Summary
本研究描述了基于脱细胞的方法，用于通过完整的肌肉体积可视化和量化肌内脂肪组织 （IMAT） 沉积，以及量化构成 IMAT 的单个脂肪细胞的指标。
Abstract
脂肪浸润是骨骼肌肌纤维之间脂肪细胞的积累，是许多肌病、代谢紊乱和营养不良的突出特征。在临床上，在人群中，脂肪浸润使用非侵入性方法进行评估，包括计算机断层扫描 （CT）、磁共振成像 （MRI） 和超声 （US）。尽管一些研究使用CT或MRI来量化小鼠肌肉中的脂肪浸润，但成本和空间分辨率不足仍然具有挑战性。其他小动物方法利用组织学来可视化单个脂肪细胞;然而，这种方法在异质性病理学中存在抽样偏倚。该协议描述了使用脱细胞在整个完整小鼠肌肉和单个脂肪细胞水平上定性地观察和定量测量脂肪浸润的方法。该方案不限于特定肌肉或特定物种，可以扩展到人体活检。此外，可以使用标准实验室设备以很少的成本进行总体定性和定量评估，使该程序在研究实验室中更容易获得。
Introduction
骨骼肌内肌纤维之间脂肪细胞的积累是不同疾病的突出特征，从 2 型糖尿病到肌肉减少症再到肌肉骨骼损伤 1,2,3,4,5,6,7。对这种肌内脂肪组织 （IMAT） 的综合评估对于了解这些疾病的发病机制至关重要，因为 IMAT 沉积与胰岛素抵抗 3、8、9、10 和骨骼肌功能差密切相关11、12、13、14、15.尽管这些关联已经存在了几十年，但与IMAT相关的机制和起源仍然是一个需要深入研究的领域。这在一定程度上是因为大多数评估骨骼肌脂肪浸润的研究都是在人类中进行的，其中机制研究有限16,17。然而，最近，包括小鼠在内的小动物模型已被用于帮助确定 IMAT 发育和信号传导的细胞调节18,19,20。这项工作旨在提供一种用于小动物模型的新工具，用于定性可视化和量化骨骼肌脂肪浸润。
在临床上，使用非侵入性方法评估脂肪浸润，包括计算机断层扫描 （CT）6,21、磁共振成像 （MRI）16、17、22、23 和超声 （US）17,24。这些成像技术通常识别肌肉中定义的感兴趣区域 （ROI） 并获取该区域内的图像切片，尽管也采用了综合方法25,26,27。这些图像切片经过定性分级6 并通过像素阈值 28 进行量化。类似的方法以前在动物中使用过29,30;然而，它们成本高昂，并且需要使用小动物成像系统。通过使用 CT 和 MRI 进行空间分辨率也是一个主要问题，因为它们无法在体素内将 IMAT 脂肪细胞与骨骼肌纤维区分开来，而是依赖于主要肌肉区域和主要 IMAT 区域的主观分离31,32。因此，无法准确识别脂肪或肌肉组织也导致这些组织的代表性定量不准确。
由于这些局限性，目前评估小动物模型中骨骼肌脂肪浸润的技术通常依赖于组织学作为一种廉价且可获得的替代方案33,34。标准染色程序，包括苏木精和伊红 （H&E）、油红 O （ORO） 和脂肪细胞标志物（如周脂）的免疫染色，可以简单检测和可视化脂肪细胞，包括肌肉内的脂肪浸润。然而，组织学方法很少是全面的，通常，IMAT定性或定量评估仅限于单个第34节。脂质提取也已用于量化总肌脂35;然而，该技术无法区分肌细胞内脂质 （IMCL） 和肌内脂肪组织 （IMAT） 存储36。总之，目前可视化和量化肌肉中脂肪的方法仍然受到财务成本或IMAT特定检测的限制。
在这里，我们描述了一种通过定性可视化和多尺度定量评估骨骼肌脂肪浸润的详细方法。该方法采用简单的脱细胞技术，去除肌细胞结构，包括IMCL，但保持较大的IMAT脂肪细胞衍生的脂滴完整。该技术特异性的验证已发表37，包括使用脂质提取显示脱细胞后 IMCL 的消耗，μCT 显示脱细胞后 IMAT 模式的保留，以及组织学显示 IMAT 脂滴的大小分布与脱细胞识别的脂滴相似。脱细胞后，可以用脂溶性染料对肌肉进行染色，以定性观察模式和脂肪浸润程度和/或单个IMAT脂滴的定量成像。随后可以用异丙醇提取染料，所得溶液的光密度（OD）可用于估计IMAT脂质体积。该技术的严格验证已在其他地方发表37.本文提供了将此方法用于小鼠肌肉的详细方案，并提供了故障排除提示，以支持该方法在其他应用中的采用，例如来自其他物种或其他组织的肌肉。
