En unik, omfattende protokol til generering af de-sialylerede humane monocytafledte dendritiske celler (mo-DC’er) fra isolerede mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) ved hjælp af en sialiidasebehandling præsenteres. Endvidere beskrives metoder til vurdering af fænotypisk og funktionel karakterisering af mo-DC’er og evaluering af, hvordan sialiidasebehandling forbedrer modningsniveauet for mo-DC’er.
Sialinsyrer er negativt ladede monosaccharider, der typisk findes ved terminalerne af celleoverfladeglykaner. På grund af deres hydrofilicitet og biofysiske egenskaber er de involveret i adskillige biologiske processer, såsom modulering af immunresponset, genkendelse af selv- og ikke-selvantigener, kulhydrat-proteininteraktioner osv. Det cellulære indhold af sialinsyre reguleres af sialidase, som katalyserer fjernelsen af sialinsyrerester. Flere undersøgelser har vist, at sialo-glycaner er afgørende for overvågning af immunovervågning ved at engagere sig med cis – og transhæmmende Siglec-receptorer på immunceller. På samme måde er glykoimmune kontrolpunkter i kræft ved at blive afgørende mål for udvikling af immunterapier. Derudover er dendritiske celler (DC’er) tænkt som en vigtig komponent i immunterapier, især inden for kræftforskning, på grund af deres unikke rolle som professionelle antigenpræsenterende celler (APC) og deres evne til at udløse adaptive immunresponser og generere immunologisk hukommelse. Ikke desto mindre er DC’ernes funktion afhængig af deres fulde modning. Umodne DC’er har en modsat funktion til modne DC’er og et højt sialinsyreindhold, hvilket yderligere dæmper deres modningsniveau. Dette nedregulerer umodne DC’ers evne til at aktivere T-celler, hvilket fører til et kompromitteret immunrespons. Følgelig inducerer fjernelse af sialinsyre fra celleoverfladen af humane DC’er deres modning, hvilket øger ekspressionen af MHC-molekyler og antigenpræsentation. Derudover kan det genoprette ekspressionen af co-stimulerende molekyler og IL-12, hvilket resulterer i, at DC’er har en højere evne til at polarisere T-celler mod en Th1-fænotype og specifikt aktivere cytotoksiske T-celler til at dræbe tumorceller. Derfor er sialinsyre opstået som en nøglemodulator af DC’er og bruges som et nyt mål for at fremme deres terapeutiske anvendelse. Denne undersøgelse giver en unik tilgang til behandling af in vitro monocytafledte DC’er med sialidase, der sigter mod at generere DC-populationer med forskellige sialinsyrefænotyper på celleoverfladen og skræddersyede modnings- og co-stimulerende profiler.
Sialsyrebærende glycaner (sialoglycaner) har fået betydelig interesse på grund af deres immunmodulerende rolle. Monosaccharidet sialinsyre, som er mest udbredt hos mennesker i form af N-acetylneuraminsyre, præsenterer grundlæggende ligander for lektiner med en anerkendt rolle i immunologi, såsom Selectins og Siglecs. Disse lektiner genkender sialoglycaner enten på samme celle (cis) eller på forskellige celler (trans) og spiller en væsentlig rolle i værtspatogeninteraktioner og forskellige fysiologiske og patologiske cellulære aktiviteter 1,2,3. Da sialinsyre desuden indtager de terminale positioner af celleoverfladeglycokonjugater, kan den skjule de underliggende strukturer og dermed hæmme celle-til-celle-kontakt via ikke-specifikke frastødende virkninger eller ved at hindre detektion af andre lektiner4. Aktiviteten af en række sialyltransferaser (der overfører sialinsyrer) og af sialidaser (der spalter sialinsyrebindinger) i cellen bestemmer mængden af sialinsyre, der er til stede på overfladen. Desuden kan opløselige sialyltransferaser og sialidaser udtrykt af værten eller patogenerne ekstrinsisk ændre mængden af sialinsyre på celleoverfladen 5,6.
