Summary
De huidige studie beschrijft op decellularisatie gebaseerde methodologieën voor het visualiseren en kwantificeren van intramusculair vetweefsel (IMAT) afzetting door middel van intact spiervolume, evenals het kwantificeren van statistieken van individuele adipocyten waaruit IMAT bestaat.
Abstract
Vetinfiltratie is de ophoping van adipocyten tussen myovezels in skeletspieren en is een prominent kenmerk van veel myopathieën, stofwisselingsstoornissen en dystrofieën. Klinisch wordt in menselijke populaties vetinfiltratie beoordeeld met behulp van niet-invasieve methoden, waaronder computertomografie (CT), magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) en echografie (VS). Hoewel sommige onderzoeken CT of MRI hebben gebruikt om vetinfiltratie in muizenspieren te kwantificeren, blijven de kosten en onvoldoende ruimtelijke resolutie een uitdaging. Andere methoden voor kleine dieren maken gebruik van histologie om individuele adipocyten te visualiseren; Deze methodologie lijdt echter aan steekproefbias in heterogene pathologie. Dit protocol beschrijft de methodologie om vetinfiltratie kwalitatief te bekijken en kwantitatief te meten in de intacte muizenspier en op het niveau van individuele adipocyten met behulp van decellularisatie. Het protocol is niet beperkt tot specifieke spieren of specifieke soorten en kan worden uitgebreid tot menselijke biopsie. Bovendien kunnen grove kwalitatieve en kwantitatieve beoordelingen worden gemaakt met standaard laboratoriumapparatuur tegen lage kosten, waardoor deze procedure toegankelijker wordt voor alle onderzoekslaboratoria.
Introduction
De ophoping van adipocyten tussen myovezels in de skeletspier is een prominent kenmerk van ongelijksoortige aandoeningen, van diabetes type 2 tot sarcopenie tot musculoskeletaal letsel 1,2,3,4,5,6,7. Een uitgebreide beoordeling van dit intramusculair vetweefsel (IMAT) is van cruciaal belang om de pathogenese van deze aandoeningen te begrijpen, aangezien IMAT-afzetting sterk gecorreleerd is met insulineresistentie 3,8,9,10 en een slechte skeletspierfunctie 11,12,13,14,15 . Hoewel deze associaties al tientallen jaren worden opgemerkt, blijven de mechanismen die verband houden met en de oorsprong van IMAT nog steeds een gebied van intensief onderzoek. Dit komt deels omdat de meeste onderzoeken naar de vetinfiltratie van skeletspieren zijn uitgevoerd bij mensen, waar mechanistisch onderzoek beperkt is16,17. Meer recentelijk zijn echter kleine diermodellen, waaronder muizen, gebruikt om de cellulaire regulatie van IMAT-ontwikkeling en -signalering vast te stellen18,19,20. Dit werk heeft tot doel een nieuw hulpmiddel te bieden voor gebruik met kleine diermodellen voor het kwalitatief visualiseren en kwantificeren van vetinfiltratie in skeletspieren.
Klinisch in menselijke populaties wordt vetinfiltratie beoordeeld met behulp van niet-invasieve methoden, waaronder computertomografie (CT)6,21, magnetische resonantiebeeldvorming (MRI)16,17,22,23 en echografie (VS)17,24. Deze beeldvormingstechnieken identificeren doorgaans een gedefinieerd interessegebied (ROI) in een spier en verkrijgen beeldsegmenten binnen dat gebied, hoewel er ook uitgebreide benaderingen zijn gebruikt25,26,27. Deze beeldsegmenten worden onderworpen aan kwalitatieve grading6 en gekwantificeerd via pixeldrempel28. Soortgelijke benaderingen zijn eerder gebruikt bij dieren29,30; Ze zijn echter kostbaar en vereisen toegang tot beeldvormingssystemen voor kleine dieren. Ruimtelijke resolutie via CT- en MRI-gebruik vormt ook een groot probleem, omdat ze IMAT-adipocyten niet kunnen afbakenen van skeletspiervezels in een voxel en in plaats daarvan vertrouwen op subjectieve scheiding van voornamelijk spierregio's en voornamelijk IMAT-regio's31,32. Als zodanig presenteert het onvermogen om vet- of spierweefsel nauwkeurig te identificeren ook een onnauwkeurige kwantificering van representatieve hoeveelheden van deze weefsels.
Vanwege deze beperkingen zijn de huidige technieken om vetinfiltratie van skeletspieren in kleine diermodellen te beoordelen meestal afhankelijk van histologie als een goedkoop en toegankelijk alternatief33,34. Standaard kleuringsprocedures, waaronder hematoxyline en eosine (H&E), olierode O (ORO) en immunokleuring voor adipocytmarkers zoals perilipine, maken eenvoudige detectie en visualisatie mogelijk van adipocyten die vetinfiltratie in de spier bevatten. Histologiebenaderingen zijn echter zelden alomvattend, en doorgaans is de kwalitatieve of kwantitatieve beoordeling van IMAT beperkt tot een enkele sectie34. Lipide-extractie is ook gebruikt om de totale spierlipiden te kwantificeren35; deze techniek maakt echter geen onderscheid tussen intramyocellulair lipide (IMCL) en intramusculair vetweefsel (IMAT)36. Samenvattend blijven de huidige methodologieën om vet in spieren te visualiseren en te kwantificeren beperkt door financiële kosten of de specifieke detectie van IMAT.
