Summary
В настоящем исследовании описаны основанные на децеллюляризации методики визуализации и количественной оценки отложения внутримышечной жировой ткани (IMAT) через интактный мышечный объем, а также количественная оценка показателей отдельных адипоцитов, составляющих IMAT.
Abstract
Жировая инфильтрация представляет собой скопление адипоцитов между миоволокнами в скелетных мышцах и является характерной чертой многих миопатий, метаболических нарушений и дистрофий. Клинически в человеческих популяциях жировая инфильтрация оценивается с помощью неинвазивных методов, включая компьютерную томографию (КТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ) и ультразвуковое исследование (УЗИ). Несмотря на то, что в некоторых исследованиях использовалась КТ или МРТ для количественной оценки жировой инфильтрации в мышцах мышей, стоимость и недостаточное пространственное разрешение остаются сложной задачей. Другие методы мелких животных используют гистологию для визуализации отдельных адипоцитов; Однако эта методология страдает от систематической ошибки выборки при гетерогенной патологии. Этот протокол описывает методологию качественного просмотра и количественного измерения жировой инфильтрации комплексно по всей интактной мышечной мышце мыши и на уровне отдельных адипоцитов с помощью децеллюляризации. Протокол не ограничивается конкретными мышцами или конкретными видами и может быть расширен на биопсию человека. Кроме того, валовая качественная и количественная оценка может быть проведена с помощью стандартного лабораторного оборудования за небольшую плату, что делает эту процедуру более доступной для исследовательских лабораторий.
Introduction
Накопление адипоцитов между миоволокнами в скелетных мышцах является характерной чертой различных заболеваний, от диабета 2 типа до саркопении и травм опорно-двигательного аппарата 1,2,3,4,5,6,7. Комплексная оценка этой внутримышечной жировой ткани (ИМАТ) имеет решающее значение для понимания патогенеза этих состояний, поскольку отложение ИМАТ сильно коррелирует с резистентностью к инсулину 3,8,9,10 и плохой функцией скелетных мышц 11,12,13,14,15 . Несмотря на то, что эти связи отмечались на протяжении десятилетий, механизмы, связанные с IMAT и их происхождение, до сих пор остаются предметом интенсивных исследований. Отчасти это связано с тем, что большинство исследований, оценивающих жировую инфильтрацию скелетных мышц, были проведены на людях, где механистические исследования ограничены16,17. Тем не менее, в последнее время модели мелких животных, включая мышей, были использованы для того, чтобы помочь точно определить клеточную регуляцию развития IMAT и передачи сигналов18,19,20. Эта работа направлена на предоставление нового инструмента для использования на моделях мелких животных для качественной визуализации и количественной оценки жировой инфильтрации скелетных мышц.
Клинически в человеческих популяциях жировая инфильтрация оценивается с помощью неинвазивных методов, включая компьютерную томографию (КТ)6,21, магнитно-резонансную томографию (МРТ)16,17,22,23 и ультразвуковое исследование (УЗИ)17,24. Эти методы визуализации, как правило, определяют определенную область интереса (ROI) в мышце и получают срезы изображения в этой области, хотя также используются комплексные подходы25,26,27. Эти фрагменты изображения подвергаются качественной цветокоррекции6 и количественно оцениваются с помощью пиксельного порога28. Аналогичные подходы применялись у животных ранее29,30; Однако они дорогостоящие и требуют доступа к системам визуализации мелких животных. Пространственное разрешение с помощью КТ и МРТ также представляет собой серьезную проблему, поскольку они не могут разграничить адипоциты IMAT от скелетных мышечных волокон внутри воксела и вместо этого полагаются на субъективное разделение преимущественно мышечных областей и в первую очередь областей IMAT31,32. Таким образом, неспособность точно идентифицировать жировую или мышечную ткань также приводит к неточным количественным определениям репрезентативных количеств этих тканей.
Из-за этих ограничений современные методы оценки жировой инфильтрации скелетных мышц на моделях мелких животных чаще всего полагаются на гистологию в качестве недорогой и доступной альтернативы33,34. Стандартные процедуры окрашивания, включая гематоксилин и эозин (H&E), масляно-красный O (ORO) и иммуноокрашивание маркеров адипоцитов, таких как перилипин, позволяют легко обнаруживать и визуализировать адипоциты, содержащие жировую инфильтрацию в мышцах. Однако гистологические подходы редко бывают всеобъемлющими, и, как правило, качественная или количественная оценка IMAT ограничивается одним разделом34. Экстракция липидов также использовалась для количественного определения общих липидов мышц35; однако этот метод не позволяет провести различие между интрамиоцеллюлярными запасами липидов (IMCL) и внутримышечными запасами жировой ткани (IMAT)36. Подводя итог, можно сказать, что существующие методики визуализации и количественного определения жира в мышцах по-прежнему ограничены либо финансовыми затратами, либо специфическим выявлением IMAT.