Protocol
小鼠的护理和处死是按照美国国立卫生研究院实验动物使用和护理指南进行的。所有工作都得到了圣路易斯医学院华盛顿大学动物研究委员会的批准。使用2-3个月的雄性C57BL / 6J小鼠（参见 材料表）生成该协议中包含的示例图像。下面描述的所有步骤都在室温下进行。
1.肌肉脱细胞
- 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备1%w / v十二烷基硫酸钠（SDS;参见 材料表）溶液。搅拌溶液直至完全混合。
注：1%SDS可以散装制备，并在室温下储存1个月。 - 如前所述解剖感兴趣的肌肉38,39。
- 用70%乙醇溶液润湿头发和皮肤，然后做一个约2厘米的经皮切口，然后用镊子和弹簧剪刀去除覆盖的皮肤，暴露感兴趣的肌肉。
注意：这里感兴趣的肌肉包括胫骨前肌 （TA）、趾长伸肌 （EDL） 和膈肌。一些肌肉可能位于其他肌肉组织的深处，需要解剖其他肌肉（例如，解剖 EDL 需要切除 TA）。 - 使用锋利的剪刀或刀片解剖感兴趣的肌肉（参见 材料表），以确保获得肌肉的整个范围并且边缘光滑。
注意：理想情况下，这是在解剖显微镜下完成的，以改善可视化。 - 检查肌肉以确保没有骨屑或粗糙的边缘，然后根据需要用锋利的剪刀修剪掉这些。
- 使用分析天平称量肌肉并记录重量。
- 用70%乙醇溶液润湿头发和皮肤，然后做一个约2厘米的经皮切口，然后用镊子和弹簧剪刀去除覆盖的皮肤，暴露感兴趣的肌肉。
- 将解剖的肌肉置于每毫克体重至少 0.1 mL 的 1% SDS 中;6、12 或 24 孔板分别适用于隔膜、TA 和 EDL 小鼠肌肉。6 孔板、12 孔板和 24 孔板的典型体积分别为 6 mL、3 mL 和 1.5 mL。
注意：SDS 溶液有时会导致肌肉变形，因此请确保肌肉在初始浸泡时是平坦/伸展的。 - 将孔板（或其他容器）放在设置为 50-80 Hz 的摇摆器上。
- 定期目视检查SDS溶液。当溶液变得浑浊时，用移液管取出溶液（注意不要吸出肌肉），并用等体积的新鲜1%SDS代替。当溶液保持透明24小时时，脱细胞完成。
注意：溶液变化所需的频率因肌肉大小和初始溶液体积而异。像 TA 这样的较大肌肉在几个小时内需要新的 SDS，而像 EDL 这样的较小肌肉可以在原始解决方案中过夜。 - 用移液管从脱细胞肌肉中取出最终的SDS溶液（注意不要吸出肌肉），并用等体积的PBS代替。
- 在解剖显微镜下目视检查脱细胞肌肉，并使用镊子和剪刀去除粘在肌肉上的任何毛发或碎屑。
注意：另外，请注意此步骤中脱细胞肌肉的清晰度。如果脱细胞肌肉不完全透明，并且SDS溶液在24小时内没有增加浑浊度，则脱细胞无效。这在定性和定量评估中产生了伪影，因此在进行实验肌肉之前，应始终对练习样品进行脱细胞优化。 - 小心地除去PBS，用等体积的3.7%甲醛或4%多聚甲醛溶液代替，并将板放回摇床24小时。
注意：确保甲醛溶液完全覆盖脱细胞肌肉，否则染色会不均匀。
2. 用油红O可视化IMAT
- 准备ORO溶液。
- 将 0.5 g ORO 粉末（参见 材料表）溶解在 100 mL 异丙醇中以生成储备溶液。
注意：向溶液中加入温和的热量以使其完全溶解。该库存可在室温下储存 1 个月。 - 将ORO储备溶液和去离子水以60：40的比例混合，以使用至少0.1mL / mg肌肉重量的体积获得所有肌肉所需的工作溶液。6 孔板、12 孔板和 24 孔板的典型体积分别为 6 mL、3 mL 和 1.5 mL。
注意： 混合前检查储备溶液。如果储备溶液含有大量颗粒，请制作新鲜的储备。 - 盖上工作溶液 10 分钟，让颗粒沉降。
- 通过40μm网过滤工作溶液，然后用0.22μm注射器过滤器过滤。
注意：0.22 μm 注射器过滤器会迅速堵塞，如果工作溶液不容易通过，则必须更换。
