Denne studien beskriver decellulariseringsbaserte metoder for visualisering og kvantifisering av intramuskulært fettvev (IMAT) avsetning gjennom intakt muskelvolum, samt kvantifisering av beregninger av individuelle adipocytter som omfatter IMAT.
Fet infiltrasjon er akkumulering av adipocytter mellom myofibre i skjelettmuskulatur og er et fremtredende trekk ved mange myopatier, metabolske forstyrrelser og dystrofier. Klinisk i humane populasjoner vurderes fettinfiltrasjon ved hjelp av ikke-invasive metoder, inkludert computertomografi (CT), magnetisk resonansavbildning (MR) og ultralyd (US). Selv om noen studier har brukt CT eller MR for å kvantifisere fettinfiltrasjon i musemuskel, er kostnader og utilstrekkelig romlig oppløsning fortsatt utfordrende. Andre små dyremetoder benytter histologi for å visualisere individuelle adipocytter; Denne metoden lider imidlertid av utvalgsskjevhet i heterogen patologi. Denne protokollen beskriver metodikken for å kvalitativt vise og kvantitativt måle fettinfiltrasjon omfattende gjennom intakt musemuskulatur og på nivå med individuelle adipocytter ved bruk av decellularisering. Protokollen er ikke begrenset til spesifikke muskler eller spesifikke arter og kan utvides til menneskelig biopsi. I tillegg kan brutto kvalitative og kvantitative vurderinger gjøres med standard laboratorieutstyr for liten kostnad, noe som gjør denne prosedyren mer tilgjengelig på tvers av forskningslaboratorier.
Akkumulering av adipocytter mellom myofibre i skjelettmuskulaturen er et fremtredende trekk ved ulike tilstander, fra type 2 diabetes til sarkopeni til muskel- og skjelettskade 1,2,3,4,5,6,7. Omfattende vurdering av dette intramuskulære fettvevet (IMAT) er avgjørende for å forstå patogenesen til disse tilstandene, da IMAT-avleiring er sterkt korrelert med insulinresistens 3,8,9,10 og dårlig skjelettmuskelfunksjon 11,12,13,14,15 . Selv om disse foreningene har blitt notert i flere tiår, er mekanismene knyttet til og opprinnelsen til IMAT fortsatt et område med intens etterforskning. Dette skyldes blant annet at de fleste studier som vurderer skjelettmuskelfettinfiltrasjon er utført hos mennesker, hvor mekanistiske undersøkelser er begrenset16,17. Imidlertid har små dyremodeller, inkludert mus, blitt brukt til å identifisere cellulær regulering av IMAT-utvikling og signalering18,19,20. Dette arbeidet tar sikte på å gi et nytt verktøy for bruk med små dyremodeller for kvalitativt visualisering og kvantifisering av skjelettmuskulaturfettinfiltrasjon.
Klinisk i humane populasjoner vurderes fettinfiltrasjon ved hjelp av ikke-invasive metoder, inkludert computertomografi (CT) 6,21, magnetisk resonansavbildning (MRI) 16,17,22,23 og ultralyd (US) 17,24. Disse bildebehandlingsteknikkene identifiserer vanligvis et definert interesseområde (ROI) i en muskel og skaffer seg bildeskiver innenfor den regionen, selv om omfattende tilnærminger også har blitt brukt25,26,27. Disse bildesnittene blir utsatt for kvalitativ gradering6 og kvantifisert via pikselterskel28. Lignende tilnærminger har blitt brukt hos dyr tidligere29,30; Imidlertid er de kostbare og krever tilgang til små dyreavbildningssystemer. Romlig oppløsning via CT- og MR-bruk utgjør også et stort problem, da de ikke er i stand til å avgrense IMAT-adipocytter fra skjelettmuskelfibre i en voxel og i stedet stole på subjektiv separasjon av primært muskelregioner og primært IMAT-regioner31,32. Som sådan presenterer manglende evne til nøyaktig å identifisere fett eller muskelvev også unøyaktig kvantifisering av representative mengder av disse vevene.