Afvigende sialylering er et træk ved flere patologiske tilstande. I autoimmune sygdomme kan hyposialylering bidrage til uhæmmet immunaktivering og organskader, da sialinsyre hjælper med at diskriminere selvantigener og regulere inflammatoriske reaktioner7. Omvendt resulterer hypersialylering i overekspression af sialoglycaner, såsom sialyl-Tn, sialyl-Lewis-antigener, polysialinsyre og gangliosider, hvilket udgør et kendetegn for nogle kræftformer 8,9. Hypersialylering afhænger også af øget ekspression af specifikke enzymer såsom N-acetylglucosaminyltransferase (GNT-V), som genererer hypersialylerede tri- og / eller tetra-antenner N-bundne glycaner, som har været forbundet med kræftvækst og metastase10. Indholdet af sialinsyre regulerer også proteinstabilitet og -funktion, som er afgørende for relevante onkogene aktørers rolle11. Derfor kan øget sialylering lette tumorudvikling, metastase, lægemiddelresistens og immununddragelse. Desuden gør opreguleringen af sialoglycaner det muligt for tumorer at interagere med hæmmende Siglec-receptorer på immunceller og undgå immunovervågning. Af den grund anses sialoglycaner nu for at være glykoimmune kontrolpunkter og attraktive terapeutiske mål. For eksempel er hæmmere af Siglec-immunaksen allerede i tidlige kliniske forsøg, da immuncellereceptoren Siglec (sialsyrebindende ImmunoGlobulin-lignende LECtin) spiller en immunhæmmende rolle12.
Enzymer er blevet brugt til at modulere glykanprofilen som værktøjer til undersøgelse eller til terapeutiske strategier13,14. Sialidase er blevet anvendt til at ændre kræftcellemalignitet, da sialylerede glycaner såsom sialyl Lewis X er kritiske for cellemigration og kræftmetastase15. Samtidig har sialidasehæmmere, som hæmmer sialinsyrespaltning, nået klinikker til behandling af sialinsyreafhængige virusinfektioner16. For nylig har sialinsyremodulation fået yderligere interesse på grund af sialinsyrers kritiske rolle som ligander i Siglec-immunaksen, hvilket betyder, at de tilbyder nye midler til at reducere kræftflugt fra immunresponser. Denne interesse blev yderligere styrket af nobelpristageren Bertozzi i 2022 og hendes teams bidrag fra flere strategier, der selektivt spalter forskellige sialoglycaner og forbedrer immunresponsermod kræft 17. Således repræsenterer sialidase-baserede strategier en lovende modalitet for glykoimmun checkpoint-terapi. Glykofænotypen af celler i immunsystemet er afhængig af celletypen og deres aktiveringsstatus. Med hensyn til T-celler har glycaner en nøglerolle i de patofysiologiske trin i T-celleudvikling og thymocytudvælgelse, T-celleaktivitet, differentiering og proliferation18. For eksempel påvirker polylactosamin på glycoproteiner basale niveauer af B-lymfocytter og T-lymfocytter og makrofagaktivering19. I makrofager har forskellige glykanekspressionsmønstre en vigtig rolle i makrofagrekruttering til tumormikromiljøet (TME)20. Derfor kan ekspressionen af O-bundne og N-bundne glycaner af immunceller anvendes som potentielle glycobiomarkører for terapeutiske tilgange til behandling af kræft og autoimmune sygdomme.
