Summary
Denne studien beskriver decellulariseringsbaserte metoder for visualisering og kvantifisering av intramuskulært fettvev (IMAT) avsetning gjennom intakt muskelvolum, samt kvantifisering av beregninger av individuelle adipocytter som omfatter IMAT.
Abstract
Fet infiltrasjon er akkumulering av adipocytter mellom myofibre i skjelettmuskulatur og er et fremtredende trekk ved mange myopatier, metabolske forstyrrelser og dystrofier. Klinisk i humane populasjoner vurderes fettinfiltrasjon ved hjelp av ikke-invasive metoder, inkludert computertomografi (CT), magnetisk resonansavbildning (MR) og ultralyd (US). Selv om noen studier har brukt CT eller MR for å kvantifisere fettinfiltrasjon i musemuskel, er kostnader og utilstrekkelig romlig oppløsning fortsatt utfordrende. Andre små dyremetoder benytter histologi for å visualisere individuelle adipocytter; Denne metoden lider imidlertid av utvalgsskjevhet i heterogen patologi. Denne protokollen beskriver metodikken for å kvalitativt vise og kvantitativt måle fettinfiltrasjon omfattende gjennom intakt musemuskulatur og på nivå med individuelle adipocytter ved bruk av decellularisering. Protokollen er ikke begrenset til spesifikke muskler eller spesifikke arter og kan utvides til menneskelig biopsi. I tillegg kan brutto kvalitative og kvantitative vurderinger gjøres med standard laboratorieutstyr for liten kostnad, noe som gjør denne prosedyren mer tilgjengelig på tvers av forskningslaboratorier.
Introduction
Akkumulering av adipocytter mellom myofibre i skjelettmuskulaturen er et fremtredende trekk ved ulike tilstander, fra type 2 diabetes til sarkopeni til muskel- og skjelettskade 1,2,3,4,5,6,7. Omfattende vurdering av dette intramuskulære fettvevet (IMAT) er avgjørende for å forstå patogenesen til disse tilstandene, da IMAT-avleiring er sterkt korrelert med insulinresistens 3,8,9,10 og dårlig skjelettmuskelfunksjon 11,12,13,14,15 . Selv om disse foreningene har blitt notert i flere tiår, er mekanismene knyttet til og opprinnelsen til IMAT fortsatt et område med intens etterforskning. Dette skyldes blant annet at de fleste studier som vurderer skjelettmuskelfettinfiltrasjon er utført hos mennesker, hvor mekanistiske undersøkelser er begrenset16,17. Imidlertid har små dyremodeller, inkludert mus, blitt brukt til å identifisere cellulær regulering av IMAT-utvikling og signalering18,19,20. Dette arbeidet tar sikte på å gi et nytt verktøy for bruk med små dyremodeller for kvalitativt visualisering og kvantifisering av skjelettmuskulaturfettinfiltrasjon.
Klinisk i humane populasjoner vurderes fettinfiltrasjon ved hjelp av ikke-invasive metoder, inkludert computertomografi (CT) 6,21, magnetisk resonansavbildning (MRI) 16,17,22,23 og ultralyd (US) 17,24. Disse bildebehandlingsteknikkene identifiserer vanligvis et definert interesseområde (ROI) i en muskel og skaffer seg bildeskiver innenfor den regionen, selv om omfattende tilnærminger også har blitt brukt25,26,27. Disse bildesnittene blir utsatt for kvalitativ gradering6 og kvantifisert via pikselterskel28. Lignende tilnærminger har blitt brukt hos dyr tidligere29,30; Imidlertid er de kostbare og krever tilgang til små dyreavbildningssystemer. Romlig oppløsning via CT- og MR-bruk utgjør også et stort problem, da de ikke er i stand til å avgrense IMAT-adipocytter fra skjelettmuskelfibre i en voxel og i stedet stole på subjektiv separasjon av primært muskelregioner og primært IMAT-regioner31,32. Som sådan presenterer manglende evne til nøyaktig å identifisere fett eller muskelvev også unøyaktig kvantifisering av representative mengder av disse vevene.
På grunn av disse begrensningene er nåværende teknikker for å vurdere skjelettmuskelfettinfiltrasjon i små dyremodeller oftest avhengige av histologi som et billig og tilgjengelig alternativ33,34. Standard fargeprosedyrer, inkludert hematoksylin og eosin (H &E), oljerød O (ORO) og immunfarging for adipocyttmarkører som perilipin, tillater enkel deteksjon og visualisering av adipocytter som omfatter fettinfiltrasjon i muskelen. Imidlertid er histologitilnærminger sjelden omfattende, og vanligvis er IMAT kvalitativ eller kvantitativ vurdering begrenset til en enkelt seksjon34. Lipidekstraksjon har også blitt brukt til å kvantifisere totale muskellipider35; Denne teknikken klarer imidlertid ikke å skille mellom intramyocellulær lipid (IMCL) og intramuskulært fettvev (IMAT) lagrer36. Oppsummert forblir dagens metoder for å visualisere og kvantifisere fett i muskler begrenset enten av økonomiske kostnader eller den spesifikke påvisningen av IMAT.