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor het beoordelen van vetinfiltratie van skeletspieren, zowel door kwalitatieve visualisatie als kwantificering op meerdere schalen. Deze methodologie maakt gebruik van een eenvoudige decellularisatietechniek die myocellulaire structuren, waaronder IMCL, verwijdert, maar de grotere IMAT-adipocyt-afgeleide lipidedruppeltjes intact houdt. Validatie van de specificiteit van deze techniek is gepubliceerd37, waaronder het gebruik van lipide-extractie om de depletie van IMCL met decellularisatie aan te tonen, μCT om het behoud van IMAT-patronen met decellularisatie aan te tonen, en histologie om de vergelijkbare grootteverdeling van IMAT-lipidedruppeltjes aan te tonen in vergelijking met die geïdentificeerd met decellularisatie. Eenmaal gedecellulariseerd, kunnen spieren worden gekleurd met in vet oplosbare kleurstoffen voor kwalitatieve visualisatie van het patroon en de mate van vetinfiltratie en/of kwantitatieve beeldvorming van individuele IMAT-lipidedruppeltjes. Kleurstoffen kunnen vervolgens worden geëxtraheerd met isopropanol en de optische dichtheid (OD) van de resulterende oplossing kan worden gebruikt om het IMAT-lipidenvolume te schatten. De strenge validatie van deze techniek is elders gepubliceerd37. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het gebruik van deze methodologie met muisspieren en geeft tips voor het oplossen van problemen ter ondersteuning van de toepassing van deze methode in andere toepassingen, zoals spieren van andere soorten of andere weefsels.
Protocol
De verzorging en opoffering van muizen werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Use and Care of Laboratory Animals. Al het werk werd goedgekeurd door de Animal Studies Committee van de Washington University in de St. Louis School of Medicine. Mannelijke C57BL/6J-muizen van 2-3 maanden oud (zie Materiaaltabel) werden gebruikt om de voorbeeldafbeeldingen in dit protocol te genereren. Alle hieronder beschreven stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
1. Spier decellularisatie
- Bereid een oplossing van 1% natriumdodecylsulfaat (SDS; zie materiaaltabel) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Roer de oplossing tot het volledig gemengd is.
OPMERKING: 1% SDS kan in bulk worden bereid en gedurende 1 maand bij kamertemperatuur worden bewaard. - Ontleed de spier(en) van belang zoals eerder beschreven38,39.
- Stel de betreffende spieren bloot door het haar en de huid nat te maken met een 70% ethanoloplossing en vervolgens een transcutane incisie van ongeveer 2 cm te maken, gevolgd door het verwijderen van de bedekkende huid met een tang en een veerschaar.
OPMERKING: De spier(en) die hier van belang zijn, zijn de tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL) en het middenrif. Sommige spieren kunnen diep in andere spieren liggen, waardoor dissectie van andere spieren nodig is (bijv. het ontleden van de EDL vereist verwijdering van de TA). - Ontleed de spier(en) van belang met een scherpe schaar of mesjes (zie Materiaaltabel) om ervoor te zorgen dat de volledige omvang van de spier wordt verkregen en de randen glad zijn.
OPMERKING: Dit wordt idealiter gedaan onder een ontleedmicroscoop om de visualisatie te verbeteren. - Inspecteer de spieren om er zeker van te zijn dat er geen botschilfers of rafelige randen in zitten en knip deze indien nodig weg met een scherpe schaar.
- Weeg de spier met behulp van een analytische balans en noteer het gewicht.
- Stel de betreffende spieren bloot door het haar en de huid nat te maken met een 70% ethanoloplossing en vervolgens een transcutane incisie van ongeveer 2 cm te maken, gevolgd door het verwijderen van de bedekkende huid met een tang en een veerschaar.
- Plaats de ontlede spier in ten minste 0,1 ml 1% SDS per milligram gewicht; Platen met 6, 12 of 24 putjes werken goed voor respectievelijk de middenrif-, TA- en EDL-muisspieren. Typische volumes zijn 6 ml, 3 ml en 1,5 ml voor respectievelijk platen met 6, 12 en 24 putjes.
NOTITIE: De SDS-oplossing zorgt er soms voor dat de spieren vervormen, dus zorg ervoor dat de spier plat/uitgestrekt is bij de eerste onderdompeling. - Plaats de putplaat (of andere vaten) op een schommelschudder die is ingesteld op 50-80 Hz.
- Inspecteer de SDS-oplossing regelmatig visueel. Wanneer de oplossing troebel wordt, verwijdert u de oplossing met een pipet (zorg ervoor dat u de spier niet opzuigt) en vervangt u deze door een gelijk volume verse 1% SDS. Wanneer de oplossing 24 uur helder blijft, is de decellularisatie voltooid.
OPMERKING: De frequentie die nodig is voor het veranderen van de oplossing is afhankelijk van de spieromvang en het initiële volume van de oplossing. Grotere spieren zoals de TA hebben binnen een paar uur een nieuwe SDS nodig, en kleinere spieren zoals de EDL kunnen 's nachts in de originele oplossing gaan. - Verwijder de uiteindelijke SDS-oplossing uit de gedecellulariseerde spieren met een pipet (zorg ervoor dat u de spier niet opzuigt) en vervang deze door een gelijk volume PBS.
- Inspecteer de gedecellulariseerde spieren visueel onder een ontleedmicroscoop en gebruik een tang en schaar om al het haar of vuil dat aan de spier vastzit te verwijderen.
OPMERKING: Let ook op de helderheid van de gedecellulariseerde spier in deze stap. Als de gedecellulariseerde spier niet volledig transparant is en de SDS-oplossing gedurende 24 uur niet in troebelheid toeneemt, was de decellularisatie niet efficiënt. Dit creëert een artefact in kwalitatieve en kwantitatieve beoordelingen, en daarom moet decellularisatie altijd worden geoptimaliseerd op oefenmonsters voordat verder wordt gegaan met experimentele spieren. - Verwijder voorzichtig de PBS, vervang deze door een gelijk volume van 3.7% formaldehyde- of 4% paraformaldehyde-oplossing en plaats de plaat gedurende 24 uur terug in de schommelschudder.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de formaldehyde-oplossing de gedecellulariseerde spier volledig bedekt, anders zal de kleuring ongelijkmatig zijn.
2. Visualisatie van IMAT met olierood O
- Bereid een oplossing van ORO.
- Los 0,5 g ORO-poeder (zie materiaaltabel) op in 100 ml isopropanol om een stockoplossing te verkrijgen.