- 将 0.5 g ORO 粉末（参见 材料表）溶解在 100 mL 异丙醇中以生成储备溶液。
- 除去甲醛或多聚甲醛溶液，并用等体积PBS的三次溶液变化洗涤脱细胞肌肉。
- 用等体积的60%异丙醇溶液替换PBS，并在摇床上孵育5分钟。
- 用ORO工作溶液代替60%异丙醇溶液，并在振荡器上孵育10分钟。
注意：确保ORO工作溶液完全覆盖脱细胞肌肉，否则染色将不均匀。 - 用等体积的1%SDS代替ORO工作溶液。定期目视检查SDS溶液。当溶液明显变成粉红色时，用移液管取出溶液（注意不要吸出肌肉）并用新鲜的1%SDS代替。
- 当溶液保持透明24小时时，用PBS替换1%SDS，并在4倍放大倍率的解剖/立体显微镜下检查染色的肌肉。清除粘在肌肉外侧的任何明显碎屑或颗粒。如果这是广泛的，可以在清洁纸上轻轻滚动脱细胞的肌肉以去除碎屑/颗粒。
- 如果染色令人满意（鲜红色球体漂浮在透明基质中），则使用连接到立体显微镜的相机根据需要获取染色图像（参见 材料表）。
注意： 如果解剖显微镜没有连接摄像头，则可以使用手机摄像头通过目镜拍照。
3. 使用BODIPY可视化IMAT脂滴
注意：共聚焦成像对 EDL 或隔膜（~2 mm 厚度）等薄肌肉最有效。或者，可以使用类似厚度的肌肉条，如 TA。
- 在PBS中制备1：200荧光BODIPY 493/503溶液（参见 材料表），以获得至少0.1mL / mg肌肉重量的工作溶液体积。6 孔板、12 孔板和 24 孔板的典型体积分别为 6 mL、3 mL 和 1.5 mL。
- 除去甲醛，多聚甲醛或1%SDS，并用等体积PBS的三次溶液变化洗涤脱细胞肌肉。
- 用BODIPY工作溶液替换PBS，并在振荡器上孵育20分钟。
- 用等体积的PBS的三次溶液变化洗涤脱细胞肌肉。
- 将肌肉置于与可用共聚焦显微镜兼容的透明底部血管中。理想情况下，培养皿将有一个凹陷的底部，以便在肌肉上放置盖玻片而不会使其变形（参见 材料表）。
- 使用488激光器使用标准共聚焦显微镜（参见 材料表）获得图像堆栈。EDL 的典型堆栈尺寸为 0.5-1 mm，切片厚度为 10 μm，每个堆栈可生成 50-100 个图像。
注：为了量化总脂质体积、IMAT 脂滴总数和聚类的最近邻指数，通过整个肌肉体积成像，注意为图像配准留出一些重叠。为了量化平均脂滴体积，一个堆栈可能就足够了。 - 如果需要，根据第 2 节用 ORO 染色肌肉，以获得 IMAT 分布的免费全肌肉图像。
注意：由于BODIPY是荧光的，因此在获取ORO图像时，在光学显微镜下将不可见。
4. 通过脂质提取估算总脂质体积
- 图像采集后，将肌肉转移到 96 孔板的单个孔中的 200 μL 异丙醇中，或者如果肌肉太大而无法适应，则调整孔/体积。
- 通过敲击板，上下移液溶液和/或用移液器吸头机械粉碎肌肉来搅拌溶液，直到在显微镜下在脱细胞肌肉中看不到红色/荧光球体。
注意：用敲击、移液和挤压的相同组合处理所有肌肉，以获得最佳可靠性。此外，请注意限制敲击、移液和压碎所花费的时间，因为异丙醇会迅速蒸发。 - 通过上下移液在每个孔中混合溶液，然后将 75 μL 转移到板的两个干净孔中。
- 盖上板并使用分光光度计或酶标仪读取重复的 75 μL 孔的吸光度。如果构建体用 ORO 染色，则在 500 nm 处读取溶液;如果用 BODIPY 493/503 染色，则读取 493 nm 的板。
注意：如果构建体同时用 BODIPY 和 ORO 染色，建议在 500 nm 处读取板，因为 500 nm 读取在仅用 ORO 染色的构建体和 ORO 加 BODIPY 之间产生相似的结果。 - 如果需要，将吸光度读数除以记录的肌肉重量，以校正样品之间的大小差异。
5. 共聚焦图像中IMAT脂滴指标的量化
注意：本部分需要访问 ImageJ 版本 1.47（参见 材料表）或更高版本以及基本的 ImageJ 技能40。
- 在 ImageJ 中打开共聚焦堆栈。
