o lisado no gelo durante 15 minutos. Em seguida, centrifugar o lisado a 20.000 x g por 10 min a 4 °C para sedimentar os núcleos e detritos insolúveis e transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco.
- Quantificar a concentração proteica do lisado utilizando o método de Bradford20 e um espectrofotômetro capaz de medir o comprimento de onda de 595 nm.
- Normalizar as quantidades de proteína e combinar 16 μL do lisado (contendo não mais de 100 μg de proteína no total) com 5x tampão PNGase F (Peptídeo:N-glicosidase F) de acordo com as instruções do fabricante antes de adicionar 1 μL da enzima PNGase F (ver Tabela de Materiais). Incubar conforme as instruções do fabricante da PNGase F.
- Adicionar um volume de tampão de amostra de Laemmli 3x para atingir uma concentração de 1x e incubar a 65 °C por 5 minutos antes do carregamento para eletroforese usando um gel de Tris-acetato para maximizar a separação de proteínas. Transfira as proteínas do gel para uma membrana adequada (ou seja, PVDF [difluoreto de polivinilideno]) usando protocolos padrão de western blot21 (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Ferver as amostras a 95 °C fará com que ATG9A seja agregado, reduzindo assim a detecção de ATG9A. - Realizar o western blot usando anticorpos específicos para ATG9A (anticorpo STO-215, produzido internamente1) (ver Tabela de Materiais). Deixe a seção de maior peso molecular da membrana sem cortes para visualizar as espécies de maior peso molecular ATG9A.
Representative Results
A ATG9A é uma proteína transmembrana associada a vários compartimentos da membrana intracelular8,17,22,23,24. Em condições basais, a ATG9A localiza-se principalmente na rede trans-Golgi (TGN), como indicado pela imunofluorescência da proteína endógena e pela sobreposição com GM130, um marcador cis-Golgi (Figura 1A), bem como em pequenas vesículas que se sobrepõem parcialmente ao compartimento de reciclagem endocítica (ERC)23. A localização de ATG9A no Golgi pode ser detectada usando diferentes protocolos de imunofluorescência. No entanto, a fração vesicular da ATG9A, bem como sua mudança de localização, em particular o aumento do pool vesicular, em resposta a estímulos específicos, como privação de nutrientes e soro, podem ser bastante variáveis em intensidade e difíceis de visualizar com as abordagens convencionais de imagem. A razão entre ATG9A localizada em Golgi e ATG9A localizada em uma fração vesicular é denominada taxa de dispersão ATG9A. Para detectar alterações na taxa de dispersão de ATG9A, por exemplo, no tratamento com EBSS, que é usado para esgotar tanto o soro quanto os aminoácidos, um marcador de Golgi como GM130 ou TGN46 e um marcador do citoesqueleto como a faloidina, que cora o contorno celular25, são úteis para quantificar prontamente a dispersão de ATG9A (Figura 1B). É importante ressaltar que a análise da razão de fluorescência média só pode ser interpretada como uma medida comparativa entre condições e não como uma taxa fixa de dispersão. A relação entre os compartimentos é altamente dependente de fatores biológicos e não biológicos, como a linhagem celular utilizada, a qualidade da coloração ou os métodos de limiarização aplicados (Figura 1B). Por essa razão, o pesquisador precisa montar um pipeline capaz de detectar o enriquecimento de ATG9A Golgi em suas condições experimentais específicas e, em seguida, estender a análise com os mesmos parâmetros a todas as imagens do conjunto a ser analisado. Imagens binárias representativas e áreas selecionadas para a análise da fluorescência média ATG9A são mostradas como guia na Figura 1B.
A ATG9A abriga vários domínios transmembrana flanqueados por dois domínios N- e C-terminais relativamente flexíveis e não estruturados, dos quais a sequência C-terminal engloba quase metade da proteína12. É importante ressaltar que o padrão de localização da ATG9A superexpressa pode ser influenciado pela extremidade da proteína marcada (Figura 2A). Em particular, ao usar sistemas de expressão transiente e marcar ATG9A diretamente em seu término N com uma etiqueta fluorescente (por exemplo, eGFP, mRFP ou derivados), sua localização de Golgi pode ser parcialmente comprometida, com menos enriquecimento observado em condições basais (i.e., alimentadas), enquanto as vesículas ATG9A ainda são prontamente visíveis (Figura 2A). A marcação de ATG9A em seu término C parece induzir ligeiramente maiores clusters positivos de GFP que poderiam ser agregados. Finalmente, uma versão monomérica do mRFP-ATG9A também mostra aglomerados fluorescentes semelhantes de vesículas e pouca coloração de Golgi em células superexpressando (Figura 2A).