NOTITIE: Voeg zachte warmte toe aan de oplossing om deze volledig op te lossen. Deze voorraad kan 1 maand bij kamertemperatuur bewaard worden. - Combineer de ORO-voorraadoplossing en gedeïoniseerd water in een verhouding van 60:40 om de werkoplossing te verkrijgen die nodig is voor alle spieren met een volume van ten minste 0,1 ml/mg spiergewicht. Typische volumes zijn 6 ml, 3 ml en 1,5 ml voor respectievelijk platen met 6, 12 en 24 putjes.
NOTITIE: Inspecteer de bouillonoplossing voordat u gaat mengen. Als de voorraadoplossing veel deeltjes bevat, maak dan verse bouillon. - Dek de werkoplossing gedurende 10 minuten af om het deeltje te laten bezinken.
- Filtreer de werkoplossing door een gaas van 40 μm, gevolgd door een spuitfilter van 0,22 μm.
OPMERKING: Het spuitfilter van 0,22 μm raakt snel verstopt en moet worden vervangen als de werkoplossing er niet gemakkelijk doorheen duwt.
- Los 0,5 g ORO-poeder (zie materiaaltabel) op in 100 ml isopropanol om een stockoplossing te verkrijgen.
- Verwijder de formaldehyde- of paraformaldehyde-oplossing en was de gedecellulariseerde spieren met drie oplossingswisselingen van een gelijk volume PBS.
- Vervang de PBS door een gelijk volume van 60% isopropanoloplossing en incubeer gedurende 5 minuten op een schommelschudder.
- Vervang de 60% isopropanoloplossing door ORO werkoplossing en incubeer gedurende 10 minuten op de schommelschudder.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de ORO-werkoplossing de gedecellulariseerde spier volledig bedekt, anders zal de kleuring ongelijkmatig zijn. - Vervang de ORO-werkoplossing door een gelijk volume van 1% SDS. Inspecteer de SDS-oplossing regelmatig visueel. Wanneer de oplossing merkbaar roze wordt, verwijdert u de oplossing met een pipet (zorg ervoor dat u de spier niet opzuigt) en vervangt u deze door verse 1% SDS.
- Wanneer de oplossing 24 uur helder blijft, vervangt u de 1% SDS door PBS en inspecteert u de gekleurde spier onder een ontleed-/stereomicroscoop met een vergroting van 4x. Verwijder al het voor de hand liggende vuil of deeltjes die aan de buitenkant van de spier vastzitten. Als dit uitgebreid is, kan de gedecellulariseerde spier voorzichtig op een reinigingsdoekje worden gerold om het vuil/deeltje te verwijderen.
- Als de kleuring bevredigend is (felrode bolletjes die in een transparante matrix zweven), maak dan naar wens beelden van de kleuring met behulp van een camera die op de stereomicroscoop is bevestigd (zie Materiaaltabel).
NOTITIE: Als de ontleedmicroscoop geen camera heeft, kan een telefooncamera worden gebruikt om foto's te maken door het oculair.
3. Visualisatie van IMAT-lipidedruppeltjes met BODIPY
OPMERKING: Confocale beeldvorming is het meest effectief bij dunne spieren zoals de EDL of het middenrif (~2 mm dikte). Als alternatief kunnen stroken van vergelijkbare dikte van spieren zoals de TA worden gebruikt.
- Bereid een 1:200 oplossing van fluorescerend BODIPY 493/503 (zie materiaaltabel) in PBS om een werkoplossingsvolume van ten minste 0,1 ml/mg spiergewicht te verkrijgen. Typische volumes zijn 6 ml, 3 ml en 1,5 ml voor respectievelijk platen met 6, 12 en 24 putjes.
- Verwijder de formaldehyde, paraformaldehyde of 1% SDS en was de gedecellulariseerde spieren met drie oplossingswisselingen van een gelijk volume PBS.
- Vervang de PBS door de BODIPY-werkoplossing en incubeer gedurende 20 minuten op de schommelschudder.
- Was de gedecellulariseerde spieren met drie oplossingswisselingen van een gelijk volume PBS.
- Plaats de spier in een vat met heldere bodem dat compatibel is met een beschikbare confocale microscoop. Idealiter heeft de schaal een verzonken bodem om een dekglaasje over de spier te plaatsen zonder deze te vervormen (zie Materiaaltabel).
- Verkrijg beeldstapels met een standaard confocale microscoop (zie Tabel met materialen) met behulp van de 488-laser. Typische stapelgroottes voor een EDL zijn 0,5-1 mm met een plakdikte van 10 μm, wat 50-100 afbeeldingen per stapel oplevert.
OPMERKING: Om het totale lipidenvolume, het totale aantal IMAT-lipidedruppeltjes en de dichtstbijzijnde buurindex van clustering te kwantificeren, moet u het hele spiervolume in beeld brengen en ervoor zorgen dat er enige overlap overblijft voor beeldregistratie. Om het gemiddelde volume van de lipidedruppeltjes te kwantificeren, kan één stapel voldoende zijn. - Kleur, indien gewenst, de spieren met ORO, zoals beschreven in sectie 2, voor een gratis beeld van de hele spier van IMAT-distributie.
OPMERKING: Omdat BODIPY fluorescerend is, zal het niet zichtbaar zijn onder de lichtmicroscoop wanneer beelden van ORO worden verkregen.
4. Schatting van het totale lipidenvolume door middel van lipidenextractie
- Breng na beeldacquisitie de spieren over naar 200 μL isopropanol in individuele putjes van een plaat met 96 putjes, of pas het putje/volume aan als de spier te groot is om te passen.
- Roer de oplossing door op de plaat te tikken, de oplossing op en neer te pipetteren en/of de spier mechanisch te pletten met een pipetpunt totdat er onder een microscoop geen rode/fluorescerende bolletjes meer te zien zijn in de gedecellulariseerde spier.
OPMERKING: Behandel alle spieren met dezelfde combinatie van tikken, pipetteren en pletten voor de beste betrouwbaarheid. Zorg er ook voor dat u de tijd die wordt besteed aan tappen, pipetteren en pletten beperkt, omdat de isopropanol snel zal verdampen. - Meng de oplossing in elk putje door op en neer te pipetteren en breng vervolgens 75 μL over naar twee schone putjes van de plaat.