В данной статье мы подробно опишем методику оценки жировой инфильтрации скелетных мышц как путем качественной визуализации, так и с помощью многомасштабной количественной оценки. Эта методика использует простую технику децеллюляризации, которая удаляет миоцеллюлярные структуры, включая IMCL, но сохраняет более крупные липидные капли, полученные из адипоцитов IMAT, нетронутыми. Валидация специфичности этого метода была опубликована37, в том числе с использованием липидной экстракции, чтобы показать истощение IMCL при децеллюляризации, μCT для демонстрации сохранения паттерна IMAT при децеллюляризации, и гистологии, чтобы показать аналогичное распределение липидных капель IMAT по размерам по сравнению с теми, которые идентифицированы при децеллюляризации. После децеллюляризации мышцы могут быть окрашены жирорастворимыми красителями для качественной визуализации рисунка и степени жировой инфильтрации и/или количественной визуализации отдельных липидных капель IMAT. Впоследствии красители могут быть экстрагированы с помощью изопропанола, а оптическая плотность (OD) полученного раствора может быть использована для оценки объема липидов IMAT. Строгая валидация этого метода была опубликована в другом месте37. В этой статье представлен подробный протокол использования этой методики с мышцами мыши и даны советы по устранению неполадок для поддержки внедрения этого метода в других приложениях, таких как мышцы других видов или другие ткани.
Protocol
Уход за мышами и их жертвоприношение осуществлялись в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по использованию и уходу за лабораторными животными. Все работы были одобрены Комитетом по изучению животных при Вашингтонском университете в Медицинской школе Сент-Луиса. Для получения образцов изображений, включенных в этот протокол, использовали самцов мышей C57BL/6J в возрасте 2-3 месяцев (см. таблицу материалов). Все действия, описанные ниже, выполняются при комнатной температуре.
1. Мышечная децеллюляризация
- Приготовьте 1% массовый раствор додецилсульфата натрия (SDS; см. таблицу материалов) в фосфатно-солевом буфере (PBS). Перемешайте раствор до полного смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1% SDS можно приготовить навалом и хранить при комнатной температуре в течение 1 месяца. - Препарируйте интересующую мышцу (мышцы), как описано ранее38,39.
- Обнажите интересующие мышцы, смочив волосы и кожу 70% раствором этанола, затем сделайте чрескожный разрез примерно 2 см с последующим удалением покрывающей кожи щипцами и пружинными ножницами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассматриваемые здесь мышцы включают переднюю большеберцовую кость (TA), длинный разгибатель пальцев (EDL) и диафрагму. Некоторые мышцы могут лежать глубоко в другой мускулатуре, требуя рассечения других мышц (например, рассечение ЖНВП требует удаления ТА). - Рассеките интересующую мышцу (мышцы) острыми ножницами или лезвиями (см. Таблицу материалов), чтобы убедиться, что вся протяженность мышцы получена, а края гладкие.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале это делается под препарирующим микроскопом для улучшения визуализации. - Осмотрите мышцы, чтобы убедиться, что на них нет костных осколков или рваных краев, затем при необходимости обрежьте их острыми ножницами.
- Взвесьте мышцу с помощью аналитических весов и запишите вес.
- Обнажите интересующие мышцы, смочив волосы и кожу 70% раствором этанола, затем сделайте чрескожный разрез примерно 2 см с последующим удалением покрывающей кожи щипцами и пружинными ножницами.
- Поместите в рассеченную мышцу не менее 0,1 мл 1% SDS на миллиграмм веса; 6-, 12- или 24-луночные пластины хорошо работают для мышц диафрагмы, ТА и МНДП мыши соответственно. Типичные объемы составляют 6 мл, 3 мл и 1,5 мл для 6-, 12- и 24-луночных планшетов соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор SDS иногда вызывает деформацию мышц, поэтому убедитесь, что мышца плоская/разтянутая при первоначальном погружении. - Поместите лунку (или другие сосуды) на качающийся встряхиватель, установленный на 50-80 Гц.
- Периодически проводите визуальный осмотр решения SDS. Когда раствор помутнеет, удалите раствор пипеткой (стараясь не аспирировать мышцу) и замените его равным объемом свежего 1% SDS. Когда раствор остается прозрачным в течение 24 ч, децеллюляризация завершается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Частота, необходимая для смены раствора, зависит от размера мышцы и начального объема раствора. Более крупные мышцы, такие как ТА, нуждаются в новом SDS в течение нескольких часов, а более мелкие мышцы, такие как EDL, могут пройти ночь в первоначальном растворе. - Удалите окончательный раствор SDS из децеллюляризованных мышц с помощью пипетки (стараясь не аспирировать мышцу) и замените его равным объемом PBS.
- Визуально осмотрите децеллюляризованные мышцы под препарирующим микроскопом и используйте щипцы и ножницы, чтобы удалить любые волосы или мусор, которые прилипли к мышце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также обратите внимание на четкость децеллюляризованной мышцы на этом этапе. Если децеллюляризованная мышца не полностью прозрачна и помутнение раствора SDS не увеличивается в течение 24 ч, то децеллюляризация не была эффективной. Это создает артефакт в качественных и количественных оценках, поэтому децеллюляризацию всегда следует оптимизировать на тренировочных образцах, прежде чем приступать к экспериментальным мышцам. - Осторожно снимите ПБС, замените его равным объемом 3,7% раствором формальдегида или 4% раствором параформальдегида и верните пластину в качающийся шейкер на 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что раствор формальдегида полностью покрывает децеллюляризованную мышцу, иначе окрашивание будет неравномерным.
2. Визуализация IMAT с масляно-красным O
- Приготовьте раствор ОРО.