注意：不同的共聚焦显微镜可能会以不同的格式保存共聚焦图像。ImageJ 可能需要额外的插件或变体，例如 Fiji，才能打开堆栈41。使用的算法是 ImageJ 软件包的一部分。 - 在 ImageJ 中运行阈值算法以识别 BODIPY 正像素。这会将当前图像转换为二进制图像。
- 通过选择 “图像”>“调整阈值”>打开阈值用户界面。在用户界面中，选择 “Intermodes ”作为阈值类型，并确保选择 “深色背景 ”。无需选择其他选项。然后单击 “应用”。
- 将打开一个对话框，将堆栈转换为二进制。确保它选择了以下选项：方法：Intermodes;背景：黑暗。计算每个图像和黑色背景（二进制掩码）的阈值。这将生成一个二进制堆栈，其中白色表示 BODIPY 正像素，黑色表示 BODIPY 负像素。
注意： Intermodes 阈值算法可能不是所有用户的最佳选择。对 ImageJ 内置阈值选项的主观检查有助于选择分离 BODIPY 正负像素的最佳算法。
- 在 ImageJ 中运行 Watershed 算法以分离接触的脂滴。选择 “处理”>“二进制>分水岭”。将打开一个对话框，询问是否应处理堆栈中的所有图像。选择 “是”。这增加了细黑线，划分了较大的纯白色区域。
- 使用 ImageJ 中的“分析粒子”算法确定 ROI。
- 选择 “分析”（Analyze>“分析粒子”（Analyze Particles）。将打开一个对话框，用于设置选择设置。
注：选择大小范围对于实现脂滴 ROI 的最佳估计至关重要。下限消除了可能太小而无法成为 IMAT 衍生的脂滴的区域（背景伪影），而上限消除了可能太大而无法成为单个 IMAT 衍生脂滴的区域（接触未被分水岭算法分离的脂滴）。 - 要设置这些值，请打开原始图像并使用椭圆形工具勾勒出视图中最小和最大的脂滴。然后，通过键入“t”将这些形状添加到 ROI 管理器中。选择 “分析”，然后选择 “设置测量”。将打开一个对话框，用于选择设置。
- 选中“仅 区域 ”，然后单击 “确定”。然后，从 ROI 管理器中选择 “度量 ”。使用此结果窗口中的两个面积测量值作为“分析粒子”中的大小范围。
- 确保选中 Add to Manager 。不需要其他选项。
- 选择 “分析”（Analyze>“分析粒子”（Analyze Particles）。将打开一个对话框，用于设置选择设置。
- 通过选中 ROI 管理器中的 “全部显示” ，将 ROI 叠加在共聚焦堆栈上。使用滑块单独检查每个堆栈切片，并使用椭圆形工具（位于 ImageJ 工具栏中）手动添加缺失区域。
- 输出 ROI 测量值。选择 “分析”>“设置测量 ”，然后选择 “面积”、“质心”、“拟合椭圆 ”和 “堆叠位置”。单击 “确定”。然后，从 ROI 管理器中选择 “度量 ”。可以选择“结果”表中的数据并将其复制到 Matlab 或 Excel 中，以便进一步分析。
- 使用 Refine.m Matlab 代码37 或类似算法将每个堆栈中的 ROI 细化为单个 ROI。
注意：此步骤是必需的，因为步骤 5.2-5.4 将相邻切片中的相同脂滴识别为不同的 ROI。但是，也可以仅手动识别 ROI，也可以在 ImageJ 中手动消除重复的 ROI，以避免对 Matlab 的需求。 - 使用Matlab或Excel获取ROI中的汇总统计信息。
- 将脂滴总数估计为 ROI 总数。
- 假设形状的深度是椭圆长轴和短轴的平均值，则将脂滴体积估计为拟合到每个 2D ROI 的椭圆的体积。
- 估计总脂质体积，即单个估计脂滴体积的总和。
Representative Results
骨骼肌脂肪浸润的定性可视化
适当脱细胞的肌肉是白色和半透明的（第 1 节; 图1）。当用ORO染色脱细胞肌肉以可视化IMAT（第2节）时，IMAT脂滴在透明肌肉结构中明显为红色球体（图1）。健康的小鼠后肢肌肉几乎没有天然的IMAT，几乎没有红色的ORO阳性脂质（图1A）。相比之下，后肢肌肉注射了心肌毒素（CTX; 图1B）或甘油（GLY; 图1C）脱细胞前 14 天 IMAT 积累增加，如前所述，CTX 后 IMAT 浓度高于 GLY37。