- Bedek de plaat en lees de absorptie van de dubbele putjes van 75 μL af met behulp van een spectrofotometer of plaatlezer. Als het construct is gekleurd met ORO, lees de oplossing dan af bij 500 nm; als het gekleurd was met BODIPY 493/503, lees de plaat dan af bij 493 nm.
OPMERKING: Als het construct is gekleurd met zowel BODIPY als ORO, wordt aanbevolen om de plaat af te lezen bij 500 nm, aangezien aflezingen van 500 nm vergelijkbare resultaten geven tussen constructen die alleen met ORO zijn gekleurd en ORO plus BODIPY. - Deel de absorptiewaarde desgewenst door het geregistreerde gewicht van de spier om te corrigeren voor verschillen in grootte tussen monsters.
5. Kwantificering van IMAT-lipidedruppelmetriek op basis van confocale beelden
OPMERKING: Deze sectie vereist toegang tot ImageJ versie 1.47 (zie Tabel met materialen) of hoger en basisvaardigheden van ImageJ40.
- Open confocale stapels in ImageJ.
OPMERKING: Verschillende confocale microscopen kunnen confocale beelden in verschillende formaten opslaan. ImageJ heeft mogelijk een extra plug-in of variant nodig, zoals Fiji, om de stacks41 te openen. De gebruikte algoritmes maken deel uit van het softwarepakket ImageJ. - Voer een drempelalgoritme uit in ImageJ om BODIPY-positieve pixels te identificeren. Hiermee wordt de huidige afbeelding geconverteerd naar een binaire afbeelding.
- Open de gebruikersinterface van de drempel door Afbeelding > > drempel aanpassen te selecteren. Selecteer in de gebruikersinterface Intermodes als drempeltype en zorg ervoor dat Donkere achtergrond is geselecteerd. Er hoeven geen andere opties te worden geselecteerd. Klik vervolgens op Toepassen.
- Er wordt een dialoogvenster geopend om de stapel naar binair te converteren. Zorg ervoor dat de volgende opties zijn geselecteerd: Methode: Intermodi; Achtergrond: Donker. Bereken de drempel voor elke afbeelding en zwarte achtergrond (van binaire maskers). Dit genereert een binaire stapel, waarbij wit BODIPY positieve pixels aangeeft en zwart BODIPY negatieve pixels.
OPMERKING: Het Intermodes-drempelalgoritme is mogelijk niet de beste keuze voor alle gebruikers. Subjectieve inspectie van de ingebouwde drempelopties van ImageJ helpt bij het selecteren van het optimale algoritme voor het scheiden van BODIPY positieve en negatieve pixels.
- Voer het Watershed-algoritme uit in ImageJ om aanrakende lipidedruppeltjes te scheiden. Selecteer Proces > Binaire > Watershed. Er wordt een dialoogvenster geopend met de vraag of alle afbeeldingen in de stapel moeten worden verwerkt. Selecteer Ja. Dit voegt dunne zwarte lijnen toe die grotere gebieden van effen wit scheiden.
- Identificeer ROI's met het algoritme Deeltjes analyseren in ImageJ.
- Selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren. Er wordt een dialoogvenster geopend om de selectie-instellingen in te stellen.
OPMERKING: Het selecteren van het groottebereik is van cruciaal belang voor het bereiken van de beste schatting van de ROI's van lipidedruppels. De ondergrens elimineert gebieden die waarschijnlijk te klein zijn om van IMAT afgeleide lipidedruppeltjes te zijn (achtergrondartefact), en de bovengrens elimineert gebieden die waarschijnlijk te groot zijn om enkelvoudige IMAT-afgeleide lipidedruppeltjes te zijn (die lipidedruppeltjes raken die niet zijn gescheiden door het Watershed-algoritme). - Als u deze waarden wilt instellen, opent u de oorspronkelijke afbeelding en schetst u de kleinste en grootste lipidedruppel in beeld met behulp van het gereedschap Ovaal. Voeg deze vormen vervolgens toe aan de ROI-manager door "t" te typen. Selecteer Analyseren en vervolgens Metingen instellen. Er wordt een dialoogvenster geopend waarin u de instellingen kunt selecteren.
- Vink Alleen gebied aan en klik op OK. Selecteer vervolgens Meten in de ROI-manager. Gebruik de twee oppervlaktemetingen in dit venster Resultaten als het groottebereik in Deeltjes analyseren.
- Zorg ervoor dat Toevoegen aan Manager is aangevinkt. Er zijn geen andere opties nodig.
- Selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren. Er wordt een dialoogvenster geopend om de selectie-instellingen in te stellen.
- Leg de ROI's over de confocale stapel door Alles weergeven in de ROI Manager aan te vinken. Gebruik de schuifbalk om elk stapelsegment afzonderlijk te inspecteren en ontbrekende gebieden met de hand toe te voegen met behulp van het gereedschap Ovaal (in de werkbalk van ImageJ).
- Voer de ROI-metingen uit. Selecteer Metingen analyseren > instellen en selecteer Oppervlakte, Zwaartepunt, Passende ellips en Stapelpositie. Klik op OK. Selecteer vervolgens Meten in de ROI-manager. De gegevens in de resultatentabel kunnen worden geselecteerd en gekopieerd naar Matlab of Excel voor verdere analyse.
- Verfijn de ROI's in elke stack tot een enkele ROI met behulp van de Refine.m Matlab-code37 of een vergelijkbaar algoritme.
OPMERKING: Deze stap is vereist omdat in de stappen 5.2-5.4 dezelfde lipidedruppel in aangrenzende plakjes wordt geïdentificeerd als verschillende ROI's. ROI's kunnen echter ook alleen met de hand worden geïdentificeerd, of dubbele ROI's kunnen met de hand worden geëlimineerd in ImageJ om de noodzaak van Matlab te vermijden. - Verkrijg de samenvattende statistieken in de ROI met behulp van Matlab of Excel.
- Schat het totale aantal lipidedruppeltjes als het totale aantal ROI's.