- Растворяют 0,5 г порошка ОРО (см. таблицу материалов) в 100 мл изопропанола для получения исходного раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте слабый нагрев раствор, чтобы он полностью растворился. Такой запас можно хранить при комнатной температуре в течение 1 месяца. - Смешайте исходный раствор ORO и деионизированную воду в соотношении 60:40, чтобы получить рабочий раствор, необходимый для всех мышц, используя объем не менее 0,1 мл/мг мышечного веса. Типичные объемы составляют 6 мл, 3 мл и 1,5 мл для 6-, 12- и 24-луночных планшетов соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед смешиванием проверьте исходный раствор. Если бульонный раствор содержит значительное количество твердых частиц, приготовьте свежий бульон. - Накройте рабочий раствор крышкой на 10 минут, чтобы частицы осели.
- Рабочий раствор фильтруют через сетку 40 мкм, а затем через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шприцевой фильтр 0,22 мкм быстро засоряется и должен быть заменен, если рабочий раствор не проходит легко.
- Растворяют 0,5 г порошка ОРО (см. таблицу материалов) в 100 мл изопропанола для получения исходного раствора.
- Удалите раствор формальдегида или параформальдегида и промойте децеллюляризованные мышцы тремя сменами раствора с равным объемом PBS.
- Замените ПБС равным объемом 60% раствора изопропанола и инкубируйте на качающемся шейкере в течение 5 мин.
- Замените 60% раствор изопропанола рабочим раствором ORO и инкубируйте на качающемся шейкере в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рабочий раствор ORO полностью покрывает децеллюляризованную мышцу, в противном случае окрашивание будет неравномерным. - Замените рабочий раствор ОРО равным объемом 1% SDS. Периодически проводите визуальный осмотр решения SDS. Когда раствор станет заметно розовым, удалите раствор пипеткой (стараясь не аспирировать мышцу) и замените его свежим 1% SDS.
- Когда раствор останется прозрачным в течение 24 ч, замените 1% SDS на PBS и осмотрите окрашенную мышцу под препарирующим/стереомикроскопом при 4-кратном увеличении. Удалите любой очевидный мусор или твердые частицы, прилипшие к внешней стороне мышцы. Если он обширный, децеллюляризованную мышцу можно аккуратно покатать по чистящей салфетке, чтобы удалить мусор/частицы.
- Если окрашивание удовлетворительное (ярко-красные шарики, плавающие в прозрачной матрице), получите желаемые изображения окрашивания с помощью камеры, прикрепленной к стереомикроскопу (см. таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если к препарирующему микроскопу не прикреплена камера, для получения снимков через окуляр можно использовать камеру телефона.
3. Визуализация липидных капель IMAT с помощью BODIPY
ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальная визуализация наиболее эффективна при работе с тонкими мышцами, такими как EDL или диафрагма (толщина ~2 мм). В качестве альтернативы можно использовать полоски мышц сопоставимой толщины, такие как ТА.
- Приготовьте раствор флуоресцентного БОДИПЫ 493/503 в соотношении 1:200 (см. таблицу материалов) в ПБС до получения объема рабочего раствора не менее 0,1 мл/мг мышечной массы. Типичные объемы составляют 6 мл, 3 мл и 1,5 мл для 6-, 12- и 24-луночных планшетов соответственно.
- Удалите формальдегид, параформальдегид или 1% SDS и промойте децеллюляризованные мышцы тремя сменами раствора равного объема PBS.
- Замените ПБС рабочим раствором БОДИПИ и инкубируйте на качающемся шейкере в течение 20 мин.
- Промойте децеллюляризованные мышцы тремя сменами раствора равного объема PBS.
- Поместите мышцу в сосуд с прозрачным дном, совместимый с имеющимся конфокальным микроскопом. В идеале блюдо должно иметь утопленное дно, чтобы покровное покрытие покрывало мышцы, не деформируя ее (см. Таблицу материалов).
- Получение стеков изображений с помощью стандартного конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов) с помощью лазера 488. Типичные размеры стека для EDL составляют 0,5-1 мм при толщине среза 10 мкм, что дает 50-100 изображений в стопке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы количественно оценить общий объем липидов, общее количество липидных капель IMAT и индекс кластеризации ближайшего соседа, проведите изображение по всему объему мышцы, стараясь оставить некоторое перекрытие для регистрации изображения. Для количественной оценки среднего объема липидных капель может быть достаточно одной стопки. - При желании, окрасьте мышцы ORO, как указано в разделе 2, для получения дополнительного изображения распределения IMAT всей мышцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку BODIPY является флуоресцентным, он не будет виден под световым микроскопом при получении изображений ORO.
4. Оценка общего объема липидов методом экстракции липидов
- После получения изображения перенесите мышцы на 200 мкл изопропанола в отдельные лунки 96-луночной пластины или адаптируйте лунку/объем, если мышца слишком велика, чтобы поместиться.
- Перемешивайте раствор, постукивая по пластине, пипетируя раствор вверх и вниз и/или механически раздавливая мышцу наконечником пипетки до тех пор, пока в децеллюляризованной мышце под микроскопом не будут видны красные/флуоресцентные сферы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействуйте на все мышцы одинаковой комбинацией постукиваний, пипетирования и раздавливания для достижения наилучшей надежности. Кроме того, позаботьтесь о том, чтобы ограничить время, затрачиваемое на постукивание, пипетирование и измельчение, так как изопропанол быстро испаряется. - Перемешайте раствор в каждой лунке, пипетируя вверх и вниз, затем перелейте 75 мкл в две чистые лунки планшета.