在初始SDS处理后或ORO染色洗脱后，可以立即识别出不完全脱细胞，为半不透明的浅粉红色纤维（图2B与图2A相比）。ORO洗脱后，ORO的不完全清除可以识别为粉红色或红色的均匀背景，而不是明显的纤维线（图2C）。图2A，B还包含肌外脂肪（星号），这是脱细胞肌肉外的一团脂滴。图2C还演示了在脱细胞过程中肌肉未展开时可能发生的肌肉折叠。不完全脱细胞、不完全 ORO 清除和残留的肌外脂肪都会人为地增加提取脂质的 （OD），但如果将它们识别为伪影，则不一定妨碍脂肪浸润的定性评估。
骨骼肌脂肪浸润的定量成像
BODIPY荧光标记的脂滴 可以通过 共聚焦显微镜成像，以更详细地评估单个脂滴指标和分布（图3）。如前所述，此过程是半自动化的，包括 Matlab 代码37。当在平面上成像时，良好的BODIPY染色会产生明亮的椭圆形，与相邻形状划定（图3A）。阈值和形状分割为生成每个脂滴的ROI提供了良好的第一步（图3B），但需要手动编辑来纠正错误。最普遍的错误是脂滴在组织深处，因此在任何切片上都不亮（图3B;粉红色双箭头）。这可以通过使用 ImageJ 中的椭圆形工具手动添加 ROI 来补救（图 3C）。第二种是将一组脂滴识别为单个ROI（图3B;红色星号）。这可以通过删除原始 ROI 并用多个新的 ROI 替换来纠正（图 3D）。最后，单个脂滴在多个切片中被识别为唯一的ROI，因此必须将重复的ROI合并为单个ROI（图3E;蓝色箭头）。使用Matlab等数据处理工具最容易完成此操作，但也可以通过确定最大的ROI并删除其余的ROI来手动完成。C57BL6/J 和 129Sv 小鼠中每个指标的平均值可以在 Biltz 等人 37 中找到。
图 1：脱细胞肌肉的油红 O （ORO） 染色示例。 注射生理盐水 （SAL）、心脏毒素 （CTX） 或甘油 （GLY） 后 14 天对 ORO 染色的肌肉进行染色。小鼠趾长伸肌 （EDL） 和胫骨前肌 （TA） 在 SAL 治疗 （A） 中几乎没有 IMAT（红色球体），但在 CTX （B） 和 GLY （C） 治疗下积累 IMAT。完全脱细胞和 ORO 清除，透明白色肌肉背景中明显的 ORO 阳性脂滴证明了这一点。比例尺 = 500 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：ORO 染色结果不佳的示例。 不完全脱细胞或不完全的ORO清除导致半不透明的粉红色/红色背景。与完全脱细胞小鼠膈肌的透明白色背景（A）相比，不完全脱细胞的特征是浅粉色/红色纤维痕迹（B），不完全ORO清除的特征是弥漫的粉红色/红色背景（C）。比例尺：上面板 = 1 mm;下面板 = 500 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用荧光 BODIPY 染色和共聚焦显微镜鉴定单个脂滴的示例 使用共聚焦显微镜可以在脱细胞肌肉中识别和定量单个 BODIPY 染色的脂滴。通过共聚焦堆栈的单个切片将平面上的脂滴显示为亮绿色椭圆，平面外的脂滴显示为较暗的形状（A;蓝色箭头）。阈值与流域对象分割和 ROI 识别相结合，可以映射 BODIPY 染色的 ROI （B）。阈值可能会遗漏一些较暗的脂滴（B;粉红色双箭头），需要手动识别（C）。分水岭分割可能会将几个脂滴组合在一起（B;红色星号），需要删除ROI并手动重新估计（D）。在多个切片中识别相同的脂滴，需要图像配准 （E） 以删除重复的 ROI。比例尺 = 100 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