- Schat het volume van de lipidedruppel als het volume van de ellips dat past bij elke 2D-ROI, ervan uitgaande dat de diepte van de vorm het gemiddelde is van de hoofd- en kleine assen van de ellips.
- Schat het totale lipidenvolume, dat is de som van de individuele geschatte lipidedruppelvolumes.
Representative Results
Kwalitatieve visualisatie van vetinfiltratie van skeletspieren
Goed gedecellulariseerde spieren zijn wit en semi-transparant (sectie 1; Figuur 1). Wanneer gedecellulariseerde spieren worden gekleurd met ORO om IMAT te visualiseren (sectie 2), zijn IMAT-lipidedruppeltjes zichtbaar in de heldere spierstructuren als rode bolletjes (Figuur 1). Gezonde achterpootspieren van muizen hebben weinig natuurlijke IMAT, wat blijkt uit weinig tot geen rood, ORO-positief lipide (Figuur 1A). Ter vergelijking: achterpootspieren geïnjecteerd met cardiotoxine (CTX; Figuur 1B) of glycerol (GLY; Figuur 1C) 14 dagen voorafgaand aan decellularisatie hebben een verhoogde accumulatie van IMAT, met een grotere concentratie van IMAT na CTX in vergelijking met GLY zoals eerder opgemerkt37.
Onvolledige decellularisatie kan onmiddellijk na de eerste SDS-behandeling of na het uitwassen van de ORO-kleuring worden geïdentificeerd als semi-ondoorzichtige, lichtroze vezels (Figuur 2B vergeleken met Figuur 2A). Onvolledige klaring van ORO kan worden geïdentificeerd na het uitwassen van ORO als een roze of rode uniforme achtergrond, in plaats van duidelijke vezellijnen (Figuur 2C). Figuur 2A,B bevat ook epimusculair vet (sterretjes), een klomp lipidedruppeltjes buiten de gedecellulariseerde spier. Figuur 2C toont ook de spierplooiing die kan optreden als spieren niet worden gespreid tijdens decellularisatie. Onvolledige decellularisatie, onvolledige ORO-klaring en resterend epimusculair vet verhogen allemaal kunstmatig de (OD) van geëxtraheerd lipide, maar belemmeren niet noodzakelijkerwijs de kwalitatieve beoordeling van vetinfiltratie als ze als een artefact worden herkend.
Kwantitatieve beeldvorming van vetinfiltratie van skeletspieren
BODIPY fluorescerend gelabelde lipidedruppeltjes kunnen worden afgebeeld via confocale microscopie voor een meer gedetailleerde beoordeling van de metriek en verdeling van individuele lipidedruppeltjes (Figuur 3). Dit proces is semi-geautomatiseerd, zoals eerder beschreven, inclusief Matlab-code37. Een goede BODIPY-kleuring resulteert in heldere elliptische vormen die worden afgebakend van naburige vormen wanneer ze in vlak worden afgebeeld (Figuur 3A). Drempels en vormsegmentatie bieden een goede eerste stap voor het genereren van ROI's voor elke lipidedruppel (Figuur 3B), maar handmatige bewerkingen zijn nodig om fouten te corrigeren. De meest doordringende fout zijn lipidedruppeltjes die diep in het weefsel zitten en dus op geen enkele plak helder zijn (Figuur 3B; roze dubbele pijlen). Dit kan worden verholpen door ROI's handmatig toe te voegen met behulp van het gereedschap Ovaal in ImageJ (Figuur 3C). De tweede is het identificeren van een groep lipidedruppeltjes als een enkele ROI (Figuur 3B; rood sterretje). Dit kan worden gecorrigeerd door de oorspronkelijke ROI te verwijderen en te vervangen door meerdere nieuwe ROI's (Afbeelding 3D). Ten slotte wordt een enkele lipidedruppel geïdentificeerd als een unieke ROI in meerdere plakjes, dus de dubbele ROI's moeten worden geconsolideerd in een enkele ROI (Figuur 3E; blauwe pijl). Dit kan het gemakkelijkst worden gedaan met behulp van een gegevensverwerkingstool zoals Matlab, maar kan ook met de hand worden gedaan door de grootste ROI te identificeren en de rest te verwijderen. Gemiddelde waarden voor elke metriek in de C57BL6/J en 129Sv muis zijn te vinden in Biltz et al.37.
Figuur 1: Voorbeeld olierode O (ORO) kleuring van gedecellulariseerde spieren. ORO-gekleurde spieren 14 dagen na injectie met zoutoplossing (SAL), cardiotoxine (CTX) of glycerol (GLY). Spieren extensor digitorum longus (EDL) en tibialis anterior (TA) van muizen hebben weinig IMAT (rode bolletjes) met SAL-behandeling (A), maar accumuleren IMAT als reactie op CTX (B) en GLY (C) behandeling. Er is een volledige decellularisatie en ORO-uitwassing, wat blijkt uit duidelijke ORO-positieve lipidedruppeltjes in een transparante witte spierachtergrond. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeelden van slechte ORO-kleuringsresultaten. Onvolledige decellularisatie of onvolledige ORO-klaring leidt tot een semi-ondoorzichtige roze/rode achtergrond. Vergeleken met de transparante witte achtergrond van volledig gedecellulariseerde muismiddenrifspier (A), wordt onvolledige decellularisatie gekenmerkt door lichtroze/rode vezelsporen (B) en onvolledige ORO-klaring wordt gekenmerkt door een diffuse roze/rode achtergrond (C). Schaalbalken: bovenste panelen = 1 mm; onderste panelen = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeelden van identificatie van individuele lipidedruppels met fluorescerende BODIPY-kleuring en confocale microscopie Individuele BODIPY-gekleurde lipidedruppeltjes kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd in gedecellulariseerde spieren met behulp van confocale microscopie. Individuele plakjes door een confocale stapel tonen lipidedruppeltjes in vlak als heldergroene ellipsen en lipidedruppeltjes buiten het vlak als zwakkere vormen (A; blauwe pijlen). Drempels in combinatie met segmentatie van stroomgebiedobjecten en ROI-identificatie kunnen BODIPY-gekleurde ROI's (B) in kaart brengen. Bij het bepalen van de drempelwaarde kunnen enkele zwakkere lipidedruppeltjes (B; roze dubbele pijl) over het hoofd worden gezien, waardoor identificatie met de hand vereist is (C). Segmentatie van stroomgebieden kan verschillende lipidedruppeltjes groeperen (B; rood sterretje), waardoor de ROI moet worden verwijderd en opnieuw met de hand moet worden geschat (D). Dezelfde lipidedruppel wordt geïdentificeerd in meerdere segmenten waarvoor beeldregistratie (E) nodig is om de dubbele ROI's te verwijderen. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit manuscript beschrijft methoden om vetinfiltratie van skeletspieren in kleine diermodellen kwalitatief te visualiseren en te kwantificeren die kunnen worden toegepast om de pathogenese van de ontwikkeling en pathologische expansie van intramusculair vetweefsel (IMAT) beter te begrijpen. Het gebruik van decellularisatie van de hele spier en in vet oplosbare kleuring zorgt voor een kosteneffectieve, reproduceerbare en eenvoudige methodologie om de aanwezigheid van IMAT in hele spieren uitgebreid te beoordelen.