Her beskriver vi en detaljert metode for å vurdere skjelettmuskelfettinfiltrasjon både ved kvalitativ visualisering og multiskala kvantifisering. Denne metoden benytter en enkel decellulariseringsteknikk som fjerner myocellulære strukturer, inkludert IMCL, men holder de større IMAT-adipocyttavlederiverte lipiddråpene intakte. Validering av spesifisiteten til denne teknikken er publisert37, inkludert bruk av lipidekstraksjon for å vise uttømming av IMCL med decellularisering, μCT for å vise retensjon av IMAT-mønstre med decellularisering og histologi for å vise den tilsvarende størrelsesfordelingen av IMAT-lipiddråper sammenlignet med de som er identifisert med decellularisering. Når de er decellularisert, kan musklene farges med lipidløselige fargestoffer for kvalitativ visualisering av mønsteret og omfanget av fettinfiltrasjon og / eller kvantitativ avbildning av individuelle IMAT-lipiddråper. Fargestoffer kan deretter ekstraheres med isopropanol, og den optiske tettheten (OD) av den resulterende løsningen kan brukes til å estimere IMAT-lipidvolumet. Den strenge valideringen av denne teknikken er publisert andre steder37. Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for å bruke denne metoden med musemuskler og gir feilsøkingstips for å støtte bruken av denne metoden i andre applikasjoner, for eksempel muskler fra andre arter eller andre vev.
Protocol
Omsorg og ofring av mus ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for bruk og pleie av laboratoriedyr. Alt arbeid ble godkjent av Animal Studies Committee ved Washington University i St. Louis School of Medicine. Hannmus C57BL/6J i alderen 2-3 måneder (se materialfortegnelse) ble brukt til å generere eksempelbildene som er inkludert i denne protokollen. Alle trinnene beskrevet nedenfor utføres ved romtemperatur.
1. Muskel decellularisering
- Klargjør en 1 % w/v natriumdodecylsulfat (SDS; se materialtabell) oppløsning i fosfatbufret saltvann (PBS). Rør løsningen til den er helt blandet.
MERK: 1% SDS kan tilberedes i bulk og lagres ved romtemperatur i 1 måned. - Dissekere muskelen (e) av interesse som beskrevet tidligere38,39.
- Utsett musklene av interesse ved å fukte håret og huden med 70% etanolløsning, og deretter lage et transkutant snitt på ca. 2 cm etterfulgt av å fjerne dekkhuden med tang og vårsaks.
MERK: Muskelen (e) av interesse her inkluderer tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL) og membran. Noen muskler kan ligge dypt i annen muskulatur, noe som krever disseksjon av andre muskler (f.eks. Dissekering av EDL krever fjerning av TA). - Dissekere muskelen (e) av interesse ved hjelp av skarp saks eller kniver (se Tabell over materialer) for å sikre at hele omfanget av muskelen er oppnådd og kantene er glatte.
MERK: Dette gjøres ideelt under et dissekerende mikroskop for å forbedre visualiseringen. - Inspiser musklene for å sikre at ingen beinflis eller fillete kanter er inkludert, og trim deretter disse bort med skarp saks etter behov.
- Vei muskelen ved hjelp av en analytisk balanse og registrer vekten.
- Utsett musklene av interesse ved å fukte håret og huden med 70% etanolløsning, og deretter lage et transkutant snitt på ca. 2 cm etterfulgt av å fjerne dekkhuden med tang og vårsaks.
- Plasser dissekert muskel i minst 0,1 ml av 1% SDS per milligram vekt; 6-, 12- eller 24-brønnsplater fungerer godt for henholdsvis membran-, TA- og EDL-musmusklene. Typiske volumer er 6 ml, 3 ml og 1,5 ml for henholdsvis 6-, 12- og 24-brønnsplater.
MERK: SDS-løsningen vil noen ganger føre til at musklene deformeres, så sørg for at muskelen er flat / utvidet ved første nedsenking. - Plasser brønnplaten (eller andre beholdere) på en gyngende shaker satt til 50-80 Hz.
- Inspiser SDS-løsningen visuelt med jevne mellomrom. Når oppløsningen blir uklar, fjern oppløsningen med en pipette (pass på at du ikke aspirerer muskelen) og erstatt den med et likt volum frisk 1% SDS. Når løsningen forblir klar i 24 timer, er decellularisering fullført.
MERK: Frekvensen som kreves for oppløsningsendringer varierer etter muskelstørrelse og det opprinnelige løsningsvolumet. Større muskler som TA trenger ny SDS i løpet av få timer, og mindre muskler som EDL kan gå over natten i den opprinnelige løsningen. - Fjern den endelige SDS-løsningen fra de decellulariserte musklene med en pipette (pass på at du ikke aspirerer muskelen) og erstatt den med et like stort volum PBS.
- Inspiser visuelt de decellulariserte musklene under et dissekerende mikroskop og bruk tang og saks for å fjerne hår eller rusk som sitter fast i muskelen.
MERK: Legg også merke til klarheten i den decellulariserte muskelen i dette trinnet. Hvis den decellulariserte muskelen ikke er helt gjennomsiktig og SDS-løsningen ikke øker i skyighet over 24 timer, var decellulariseringen ikke effektiv. Dette skaper en artefakt i kvalitative og kvantitative vurderinger, og derfor bør decellularisering alltid optimaliseres på praksisprøver før du fortsetter med eksperimentelle muskler. - Fjern forsiktig PBS, erstatt den med et likt volum på 3,7% formaldehyd eller 4% paraformaldehydoppløsning, og sett platen tilbake i gyngeshakeren i 24 timer.
NOTAT: Forsikre deg om at formaldehydløsningen dekker den decellulariserte muskelen helt, ellers vil fargingen være ujevn.
2. Visualisering av IMAT med olje rød O
- Forbered en løsning av ORO.
- Løs opp 0,5 g ORO-pulver (se materialfortegnelse) i 100 ml isopropanol for å generere en stamløsning.