- Накройте планшет и считайте поглощение дубликатов лунок объемом 75 мкл с помощью спектрофотометра или планшетного ридера. Если конструкция была окрашена ORO, считывают раствор на длине волны 500 нм; если он был окрашен BODIPY 493/503, прочтите пластину на длине волны 493 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если конструкция была окрашена как BODIPY, так и ORO, рекомендуется читать пластину на длине волны 500 нм, так как показания на длине волны 500 нм дают аналогичные результаты между конструкциями, окрашенными только ORO и ORO плюс BODIPY. - При необходимости разделите показания абсорбции на зарегистрированный вес мышцы, чтобы скорректировать различия в размерах между образцами.
5. Количественная оценка показателей липидных капель IMAT по конфокальным изображениям
ПРИМЕЧАНИЕ: Для работы в этом разделе требуется доступ к ImageJ версии 1.47 (см. Таблицу материалов) или более поздней, а также базовые навыки работы с ImageJ40.
- Открытые конфокальные стеки в ImageJ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные конфокальные микроскопы могут сохранять конфокальные изображения в разных форматах. ImageJ может потребовать дополнительный плагин или вариант, например, Fiji, для открытия стеков41. Используемые алгоритмы входят в состав программного комплекса ImageJ. - Запустите алгоритм пороговых значений в ImageJ для идентификации положительных пикселей BODIPY. При этом текущее изображение преобразуется в двоичное.
- Откройте пользовательский интерфейс порога, выбрав Изображение > Настроить > пороговое значение. В пользовательском интерфейсе выберите Intermodes в качестве порогового значения и убедитесь, что выбран параметр Темный фон . Никаких других вариантов выбирать не нужно. Затем нажмите « Применить».
- Откроется диалоговое окно для преобразования стека в двоичный. Убедитесь, что выбраны следующие параметры: Метод: Интермоды; Фон: Темный. Вычислите порог для каждого изображения и черного фона (бинарных масок). При этом создается двоичный стек, где белый цвет обозначает положительные пиксели BODIPY, а черный — отрицательные пиксели BODIPY.
ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм пороговых значений Intermodes может быть не лучшим выбором для всех пользователей. Субъективный осмотр встроенных пороговых опций ImageJ помогает выбрать оптимальный алгоритм разделения положительных и отрицательных пикселей BODIPY.
- Запустите алгоритм Watershed в ImageJ, чтобы отделить соприкасающиеся липидные капли. Выберите Process > Binary > Watershed. Откроется диалоговое окно с запросом на обработку всех изображений в стеке. Выберите Да. При этом добавляются тонкие черные линии, разделяющие большие участки сплошного белого цвета.
- Определите окупаемость инвестиций с помощью алгоритма анализа частиц в ImageJ.
- Выберите «Анализ » > «Анализ частиц». Откроется диалоговое окно для настройки параметров выбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор диапазона размеров имеет решающее значение для достижения наилучшей оценки рентабельности инвестиций липидных капель. Нижняя граница исключает области, которые, вероятно, слишком малы, чтобы быть липидными каплями, полученными IMAT (фоновый артефакт), а верхняя граница исключает области, которые, вероятно, слишком велики, чтобы быть отдельными липидными каплями, полученными IMAT (соприкасаясь с липидными каплями, которые не были разделены алгоритмом Watershed). - Чтобы установить эти значения, откройте исходное изображение и обведите контуром самую маленькую и самую большую липидную каплю в поле зрения с помощью инструмента «Овал». Затем добавьте эти фигуры в диспетчер ROI, введя «t». Выберите «Анализ», а затем «Задать измерения». Откроется диалоговое окно для выбора настроек.
- Установите флажок « Только область» и нажмите кнопку «ОК». Затем выберите Измерить в диспетчере рентабельности инвестиций. Используйте две меры площади из этого окна Результаты в качестве диапазона размеров в Анализе частиц.
- Убедитесь, что установлен флажок Добавить в менеджер . Никаких других вариантов не требуется.
- Выберите «Анализ » > «Анализ частиц». Откроется диалоговое окно для настройки параметров выбора.
- Наложите ROI на конфокальный стек, установив флажок Показать все в диспетчере ROI. Используйте ползунок для проверки каждого фрагмента подборки по отдельности и добавления отсутствующих областей вручную с помощью инструмента «Овал» (находится на панели инструментов ImageJ).
- Выведите результаты измерений ROI. Выберите «Анализ» > «Задать измерения » и выберите « Площадь», «Центроид», «Подогнать эллипс» и «Положение стека». Нажмите кнопку ОК. Затем выберите Измерить в диспетчере рентабельности инвестиций. Данные в таблице Results могут быть выбраны и скопированы в Matlab или Excel для дальнейшего анализа.
- Уточните ROI в каждом стеке до одного ROI с помощью кода Refine.m Matlab37 или аналогичного алгоритма.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является обязательным, так как шаги 5.2-5.4 идентифицируют одну и ту же липидную каплю в соседних срезах как различные ROI. Тем не менее, ROI можно определить только вручную, или дублирующиеся ROI могут быть устранены вручную в ImageJ, чтобы избежать необходимости в Matlab. - Получайте сводную статистику по ROI с помощью Matlab или Excel.
- Оцените общее количество липидных капель как общее количество ROI.
- Оцените объем липидной капли как объем эллипса, подогнанного к каждому 2D-ROI, предполагая, что глубина формы равна среднему значению большой и малой осей эллипса.
- Оцените общий объем липидов, который представляет собой сумму отдельных расчетных объемов липидных капель.