De basis voor dit protocol is dat decellularisatie van spieren met SDS de cellulaire componenten van myovezels verwijdert, inclusief de kleine lipidedruppeltjes van IMCL, maar de grote lipidedruppeltjes in intramyocellulaire adipocyten spaart. SDS is op grote schaal gebruikt42 in tissue engineering om matrices te decellulariseren. Weefsels zoals vet- en skeletspieren vereisen doorgaans extra mechanische dissociatie en/of alcoholextractie om het resterende adipocytlipide42,43 te verwijderen. We hebben eerder aangetoond dat dit komt omdat terwijl decellularisatie met SDS IMCL elimineert, het de grote lipidedruppel in adipocytenspaart37. Beeldvorming van osmiumtetroxide-gekleurde intacte spier pre- en post-decellularisatie met μCT bevestigde dat het ruimtelijke patroon van IMAT niet werd verstoord door decellularisatie. Verder was de kwantificering van intramusculaire triglyceriden in een gedecellulariseerde spier met verwaarloosbare IMAT ~5% van de intacte spierwaarden, waarmee de verwijdering van IMCL werd geverifieerd. Daarom behoudt deze methodologie IMAT-lipidedruppeltjes in hun oorspronkelijke anatomische verdeling via een semi-transparante spiermatrix.
Een goede decellularisatie is de meest kritische stap in dit protocol. Als de decellularisatie onvolledig is, zullen IMAT-lipidedruppeltjes moeilijk te visualiseren zijn en zal resterende IMCL een hoge achtergrondkleuring veroorzaken met ORO of BODIPY (Figuur 2). Veelvoorkomende fouten door onervaren gebruikers zijn onvoldoende SDS-dekking per spier (binnen elk putje), zodat elke spier niet volledig bedekt is met SDS-oplossing, het niet gebruiken van een tuimelschakelaar om de oplossing te roeren tijdens decellularisatie en het niet vaak genoeg uitvoeren van oplossingsveranderingen. In dit manuscript hebben we de hoeveelheid SDS aanbevolen die nodig is per eenheid spiermassa, maar de gebruiker zal er nog steeds voor moeten zorgen dat spieren volledig worden bedekt door oplossingen, aangezien elke spier een unieke geometrie heeft. Gebruikers wordt ook aangeraden om de oplossingen royaal te veranderen (tot twee keer per dag) om ervoor te zorgen dat de decellularisatie volledig is. Een goede kleuring van IMAT-lipidedruppeltjes is bereikt na maar liefst 4 dagen SDS-behandeling. Voor hoogwaardige ORO-kleuringsresultaten zijn ook voldoende fixatie en voorbereiding van de ORO-oplossing belangrijk. Net als bij de hierboven beschreven SDS-behandeling, is een adequate dekking van 3,7% formaldehyde-oplossing voor elk spiermonster nodig. Als de spier te vroeg uit het fixeermiddel wordt verwijderd, zullen lipidedruppeltjes slechts zwak kleuren met ORO. Een totaal van 1-2 uur zou voldoende moeten zijn, maar een nachtelijke fixatie wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat het fixeermiddel doordringt tot het midden van de spier en alle lipidedruppeltjes volledig fixeert. Een extra uitdaging bij ORO-kleuring is dat wanneer de alcoholconcentratie wordt verlaagd tot 60%, zich een deeltje begint te vormen. Dit deeltje kan zich op het oppervlak nestelen en vast komen te zitten op de rand van spieren. De beste manier om dit te voorkomen, is door voor elke kleuring een nieuwe werkoplossing te maken en zowel filters van 40 mesh μm als 0.22 μm te gebruiken. Door vervolgens de tuimelaar in beweging te houden en de kleuringstijd te beperken tot 10 minuten, wordt voorkomen dat eventuele deeltjes die zich vormen bezinken. Als het probleem aanhoudt, kan het helpen om een nieuwe ORO-voorraadoplossing te maken. Als een artefact aan het gedecellulariseerde spieroppervlak blijft kleven, kunnen een stereomicroscoop, een pincet en een chirurgische schaar worden gebruikt om dit artefact te verwijderen. Het niet elimineren van artefacten heeft invloed op de beeldkwaliteit van spieren en overschat het IMAT-gehalte tijdens het lipide-extractiegedeelte ter voorbereiding op OD-meting.