MERK: Tilsett forsiktig varme til løsningen for å løse den helt opp. Dette lageret kan lagres ved romtemperatur i 1 måned. - Kombiner ORO-stamløsningen og avionisert vann i forholdet 60:40 for å oppnå arbeidsløsningen som trengs for alle muskler ved bruk av et volum på minst 0,1 ml / mg muskelvekt. Typiske volumer er 6 ml, 3 ml og 1,5 ml for henholdsvis 6-, 12- og 24-brønnsplater.
MERK: Inspiser stamoppløsningen før blanding. Hvis stamløsningen inneholder betydelige partikler, må du lage fersk kraft. - Dekk til arbeidsløsningen i 10 minutter slik at partiklene kan sette seg.
- Filtrer arbeidsløsningen gjennom et 40 μm nett, etterfulgt av et 0,22 μm sprøytefilter.
MERK: 0,22 μm sprøytefilteret tetter seg raskt og må skiftes ut hvis arbeidsløsningen ikke presser lett gjennom.
- Løs opp 0,5 g ORO-pulver (se materialfortegnelse) i 100 ml isopropanol for å generere en stamløsning.
- Fjern formaldehyd- eller paraformaldehydoppløsningen og vask de decellulariserte musklene med tre løsningsendringer med like stort volum PBS.
- Bytt PBS med et likt volum på 60% isopropanoloppløsning og inkuber på en gyngende shaker i 5 minutter.
- Bytt ut 60% isopropanoloppløsningen med ORO arbeidsløsning og inkuber på gyngeshakeren i 10 minutter.
NOTAT: Forsikre deg om at ORO-arbeidsløsningen dekker den decellulariserte muskelen helt, ellers vil fargingen være ujevn. - Bytt ut ORO-arbeidsløsningen med et like stort volum på 1% SDS. Inspiser SDS-løsningen visuelt med jevne mellomrom. Når løsningen blir merkbart rosa, fjern løsningen med en pipette (pass på at du ikke aspirerer muskelen) og erstatt den med frisk 1% SDS.
- Når oppløsningen forblir klar i 24 timer, erstatt 1% SDS med PBS og inspiser den fargede muskelen under et dissekering / stereomikroskop ved 4x forstørrelse. Fjern åpenbart rusk eller partikler som sitter fast på utsiden av muskelen. Hvis dette er omfattende, kan den decellulariserte muskelen rulles forsiktig på et rengjøringspapir for å trekke av rusk / partikler.
- Hvis fargingen er tilfredsstillende (lyse røde kuler som flyter i en gjennomsiktig matrise), ta bilder av fargingen etter ønske ved hjelp av et kamera festet til stereomikroskopet (se Materialfortegnelse).
MERK: Hvis dissekeringsmikroskopet ikke har et tilkoblet kamera, kan et telefonkamera brukes til å ta bilder gjennom okularet.
3. Visualisering av IMAT lipiddråper med BODIPY
MERK: Konfokal avbildning er mest effektiv med tynne muskler som EDL eller membran (~ 2 mm tykkelse). Alternativt kan sammenlignbare tykkelsesstrimler av muskler som TA brukes.
- Klargjør en 1:200 oppløsning av fluorescerende BODIPY 493/503 (se materialfortegnelse) i PBS for å oppnå et arbeidsløsningsvolum på minst 0,1 ml / mg muskelvekt. Typiske volumer er 6 ml, 3 ml og 1,5 ml for henholdsvis 6-, 12- og 24-brønnsplater.
- Fjern formaldehyd, paraformaldehyd eller 1% SDS og vask de decellulariserte musklene med tre løsningsendringer med like stort volum PBS.
- Bytt PBS med BODIPY arbeidsløsning og rug på gyngeshakeren i 20 minutter.
- Vask de decellulariserte musklene med tre løsningsendringer med like stort volum PBS.
- Plasser muskelen i et klarbunnet kar som er kompatibelt med et tilgjengelig konfokalmikroskop. Ideelt sett vil parabolen ha en innfelt bunn for å plassere et deksel over muskelen uten å deformere den (se materialfortegnelse).
- Få bildestakker med et standard konfokalmikroskop (se materialfortegnelse) ved hjelp av 488-laseren. Typiske stabelstørrelser for en EDL er 0,5-1 mm med en tykkelse på 10 μm, noe som gir 50-100 bilder per stabel.
MERK: For å kvantifisere totalt lipidvolum, det totale antallet IMAT-lipiddråper og nærmeste naboindeks for klynging, bilde gjennom hele muskelvolumet, og pass på å la noe overlapping for bilderegistrering. For å kvantifisere gjennomsnittlig lipiddråpevolum kan en stabel være tilstrekkelig. - Hvis ønskelig, flekk musklene med ORO, i henhold til seksjon 2, for et gratis helmuskelbilde av IMAT-distribusjon.
MERK: Fordi BODIPY er fluorescerende, vil det ikke være synlig under lysmikroskopet når bilder av ORO er anskaffet.
4. Estimering av totalt lipidvolum ved lipidekstraksjon
- Etter bildeinnsamling overfører du musklene til 200 μL isopropanol i individuelle brønner på en 96-brønnsplate, eller tilpasser brønnen/volumet hvis muskelen er for stor til å passe.
- Beveg oppløsningen ved å banke på platen, pipetere oppløsningen opp og ned og/eller mekanisk knuse muskelen med en pipettespiss til ingen røde/fluorescerende kuler kan sees i den decellulariserte muskelen under et mikroskop.