Representative Results
Качественная визуализация жировой инфильтрации скелетных мышц
Правильно децеллюляризованные мышцы белые и полупрозрачные (секция 1; Рисунок 1). Когда децеллюляризованные мышцы окрашиваются ORO для визуализации IMAT (раздел 2), липидные капли IMAT видны в прозрачных мышечных структурах в виде красных сфер (рис. 1). Здоровые мышцы задних конечностей мышей имеют мало естественного IMAT, о чем свидетельствует практически полное отсутствие красных ORO-положительных липидов (рис. 1A). Для сравнения, мышцы задних конечностей, которым вводят кардиотоксин (CTX; Рисунок 1Б) или глицерин (GLY; Рисунок 1В) За 14 дней до децеллюляризации наблюдается повышенное накопление IMAT, с большей концентрацией IMAT после CTX по сравнению с GLY, как отмечалось ранее37.
Неполная децеллюляризация может быть идентифицирована сразу после первоначальной обработки SDS или после вымывания окрашивания ORO в виде полупрозрачных светло-розовых волокон (Рисунок 2B в сравнении с Рисунком 2A). Неполный клиренс РВК может быть идентифицирован после вымывания РВК в виде розового или красного однородного фона, а не отдельных волоконных линий (рис. 2C). На рисунке 2A, B также изображен эпимышечный жир (звездочки), скопление липидных капель за пределами децеллюляризованной мышцы. На рисунке 2C также показано сгибание мышц, которое может произойти, если мышцы не раздвигаются во время децеллюляризации. Неполная децеллюляризация, неполный клиренс ОРО и остаточный эпимышечный жир искусственно увеличивают (OD) экстрагированного липида, но не обязательно препятствуют качественной оценке жировой инфильтрации, если они распознаются как артефакт.
Количественная визуализация жировой инфильтрации скелетных мышц
Флуоресцентно меченные липидные капли BODIPY могут быть визуализированы с помощью конфокальной микроскопии для более детальной оценки индивидуальных показателей и распределения липидных капель (рис. 3). Этот процесс является полуавтоматическим, как описано ранее, включая код Matlab37. Хорошее окрашивание по методу БОДИПИ приводит к получению ярких эллиптических форм, отличающихся от соседних фигур при изображении в плоскости (рис. 3A). Пороговые значения и сегментация по форме обеспечивают хороший первый проход для получения ROI для каждой липидной капли (рис. 3B), но для исправления ошибок необходимо ручное редактирование. Наиболее распространенной ошибкой являются липидные капли, которые находятся глубоко в тканях и, таким образом, не являются яркими ни на одном срезе (рис. 3B; розовые двойные стрелки). Это можно исправить, добавив ROI вручную с помощью инструмента Oval в ImageJ (рис. 3C) . Во-вторых, идентификация группы липидных капель как одного ROI (рис. 3B; красная звездочка). Это можно исправить, удалив и заменив исходный ROI несколькими новыми ROI (рис. 3D). Наконец, одна липидная капля идентифицируется как уникальный ROI в нескольких срезах, поэтому повторяющиеся ROI должны быть объединены в один ROI (рис. 3E; синяя стрелка). Проще всего это сделать с помощью инструмента обработки данных, такого как Matlab, но также можно сделать это вручную, определив наибольшую рентабельность инвестиций и удалив остальные. Средние значения для каждого показателя в мышах C57BL6/J и 129Sv можно найти в работе Biltz et al.37.
Рисунок 1: Пример окрашивания децеллюляризованных мышц в масляно-красный цвет O (ORO). Окрашенные ORO мышцы через 14 дней после инъекции физиологическим раствором (SAL), кардиотоксином (CTX) или глицерином (GLY). Мышцы-разгибатели пальцев (EDL) и передние большеберцовые мышцы (TA) имеют мало IMAT (красные сферы) при лечении SAL (A), но накапливают IMAT в ответ на лечение CTX (B) и GLY (C). Происходит полная децеллюляризация и вымывание ОРО, о чем свидетельствуют отчетливые ОРО-положительные липидные капли на прозрачном белом мышечном фоне. Масштабные линейки = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Примеры плохих результатов окрашивания ORO. Неполная децеллюляризация или неполный клиренс ORO приводит к полунепрозрачному розовому/красному фону. По сравнению с прозрачным белым фоном полностью децеллюляризованной мышцы диафрагмы мыши (А), неполная децеллюляризация характеризуется светло-розовыми/красными волокнистыми дорожками (В), а неполный клиренс ORO характеризуется диффузным розово-красным фоном (С). Масштабные линейки: верхние панели = 1 мм; Нижние панели = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Примеры идентификации отдельных липидных капель с помощью флуоресцентного окрашивания BODIPY и конфокальной микроскопии Отдельные липидные капли, окрашенные BODIPY, могут быть идентифицированы и количественно определены в децеллюляризованных мышцах с помощью конфокальной микроскопии. Отдельные срезы через конфокальный стек показывают липидные капли в плоскости в виде ярко-зеленых эллипсов, а липидные капли вне плоскости — в виде более слабых форм (А; синие стрелки). Пороговые значения в сочетании с сегментацией водосборных объектов и идентификацией ROI позволяют отображать ROI, окрашенные BODIPY (B). Пороговое значение может пропустить некоторые более слабые липидные капли (B; розовая двойная стрелка), требующие идентификации вручную (C). Сегментация водосборного бассейна может сгруппировать несколько липидных капель вместе (B; красная звездочка), что требует удаления ROI и повторной оценки вручную (D). Одна и та же липидная капля идентифицируется в нескольких срезах, требующих регистрации изображения (E) для удаления повторяющихся ROI. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
В данной статье описаны методы качественной визуализации и количественной оценки жировой инфильтрации скелетных мышц на моделях мелких животных, которые могут быть применены для дальнейшего понимания патогенеза развития и патологического расширения внутримышечной жировой ткани (ИМАТ). Использование цельномышечной децеллюляризации и жирорастворимого окрашивания позволяет использовать экономичную, воспроизводимую и простую методику для комплексной оценки наличия IMAT в целых мышцах.