Dendritiske celler (DC’er) er specifikke antigenpræsenterende celler med en unik kapacitet til at udløse immunresponser, såsom anticancerimmunitet21. DC’er skal gennemgå en opregulering af deres antigenpræsenterende MHC-molekyler for at præsentere antigener til T-celler (signal 1), co-stimulerende molekyler for at aktivere T-celler (signal 2) og proinflammatoriske cytokiner, såsom IL-12, for at udløse type 1-hjælper T-celleproliferation (signal 3)22. Den resulterende immunprofil er stramt reguleret, og kontrolpunkter er afgørende for at forhindre sunde celler i at blive angrebet. Da DC’er kan stimulere forskellige immunresponser mod tumorceller, bruges de som cellebaserede vacciner, og et betydeligt antal kliniske undersøgelser har vist deres potentielle fordele23,24. Efter FDA godkendte den første DC-baserede vaccine i 201025,26, er mange andre DC-baserede vacciner blevet udviklet. DC-baserede vacciner produceres hovedsageligt ex vivo og administreres til patienter for at fremkalde immunresponser mod tumorer. Imidlertid er utilstrækkelig eller kortvarig modning i øjeblikket en af de faktorer, der begrænser den kliniske effekt af DC’er og betyder, at dyre cytokincocktails skal anvendes. Uden tilstrækkelig modning kan DC’er ikke aktivere T-celler under kliniske omstændigheder. I stedet udtrykker DC’erne immunkontrolpunkter og udløser et tolerogent immunrespons, der forhindrer cytotoksiske T-celler i at virke mod tumorceller.
Humane DC’er har stærkt sialylerede overflader, og denne sialylering falder ved modning og under et samlet immunrespons27. Modningen af DC’er kan induceres ved at eliminere disse sialinsyrer med sialidase. Desilaylering opregulerer i høj grad forskellige cytokiner, herunder IL-12, på grund af translokationen af NF-kB-transkriptionsfaktoren til kernen 6,28. Derudover forbedrer desialylering antigenkrydspræsentation gennem MHC-I og antitumorimmunrespons29,30. Følgelig genererer knockout af sialyltransferaserne ST3Gal.l og ST6Gal.l, som har en vigtig rolle i DC-sialylering, en mere moden fænotype i murine DC’er31.
Sialidasebehandling giver en metode til stimulering af alle aspekter af DC-modning, herunder øget antigenpræsentation, øget ekspression af co-stimulerende molekyler og øget cytokinproduktion, for at løse de ovennævnte mangler og gøre det muligt for DC’er at fremkalde effektive reaktioner. Denne artikel præsenterer en procedure til opnåelse af levedygtige desialylerede humane DC’er ved anvendelse af en bakteriel sialidase. De-sialylerede DC’er viser en forbedret modningsprofil og kan bruges som cellemodeller til at øge antitumorimmunresponser in vitro. DC’erne opnås fra blodmonocytter, som derefter differentieres in vitro i nærvær af cytokininterleukin-4 (IL-4) og granulocytmakrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF). Dette arbejde beskriver også lektinbaserede metoder til analyse af sialinsyre ved celleoverfladen og metoder til immunofænotype DC-modningsniveauet. Proceduren beskrevet her kan bruges til at desialylate andre celletyper og dermed give en tilgang til at undersøge rollen som sialoglycaner, som er vitale glykoimmune kontrolpunkter og relevante i immunmodulering.
Monocytisolering
Dette manuskript beskriver en protokol til generering af mo-DC’er fra humant isolerede monocytter CD14+ (figur 1A), efterfulgt af udførelse af en sialidasebehandling for at reducere sialinsyreindholdet på overfladen af disse celler.
Der er forskellige måder at opnå humane DC’er på, såsom direkte fra perifert blod eller væv eller gennem differentiering fra prækursorer såsom stamceller eller monocytter. Opnåelse af DC’er differentieret fra monocytter isoleret fra perifert blod er langt mere ligetil på grund af den lette opnåelse af store mængder monocytter sammenlignet med andre DC-kilder41. For at opnå en høj procentdel af isolerede monocytter skal alle protokoltrin følges nøje. For eksempel kan densitetsgradientmediet være giftigt for cellerne, og for at forhindre celledød skal man undgå langvarig cellekontakt med densitetsgradientmediet og vaske cellerne grundigt. Cellemanipulation skal udføres så hurtigt som muligt for at undgå tab af cellelevedygtighed. Fra PBMC’er kan monocytter isoleres gennem positiv selektion ved hjælp af MACS-metoden (magnetisk aktiveret cellesortering), som er en egnet teknologi til at give et stort antal monocytter. Derudover har mo-DC’er afledt af MACS-isolerede monocytter sammenlignet med andre monocytudvælgelsesmetoder en større evne til at stimulere antitumor-T-celleaktivitet42. I denne protokol blev monocytterne, når de var isoleret, inkuberet med IL-4 og GM-CSF i en periode på 5-6 dage for at opnå differentieringen i umodne mo-DC’er (figur 1). Resultaterne viste, at morfologisk (figur 1A) og fænotypisk (figur 1B) differentierede de isolerede monocytter sig i umodne mo-DC’er. Desuden mistede mo-DC’erne gennem differentieringen ekspressionen af CD14-markører og opnåede ekspressionen af CD1a og MHC-II (figur 1B), som er nødvendige for antigenpræsentation til T-celler.