MERK: Behandle alle musklene med samme kombinasjon av tapping, pipettering og knusing for best pålitelighet. Pass også på å begrense tiden du bruker på å tappe, pipettere og knuse, da isopropanolen vil fordampe raskt. - Bland løsningen i hver brønn ved å pipettere opp og ned, og overfør deretter 75 μL til to rene brønner på platen.
- Dekk til platen og avles absorbansen til de dupliserte 75 μL-brønnene ved hjelp av et spektrofotometer eller plateleser. Hvis konstruksjonen ble farget med ORO, les løsningen ved 500 nm; hvis den var farget med BODIPY 493/503, les platen på 493 nm.
MERK: Hvis konstruksjonen ble farget med både BODIPY og ORO, anbefales det å lese platen ved 500 nm, da 500 nm leser gir lignende resultater mellom konstruksjoner farget med ORO bare og ORO pluss BODIPY. - Del absorbansavlesningen med den registrerte vekten av muskelen om ønskelig for å korrigere for størrelsesforskjeller mellom prøvene.
5. Kvantifisering av IMAT lipiddråpeberegninger fra konfokale bilder
MERK: Denne delen krever tilgang til ImageJ versjon 1.47 (se Materialfortegnelse) eller nyere og grunnleggende ImageJ-ferdigheter40.
- Åpne konfokale stakker i ImageJ.
MERK: Ulike konfokale mikroskoper kan lagre konfokale bilder i forskjellige formater. ImageJ kan kreve en ekstra plugin eller variant, for eksempel Fiji, for å åpne stablene41. Algoritmene som brukes er en del av programvarepakken ImageJ. - Kjør en terskelalgoritme i ImageJ for å identifisere BODIPY positive piksler. Dette konverterer gjeldende bilde til et binært bilde.
- Åpne terskelbrukergrensesnittet ved å velge Bilde > Juster > terskel. I brukergrensesnittet velger du Intermodes som terskeltype og sørger for at Mørk bakgrunn er valgt. Ingen andre alternativer trenger å velges. Klikk deretter på Bruk.
- Det åpnes en dialogboks der du konverterer stakken til binær. Kontroller at følgende alternativer er valgt: Metode: Intermodus; Bakgrunn: Mørk. Beregn terskelen for hvert bilde og svart bakgrunn (av binære masker). Dette genererer en binær stakk, der hvitt indikerer BODIPY positive piksler og svart indikerer BODIPY negative piksler.
MERK: Intermodes-terskelalgoritmen er kanskje ikke det beste valget for alle brukere. Subjektiv inspeksjon av de innebygde terskelalternativene til ImageJ hjelper deg med å velge den optimale algoritmen for å skille BODIPY positive og negative piksler.
- Kjør vannskillealgoritmen i ImageJ for å skille berøring av lipiddråper. Velg Prosess > binær > vannskille. Det åpnes en dialogboks som spør om alle bildene i stakken skal behandles. Velg Ja. Dette legger til tynne svarte linjer som deler større områder av solid hvitt.
- Identifiser avkastning med algoritmen Analyser partikler i ImageJ.
- Velg Analyser > analyser partikler. Det åpnes en dialogboks der du kan angi valginnstillingene.
MERK: Valg av størrelsesområde er avgjørende for å oppnå det beste estimatet av lipiddråpeavkastning. Den nedre grensen eliminerer regioner som sannsynligvis er for små til å være IMAT-avledede lipiddråper (bakgrunnsartefakt), og den øvre grensen eliminerer regioner som sannsynligvis er for store til å være enkle IMAT-avledede lipiddråper (berører lipiddråper som ikke ble separert av vannskillealgoritmen). - For å angi disse verdiene, åpne det opprinnelige bildet og skissere den minste og største lipiddråpen som vises ved hjelp av det ovale verktøyet. Deretter legger du til disse figurene i ROI-behandleren ved å skrive "t". Velg Analyser og deretter Angi målinger. Det åpnes en dialogboks der du kan velge innstillingene.
- Merk av for Bare område , og klikk OK. Velg deretter Mål fra ROI Manger. Bruk målene for to områder fra dette resultatvinduet som størrelsesområde i Analyser partikler.
- Kontroller at det er merket av for Legg til leder. Ingen andre alternativer er nødvendig.
- Velg Analyser > analyser partikler. Det åpnes en dialogboks der du kan angi valginnstillingene.
- Legg over avkastningen på konfokalstabelen ved å merke av for Vis alle i ROI Manager. Bruk glidebryteren til å undersøke hvert stakkstykke enkeltvis, og legg til manglende områder manuelt ved hjelp av det ovale verktøyet (på ImageJ-verktøylinjen).
- Send ut ROI-målingene. Velg Analyser > Angi mål , og velg Område, Centroid, Tilpass-ellipse og Stakkposisjon. Klikk på OK. Velg deretter Mål fra ROI Manger. Dataene i resultattabellen kan velges og kopieres til Matlab eller Excel for videre analyse.
- Finjuster avkastningen i hver stabel til én enkelt avkastning ved hjelp av Refine.m Matlab-kode37 eller en lignende algoritme.
MERK: Dette trinnet er nødvendig ettersom trinn 5.2-5.4 identifiserer den samme lipiddråpen i tilstøtende skiver som distinkte avkastninger. Imidlertid kan ROIer alternativt bare identifiseres for hånd, eller dupliserte avkastninger kan elimineres for hånd i ImageJ for å unngå behovet for Matlab. - Hent sammendragsstatistikken i ROI ved hjelp av Matlab eller Excel.
- Beregn totalt antall lipiddråper som totalt antall avkastninger.