В основе этого протокола лежит то, что децеллюляризация мышц с помощью SDS удаляет клеточные компоненты миоволокон, в том числе мелкие липидные капли IMCL, но щадит крупные липидные капли в интрамиоцеллюлярных адипоцитах. SDS широко используется в тканевой инженериидля децеллюляризации матриц. Такие ткани, как жировые и скелетные мышцы, обычно требуют дополнительной механической диссоциации и/или экстракции спиртом для удаления остаточного липида адипоцитов42,43. Ранее мы показали, что это связано с тем, что в то время как децеллюляризация с помощью SDS устраняет IMCL, она щадит крупную липидную каплю в адипоцитах37. Визуализация окрашенных тетраоксидом осмия интактных мышц до и после децеллюляризации с помощью микроКТ подтвердила, что пространственный паттерн IMAT не был нарушен децеллюляризацией. Кроме того, внутримышечное количественное определение триглицеридов в децеллюляризованной мышце с незначительным IMAT составило ~5% от интактных мышечных значений, что подтверждает удаление IMCL. Таким образом, данная методика сохраняет липидные капли IMAT в их первоначальном анатомическом распределении через полупрозрачный мышечный матрикс.
Правильная децеллюляризация является наиболее важным этапом в этом протоколе. Если децеллюляризация неполная, липидные капли IMAT будет трудно визуализировать, а остаточный IMCL вызовет высокое фоновое окрашивание либо ORO, либо BODIPY (рисунок 2). Распространенными ошибками неопытных пользователей являются недостаточное покрытие SDS на каждую мышцу (в каждой лунке), так что каждая мышца не полностью покрыта раствором SDS, отсутствие использования коромысла для перемешивания раствора во время децеллюляризации и недостаточно частая смена раствора. В этой рукописи мы рекомендовали количество SDS, необходимое на единицу мышечной массы, но пользователю все равно нужно будет убедиться, что мышцы полностью покрыты растворами, так как каждая мышца имеет уникальную геометрию. Пользователям также рекомендуется обильно менять растворы (до двух раз в день), чтобы обеспечить полную децеллюляризацию. Хорошее качество окрашивания липидных капель IMAT было достигнуто уже через 4 дня обработки SDS. Для получения качественных результатов окрашивания ORO также важна адекватная фиксация и приготовление раствора ORO. Аналогично описанному выше методу SDS, необходимо адекватное покрытие 3,7% раствора формальдегида для каждого образца мышцы. Если мышца будет удалена из фиксатора слишком рано, липидные капли будут слабо окрашиваться ORO. В общей сложности 1-2 ч должно быть достаточно, но рекомендуется ночная фиксация, чтобы закрепитель проник в центр мышцы и полностью зафиксировал все липидные капли. Дополнительная проблема при окрашивании ORO заключается в том, что при снижении концентрации спирта до 60% начинают образовываться твердые частицы. Эти частицы могут осесть на поверхности и застрять на границе мышцы. Лучший способ избежать этого — сделать свежий рабочий раствор для каждого окрашивания и использовать фильтры как 40 мкм, так и 0,22 мкм. Затем, поддерживая перемешивание с помощью коромысла и ограничивая время окрашивания до 10 минут, вы предотвратите оседание любых образующихся частиц. Если проблема не устранена, может помочь создание свежего решения для запасов РВК. Если какой-то артефакт остается прилипшим к децеллюляризованной поверхности мышцы, для удаления этого артефакта можно использовать стереомикроскоп, щипцы и хирургические ножницы. Неспособность устранить артефакты повлияет на качество изображения мышц и переоценит содержание IMAT во время экстракции липидов при подготовке к измерению OD.