Denne isolering og differentiering af monocytter i mo-DC’er er begrænsninger for denne protokol. Isolationsprocessen er et følsomt trin, der skal udføres omhyggeligt og hurtigt for at undgå celledød, og dette trin skal også udføres, hver gang mo-DC’er er nødvendige for et nyt eksperiment. Differentieringsprocessen tager 5-6 dage, hvilket giver et problem med hensyn til at anvende denne metode til analyser med høj kapacitet. Ikke desto mindre er isolationsmetoden og anvendelse af cytokiner til differentiering af mo-DC’er nyttige til generering af et stort antal funktionelle mo-DC’er in vitro til forsøgsformål. Mo-DC’erne, der genereres i denne protokol, er i stand til at gennemgå sialiidasebehandling, flowcytometri, ELISA, konfokalmikroskopi og så videre, hvilket understreger vigtigheden og anvendeligheden af denne metode30.
Umodne mo-DC’er og sialidasebehandling
Sialidaser er essentielle i sialyleringsregulering og er ansvarlige for at fjerne sialinsyrer fra celleoverfladeglykanerne. I mo-DC’er fører sialinsyrefjernelse af sialidase til modning af disse celler, hvilket øger antigen-krydspræsentation og efterfølgende T-celleaktivering og antitumoraktivitet30.
Umodne humane mo-DC’er viser et højt indhold af celleoverflade α(2,6)- og α(2,3)-bundne sialinsyrer27 sammenlignet med modne mo-DC’er 31,43. Desuden forbedrer fjernelse af sialinsyrer ved behandling af mo-DC’er med sialidase modningen af DC’erne 28,30,31. Den sialidase, der blev udvalgt til dette eksperiment, var fra bakterien Clostridium perfringens. Alligevel producerer andre organismer også sialidaser, såsom bakterierne Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae eller Salmonella typhimurium44, iglen Macrobdella decora45 og endda Homo sapiens46, og sialidaser fra disse organismer anvendes også eksperimentelt. Hver sialidase har imidlertid forskellige substratspecificiteter. Derudover kan brug af sialiidaseenzymet have sine begrænsninger; for eksempel kan manipulation af mo-DC’er under behandlingen yderligere stimulere disse celler. Desuden skal mængden af sialidase og inkubationstiderne optimeres ud fra den type celler, der anvendes, og deres sialinsyresammensætning. Fjernelse af sialinsyre er ikke en permanent effekt, men snarere et forbigående fænomen, fordi cellen vil genoprette sit celleoverfladeindhold af sialinsyre. Udover sialidase er der andre metoder til at reducere sialinsyremolekylerne på overfladen af celler, såsom anvendelse af sialyltransferasehæmmere, genudslag af sialyltransferasegener eller metabolisk blokade af sialinsyre ved hjælp af sialinsyreefterligning47,48,49. Ikke desto mindre kan disse metoder have forskellige virkninger på celler, og udover desialylering skal cellens levedygtighed overvejes. Sialiidaseenzymbehandlingen er en praktisk metode til effektivt og forbigående at fjerne sialinsyrer på celleoverfladen, samtidig med at cellens levedygtighed opretholdes.