- Estimere lipiddråpevolum som volumet av ellipsen montert på hver 2D ROI, forutsatt at dybden av formen er gjennomsnittet av ellipsens store og mindre akser.
- Beregn det totale lipidvolumet, som er summen av individuelle estimerte lipiddråpevolumer.
Representative Results
Kvalitativ visualisering av skjelettmuskulaturfettinfiltrasjon
Riktig decellulariserte muskler er hvite og halvtransparente (seksjon 1; Figur 1). Når decellulariserte muskler farges med ORO for å visualisere IMAT (seksjon 2), er IMAT-lipiddråper tydelige i de klare muskelstrukturene som røde kuler (figur 1). Friske mus baklemmer muskler har lite naturlig IMAT, dokumentert av liten eller ingen rød, ORO positiv lipid (figur 1A). Til sammenligning injiseres baklemmemuskulaturen med kardiotoksin (CTX; Figur 1B) eller glyserol (GLY; Figur 1C) 14 dager før decellularisering har en økt akkumulering av IMAT, med en større konsentrasjon av IMAT etter CTX sammenlignet med GLY som tidligere nevnt37.
Ufullstendig decellularisering kan identifiseres umiddelbart etter innledende SDS-behandling eller etter utvasking av ORO-fargingen som semi-ugjennomsiktige, lyserosa fibre (figur 2B sammenlignet med figur 2A). Ufullstendig clearance av ORO kan identifiseres etter ORO-utvasking som en rosa eller rød ensartet bakgrunn, i stedet for distinkte fiberlinjer (figur 2C). Figur 2A,B inneholder også epimuskulær adipose (stjerner), en klump av lipiddråper utenfor den decellulariserte muskelen. Figur 2C viser også muskelfoldingen som kan oppstå hvis musklene ikke spres ut under decellularisering. Ufullstendig decellularisering, ufullstendig ORO-clearance og gjenværende epimuskulær adipose øker alle artifakter (OD) av ekstrahert lipid, men hindrer ikke nødvendigvis kvalitativ vurdering av fettinfiltrasjon hvis de gjenkjennes som en artefakt.
Kvantitativ avbildning av skjelettmuskelfettinfiltrasjon
BODIPY fluorescerende merkede lipiddråper kan avbildes via konfokalmikroskopi for en mer detaljert vurdering av individuelle lipiddråpemålinger og distribusjon (figur 3). Denne prosessen er halvautomatisert, som tidligere beskrevet, inkludert Matlab-kode37. God BODIPY-farging resulterer i lyse elliptiske former avgrenset fra naboformer når de avbildes i plan (figur 3A). Terskel og formsegmentering gir et godt første pass for å generere avkastning for hver lipiddråpe (figur 3B), men manuelle redigeringer er nødvendige for å rette feil. Den mest gjennomgripende feilen er lipiddråper som er dype i vevet og dermed ikke lyser på noen skiver (figur 3B; rosa dobbeltpiler). Dette kan løses ved å legge til ROI for hånd ved hjelp av det ovale verktøyet i ImageJ (figur 3C). Den andre er å identifisere en gruppe lipiddråper som en enkelt avkastning (figur 3B; rød stjerne). Dette kan korrigeres ved å slette og erstatte den opprinnelige avkastningen med flere nye avkastninger (figur 3D). Til slutt identifiseres en enkelt lipiddråpe som en unik avkastning i flere skiver, slik at de dupliserte avkastningene må konsolideres til en enkelt avkastning (figur 3E; blå pil). Dette gjøres enklest ved hjelp av et databehandlingsverktøy som Matlab, men kan også gjøres for hånd ved å identifisere den største avkastningen og slette resten. Gjennomsnittsverdier for hver beregning i C57BL6/J og 129Sv-musen finnes i Biltz et al.37.
Figur 1: Eksempel på oljerød O (ORO) farging av decellulariserte muskler. ORO-fargede muskler 14 dager etter injeksjon med saltvann (SAL), kardiotoksin (CTX) eller glyserol (GLY). Mus extensor digitorum longus (EDL) og tibialis anterior (TA) muskler har lite IMAT (røde kuler) med SAL-behandling (A), men akkumulerer IMAT som respons på CTX (B) og GLY (C) behandling. Det er en fullstendig decellularisering og ORO-utvasking, dokumentert av forskjellige ORO-positive lipiddråper i en gjennomsiktig hvit muskelbakgrunn. Skala barer = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempler på dårlige ORO-fargeresultater. Ufullstendig decellularisering eller ufullstendig ORO-clearance fører til en semi-ugjennomsiktig rosa/rød bakgrunn. Sammenlignet med den gjennomsiktige hvite bakgrunnen av fullstendig decellularisert musmembranmuskel (A), er ufullstendig decellularisering preget av lyserosa / røde fiberspor (B), og ufullstendig ORO-clearance er preget av en diffus rosa / rød bakgrunn (C). Skalastenger: øvre paneler = 1 mm; nedre paneler = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på individuell lipiddråpeidentifikasjon med fluorescerende BODIPY-farging og konfokalmikroskopi Individuelle BODIPY-fargede lipiddråper kan identifiseres og kvantifiseres i decellulariserte muskler ved bruk av konfokalmikroskopi. Individuelle skiver gjennom en konfokal stabel viser lipiddråper i plan som lysegrønne ellipser, og lipiddråper ut av plan som svakere former (A; blå piler). Terskel kombinert med vannskilleobjektsegmentering og ROI-identifikasjon kan kartlegge BODIPY-farget avkastning (B). Terskel kan savne noen svakere lipiddråper (B; rosa dobbeltpil), som krever identifikasjon for hånd (C). Vannskillesegmentering kan gruppere flere lipiddråper sammen (B; rød stjerne), som krever sletting av avkastningen og estimering for hånd (D). Den samme lipiddråpen identifiseres i flere skiver som krever bilderegistrering (E) for å slette de dupliserte avkastningene. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver metoder for kvalitativt å visualisere og kvantifisere skjelettmuskelfettinfiltrasjon i smådyrmodeller som kan anvendes til videre forståelse av patogenesen av intramuskulær fettvevsutvikling (IMAT) og patologisk ekspansjon. Bruken av decellularisering av hele muskler og lipidløselig farging muliggjør en kostnadseffektiv, reproduserbar og enkel metodikk for å vurdere tilstedeværelsen av IMAT i hele muskler.