本手稿描述了在小动物模型中定性可视化和量化骨骼肌脂肪浸润的方法，可用于进一步了解肌内脂肪组织 （IMAT） 发育和病理扩张的发病机制。使用全肌肉脱细胞和脂溶性染色可以采用一种经济高效、可重复且简单的方法来全面评估整个肌肉中 IMAT 的存在。
该协议的基础是用SDS去除肌肉的细胞化去除肌纤维的细胞成分，包括IMCL的小脂滴，但保留肌细胞内脂肪细胞中的大脂滴。SDS 已在组织工程中广泛使用42 以使基质脱细胞。脂肪和骨骼肌等组织通常需要额外的机械解离和/或酒精提取，以去除残留的脂肪细胞脂质42,43。我们之前已经证明，这是因为虽然用 SDS 脱细胞消除了 IMCL，但它保留了脂肪细胞中的大脂滴37。用μCT对脱细胞前后四氧化锇染色的完整肌肉进行成像，证实IMAT的空间模式未被脱细胞破坏。此外，IMAT可忽略不计的脱细胞肌肉中的肌内甘油三酯定量为完整肌肉值的~5%，验证了IMCL的去除。因此，这种方法通过半透明的肌肉基质保留了IMAT脂滴的原始解剖分布。
适当的脱细胞是该协议中最关键的步骤。如果脱细胞不完全，IMAT脂滴将难以观察，残留的IMCL将导致ORO或BODIPY的高背景染色（图2）。没有经验的用户的常见错误是每块肌肉（在每个孔内）的 SDS 覆盖不足，因此每块肌肉都没有完全被 SDS 溶液覆盖，在脱细胞过程中没有使用摇杆搅拌溶液，并且没有足够频繁地进行溶液更换。在这份手稿中，我们推荐了每单位肌肉质量所需的 SDS 量，但用户仍然需要确保肌肉完全被溶液覆盖，因为每块肌肉都有独特的几何形状。还建议用户自由地更换溶液（每天最多两次），以确保脱细胞完全。经过长达 4 天的 SDS 处理后，已实现 IMAT 脂滴的良好染色质量。为了获得高质量的ORO染色结果，充分的固定和ORO溶液制备也很重要。与上述 SDS 处理类似，每个肌肉样本需要充分覆盖 3.7% 甲醛溶液。如果过早地将肌肉从固定剂中取出，脂滴只会微弱地沾染 ORO。总共1-2小时就足够了，但建议过夜固定，以确保固定剂渗透到肌肉中心并完全固定所有脂滴。ORO染色的另一个挑战是，当酒精浓度降低到60%时，开始形成颗粒。这种颗粒会沉积在表面并卡在肌肉边缘。避免这种情况的最佳方法是为每次染色配制新的工作溶液，并使用 40 目 μm 和 0.22 μm 过滤器。然后，用摇杆保持搅拌并将染色时间限制在 10 分钟将有助于防止形成的任何颗粒沉降。如果问题仍然存在，制作新的 ORO 储备溶液可能会有所帮助。如果一些伪影仍然粘在脱细胞的肌肉表面，可以使用立体显微镜、镊子和手术剪刀来去除该伪影。未能消除伪影将影响肌肉的图像质量，并在准备OD读数的脂质提取部分高估IMAT含量。
总体而言，该技术简单明了，与可视化和量化骨骼肌脂肪浸润的金标准方法相比，具有多项优势。CT、MRI 和超声等非侵入性技术广泛用于人类，有时也用于动物模型，其空间分辨率有限，无法区分脂滴和肌纤维。因此，中间信号强度的像素或体素被指定为“肌肉”或“脂肪”，而实际上它可能是肌纤维和脂肪细胞的混合物。更常见的是，动物肌肉中的脂肪浸润通过组织学评估，最常见的是肌肉冷冻切片中的 ORO。然而，这通常只在单个代表性切片中进行，并且由于脂质散布在切片上而难以量化。相比之下，整个脱细胞肌肉的ORO染色提供了对IMAT的全面评估，其成本和工作量与完整形态相似。此外，除了增强可视化外，脱细胞的ORO染色还可以通过脂质提取来量化脂肪浸润。为了更深入地研究脂肪浸润的特征，荧光染色剂BODIPY可以与共聚焦显微镜结合使用。这使得单个IMAT脂滴的重建能够绘制3D景观，这在组织学中是不可能的，除非在肌肉长度上分析切片。虽然共聚焦显微镜不是标准的实验室设备，但与小动物MRI或CT相比，它更有可能在大学或工业环境中使用。此外，该过程的大部分可以自动化，与序贯组织学相比，减少了时间成本。优化共聚焦显微镜上的设置是BODIPY染色的另一个考虑因素。这些是每个显微镜所独有的。临界值是激光强度，它必须足够高，以检测肌肉远处表面的脂滴，同时也不会使近侧脂滴的信号饱和。因此，建议使用共聚焦显微镜的BODIPY染色最适合较薄的肌肉，包括EDL或横膈膜。