I dette arbejde blev sialidase tilsat til de umodne mo-DC’er i en koncentration på 500 mU/5 x 106 celler/ml, og cellerne blev inkuberet ved 37 °C i 60 minutter. Behandlingen blev udført under anvendelse af RPMI-1640 uden serum for at bevare cellelevedygtigheden og undgå enhver interaktion mellem de sialylerede molekyler, der er til stede i serum30. Behandling med Sialidase kan udføres med andre buffere end RPMI, såsom 50 mM natriumacetat, pH 5,1 (i tilfælde af C. perfingens sialidase) eller PBS50,51,52. Ikke desto mindre er RPMI-1640 det mest almindelige dyrkningsmedium for DC’er, da det opretholder konstante eksperimentelle betingelser under proceduren, undgår at inducere modning og reducerer enhver stress, der kan være forårsaget af sialiidasebuffere eller PBS53,54,55,56. Efter inkubation med sialidase er det afgørende at vaske cellerne grundigt med et serumsuppleret medium for at garantere, at enzymreaktionen er stoppet. Tilstedeværelsen af sialylerede molekyler i serumet vil konkurrere som substrater for sialidase, hvilket sikrer et hurtigt reaktionsstop.
Karakterisering af overflademarkør ved flowcytometri og konfokal mikroskopi
Til bestemmelse af sialinsyreprofilen anvendte vi i protokolafsnit 3 lektinfarvning efterfulgt af flowcytometri og konfokal laserscanningsmikroskopi. Til cellefarvningsproceduren blev lektinkoncentrationerne og inkubationsbetingelserne i begge tilfælde optimeret for at undgå celleagglutination og død. Det er afgørende at udføre inkubationen ved 4 °C i buffere, der indeholder mindst 2% af enten FBS eller BSA for at undgå ikke-specifik binding af lektinerne. I denne protokol blev RPMI-1640 indeholdende 10% FBS anvendt til at opretholde konstante eksperimentelle betingelser og undgå cellestress. Med hensyn til konfokal mikroskopi er fiksering af cellerne før farvning afgørende for at bevare morfologien, forhindre autolyse og opretholde antigenicitet.
Analysen af mo-DC-fænotypen ved flowcytometri viste, at sialidase-behandlede mo-DC’er havde en signifikant højere mængde PNA-lektin bundet til celleoverfladen sammenlignet med MMA- og SNA-lektiner, som faldt efter sialiidasebehandlingen (figur 2A). Som forventet steg PNA-farvningen, da PNA genkender ikke-sialylerede antigener i modsætning til MAA og SNA, som binder direkte til henholdsvis α2,3- og α2,6-sialinsyrer. Denne farvning bekræfter den effektive fjernelse af sialinsyrer fra celleoverfladen ved hjælp af denne protokol. En anden metode, der kan bruges til at validere behandlingen og analysere celleoverfladens sialinsyreindhold, er lektinfarvning efterfulgt af konfokal mikroskopi, som eksemplificeret i figur 2B.
Udover de tidligere eksempler findes der alternative tilgange til at evaluere og karakterisere sialinsyreindholdet, såsom lectinsondering ved western blotting. Alternative sialinsyrespecifikke lektiner er også tilgængelige, såsom Siglecs, en gruppe lektiner, der har en tydelig præference for sialinsyretyper og bindinger57. Udover at bruge lektiner i begge teknikker (flowcytometri, mikroskopi eller western blot), er det også muligt at karakterisere sialinsyreindholdet ved hjælp af antistoffer; For eksempel kan α2,8-sialinsyrer vurderes ved hjælp af antistoffer såsom klon 735, som er specifik for polysialinsyre58. Derudover kan celler efter sialiidasebehandling funktionelt testes for deres biologiske eller terapeutiske effektivitet ved at evaluere deres fænotype og evne til at aktivere T-celler40. Faktisk, som vist i de givne eksempler, viste sialidasebehandlede mo-DC’er højere modningsfænotype såvel som en forhøjet ekspression af antigenpræsenterende og co-stimulerende molekyler.