Grunnlaget for denne protokollen er at decellularisering av muskler med SDS fjerner de cellulære komponentene av myofibre, inkludert de små lipiddråpene av IMCL, men sparer de store lipiddråpene i intramyocellulære adipocytter. SDS har blitt brukt mye42 i vevsteknikk for å decellularisere matriser. Vev som fett- og skjelettmuskulatur krever vanligvis ytterligere mekanisk dissosiasjon og / eller alkoholekstraksjon for å fjerne gjenværende adipocyttlipid42,43. Vi har tidligere vist at dette skyldes at mens decellularisering med SDS eliminerer IMCL, sparer det den store lipiddråpen i adipocytter37. Avbildning av osmiumtetroksidfarget intakt muskel før og etter decellularisering med μCT verifiserte at det romlige mønsteret til IMAT ikke ble forstyrret av decellularisering. Videre var intramuskulær triglyseridkvantifisering i en decellularisert muskel med ubetydelig IMAT ~ 5% av de intakte muskelverdiene, noe som verifiserte fjerning av IMCL. Derfor beholder denne metoden IMAT-lipiddråper i sin opprinnelige anatomiske fordeling gjennom en halvtransparent muskelmatrise.
Riktig decellularisering er det mest kritiske trinnet i denne protokollen. Hvis decellulariseringen er ufullstendig, vil IMAT-lipiddråper være vanskelige å visualisere, og gjenværende IMCL vil forårsake høy bakgrunnsfarging med enten ORO eller BODIPY (figur 2). Vanlige feil hos uerfarne brukere er mangelfull SDS-dekning per muskel (innenfor hver brønn), slik at hver muskel ikke er helt dekket i SDS-løsning, ikke bruker en vippe til å agitere løsningen under decellularisering, og ikke utfører løsningsendringer ofte nok. I dette manuskriptet har vi anbefalt mengden SDS som trengs per enhet muskelmasse, men brukeren må fortsatt sørge for at musklene er fullstendig dekket av løsninger, da hver muskel har en unik geometri. Brukere anbefales også å endre løsningene liberalt (så mye som to ganger per dag) for å sikre at decellularisering er fullført. God kvalitet farging av IMAT lipiddråper er oppnådd etter så mange som 4 dager med SDS-behandling. For ORO-fargeresultater av høy kvalitet er tilstrekkelig fiksering og forberedelse av ORO-løsning også viktig. I likhet med SDS-behandlingen beskrevet ovenfor, er det nødvendig med tilstrekkelig dekning av 3,7% formaldehydoppløsning for hver muskelprøve. Hvis muskelen fjernes fra fiksativet for tidlig, vil lipiddråper bare svakt flekke med ORO. Totalt 1-2 timer bør være tilstrekkelig, men fiksering over natten anbefales for å sikre at fiksativet trenger inn i midten av muskelen og fikserer alle lipiddråper helt. En ekstra utfordring med ORO-farging er at når alkoholkonsentrasjonen reduseres til 60%, begynner det å danne seg partikler. Dette partikkelformede kan slå seg ned på overflaten og bli sittende fast på grensen til muskel. Den beste måten å unngå dette på er å lage en ny arbeidsløsning for hver farging og bruke både 40 mesh μm og 0,22 μm filtre. Deretter vil det å opprettholde omrøring med vipperen og begrense fargetiden til 10 minutter bidra til å forhindre at partikler som dannes legger seg. Hvis problemet vedvarer, kan det hjelpe å lage en ny ORO-lagerløsning. Hvis noen artefakter forblir fast på den decellulariserte muskeloverflaten, kan et stereomikroskop, tang og kirurgisk saks brukes til å fjerne denne gjenstanden. Unnlatelse av å eliminere artefakter vil påvirke bildekvaliteten på musklene og overvurdere IMAT-innholdet under lipidekstraksjonsdelen som forberedelse til OD-lesing.