这种方法的几个局限性值得讨论。首先，虽然预计该技术在小鼠损伤模型（心脏毒素和甘油）之外具有广泛的适用性，但新的应用（例如，mdx模型）可能需要优化，因为肌肉的大小和组成（例如，纤维化）可能会影响脱细胞，需要增加SDS浓度或孵育时间。其他肌肉质量改变的疾病模型还需要分析脂肪浸润的绝对和标准化（肌肉质量）指标，以确定脂质的绝对量或脂质相对于肌肉体积的百分比，以提供更有意义的结果测量。此外，该技术预计将广泛适用于大型动物模型和人体活检，但这可能需要针对每个新应用进行优化。其次，在这种策略中，整个肌肉必须专用于该测定，不能用于评估其他病理特征。旨在评估IMAT纵向变化的研究最好使用无创成像技术，而主要目的需要肌肉用于其他目的（组织学、定量聚合酶链反应、蛋白质印迹）的研究更适合组织学评估，因为冷冻肌肉的其余部分可以分配给其他测定。然而，该测定非常适合与 体内 测试配对，例如跑步机跑步或 离体 收缩测试，因为这些措施可以在脱细胞之前进行44。第三，尽管将BODIPY染色与共聚焦显微镜结合使用可提供脂滴的高分辨率可视化和定量，但由于细胞膜被去除并且内源性脂肪细胞蛋白丢失，因此无法最终将脂滴识别为单个脂肪细胞。多房脂肪细胞，代表未成熟的脂肪细胞或“棕色/米色”表型，可被识别为多个脂滴。最后，该协议在以前冻结的肌肉上效果不佳。这些局限性对于人体活检来说可能是最深刻的，因为虽然整个活检可以脱细胞，但活检中IMAT的空间分布不太可能比组织学切片更能代表整个肌肉。然而，由于该技术对未冷冻的活检处理条件（例如，在 PBS 中冰上数小时）相对不敏感，因此可以稍后将活检分为各种测定，包括用于脱细胞的部分，这将提供更好的单个脂滴分辨率。
总之，通过对脱细胞结构的残留脂质进行染色和成像，开发了一种用于骨骼肌脂肪浸润定性和定量分析的新方法。与金标准方法相比，该方法有所改进，因为它能够对肌肉内的三维脂肪浸润进行全面成像，并使用 ORO 染色进行快速、廉价的定量。为了获得更详细的测量，第二种脂溶性BODIPY染色剂可对脂滴数量、体积和分布模式进行更详细的定量分析，如共聚焦显微镜成像的那样。总之，这些措施为研究人员提供了一种在单个脂滴水平上精确测量骨骼肌脂肪浸润的方法，而无需取样或昂贵的无创成像。
Disclosures
作者没有要披露的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了 R01AR075773 to GAM 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
| 1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| 12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
| 12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
| 37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
| 40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
| 6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
| Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
| ImageJ | NIH | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
| Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |
References
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