Desuden kan sialidasebehandlede mo-DC’er fyldes med antigener og dyrkes sammen med T-celler eller andre celler og kan derefter undersøges med hensyn til fænotypen, cytokinsekretionsprofilen eller andre funktioner. I det angivne eksempel viser dataene, at sialidase-behandlede mo-DC’er kan fyldes med tumorantigener og derefter bruges til at aktivere T-celler. Faktisk viste de resulterende T-celler øget IFN-γ-sekretion, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter om effekten af sialinsyremangel på at øge mo-DC’ernes kapacitet til at aktivere T-celler 27,28,29,30,31.
Afslutningsvis viser denne protokol en gennemførlig, levedygtig og praktisk metode til at generere mo-DC’er til manipulation af sialinsyreindhold ved behandling med sialidase. Denne protokol præsenterer en metode, der kan tjene forskellige formål og applikationer. Denne metode kan ikke kun have en afgørende rolle i forståelsen af sialinsyrers rolle i modning og respons af immunceller, men kan også bruges som et immunmodulerende værktøj.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender finansiering fra Europa-Kommissionens GA 101079417 og EJPRD/0001/2020 EU 825575; Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, under tilskud FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) og LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. og Stemmatters blev også finansieret af Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) gennem Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) til SI I& DT DCMatters-projektet (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Vi anerkender Biolabs facilitet på FCT-NOVA og GLYCOVID NOVA Saude.
15 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E15-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
24-well plate | Greiner Bio-one | 662 160 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
50 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E50-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) | BioLegend | 420404 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Annexin V | Immunotools | 31490013 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs | |
BSA | Sigma – Aldrich | A3294-100G | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile |
CD14 (Monoclonal TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
CD80 | Immunotools | 21270803 | Maturation Profiling of mo-DCs |
CD86 | Immunotools | 21480863 | Maturation Profiling of mo-DCs |
Cell counting slides and trypan blue | EVE | EVS-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Density gradient medium (Histopaque) | Sigma – Aldrich | 10771-100ML | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
EDTA | Gibco, ThermoFisher | 15400054 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Elisa kit (IFN-γ) | Immunotools | 31673539 | Maturation Profiling of mo-DCs |
EVE automated cell count | NanoEntek | 10027-452 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500064 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-093-864 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-1β | Sigma – Aldrich | I9401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-4 | Miltenyi Biotec | 130-093-919 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-6 | Sigma – Aldrich | SRP3096 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
L-glutamine | Gibco | A2916801 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
LS column and plunger | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin – Biotinylated) | Vector labs | B-1265-1 | Determination of Sialic Acid Profile |
MHC-I (HLA-ABC) | Immunotools | 21159033 | Maturation Profiling of mo-DCs |
MHC-II (HLA-DR) | Immunostep | HLADRA-100T | Maturation Profiling of mo-DCs |
Microtubes | AstiK’s | PCRP-E015-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Neuraminidase (Sialidase) | Roche | 11585886001 | Treatment of Cells with Sialidase |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Paraformaldehyde (PFA 2%) | Polysciences Europe | 25085-1 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Paraformaldehyde (PFA 4%) | Biotium | 22023 | Determination of Sialic Acid Profile |
Pasteur pipettes | Labbox | PIPP-003-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin – FITC) | Vector labs | FL-1071 | Determination of Sialic Acid Profile |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140163 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | NZYTech | MB18201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Sigma – Aldrich | P0409 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
RBC lysis buffer | BioLegend | 420302 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) | Gibco | 31870074 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – Biotinylated) | Vector labs | B-1305-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – FITC) | Vector labs | FL-1301-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
Sodium pyruvate | Thermofisher | 11360-070 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
SpectroMax190 | Molecular Devices | Maturation Profiling of mo-DCs | |
Streptavidin-PE | BioLegend | 405203 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma – Aldrich | T0440 | Maturation Profiling of mo-DCs |
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) | Sigma – Aldrich | H8916 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Zeiss LSM710 confocal microscope | Zeiss | Determination of Sialic Acid Profile |