ATG9A dobra na membrana de ER antes de ser trafegado para as vesículas de Golgi e ATG9A. Durante sua residência no RE, a ATG9A torna-se modificada pelos glicanos ligados à N em Asparagina 99 e, ao atingir o Golgi, adquire glicanos ligados a N maduros e complexos 1,14. Essa modificação por glicosilação pode ser detectada através do western blot pelo aparecimento de uma banda dupla14. Consistente com sua localização intracelular, a maioria dos ATG9A endógenos abriga glicanos complexos ligados a N, e, portanto, a banda de maior peso molecular é predominante, com uma tênue banda de menor peso molecular também visível (Figura 2B). A presença de banda dupla é mais facilmente observada quando se utilizam géis de Tris-acetato para melhorar a resolução de proteínas de maior peso molecular (Figura 2B, controle, t = 0). Quando a proteína endógena é submetida ao tratamento com PNGase F (Peptídeo:N-glicosidase F), que remove a maior parte dos glicanos ligados ao complexo N, a proteína funciona como uma única banda (Figura 2B, PNGase F, t = 0). Portanto, o estado de glicosilação N-ligada de ATG9A pode ser usado como um proxy para monitorar a saída de ATG9A do RE para o Golgi, que é refletida pela razão relativa entre as duas bandas.
Quando a transfecção de mRFP-ATG9A constrói transitoriamente, a proteína superexpressa inicialmente se acumula no RE, potencialmente porque a maquinaria de tráfico é incapaz de dobrar e trafegar toda a ATG9A, e a banda de menor peso molecular é predominante (Figura 2C, controle t = 0). Notavelmente, após 24 h de expressão de mRFP-ATG9A, há aproximadamente uma distribuição igual entre as bandas superior e inferior, sugerindo que o pool mRFP-ATG9A está se movendo para dentro do Golgi (Figura 2C, Controle, t = 24). Se as células forem tratadas com cicloheximida (CHX), que bloqueia a síntese proteica de novo 26, o enovelamento e a saída de ATG9A do RE podem ser esclarecidos. Como a proteína endógena é dobrada, glicosilada e residente no Golgi, o tratamento com CHX não altera significativamente a relação entre as bandas de menor e maior peso molecular (Figura 2B, Controle). Entretanto, utilizando a expressão transitória de mRFP-ATG9A, o tratamento com CHX promove o acúmulo da banda de maior peso molecular (Figura 2C, Controle, CHX t = 24). A banda mRFP-ATG9A superexpressa de maior peso molecular colapsa na banda inferior após o tratamento com PNGase F (Figura 2C, PNGase F, t = 24). Esses dados mostram que a proteína endógena adquire rapidamente glicanos maduros, refletido pela predominância da banda de maior peso molecular, e a perseguição de CHX não afeta a proporção das bandas duplas (Figura 2B). No caso de mRFP-ATG9A transitoriamente superexpresso, o tratamento com CHX induz o acúmulo da banda superior, indicando que glicanos mais maduros são adquiridos à medida que o pool de RE dobra e sai do RE para o Golgi (Figura 2C).
A adição de um ligante entre a sequência ATG9A e os tags fluorescentes pode ser útil na promoção de uma localização mais fisiológica e tráfego da proteína. A fusão de uma sequência 3x-FLAG (24 aminoácidos) entre um fluoróforo N-terminal e ATG9A ajuda a proteína superexpressa a se comportar de forma semelhante à endógena (Figura 3). De fato, mCherry-3xFLAG-ATG9A superexpresso colocaliza-se com o marcador de Golgi GM130 em condições de alimentação (Figura 3A). É importante ressaltar que essa localização e o compartimento vesicular do ATG9A são preservados ao longo do tempo, permitindo o estudo espaço-temporal do tráfego do ATG9A (Figura 3B).