В целом, этот метод прост и имеет ряд преимуществ по сравнению с методами золотого стандарта для визуализации и количественной оценки жировой инфильтрации скелетных мышц. Неинвазивные методы, такие как КТ, МРТ и УЗИ, которые широко используются на людях, а иногда и на животных моделях, имеют ограниченное пространственное разрешение и не способны отличить липидные капли от мышечных волокон. Таким образом, пиксель или воксель промежуточной интенсивности сигнала обозначается как «мышца» или «жир», в то время как на самом деле это, скорее всего, смесь миоволокон и адипоцитов. Чаще жировую инфильтрацию в мышцах животных оценивают с помощью гистологии, чаще всего с помощью ORO в мышечных криосекциях. Однако, как правило, это выполняется только в одном репрезентативном срезе, и его трудно количественно оценить из-за рассеяния липидов по срезу. В отличие от этого, окрашивание всей децеллюляризованной мышцы ORO обеспечивает всестороннюю оценку IMAT с теми же затратами и усилиями, что и интактная морфология. Кроме того, в дополнение к улучшению визуализации, ORO-окрашивание децеллюляризации позволяет количественно оценить жировую инфильтрацию путем липидной экстракции. Для более глубокого погружения в особенности жировой инфильтрации в сочетании с конфокальной микроскопией можно использовать флуоресцентный краситель BODIPY. Это позволяет реконструировать отдельные липидные капли IMAT для картографирования 3D-ландшафта, что невозможно при гистологии, если срезы не анализируются по всей длине мышцы. Несмотря на то, что конфокальный микроскоп не является стандартным лабораторным оборудованием, он с большей вероятностью будет доступен в университетских или промышленных условиях, чем МРТ или КТ мелких животных. Кроме того, большая часть этого процесса может быть автоматизирована, что снижает временные затраты по сравнению с последовательной гистологией. Оптимизация настроек конфокального микроскопа является дополнительным фактором при окрашивании по методу БОДИПИ. Они уникальны для каждого микроскопа. Критическим значением является интенсивность лазера, которая должна быть достаточно высокой, чтобы обнаружить липидные капли на дальней поверхности мышцы, но при этом не насыщать сигнал от липидных капель на ближней стороне. В связи с этим предполагается, что использование окрашивания BODIPY с конфокальной микроскопией лучше всего подходит для более тонких мышц, включая EDL или диафрагму.
Некоторые ограничения этого подхода заслуживают обсуждения. Во-первых, несмотря на то, что предполагается, что этот метод имеет широкое применение за пределами моделей травм (кардиотоксин и глицерин) у мышей, представленных здесь, новые приложения (например, модель mdx) могут потребовать оптимизации, поскольку размер и состав мышцы (например, фиброз) могут повлиять на децеллюляризацию, требуя увеличения концентрации SDS или инкубационного времени. Другие модели заболеваний с измененной мышечной массой также потребуют анализа как абсолютных, так и нормализованных (к мышечной массе) показателей жировой инфильтрации, чтобы определить абсолютное количество липидов или процентное соотношение липидов по отношению к мышечному объему, чтобы обеспечить более значимую оценку результата. Кроме того, ожидается, что этот метод будет широко применим к более крупным моделям животных и биопсии человека, но это может потребовать оптимизации для каждого нового применения. Во-вторых, в этой стратегии вся мышца должна быть посвящена этому анализу и не может быть использована для оценки другого патологического признака. Исследования, направленные на оценку продольных изменений IMAT, лучше подходят для неинвазивных методов визуализации, а исследования, основная цель которых требует использования мышцы для других целей (гистология, количественная полимеразная цепная реакция, вестерн-блоттинг), лучше подходят для гистологической оценки, поскольку оставшаяся часть замороженной мышцы может быть отнесена к другим анализам. Тем не менее, этот анализ хорошо подходит для сочетания с тестированием in vivo, таким как бег на беговой дорожке или сократительное тестирование ex vivo , поскольку эти меры могут быть проведены до децеллюляризации44. В-третьих, несмотря на то, что использование окрашивания BODIPY с конфокальной микроскопией обеспечивает визуализацию и количественное определение липидных капель с высоким разрешением, оно не может окончательно идентифицировать липидные капли как отдельные адипоциты, так как клеточная мембрана удаляется, а эндогенные белки адипоцитов теряются. Мультилокулярные адипоциты, представляющие собой незрелые адипоциты или фенотип «коричнево-бежевый», могут быть идентифицированы как множественные липидные капли. Наконец, протокол плохо работает на ранее замороженных мышцах. Эти ограничения, вероятно, наиболее серьезны для биопсии человека, поскольку, хотя вся биопсия может быть децеллюляризована, пространственное распределение IMAT в биопсии вряд ли будет более репрезентативным для всей мышцы, чем гистологический срез. Однако, поскольку этот метод относительно нечувствителен к условиям обработки незамороженной биопсии (например, часы на льду в PBS), биопсия может быть разделена позже для различных анализов, включая часть для децеллюляризации, что обеспечит лучшее разрешение отдельных липидных капель.
В заключение следует отметить, что был разработан новый метод качественного и количественного анализа жировой инфильтрации скелетных мышц путем окрашивания и визуализации сохраненного липида децеллюляризованных конструкций. Эта методология предлагает преимущества по сравнению с подходами золотого стандарта, поскольку она позволяет получить всестороннюю визуализацию трехмерной жировой инфильтрации в мышцах и быструю и дешевую количественную оценку с помощью окрашивания ORO. Для более детальных измерений второй жирорастворимый краситель БОДИПИ обеспечивает более детальную количественную оценку количества капель, объема и характера распределения липидов, полученных с помощью конфокальной микроскопии. Вместе эти меры дают исследователям возможность точно измерить жировую инфильтрацию скелетных мышц на уровне отдельных липидных капель без отбора проб или дорогостоящей неинвазивной визуализации.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана R01AR075773 GAM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
| 1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| 12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
| 12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
| 37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
| 40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
| 6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
| Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
| ImageJ | NIH | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
| Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |
References
- Delmonico, M. J., et al. Longitudinal study of muscle strength, quality, and adipose tissue infiltration. The American Journal of Clinical Nutrition. 90 (6), 1579-1585 (2009).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
- Freda, P. U., et al. Lower visceral and subcutaneous but higher intermuscular adipose tissue depots in patients with growth hormone and insulin-like growth factor I excess due to acromegaly. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 93 (6), 2334-2343 (2008).