Samlet sett er denne teknikken enkel og gir flere fordeler i forhold til gullstandardmetoder for visualisering og kvantifisering av skjelettmuskulaturfettinfiltrasjon. Ikke-invasive teknikker, som CT, MR og US, som brukes mye hos mennesker og noen ganger i dyremodeller, har begrenset romlig oppløsning og er ikke i stand til å skille lipiddråper fra muskelfibre. Dermed er en piksel eller voxel av mellomliggende signalintensitet tildelt som "muskel" eller "fett", mens det i virkeligheten sannsynligvis er en blanding av myofibre og adipocytter. Mer vanlig er fettinfiltrasjon i dyremuskel vurdert ved histologi, hyppigst ved ORO i muskelkryoseksjoner. Dette utføres imidlertid vanligvis bare i en enkelt representativ seksjon og er vanskelig å kvantifisere på grunn av lipidspredning over seksjonen. Derimot gir ORO-farging av en hel decellularisert muskel en omfattende vurdering av IMAT med lignende kostnader og innsats som intakt morfologi. Videre, i tillegg til å forbedre visualisering, muliggjør ORO-farging av decellularisering kvantifisering av fettinfiltrasjon ved lipidekstraksjon. For et dypere dykk inn i egenskapene til fettinfiltrasjon, kan en fluorescerende flekk, BODIPY, brukes i forbindelse med konfokal mikroskopi. Dette muliggjør rekonstruksjon av individuelle IMAT-lipiddråper for å kartlegge 3D-landskapet, noe som ikke er mulig med histologi med mindre seksjoner analyseres over muskelens lengde. Mens et konfokalmikroskop ikke er standard laboratorieutstyr, er det mer sannsynlig å være tilgjengelig på et universitet eller industri enn smådyr MR eller CT. Videre kan mye av denne prosessen automatiseres, noe som reduserer tidskostnaden sammenlignet med sekvensiell histologi. Optimalisering av innstillingene på konfokalmikroskopet er en ekstra vurdering for BODIPY-farging. Disse er unike for hvert mikroskop. Den kritiske verdien er laserintensitet, som må være høy nok til å oppdage lipiddråpene på den fjerne overflaten av muskelen, samtidig som den ikke metter signalet fra lipiddråpene på nærsiden. På grunn av dette foreslås det at bruk av BODIPY-farging med konfokalmikroskopi er best egnet på tynnere muskler, inkludert EDL eller membran.
Flere begrensninger ved denne tilnærmingen berettiger diskusjon. For det første, mens det forventes at denne teknikken har bred anvendelighet utover skademodeller (kardiotoksin og glyserol) hos mus som presenteres her, kan nye applikasjoner (f.eks. MDX-modellen) kreve optimalisering, da størrelsen og sammensetningen av muskelen (f.eks. Fibrose) kan påvirke decellularisering, noe som krever økt SDS-konsentrasjon eller inkubasjonstider. Andre sykdomsmodeller med endret muskelmasse vil også kreve analyse av både absolutte og normaliserte (til muskelmasse) beregninger av fettinfiltrasjon for å bestemme den absolutte mengden lipid eller prosentandel lipid i forhold til muskelvolumet for å gi et mer meningsfylt utfallsmål. Videre forventes denne teknikken å være bredt anvendelig for større dyremodeller og humane biopsier, men dette kan kreve optimalisering for hver ny applikasjon. For det andre, i denne strategien, må hele muskelen være dedikert til denne analysen og kan ikke brukes til å vurdere et annet patologisk trekk. Studier som tar sikte på å vurdere langsgående endringer i IMAT er bedre tjent med ikke-invasive bildebehandlingsteknikker og studier hvis primære mål krever muskelen til andre formål (histologi, kvantitativ polymerasekjedereaksjon, vestlig blotting) er bedre tjent med histologisk vurdering, da resten av den frosne muskelen kan allokeres til andre analyser. Imidlertid er denne analysen godt egnet til å parre med in vivo-testing, for eksempel tredemølleløping eller ex vivo kontraktil testing, siden disse tiltakene kan gjøres før decellularisering44. For det tredje, selv om bruken av BODIPY-flekk med konfokalmikroskopi gir høyoppløselig visualisering og kvantifisering av lipiddråper, kan den ikke endelig identifisere lipiddråper som individuelle adipocytter, da cellemembranen fjernes og endogene adipocyttproteiner går tapt. Multilokulære adipocytter, som representerer umodne adipocytter eller en "brun / beige" fenotype, kan identifiseres som flere lipiddråper. Endelig fungerer protokollen ikke bra på tidligere frossen muskel. Disse begrensningene er sannsynligvis mest dyptgripende for humane biopsier, da mens hele biopsien kan decellulariseres, er den romlige fordelingen av IMAT i biopsien sannsynligvis ikke mer representativ for hele muskelen enn et histologisk stykke. Men siden denne teknikken er relativt ufølsom for ikke-frosne biopsihåndteringsforhold (f.eks. Timer på is i PBS), kan biopsien deles senere for forskjellige analyser, inkludert en del for decellularisering, noe som vil gi en bedre oppløsning av individuelle lipiddråper.
Avslutningsvis har en ny metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av skjelettmuskelfettinfiltrasjon blitt utviklet ved farging og avbildning av det beholdte lipidet av decellulariserte konstruksjoner. Denne metodikken gir forbedringer i forhold til gullstandardtilnærminger, ved at den muliggjør omfattende avbildning av tredimensjonal fettinfiltrasjon i muskler og rask, billig kvantifisering med ORO-farging. For mer detaljerte målinger gir en andre lipidløselig BODIPY-flekk en mer detaljert kvantifisering av lipiddråpenummer, volum og distribusjonsmønster, som avbildet ved konfokalmikroskopi. Sammen gir disse tiltakene forskere en måte å nøyaktig måle skjelettmuskulaturfettinfiltrasjon på nivået av de enkelte lipiddråpene uten prøvetaking eller kostbar ikke-invasiv avbildning.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av R01AR075773 til GAM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
| 1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| 12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
| 12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
| 37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
| 40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
| 6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
| Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
| ImageJ | NIH | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
| Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |
References
- Delmonico, M. J., et al. Longitudinal study of muscle strength, quality, and adipose tissue infiltration. The American Journal of Clinical Nutrition. 90 (6), 1579-1585 (2009).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
- Freda, P. U., et al. Lower visceral and subcutaneous but higher intermuscular adipose tissue depots in patients with growth hormone and insulin-like growth factor I excess due to acromegaly. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 93 (6), 2334-2343 (2008).