Figura 1: Análise das imagens da localização endógena do ATG9A. (A) Imagem representativa de imunofluorescência de ATG9A endógeno (vermelho), GM130 como marcador de Golgi (verde) e faloidina para visualização do citoesqueleto de actina (ciano). Barra de escala = 10 μm. (B) Fluxo de trabalho da análise de imagem para determinar a fração de ATG9A endógena que se localiza na área de Golgi. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise dos construtos ATG9A marcados fluorescentemente por localização e glicosilação . (A) eGFP N-terminally tagged ATG9A é menos localizado no Golgi e reside principalmente nas vesículas. eGFP C-terminally marcado ATG9A exibe agregados dentro da célula (alguns exemplos são marcados por pontas de seta brancas; o eGFP-ATG9A e ATG9A-eGFP estão em verde). mRFP N-terminally tagged ATG9A é menos localizado no Golgi e reside principalmente nas vesículas. N denota a localização aproximada do núcleo celular, e o mRFP-ATG9A está em vermelho. Barra de escala = 5 μm. (B) A ATG9A endógena aparece como duas bandas quando analisadas por western blot (cabeças de setas): uma banda superior (glicanos complexos ligados a N) e uma banda inferior (sem glicanos N-ligados maduros). O tratamento com ciclohexamida (CHX) não afeta a relação entre as bandas superior e inferior. O tratamento com PNGase F causa o desaparecimento da banda superior. (C) Após transfecção transitória de ATG9A marcada com mRFP em células HEK293A, duas bandas proeminentes são visíveis no western blot (cabeças de setas). O tratamento com PNGase F causa o desaparecimento da banda superior. O tratamento com CHX após a transfecção leva ao aumento da glicosilação, pois o pool de ATG9A transfectado é trafegado do pronto-socorro para o Golgi. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise da localização do mCherry-3xFLAG-ATG9A por imunofluorescência e imagens ao vivo. (A) Experimentos de imunofluorescência de células HEK293A superexpressando transitoriamente mCherry-3xFLAG-ATG9A e coradas com o marcador de Golgi GM130. Barra de escala = 10 μm. O mCherry-3xFLAG-ATG9A está em vermelho e o marcador GM130 Golgi está em verde. (B) Montagem a partir de experimentos de imagem ao vivo em células HEK293A superexpressando transitoriamente mCherry-3xFLAG-ATG9A. N denota a localização aproximada do núcleo. Período de tempo = 1 fps. Barra de escala = 10 μm. O mCherry-3xFLAG-ATG9A está em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este estudo ilustra as várias ferramentas que podem ser usadas para investigar a localização da ATG9A. Primeiramente, este estudo descreve como a ATG9A pode ser visualizada por imunofluorescência e como esta pode ser quantificada. Em segundo lugar, são comparadas estratégias que podem ser usadas para marcar ATG9A com um marcador fluorescente para visualização em células fixas ou vivas. Finalmente, este trabalho descreve como investigar e usar o estado de glicosilação de ATG9A para determinar se ATG9A saiu do RE e trafegou através do Golgi.
Em relação à caracterização da localização endógena de ATG9A por imunofluorescência, deve-se ter cuidado com os métodos de fixação e permeabilização empregados no experimento. De acordo com os procedimentos padrão aqui descritos, a fixação do paraformaldeído associada à permeabilização da digitonina são boas condições para visualizar tanto as vesículas ATG9A associadas a Golgi quanto as positivas para ATG9A7. Juntamente com a fixação e permeabilização, o momento da incubação com a solução de anticorpos primários também é crítico. Observamos, mas não documentamos, que concentrações mais altas de solução de anticorpos primários e tempos de incubação mais longos podem levar a um aumento deturpado na coloração de Golgi de ATG9A, o que eventualmente compromete a detecção de redistribuição de ATG9A para outros compartimentos da membrana. Além disso, como a ATG9A está presente em muitos compartimentos intracelulares 1,13,17,22,23,24,27,28, é importante a utilização de marcadores de membrana específicos, juntamente com a ATG9A, para identificar onde a ATG9A está localizada. Várias abordagens foram usadas no passado para quantificar a localização de ATG9A, incluindo o coeficiente de correlação de Pearson para colocalização29. Entretanto, a sobreposição parcial do ATG9A com o Golgi e o compartimento vesicular distinto leva a um elevado número de outliers de pixels, o que pode enviesar a interpretação do coeficiente de correlação. Por esta razão, uma abordagem mais simplista baseada na razão da fluorescência média nos dois compartimentos a serem analisados é preferível, e essa abordagem é menos sensível à variabilidade célula a célula. Para maiores informações sobre análise de imagens através de microscopia, os leitores são direcionados para este livro capítulo30.