Over het algemeen is deze techniek eenvoudig en biedt ze verschillende voordelen ten opzichte van gouden standaardmethoden voor het visualiseren en kwantificeren van vetinfiltratie in skeletspieren. Niet-invasieve technieken, zoals CT, MRI en US, die op grote schaal worden gebruikt bij mensen en soms in diermodellen, hebben een beperkte ruimtelijke resolutie en zijn niet in staat om lipidedruppeltjes te onderscheiden van spiervezels. Zo wordt een pixel of voxel met een gemiddelde signaalintensiteit toegewezen als "spier" of "vet", terwijl het in werkelijkheid waarschijnlijk een mix is van myovezels en adipocyten. Vaker wordt vetinfiltratie in dierlijke spieren beoordeeld door histologie, meestal door ORO in spiercryosecties. Dit wordt echter meestal alleen uitgevoerd in een enkele representatieve sectie en is moeilijk te kwantificeren vanwege de lipidenverstrooiing over de sectie. ORO-kleuring van een volledige gedecellulariseerde spier biedt daarentegen een uitgebreide beoordeling van IMAT met vergelijkbare kosten en inspanningen als intacte morfologie. Bovendien maakt ORO-kleuring van decellularisatie, naast het verbeteren van de visualisatie, de kwantificering van vetinfiltratie door lipide-extractie mogelijk. Voor een diepere duik in de kenmerken van vetinfiltratie kan een fluorescerende kleurstof, BODIPY, worden gebruikt in combinatie met confocale microscopie. Dit maakt de reconstructie van individuele IMAT-lipidedruppeltjes mogelijk om het 3D-landschap in kaart te brengen, wat niet mogelijk is met histologie, tenzij secties over de lengte van de spier worden geanalyseerd. Hoewel een confocale microscoop geen standaard laboratoriumapparatuur is, is de kans groter dat deze toegankelijk is in een universitaire of industriële omgeving dan MRI of CT van kleine dieren. Bovendien kan een groot deel van dit proces worden geautomatiseerd, waardoor de tijdskosten worden verlaagd in vergelijking met sequentiële histologie. Het optimaliseren van de instellingen op de confocale microscoop is een extra overweging voor BODIPY-kleuring. Deze zijn uniek voor elke microscoop. De kritische waarde is de laserintensiteit, die hoog genoeg moet zijn om de lipidedruppeltjes op het verre oppervlak van de spier te detecteren en tegelijkertijd het signaal van de lipidedruppeltjes aan de nabije kant niet te verzadigen. Daarom wordt gesuggereerd dat het gebruik van BODIPY-kleuring met confocale microscopie het meest geschikt is voor dunnere spieren, waaronder de EDL of het middenrif.
Verschillende beperkingen van deze benadering verdienen discussie. Ten eerste, hoewel wordt verwacht dat deze techniek breed toepasbaar is buiten letselmodellen (cardiotoxine en glycerol) bij muizen die hier worden gepresenteerd, kunnen nieuwe toepassingen (bijv. het mdx-model) optimalisatie vereisen, omdat de grootte en samenstelling van de spier (bijv. fibrose) de decellularisatie kunnen beïnvloeden, waardoor een verhoogde SDS-concentratie of incubatietijd nodig is. Andere ziektemodellen met veranderde spiermassa zouden ook analyse vereisen van zowel absolute als genormaliseerde (naar spiermassa) metriek van vetinfiltratie om de absolute hoeveelheid lipide of percentage lipide ten opzichte van het spiervolume te bepalen om een zinvollere uitkomstmaat te bieden. Bovendien wordt verwacht dat deze techniek breed toepasbaar zal zijn op grotere diermodellen en menselijke biopten, maar dit kan voor elke nieuwe toepassing optimalisatie vereisen. Ten tweede moet in deze strategie de hele spier aan deze test worden gewijd en kan deze niet worden gebruikt om een ander pathologisch kenmerk te beoordelen. Studies die gericht zijn op het beoordelen van longitudinale veranderingen in IMAT zijn beter gediend met niet-invasieve beeldvormingstechnieken en studies waarvan het primaire doel de spier voor andere doeleinden vereist (histologie, kwantitatieve polymerasekettingreactie, western blotting) zijn beter gediend met histologische beoordeling, aangezien de rest van de bevroren spier kan worden toegewezen aan andere tests. Deze test is echter zeer geschikt om te combineren met in vivo testen, zoals hardlopen op een loopband, of ex vivo contractiele testen, aangezien deze maatregelen kunnen worden genomen vóór decellularisatie44. Ten derde, hoewel het gebruik van BODIPY-kleuring met confocale microscopie visualisatie en kwantificering van lipidedruppeltjes met hoge resolutie biedt, kan het lipidedruppeltjes niet definitief identificeren als individuele adipocyten, omdat het celmembraan wordt verwijderd en endogene adipocyteiwitten verloren gaan. Multiloculaire adipocyten, die onrijpe adipocyten of een "bruin/beige" fenotype vertegenwoordigen, kunnen worden geïdentificeerd als meerdere lipidedruppeltjes. Ten slotte werkt het protocol niet goed op eerder ingevroren spieren. Deze beperkingen zijn waarschijnlijk het meest ingrijpend voor menselijke biopsieën, want hoewel de hele biopsie kan worden gedecellulariseerd, is de ruimtelijke verdeling van IMAT in de biopsie waarschijnlijk niet representatiever voor de hele spier dan een histologische plak. Aangezien deze techniek echter relatief ongevoelig is voor niet-bevroren biopsiebehandelingsomstandigheden (bijv. uren op ijs in PBS), zou de biopsie later kunnen worden verdeeld voor verschillende tests, waaronder een deel voor decellularisatie, wat een betere resolutie van individuele lipidedruppeltjes zou opleveren.
Concluderend is een nieuwe methode ontwikkeld voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de infiltratie van skeletspiervet door het vastgehouden lipide van gedecellulariseerde constructen te kleuren en in beeld te brengen. Deze methodologie biedt verbeteringen ten opzichte van gouden standaardbenaderingen, in die zin dat het uitgebreide beeldvorming van driedimensionale vetinfiltratie in spieren en snelle, goedkope kwantificering met ORO-kleuring mogelijk maakt. Voor meer gedetailleerde metingen biedt een tweede in lipiden oplosbare BODIPY-kleuring een meer gedetailleerde kwantificering van het aantal, het volume en het distributiepatroon van lipidedruppels, zoals afgebeeld door confocale microscopie. Samen bieden deze maatregelen onderzoekers een manier om de vetinfiltratie van skeletspieren nauwkeurig te meten op het niveau van de individuele lipidedruppeltjes zonder bemonstering of dure niet-invasieve beeldvorming.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door R01AR075773 aan GAM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
| 1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| 12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
| 12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
| 37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
| 40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
| 6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
| Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
| ImageJ | NIH | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
| Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |
References
- Delmonico, M. J., et al. Longitudinal study of muscle strength, quality, and adipose tissue infiltration. The American Journal of Clinical Nutrition. 90 (6), 1579-1585 (2009).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
- Freda, P. U., et al. Lower visceral and subcutaneous but higher intermuscular adipose tissue depots in patients with growth hormone and insulin-like growth factor I excess due to acromegaly. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 93 (6), 2334-2343 (2008).