På grunn av disse begrensningene er nåværende teknikker for å vurdere skjelettmuskelfettinfiltrasjon i små dyremodeller oftest avhengige av histologi som et billig og tilgjengelig alternativ33,34. Standard fargeprosedyrer, inkludert hematoksylin og eosin (H &E), oljerød O (ORO) og immunfarging for adipocyttmarkører som perilipin, tillater enkel deteksjon og visualisering av adipocytter som omfatter fettinfiltrasjon i muskelen. Imidlertid er histologitilnærminger sjelden omfattende, og vanligvis er IMAT kvalitativ eller kvantitativ vurdering begrenset til en enkelt seksjon34. Lipidekstraksjon har også blitt brukt til å kvantifisere totale muskellipider35; Denne teknikken klarer imidlertid ikke å skille mellom intramyocellulær lipid (IMCL) og intramuskulært fettvev (IMAT) lagrer36. Oppsummert forblir dagens metoder for å visualisere og kvantifisere fett i muskler begrenset enten av økonomiske kostnader eller den spesifikke påvisningen av IMAT.
Her beskriver vi en detaljert metode for å vurdere skjelettmuskelfettinfiltrasjon både ved kvalitativ visualisering og multiskala kvantifisering. Denne metoden benytter en enkel decellulariseringsteknikk som fjerner myocellulære strukturer, inkludert IMCL, men holder de større IMAT-adipocyttavlederiverte lipiddråpene intakte. Validering av spesifisiteten til denne teknikken er publisert37, inkludert bruk av lipidekstraksjon for å vise uttømming av IMCL med decellularisering, μCT for å vise retensjon av IMAT-mønstre med decellularisering og histologi for å vise den tilsvarende størrelsesfordelingen av IMAT-lipiddråper sammenlignet med de som er identifisert med decellularisering. Når de er decellularisert, kan musklene farges med lipidløselige fargestoffer for kvalitativ visualisering av mønsteret og omfanget av fettinfiltrasjon og / eller kvantitativ avbildning av individuelle IMAT-lipiddråper. Fargestoffer kan deretter ekstraheres med isopropanol, og den optiske tettheten (OD) av den resulterende løsningen kan brukes til å estimere IMAT-lipidvolumet. Den strenge valideringen av denne teknikken er publisert andre steder37. Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for å bruke denne metoden med musemuskler og gir feilsøkingstips for å støtte bruken av denne metoden i andre applikasjoner, for eksempel muskler fra andre arter eller andre vev.
Dette manuskriptet beskriver metoder for kvalitativt å visualisere og kvantifisere skjelettmuskelfettinfiltrasjon i smådyrmodeller som kan anvendes til videre forståelse av patogenesen av intramuskulær fettvevsutvikling (IMAT) og patologisk ekspansjon. Bruken av decellularisering av hele muskler og lipidløselig farging muliggjør en kostnadseffektiv, reproduserbar og enkel metodikk for å vurdere tilstedeværelsen av IMAT i hele muskler.
Grunnlaget for denne protokollen er at decellularisering av muskler med SDS fjerner de cellulære komponentene av myofibre, inkludert de små lipiddråpene av IMCL, men sparer de store lipiddråpene i intramyocellulære adipocytter. SDS har blitt brukt mye42 i vevsteknikk for å decellularisere matriser. Vev som fett- og skjelettmuskulatur krever vanligvis ytterligere mekanisk dissosiasjon og / eller alkoholekstraksjon for å fjerne gjenværende adipocyttlipid42,43. Vi har tidligere vist at dette skyldes at mens decellularisering med SDS eliminerer IMCL, sparer det den store lipiddråpen i adipocytter37. Avbildning av osmiumtetroksidfarget intakt muskel før og etter decellularisering med μCT verifiserte at det romlige mønsteret til IMAT ikke ble forstyrret av decellularisering. Videre var intramuskulær triglyseridkvantifisering i en decellularisert muskel med ubetydelig IMAT ~ 5% av de intakte muskelverdiene, noe som verifiserte fjerning av IMCL. Derfor beholder denne metoden IMAT-lipiddråper i sin opprinnelige anatomiske fordeling gjennom en halvtransparent muskelmatrise.