Ao investigar o estado de glicosilação de ATG9A, a seleção de géis para executar os western blots é importante. Para este protocolo, géis de Tris-acetato 3%-8% são preferidos porque oferecem a mais alta resolução para proteínas maiores, mas composições alternativas de gel ou tampões de corrida que oferecem uma boa separação de proteínas de alto peso molecular também podem ser usados. O experimentador pode garantir a separação máxima das proteínas aumentando o tempo de eletroforese.
Ao preparar as amostras para visualizar ATG9A no western blot, deve-se tomar cuidado para não ferver as amostras após a adição do tampão Laemmli; a ebulição a 95 °C induz a formação de agregados de ATG9A e, posteriormente, ATG9A não migra eficientemente para o gel1. Recomenda-se o aquecimento das amostras a 65 °C durante 5 min27.
Altos níveis de transfecção geralmente levam a maior acúmulo de ATG9A no RE, enquanto níveis moderados de expressão auxiliam na localização fisiológica da proteína. Curiosamente, tempos de incubação de 72 h em vez de 48 h geralmente ajudam a reduzir os artefatos de localização de RE. Notavelmente, o mRFP-ATG9A pode relatar com precisão o tráfego e a função de ATG9A se os níveis forem controlados através de níveis de expressão ou usando linhagens celulares estáveis 8,9,22,27.
A falha de uma população de ATG9A superexpressa em adquirir glicanos maduros ligados a N pode ser usada como uma leitura para o tráfico perturbado de ATG9A. Ao mutar ou excluir certas regiões de ATG9A, há um risco de aumento da retenção de RE, o que pode levar à falha em adquirir glicanos N-ligados maduros e, portanto, uma banda ATG9A de migração mais rápida no western blot. Os pesquisadores que trabalham com construções ATG9A truncadas devem verificar a retenção de RE, estados de glicosilação e localização de Golgi.
Para a imagem de células vivas do ATG9A, um microscópio Airyscan, contando com a função Airyscan rápida, fornece resolução ideal de tipicamente cerca de 120 nm. Para precisão de localização, as taxas de quadros de cerca de 1-2 quadros por segundo (fps) no modo de super-resolução são ideais, dependendo de quantos canais são fotografados. Microscópios confocais semelhantes que podem obter imagens em alta velocidade também podem ser usados para a obtenção de imagens de vesículas ATG9A; Entretanto, deve-se ressaltar que a velocidade da imagem pode afetar diretamente a detecção de eventos e, portanto, afetar a interpretação dos dados.
Em resumo, os protocolos apresentados descrevem maneiras de quantificar e caracterizar a localização de ATG9A por imunofluorescência, microscopia de células vivas e seu status de glicosilação. Esses protocolos podem ajudar os pesquisadores que trabalham com ATG9A e ajudar a evitar algumas armadilhas.
Disclosures
S.A.T. faz parte do conselho consultivo científico da Casma Therapeutics.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Rocco D'Antuono pela revisão dos aspectos do manuscrito, bem como a todos os membros atuais e passados do laboratório de Biologia Celular Molecular da Autofagia (MCBA) pelas discussões que levaram ao refinamento desses protocolos. A. v.V., S.d.T., E.A., S.A.T, foram apoiados pelo The Francis Crick Institute, que recebe seu financiamento principal da Cancer Research UK (CC2134), do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido (CC2134). Esta pesquisa foi financiada no todo ou em parte pelo Wellcome Trust (CC2134). Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença pública de direitos autorais CC BY a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
| 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 60 mm tissue culture dish | Thermofisher Scientific | 10099170 | For tissue culture |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofisher Scientific | A22287 | Actin stain |
| anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
| anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
| anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
| ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
| ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Bemis Parafilm | Thermofisher Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
| CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
| D-Glucose | / | For EBSS | |
| Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
| DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
| eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
| FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
| Hoechst | Thermofisher Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
| KCl | / | For EBSS | |
| L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
| LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
| MgCl2 | / | For PBS | |
| MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
| Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
| NaCl | / | For EBSS | |
| NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
| NaHCO3 | / | For EBSS | |
| NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofisher Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermofisher Scientific | 31985062 | For Cell Transfection |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
| pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
| PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
| Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
| Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
| RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Triton X-100 | Thermofisher Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
| Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
| Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |
References
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