- Garg, A., Peshock, R. M., Fleckenstein, J. L. Adipose tissue distribution pattern in patients with familial partial lipodystrophy (Dunnigan variety). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84 (1), 170-174 (1999).
- Gorgey, A. S., Dudley, G. A. Skeletal muscle atrophy and increased intramuscular fat after incomplete spinal cord injury. Spinal Cord. 45 (4), 304-309 (2007).
- Goutallier, D., Postel, J. M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre- and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. (304), 78-83 (1994).
- Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
- Elder, C. P., Apple, D. F., Bickel, C. S., Meyer, R. A., Dudley, G. A. Intramuscular fat and glucose tolerance after spinal cord injury-a cross-sectional study. Spinal Cord. 42 (12), 711-716 (2004).
- Albu, J. B., et al. Independent association of insulin resistance with larger amounts of intermuscular adipose tissue and a greater acute insulin response to glucose in African American than in white nondiabetic women. The American Journal of Clinical Nutrition. 82 (6), 1210-1217 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Mueller, M. J. Intermuscular adipose tissue is muscle specific and associated with poor functional performance. Journal of Aging Research. 2012, 172957 (2012).
- Gerber, C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., Meyer, D. C. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16 (6), 691-696 (2007).
- Hilton, T. N., Tuttle, L. J., Bohnert, K. L., Mueller, M. J., Sinacore, D. R. Excessive adipose tissue infiltration in skeletal muscle in individuals with obesity, diabetes mellitus, and peripheral neuropathy: association with performance and function. Physical Therapy. 88 (11), 1336-1344 (2008).
- Gaeta, M., et al. Muscle fat-fraction and mapping in Duchenne muscular dystrophy: evaluation of disease distribution and correlation with clinical assessments. Preliminary experience. Skeletal Radiology. 41 (8), 955-961 (2012).
- Buford, T. W., et al. Age-related differences in lower extremity tissue compartments and associations with physical function in older adults. Experimental Gerontology. 47 (1), 38-44 (2012).
- Addona, J., et al. Estimating 3D supraspinatus intramuscular fatty infiltration in older adults: a pilot study. Acta Radiologica. , 2841851221139597 (2022).
- Crook, J., et al. Comparison of multifidus muscle intramuscular fat by ultrasound echo intensity and fat-water based MR images in individuals with chronic low back pain. Musculoskeletal Science & Practice. 63, 102717 (2023).
- Lee, C., et al. Beige FAPs transplantation improves muscle quality and shoulder function after massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 1159-1166 (2020).
- Lee, C., et al. Beige fibro-adipogenic progenitor transplantation reduces muscle degeneration and improves function in a mouse model of delayed repair of rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 29 (4), 719-727 (2020).
- Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
- Overend, T. J., Cunningham, D. A., Paterson, D. H., Lefcoe, M. S. Thigh composition in young and elderly men determined by computed tomography. Clinical Physiology. 12 (6), 629-640 (1992).
- Li, W., et al. Progression and variation of fatty infiltration of the thigh muscles in Duchenne muscular dystrophy, a muscle magnetic resonance imaging study. Neuromuscular Disorders. 25 (5), 375-380 (2015).
- Davis, D. L., et al. Supraspinatus fatty infiltration on MRI among older adults receiving physical therapy as initial management for clinically suspected rotator cuff tear: A pilot study. Journal of Clinical Imaging Science. 12, 66 (2022).
- Salaffi, F., et al. Ultrasound and magnetic resonance imaging as diagnostic tools for sarcopenia in immune-mediated rheumatic diseases (IMRDs). La Radiologia Medica. 127 (11), 1277-1291 (2022).
- Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: a novel depot similar in size to visceral adipose tissue. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (4), 903-910 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Cade, W. T., Mueller, M. J. Lower physical activity is associated with higher intermuscular adipose tissue in people with type 2 diabetes and peripheral neuropathy. Physical Therapy. 91 (6), 923-930 (2011).
- Matsumura, N., et al. Quantitative assessment of fatty infiltration and muscle volume of the rotator cuff muscles using 3-dimensional 2-point Dixon magnetic resonance imaging. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 26 (10), 309-318 (2017).
- Cheuy, V. A., Hastings, M. K., Commean, P. K., Ward, S. R., Mueller, M. J. Intrinsic foot muscle deterioration is associated with metatarsophalangeal joint angle in people with diabetes and neuropathy. Clinical Biomechanics. 28 (9-10), 1055-1060 (2013).
- Samagh, S. P., et al. MRI quantification of fatty infiltration and muscle atrophy in a mouse model of rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 31 (3), 421-426 (2013).
- Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: an experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
- Goodpaster, B. H., Kelley, D. E., Thaete, F. L., He, J., Ross, R. Skeletal muscle attenuation determined by computed tomography is associated with skeletal muscle lipid content. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 104-110 (2000).
- Torriani, M., et al. Lower leg muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MR imaging and spectroscopy study. Skeletal Radiology. 41 (4), 437-445 (2012).
- Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
- Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (13), 2270-2278 (2010).
- Li, B., et al. Skeletal muscle respiratory uncoupling prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Medicine. 6 (10), 1115-1120 (2000).
- Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
- Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), 1 (2017).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), 50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Ungerleider, J. L., Johnson, T. D., Rao, N., Christman, K. L. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).
- Biltz, N. K., et al. Infiltration of intramuscular adipose tissue impairs skeletal muscle contraction. The Journal of Physiology. 598 (13), 2669-2683 (2020).