Riktig decellularisering er det mest kritiske trinnet i denne protokollen. Hvis decellulariseringen er ufullstendig, vil IMAT-lipiddråper være vanskelige å visualisere, og gjenværende IMCL vil forårsake høy bakgrunnsfarging med enten ORO eller BODIPY (figur 2). Vanlige feil hos uerfarne brukere er mangelfull SDS-dekning per muskel (innenfor hver brønn), slik at hver muskel ikke er helt dekket i SDS-løsning, ikke bruker en vippe til å agitere løsningen under decellularisering, og ikke utfører løsningsendringer ofte nok. I dette manuskriptet har vi anbefalt mengden SDS som trengs per enhet muskelmasse, men brukeren må fortsatt sørge for at musklene er fullstendig dekket av løsninger, da hver muskel har en unik geometri. Brukere anbefales også å endre løsningene liberalt (så mye som to ganger per dag) for å sikre at decellularisering er fullført. God kvalitet farging av IMAT lipiddråper er oppnådd etter så mange som 4 dager med SDS-behandling. For ORO-fargeresultater av høy kvalitet er tilstrekkelig fiksering og forberedelse av ORO-løsning også viktig. I likhet med SDS-behandlingen beskrevet ovenfor, er det nødvendig med tilstrekkelig dekning av 3,7% formaldehydoppløsning for hver muskelprøve. Hvis muskelen fjernes fra fiksativet for tidlig, vil lipiddråper bare svakt flekke med ORO. Totalt 1-2 timer bør være tilstrekkelig, men fiksering over natten anbefales for å sikre at fiksativet trenger inn i midten av muskelen og fikserer alle lipiddråper helt. En ekstra utfordring med ORO-farging er at når alkoholkonsentrasjonen reduseres til 60%, begynner det å danne seg partikler. Dette partikkelformede kan slå seg ned på overflaten og bli sittende fast på grensen til muskel. Den beste måten å unngå dette på er å lage en ny arbeidsløsning for hver farging og bruke både 40 mesh μm og 0,22 μm filtre. Deretter vil det å opprettholde omrøring med vipperen og begrense fargetiden til 10 minutter bidra til å forhindre at partikler som dannes legger seg. Hvis problemet vedvarer, kan det hjelpe å lage en ny ORO-lagerløsning. Hvis noen artefakter forblir fast på den decellulariserte muskeloverflaten, kan et stereomikroskop, tang og kirurgisk saks brukes til å fjerne denne gjenstanden. Unnlatelse av å eliminere artefakter vil påvirke bildekvaliteten på musklene og overvurdere IMAT-innholdet under lipidekstraksjonsdelen som forberedelse til OD-lesing.
Samlet sett er denne teknikken enkel og gir flere fordeler i forhold til gullstandardmetoder for visualisering og kvantifisering av skjelettmuskulaturfettinfiltrasjon. Ikke-invasive teknikker, som CT, MR og US, som brukes mye hos mennesker og noen ganger i dyremodeller, har begrenset romlig oppløsning og er ikke i stand til å skille lipiddråper fra muskelfibre. Dermed er en piksel eller voxel av mellomliggende signalintensitet tildelt som “muskel” eller “fett”, mens det i virkeligheten sannsynligvis er en blanding av myofibre og adipocytter. Mer vanlig er fettinfiltrasjon i dyremuskel vurdert ved histologi, hyppigst ved ORO i muskelkryoseksjoner. Dette utføres imidlertid vanligvis bare i en enkelt representativ seksjon og er vanskelig å kvantifisere på grunn av lipidspredning over seksjonen. Derimot gir ORO-farging av en hel decellularisert muskel en omfattende vurdering av IMAT med lignende kostnader og innsats som intakt morfologi. Videre, i tillegg til å forbedre visualisering, muliggjør ORO-farging av decellularisering kvantifisering av fettinfiltrasjon ved lipidekstraksjon. For et dypere dykk inn i egenskapene til fettinfiltrasjon, kan en fluorescerende flekk, BODIPY, brukes i forbindelse med konfokal mikroskopi. Dette muliggjør rekonstruksjon av individuelle IMAT-lipiddråper for å kartlegge 3D-landskapet, noe som ikke er mulig med histologi med mindre seksjoner analyseres over muskelens lengde. Mens et konfokalmikroskop ikke er standard laboratorieutstyr, er det mer sannsynlig å være tilgjengelig på et universitet eller industri enn smådyr MR eller CT. Videre kan mye av denne prosessen automatiseres, noe som reduserer tidskostnaden sammenlignet med sekvensiell histologi. Optimalisering av innstillingene på konfokalmikroskopet er en ekstra vurdering for BODIPY-farging. Disse er unike for hvert mikroskop. Den kritiske verdien er laserintensitet, som må være høy nok til å oppdage lipiddråpene på den fjerne overflaten av muskelen, samtidig som den ikke metter signalet fra lipiddråpene på nærsiden. På grunn av dette foreslås det at bruk av BODIPY-farging med konfokalmikroskopi er best egnet på tynnere muskler, inkludert EDL eller membran.