- Garg, A., Peshock, R. M., Fleckenstein, J. L. Adipose tissue distribution pattern in patients with familial partial lipodystrophy (Dunnigan variety). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84 (1), 170-174 (1999).
- Gorgey, A. S., Dudley, G. A. Skeletal muscle atrophy and increased intramuscular fat after incomplete spinal cord injury. Spinal Cord. 45 (4), 304-309 (2007).
- Goutallier, D., Postel, J. M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre- and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. (304), 78-83 (1994).
- Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
- Elder, C. P., Apple, D. F., Bickel, C. S., Meyer, R. A., Dudley, G. A. Intramuscular fat and glucose tolerance after spinal cord injury-a cross-sectional study. Spinal Cord. 42 (12), 711-716 (2004).
- Albu, J. B., et al. Independent association of insulin resistance with larger amounts of intermuscular adipose tissue and a greater acute insulin response to glucose in African American than in white nondiabetic women. The American Journal of Clinical Nutrition. 82 (6), 1210-1217 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Mueller, M. J. Intermuscular adipose tissue is muscle specific and associated with poor functional performance. Journal of Aging Research. 2012, 172957 (2012).
- Gerber, C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., Meyer, D. C. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16 (6), 691-696 (2007).
- Hilton, T. N., Tuttle, L. J., Bohnert, K. L., Mueller, M. J., Sinacore, D. R. Excessive adipose tissue infiltration in skeletal muscle in individuals with obesity, diabetes mellitus, and peripheral neuropathy: association with performance and function. Physical Therapy. 88 (11), 1336-1344 (2008).
- Gaeta, M., et al. Muscle fat-fraction and mapping in Duchenne muscular dystrophy: evaluation of disease distribution and correlation with clinical assessments. Preliminary experience. Skeletal Radiology. 41 (8), 955-961 (2012).
- Buford, T. W., et al. Age-related differences in lower extremity tissue compartments and associations with physical function in older adults. Experimental Gerontology. 47 (1), 38-44 (2012).
- Addona, J., et al. Estimating 3D supraspinatus intramuscular fatty infiltration in older adults: a pilot study. Acta Radiologica. , 2841851221139597 (2022).
- Crook, J., et al. Comparison of multifidus muscle intramuscular fat by ultrasound echo intensity and fat-water based MR images in individuals with chronic low back pain. Musculoskeletal Science & Practice. 63, 102717 (2023).
- Lee, C., et al. Beige FAPs transplantation improves muscle quality and shoulder function after massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 1159-1166 (2020).
- Lee, C., et al. Beige fibro-adipogenic progenitor transplantation reduces muscle degeneration and improves function in a mouse model of delayed repair of rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 29 (4), 719-727 (2020).
- Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
- Overend, T. J., Cunningham, D. A., Paterson, D. H., Lefcoe, M. S. Thigh composition in young and elderly men determined by computed tomography. Clinical Physiology. 12 (6), 629-640 (1992).
- Li, W., et al. Progression and variation of fatty infiltration of the thigh muscles in Duchenne muscular dystrophy, a muscle magnetic resonance imaging study. Neuromuscular Disorders. 25 (5), 375-380 (2015).
- Davis, D. L., et al. Supraspinatus fatty infiltration on MRI among older adults receiving physical therapy as initial management for clinically suspected rotator cuff tear: A pilot study. Journal of Clinical Imaging Science. 12, 66 (2022).
- Salaffi, F., et al. Ultrasound and magnetic resonance imaging as diagnostic tools for sarcopenia in immune-mediated rheumatic diseases (IMRDs). La Radiologia Medica. 127 (11), 1277-1291 (2022).
- Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: a novel depot similar in size to visceral adipose tissue. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (4), 903-910 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Cade, W. T., Mueller, M. J. Lower physical activity is associated with higher intermuscular adipose tissue in people with type 2 diabetes and peripheral neuropathy. Physical Therapy. 91 (6), 923-930 (2011).
- Matsumura, N., et al. Quantitative assessment of fatty infiltration and muscle volume of the rotator cuff muscles using 3-dimensional 2-point Dixon magnetic resonance imaging. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 26 (10), 309-318 (2017).
- Cheuy, V. A., Hastings, M. K., Commean, P. K., Ward, S. R., Mueller, M. J. Intrinsic foot muscle deterioration is associated with metatarsophalangeal joint angle in people with diabetes and neuropathy. Clinical Biomechanics. 28 (9-10), 1055-1060 (2013).
- Samagh, S. P., et al. MRI quantification of fatty infiltration and muscle atrophy in a mouse model of rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 31 (3), 421-426 (2013).
- Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: an experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
- Goodpaster, B. H., Kelley, D. E., Thaete, F. L., He, J., Ross, R. Skeletal muscle attenuation determined by computed tomography is associated with skeletal muscle lipid content. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 104-110 (2000).
- Torriani, M., et al. Lower leg muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MR imaging and spectroscopy study. Skeletal Radiology. 41 (4), 437-445 (2012).
- Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
- Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (13), 2270-2278 (2010).
- Li, B., et al. Skeletal muscle respiratory uncoupling prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Medicine. 6 (10), 1115-1120 (2000).
- Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
- Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), 1 (2017).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), 50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Ungerleider, J. L., Johnson, T. D., Rao, N., Christman, K. L. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).
- Biltz, N. K., et al. Infiltration of intramuscular adipose tissue impairs skeletal muscle contraction. The Journal of Physiology. 598 (13), 2669-2683 (2020).