- Garg, A., Peshock, R. M., Fleckenstein, J. L. Adipose tissue distribution pattern in patients with familial partial lipodystrophy (Dunnigan variety). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84 (1), 170-174 (1999).
- Gorgey, A. S., Dudley, G. A. Skeletal muscle atrophy and increased intramuscular fat after incomplete spinal cord injury. Spinal Cord. 45 (4), 304-309 (2007).
- Goutallier, D., Postel, J. M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre- and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. (304), 78-83 (1994).
- Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
- Elder, C. P., Apple, D. F., Bickel, C. S., Meyer, R. A., Dudley, G. A. Intramuscular fat and glucose tolerance after spinal cord injury-a cross-sectional study. Spinal Cord. 42 (12), 711-716 (2004).
- Albu, J. B., et al. Independent association of insulin resistance with larger amounts of intermuscular adipose tissue and a greater acute insulin response to glucose in African American than in white nondiabetic women. The American Journal of Clinical Nutrition. 82 (6), 1210-1217 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Mueller, M. J. Intermuscular adipose tissue is muscle specific and associated with poor functional performance. Journal of Aging Research. 2012, 172957 (2012).
- Gerber, C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., Meyer, D. C. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16 (6), 691-696 (2007).
- Hilton, T. N., Tuttle, L. J., Bohnert, K. L., Mueller, M. J., Sinacore, D. R. Excessive adipose tissue infiltration in skeletal muscle in individuals with obesity, diabetes mellitus, and peripheral neuropathy: association with performance and function. Physical Therapy. 88 (11), 1336-1344 (2008).
- Gaeta, M., et al. Muscle fat-fraction and mapping in Duchenne muscular dystrophy: evaluation of disease distribution and correlation with clinical assessments. Preliminary experience. Skeletal Radiology. 41 (8), 955-961 (2012).
- Buford, T. W., et al. Age-related differences in lower extremity tissue compartments and associations with physical function in older adults. Experimental Gerontology. 47 (1), 38-44 (2012).
- Addona, J., et al. Estimating 3D supraspinatus intramuscular fatty infiltration in older adults: a pilot study. Acta Radiologica. , 2841851221139597 (2022).
- Crook, J., et al. Comparison of multifidus muscle intramuscular fat by ultrasound echo intensity and fat-water based MR images in individuals with chronic low back pain. Musculoskeletal Science & Practice. 63, 102717 (2023).
- Lee, C., et al. Beige FAPs transplantation improves muscle quality and shoulder function after massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 1159-1166 (2020).
- Lee, C., et al. Beige fibro-adipogenic progenitor transplantation reduces muscle degeneration and improves function in a mouse model of delayed repair of rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 29 (4), 719-727 (2020).
- Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
- Overend, T. J., Cunningham, D. A., Paterson, D. H., Lefcoe, M. S. Thigh composition in young and elderly men determined by computed tomography. Clinical Physiology. 12 (6), 629-640 (1992).
- Li, W., et al. Progression and variation of fatty infiltration of the thigh muscles in Duchenne muscular dystrophy, a muscle magnetic resonance imaging study. Neuromuscular Disorders. 25 (5), 375-380 (2015).
- Davis, D. L., et al. Supraspinatus fatty infiltration on MRI among older adults receiving physical therapy as initial management for clinically suspected rotator cuff tear: A pilot study. Journal of Clinical Imaging Science. 12, 66 (2022).
- Salaffi, F., et al. Ultrasound and magnetic resonance imaging as diagnostic tools for sarcopenia in immune-mediated rheumatic diseases (IMRDs). La Radiologia Medica. 127 (11), 1277-1291 (2022).
- Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: a novel depot similar in size to visceral adipose tissue. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (4), 903-910 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Cade, W. T., Mueller, M. J. Lower physical activity is associated with higher intermuscular adipose tissue in people with type 2 diabetes and peripheral neuropathy. Physical Therapy. 91 (6), 923-930 (2011).
- Matsumura, N., et al. Quantitative assessment of fatty infiltration and muscle volume of the rotator cuff muscles using 3-dimensional 2-point Dixon magnetic resonance imaging. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 26 (10), 309-318 (2017).
- Cheuy, V. A., Hastings, M. K., Commean, P. K., Ward, S. R., Mueller, M. J. Intrinsic foot muscle deterioration is associated with metatarsophalangeal joint angle in people with diabetes and neuropathy. Clinical Biomechanics. 28 (9-10), 1055-1060 (2013).
- Samagh, S. P., et al. MRI quantification of fatty infiltration and muscle atrophy in a mouse model of rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 31 (3), 421-426 (2013).
- Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: an experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
- Goodpaster, B. H., Kelley, D. E., Thaete, F. L., He, J., Ross, R. Skeletal muscle attenuation determined by computed tomography is associated with skeletal muscle lipid content. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 104-110 (2000).
- Torriani, M., et al. Lower leg muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MR imaging and spectroscopy study. Skeletal Radiology. 41 (4), 437-445 (2012).
- Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
- Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (13), 2270-2278 (2010).
- Li, B., et al. Skeletal muscle respiratory uncoupling prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Medicine. 6 (10), 1115-1120 (2000).
- Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
- Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), 1 (2017).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), 50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Ungerleider, J. L., Johnson, T. D., Rao, N., Christman, K. L. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).
- Biltz, N. K., et al. Infiltration of intramuscular adipose tissue impairs skeletal muscle contraction. The Journal of Physiology. 598 (13), 2669-2683 (2020).