Flere begrensninger ved denne tilnærmingen berettiger diskusjon. For det første, mens det forventes at denne teknikken har bred anvendelighet utover skademodeller (kardiotoksin og glyserol) hos mus som presenteres her, kan nye applikasjoner (f.eks. MDX-modellen) kreve optimalisering, da størrelsen og sammensetningen av muskelen (f.eks. Fibrose) kan påvirke decellularisering, noe som krever økt SDS-konsentrasjon eller inkubasjonstider. Andre sykdomsmodeller med endret muskelmasse vil også kreve analyse av både absolutte og normaliserte (til muskelmasse) beregninger av fettinfiltrasjon for å bestemme den absolutte mengden lipid eller prosentandel lipid i forhold til muskelvolumet for å gi et mer meningsfylt utfallsmål. Videre forventes denne teknikken å være bredt anvendelig for større dyremodeller og humane biopsier, men dette kan kreve optimalisering for hver ny applikasjon. For det andre, i denne strategien, må hele muskelen være dedikert til denne analysen og kan ikke brukes til å vurdere et annet patologisk trekk. Studier som tar sikte på å vurdere langsgående endringer i IMAT er bedre tjent med ikke-invasive bildebehandlingsteknikker og studier hvis primære mål krever muskelen til andre formål (histologi, kvantitativ polymerasekjedereaksjon, vestlig blotting) er bedre tjent med histologisk vurdering, da resten av den frosne muskelen kan allokeres til andre analyser. Imidlertid er denne analysen godt egnet til å parre med in vivo-testing, for eksempel tredemølleløping eller ex vivo kontraktil testing, siden disse tiltakene kan gjøres før decellularisering44. For det tredje, selv om bruken av BODIPY-flekk med konfokalmikroskopi gir høyoppløselig visualisering og kvantifisering av lipiddråper, kan den ikke endelig identifisere lipiddråper som individuelle adipocytter, da cellemembranen fjernes og endogene adipocyttproteiner går tapt. Multilokulære adipocytter, som representerer umodne adipocytter eller en “brun / beige” fenotype, kan identifiseres som flere lipiddråper. Endelig fungerer protokollen ikke bra på tidligere frossen muskel. Disse begrensningene er sannsynligvis mest dyptgripende for humane biopsier, da mens hele biopsien kan decellulariseres, er den romlige fordelingen av IMAT i biopsien sannsynligvis ikke mer representativ for hele muskelen enn et histologisk stykke. Men siden denne teknikken er relativt ufølsom for ikke-frosne biopsihåndteringsforhold (f.eks. Timer på is i PBS), kan biopsien deles senere for forskjellige analyser, inkludert en del for decellularisering, noe som vil gi en bedre oppløsning av individuelle lipiddråper.
Avslutningsvis har en ny metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av skjelettmuskelfettinfiltrasjon blitt utviklet ved farging og avbildning av det beholdte lipidet av decellulariserte konstruksjoner. Denne metodikken gir forbedringer i forhold til gullstandardtilnærminger, ved at den muliggjør omfattende avbildning av tredimensjonal fettinfiltrasjon i muskler og rask, billig kvantifisering med ORO-farging. For mer detaljerte målinger gir en andre lipidløselig BODIPY-flekk en mer detaljert kvantifisering av lipiddråpenummer, volum og distribusjonsmønster, som avbildet ved konfokalmikroskopi. Sammen gir disse tiltakene forskere en måte å nøyaktig måle skjelettmuskulaturfettinfiltrasjon på nivået av de enkelte lipiddråpene uten prøvetaking eller kostbar ikke-invasiv avbildning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av R01AR075773 til GAM.
0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
ImageJ | NIH | ||
Matlab | Mathworks | ||
Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |