Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65525
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 4,5, 6, 1,2,7
1Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 2UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 3LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade NOVA de Lisboa, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Oncology, Albert Einstein College of Medicine, 6Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark, Zona Industrial da Gandra, 7CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa

Summary

Bir sialidaz tedavisi kullanılarak izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) de-sialillenmiş insan monosit türevli dendritik hücreler (mo-DC'ler) oluşturmak için benzersiz, kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, mo-DC'lerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu değerlendirmek ve sialidaz tedavisinin mo-DC'lerin olgunlaşma seviyesini nasıl iyileştirdiğini değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Abstract

Sialik asitler, tipik olarak hücre yüzeyi glikanlarının terminallerinde bulunan negatif yüklü monosakkaritlerdir. Hidrofiliklikleri ve biyofiziksel özellikleri nedeniyle, bağışıklık tepkisinin modülasyonu, öz ve öz olmayan antijenlerin tanınması, karbonhidrat-protein etkileşimleri vb. gibi çok sayıda biyolojik süreçte yer alırlar. Sialik asidin hücresel içeriği, sialik asit kalıntılarının uzaklaştırılmasını katalize eden sialidaz tarafından düzenlenir. Birkaç çalışma, sialo-glikanların, bağışıklık hücreleri üzerindeki cis ve trans inhibitör Siglec reseptörleri ile etkileşime girerek bağışıklık sürveyansının izlenmesinde kritik olduğunu göstermiştir. Benzer şekilde, kanserdeki gliko-immün kontrol noktaları, immünoterapilerin geliştirilmesi için çok önemli hedefler haline geliyor. Ek olarak, dendritik hücreler (DC'ler), profesyonel antijen sunan hücreler (APC) olarak benzersiz rolleri ve adaptif immün yanıtları tetikleme ve immünolojik hafıza oluşturma kapasiteleri nedeniyle, immünoterapilerde, özellikle kanser araştırmalarında önemli bir bileşen olarak öngörülmektedir. Bununla birlikte, DC'lerin işlevi tam olgunlaşmalarına bağlıdır. Olgunlaşmamış DC'ler, olgun DC'lere zıt bir işleve ve olgunlaşma seviyelerini daha da azaltan yüksek bir sialik asit içeriğine sahiptir. Bu, olgunlaşmamış DC'lerin T hücrelerini aktive etme yeteneğini aşağı regüle ederek tehlikeye atılmış bir bağışıklık tepkisine yol açar. Sonuç olarak, insan DC'lerinin hücre yüzeyinden sialik asidin çıkarılması, olgunlaşmalarını indükler, böylece MHC moleküllerinin ekspresyonunu ve antijen sunumunu arttırır. Ek olarak, ko-stimülatör moleküllerin ve IL-12'nin ekspresyonunu geri yükleyebilir, bu da DC'lerin T hücrelerini bir Th1 fenotipine doğru polarize etme ve tümör hücrelerini öldürmek için sitotoksik T hücrelerini spesifik olarak aktive etme konusunda daha yüksek bir yeteneğe sahip olmasına neden olur. Bu nedenle, sialik asit, DC'lerin önemli bir modülatörü olarak ortaya çıkmıştır ve terapötik kullanımlarını ilerletmek için yeni bir hedef olarak kullanılmaktadır. Bu çalışma, farklı hücre yüzeyi sialik asit fenotiplerine ve özel olgunlaşma ve ko-stimülatör profillere sahip DC popülasyonları üretmeyi amaçlayan, in vitro monosit türevli DC'leri sialidaz ile tedavi etmek için benzersiz bir yaklaşım sunmaktadır.

Introduction

Sialik asit taşıyan glikanlar (sialoglikanlar), immünomodülatör rolleri nedeniyle önemli ilgi görmüştür. İnsanlarda en yaygın olarak N-asetilnöraminik asit formunda bulunan monosakkarit sialik asit, Selectins ve Siglecs gibi immünolojide tanınmış bir role sahip lektinler için temel ligandlar sunar. Bu lektinler, aynı hücrede (cis) veya farklı hücrelerde (trans) sialoglikanları tanır ve konak-patojen etkileşimlerinde ve çeşitli fizyolojik ve patolojik hücresel aktivitelerde önemli bir rol oynar 1,2,3. Ayrıca, sialik asit, hücre yüzeyi glikokonjugatlarının terminal pozisyonlarını işgal ettiğinden, alttaki yapıları gizleyebilir, böylece spesifik olmayan itici etkiler yoluyla veya diğer lektinler tarafından tespit edilmesini engelleyerek hücreden hücreye teması inhibe edebilir4. Hücre içindeki çeşitli sialiltransferazların (sialik asitleri aktaran) ve sialidazların (sialik asit bağlarını parçalayan) aktivitesi, yüzeyde bulunan sialik asit miktarını belirler. Ek olarak, konakçı veya patojenler tarafından eksprese edilen çözünür sialiltransferazlar ve sialidazlar, hücre yüzeyindeki sialik asit miktarını dışsal olarak değiştirebilir 5,6.

Anormal sialilasyon, çeşitli patolojik durumların bir özelliğidir. Otoimmün hastalıklarda, hiposialilasyon, sınırsız bağışıklık aktivasyonuna ve organ hasarına katkıda bulunabilir, çünkü sialik asit kendi antijenlerini ayırt etmeye ve inflamatuar yanıtları düzenlemeye yardımcı olur7. Tersine, hipersialilasyon, sialil-Tn, sialil-Lewis antijenleri, polisialik asit ve gangliosidler gibi sialoglikanların aşırı ekspresyonuna neden olur ve bu da bazı kanserlerin ayırt edici özelliğini oluşturur 8,9. Hipersialilasyon ayrıca, kanser büyümesi ve metastaz10 ile ilişkili olan hipersialile tri- ve/veya tetra-anten N-bağlı glikanlar üreten N-asetilglukozaminiltransferaz (GNT-V) gibi spesifik enzimlerin artan ekspresyonuna da bağlıdır. Sialik asit içeriği ayrıca, ilgili onkojenik oyuncuların rolü için anahtar olan protein stabilitesini ve işlevini de düzenler11. Bu nedenle, artan sialilasyon, tümör gelişimini, metastazı, ilaç direncini ve bağışıklık kaçışını kolaylaştırabilir. Ayrıca, sialoglikanların yukarı regülasyonu, tümörlerin bağışıklık hücreleri üzerindeki inhibitör Siglec reseptörleri ile etkileşime girmesini ve bağışıklık gözetiminden kaçınmasını sağlar. Bu nedenle, sialoglikanlar artık gliko-immün kontrol noktaları ve çekici terapötik hedefler olarak kabul edilmektedir. Örneğin, Siglec-immün ekseninin inhibitörleri zaten erken klinik çalışmalardadır, çünkü immün hücre reseptörü Siglec (sialik asit bağlayıcı ImmunoGlobulin benzeri LECtin) immün inhibitör bir rol oynar12.

Enzimler, glikan profilini çalışma veya terapötik stratejiler için araçlar olarak modüle etmek için kullanılmıştır13,14. Sialil Lewis X gibi sialillenmiş glikanlar hücre göçü ve kanser metastazı için kritik olduğundan, kanser hücresi malignitesini değiştirmek için sialidaz kullanılmıştır15. Aynı zamanda, sialik asit bölünmesini engelleyen sialidaz inhibitörleri, sialik aside bağımlı viral enfeksiyonların tedavisi için kliniklere ulaşmıştır16. Son zamanlarda, sialik asit modülasyonu, sialik asitlerin Siglec-immün ekseninde ligandlar olarak kritik rolü nedeniyle daha fazla ilgi görmüştür, yani immün yanıtlardan kanser kaçışını azaltmak için yeni araçlar sunarlar. Bu ilgi, 2022 Nobel ödüllü Bertozzi ve ekibinin çeşitli sialoglikanları seçici olarak parçalayan ve anti-kanser bağışıklık tepkilerini iyileştiren çeşitli stratejilere katkısıyla daha da güçlendi17. Bu nedenle, sialidaz bazlı stratejiler, gliko-immün kontrol noktası tedavisi için umut verici bir yöntemi temsil eder. Bağışıklık sistemi hücrelerinin glikofenotipi, hücre tipine ve aktivasyon durumlarına bağlıdır. T hücreleri ile ilgili olarak, glikanlar, T hücresi gelişimi ve timosit seçimi, T hücresi aktivitesi, farklılaşma ve proliferasyonun patofizyolojik basamaklarında anahtar bir role sahiptir18. Örneğin, glikoproteinler üzerindeki polilaktozamin, B lenfositlerinin ve T lenfositlerinin bazal seviyelerini ve makrofaj aktivasyonunu etkiler19. Makrofajlarda, farklı glikan ekspresyon paternleri, tümör mikroçevresine (TME) makrofaj alımında önemli bir role sahiptir20. Bu nedenle, O-bağlı ve N-bağlı glikanların bağışıklık hücreleri tarafından ekspresyonu, kanser ve otoimmün hastalıkların tedavisinde terapötik yaklaşımlar için potansiyel glikobiyobelirteçler olarak kullanılabilir.

Dendritik hücreler (DC'ler), anti-kanser bağışıklığı gibi bağışıklık tepkilerini tetiklemek için benzersiz bir kapasiteye sahip spesifik antijen sunan hücrelerdir21. DC'ler, antijenleri T hücrelerine sunmak için antijen sunan MHC moleküllerinin yukarı regülasyonuna tabi tutulmalıdır (sinyal 1), T hücrelerini aktive etmek için ko-uyarıcı moleküller (sinyal 2) ve tip 1 yardımcı T hücresi proliferasyonunu tetiklemek için IL-12 gibi pro-inflamatuar sitokinler (sinyal 3)22. Ortaya çıkan bağışıklık profili sıkı bir şekilde düzenlenir ve sağlıklı hücrelerin saldırıya uğramasını önlemek için kontrol noktaları gereklidir. DC'ler tümör hücrelerine karşı çeşitli bağışıklık tepkilerini uyarabildiklerinden, hücre bazlı aşılar olarak kullanılırlar ve çok sayıda klinik çalışma potansiyel faydalarını göstermiştir23,24. FDA, 2010 yılında ilk DC bazlı aşıyı onayladıktan sonra25,26, diğer birçok DC bazlı aşı geliştirilmiştir. DC bazlı aşılar esas olarak ex vivo olarak üretilir ve tümörlere karşı bağışıklık tepkileri ortaya çıkarmak için hastalara uygulanır. Bununla birlikte, yetersiz veya kısa olgunlaşma şu anda DC'lerin klinik etkinliğini sınırlayan faktörlerden biridir ve pahalı sitokin kokteyllerinin kullanılması gerektiği anlamına gelir. Yeterli olgunlaşma olmadan, DC'ler klinik durumlarda T hücrelerini aktive edemezler. Bunun yerine, DC'ler bağışıklık kontrol noktalarını ifade eder ve sitotoksik T hücrelerinin tümör hücrelerine karşı hareket etmesini önleyen tolerojenik bir bağışıklık tepkisini tetikler.

İnsan DC'leri yoğun sialile yüzeylere sahiptir ve bu sialilasyon olgunlaşma üzerine ve genel bir bağışıklık tepkisi sırasında azalır27. DC'lerin olgunlaşması, bu sialik asitlerin sialidaz ile ortadan kaldırılmasıyla indüklenebilir. Desiyalilasyon, NF-kB transkripsiyon faktörünün çekirdeğetranslokasyonu nedeniyle IL-12 dahil olmak üzere çeşitli sitokinleri büyük ölçüde yukarı regüle eder 6,28. Ek olarak, desialilasyon, MHC-I ve anti-tümör immün yanıtları yoluyla antijen çapraz sunumunu iyileştirir29,30. Buna göre, DC sialilasyonunda önemli bir role sahip olan sialiltransferazlar ST3Gal.l ve ST6Gal.l'nin nakavt, murin DC'lerinde daha olgun bir fenotip oluşturur31.

Sialidaz tedavisi, yukarıda belirtilen eksiklikleri gidermek ve DC'lerin etkili yanıtlar ortaya çıkarmasını sağlamak için artan antijen sunumu, ko-uyarıcı moleküllerin artan ekspresyonu ve artan sitokin üretimi dahil olmak üzere DC olgunlaşmasının tüm yönlerini uyarmak için bir yöntem sağlar. Bu makale, bir bakteriyel sialidaz kullanımı yoluyla canlı desialile insan DC'leri elde etmek için bir prosedür sunmaktadır. De-sialillenmiş DC'ler gelişmiş bir olgunlaşma profili gösterir ve in vitro anti-tümör bağışıklık tepkilerini artırmak için hücre modelleri olarak kullanılabilir. DC'ler, daha sonra sitokin interlökin-4 (IL-4) ve granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) varlığında in vitro olarak farklılaştırılan kan monositlerinden elde edilir. Bu çalışma aynı zamanda hücre yüzeyindeki sialik asidi analiz etmek için lektin bazlı yöntemleri ve DC olgunlaşma seviyesini immünofenotipleme yöntemlerini açıklamaktadır. Burada açıklanan prosedür, diğer hücre tiplerini desyalillemek için kullanılabilir, böylece hayati gliko-immün kontrol noktaları olan ve immünomodülasyonla ilgili olan sialoglikanların rolünü araştırmak için bir yaklaşım sağlar.

Protocol

Hücreler, yazılı ve bilgilendirilmiş donör onayı alındıktan sonra, ulusal kan bankası Instituto Português do Sangue e da Transplantação (IPST) tarafından sağlanan gönüllüler olan sağlıklı anonim kan bağışçılarının buffy paltolarından izole edildi (IMP.74.52.4). Kan kullanımı, insan doku ve hücrelerinin bağışlanması, tedariki, test edilmesi, işlenmesi, korunması, depolanması ve dağıtımı için kalite ve güvenlik standartlarına ilişkin 2004/23/EC sayılı direktife göre etik kurul (IPST 30072015) tarafından onaylanmıştır (Portekiz Yasası 22/2007, 29 Haziran). IPST biyobankası, işlenene kadar kanın bütünlüğünü korumak için kanı koruyucu ve pıhtılaşma önleyici bir çözelti olan sitrat fosfat dekstroz (CPD) içeren özel bir plastik toplama torbasında toplar ve saklar. Biyolojik materyalin manipülasyon için uygun olup olmadığını değerlendirmek için, Treponema pallidum, hepatit B virüsü (HBV), hepatit C virüsü (HCV) ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) için serolojik kontrol yapılır ve bunların hepsinin negatif olması gerekir. Bu çalışma için, buffy ceket IPST tarafından araştırma amacıyla sağlanmış, toplanma tarihi, serolojik sonuçlar, kan grubu ve donörünyaşı ile ilgili bilgiler 32. Buffy ceket oda sıcaklığında en fazla 1 gün kalabilir.

1. Monosit kaynaklı dendritik hücrelerin elde edilmesi

NOT: İnsan periferik kanı manipüle edilirken, belirli evrensel güvenlik önlemlerinin ve uygun malzeme imhasının dikkate alınması gerektiğini belirtmek önemlidir. Başlamadan önce, gerekli tüm reaktiflerin ve malzemelerin hazırlandığını ve kullanıma hazır olduğunu onaylayın.

  1. Periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu
    1. İnsan buffy ceketine erişin.
      NOT: Buffy coat, santrifüj yoluyla beyaz kan hücrelerinde zenginleştirilen lökoferez32 yoluyla toplanan kandan elde edilen bir yan üründür. Tüm adımlar dikey akış odalı bir biyogüvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirildi.
    2. Mühürlü çıkış borusunu bir neşter ile keserek buffy coat ambalajını açın ve içindekileri 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Steril 15 mL'lik konik tüp başına 7 mL buffy coat numunesi aktarın ve bir ön yıkama gerçekleştirmek için 6 mL fosfat tamponlu salin solüsyonu (PBS) ekleyin. Bu ilk yıkama adımı, numuneyi önemli miktarda kırmızı kan hücresinden (RBC) ve plazmadan temizlemek için gereklidir, böylece numune bir yoğunluk gradyan ortamı ile gradyan ayırma için optimize edilir (bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.100 x g'da döner rotorlu ve frenli bir santrifüjde santrifüjleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
    4. Santrifüjlemeden sonra, lökosit süspansiyonunu (plazma ve eritrositler arasındaki beyaz halka) bir Pasteur pipeti ile toplayın ve yeni bir steril 15 mL konik tüpe aktarın.
    5. Bir sonraki ayırma adımına yardımcı olmak için lökosit süspansiyonunu 10 mL'ye kadar PBS ile doldurun ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    6. Yoğunluk gradyan ortamını hazırlayın (yoğunluk: 1.077 g / mL) çözelti: 3 mL yoğunluk gradyan ortamını yeni bir steril 15 mL konik tüpe yerleştirin ve oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
    7. Yoğunluk gradyan ayrımını gerçekleştirmek için yoğunluk gradyan ortamını (5:3) içeren konik tüpe 5 mL seyreltilmiş lökosit süspansiyonu (adım 1.1.5'ten itibaren) ekleyin. Yoğunluk gradyan ortamını bozmamak için tüp duvarlarını kullanarak numuneyi yavaşça, damla damla ekleyin.
    8. Gradyan ayrımı: Yoğunluk gradyanlı orta süspansiyonu, döner rotorlu ve fren kapalıyken bir santrifüjde 30 x g'de 1,100 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin.
    9. Santrifüjlemeden sonra, konik tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Bu adımdan sonra, aşağıdan başlayarak aşağıdakiler de dahil olmak üzere bir dizi iyi tanımlanmış katman görülebilir: kırmızı bir katman (RBC'ler ve granülositler), yoğunluk gradyan ortamı, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) ince bir soluk tabakası ve plazma.
    10. Bir Pasteur pipeti kullanarak ince PBMC tabakasını toplayın ve aşağıdaki yoğunluk gradyan ortamını veya yukarıda çok fazla plazma almaktan kaçının. PBMC örneğini 50 mL'lik yeni bir konik tüpe yerleştirin, PBS ile 25 mL'ye kadar doldurun ve örneği hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    11. Kalan hücreleri ve kalıntıları yıkamak için numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600 x g'da (normal fren) santrifüjleyin ve tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatanı atın.
      NOT: Çok fazla kırmızı kan hücresi kontaminasyonu varsa, ki bu hücre peleti veya buffy kılıfı tamamen ayrılmadığında veya kırmızımsı göründüğünde gözlemlenebilir, kalan eritrositlerin parçalanması önerilir. Bu durumda, 5 mL RBC lizis tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın), iyice karıştırın ve 5 dakika inkübe edin. PBS ile 40 mL'ye kadar doldurun, numuneleri oda sıcaklığında 900 x g'da (normal fren) 10 dakika santrifüjleyin ve tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatanı atın.
    12. Numuneyi PBS ile 10 mL'ye kadar doldurun ve hücreleri saymak için bir alikot alın. Trombositleri çıkarmak için, oda sıcaklığında 400 x g'da (normal fren) 5 dakika santrifüjleyin ve tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatanı atın.
      NOT: Önemli sayıda trombosit olması durumunda, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g'da (normal fren) iki kez santrifüjleyin. Hücreler sayılırken numune görselleştirilerek trombositler tanımlanır.
  2. İmmünomanyetik ayırma ile monosit izolasyonu
    1. PBS'yi %0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile destekleyerek mikro boncuk tamponunu hazırlayın. Çözeltiyi süzülerek (0,2 μm) sterilize edin ve tamponu buzdolabında (2-8 °C) saklayın.
    2. Manyetik ile aktive edilen hücre sıralaması (MACS) ile monosit CD14+ izolasyonu gerçekleştirin.
      1. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayımından sonra (adım 1.4.1), gerekli olan uygun mikroboncuk tamponu ve CD14 immünomanyetik boncuk hacmini hesaplayın (Malzeme Tablosuna bakın). Bu çözeltilerin buz üzerinde tutulduğundan emin olun. 1 x 107 hücre başına 80 μL mikro boncuk tamponu ve 1 x 107 hücre başına 20 μL CD14 boncuk ekleyin.
      2. Hücre peletini önceden belirlenen hacimlerde yeniden süspanse edin ve 4 °C'de (2-8 °C) 15 dakika inkübe edin.
        NOT: PBMC örneklerinde monosit seviyelerinin doğrulanması gerekiyorsa, boyama antikorları (örneğin, CD14 [Monoklonal TÜK4]) kullanarak bir akış sitometrik analizi yapın. Akış sitometrik analiziyle ilgili ayrıntılar için adım 3.2'yi izleyin.
      3. 1 x 107 hücre başına 1-2 mL mikro boncuk tamponu ekleyin, bağlanmamış boncukları çıkarmak için oda sıcaklığında 600 x g'da (normal fren) 10 dakika santrifüjleyin ve tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatanı atın.
      4. LS sütununu hazırlayın. LS kolonları, bir mıknatıs üzerine yerleştirildiğinde, manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerin pozitif, nazik tutulmasına izin veren ferromanyetik küreler içerir33. Kullanmadan hemen önce, mıknatısın üzerine bir LS sütunu ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin, tamamen kurumadan 3 mL mikro boncuk tamponu ile durulayın ve hemen bir sonraki adıma geçin.
        NOT: Verimden ödün vermemek için işlem sırasında kolonun kurumasına asla izin vermeyin.
      5. Hücre peletini 1 x 108 hücre başına 500 μL mikro boncuk tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre sayısı 4 x 108'den yüksekse, hücre toplanmasını önlemek için 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanın.
      6. Hücre süspansiyonunu kolon girişine ekleyin, negatif hücre fraksiyonunu toplamak için kolon çıkışının altına 15 mL'lik konik bir tüp yerleştirin ve kolonu 3 mL mikroboncuk tamponu ile üç kez yıkayın. Negatif fraksiyon, CD14 boncukları ile toplanmayan hücreleri (yani CD14− hücreleri) içerir.
      7. Son yıkamadan sonra, kolonu mıknatıstan çıkarın, steril bir 15 mL konik tüpe yerleştirin, kolon girişine 5 mL mikro boncuk tamponu pipetleyin ve şırınga pistonunu hemen kolon girişine yerleştirin ve hedef hücreleri dağıtmak için itin.
      8. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri (CD14+ hücreleri) toplayın ve adım 1.4.1'de açıklandığı gibi hücreleri saymak için bir alikot alın.
      9. Her iki hücre fraksiyonunu, CD14− ve CD14+ hücrelerini, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600 x g'da (normal fren) santrifüjleyin. Süpernatanı atın, sonraki adımlar için CD14 + fraksiyonunu saklayın ve gerekirse ko-kültür tahlilleri gibi gelecekteki tahliller için CD14− fraksiyonunu saklayın. Gerekirse, CD14− fraksiyonundan gelen hücreler −80 °C'de RPMI-1640 %20 FBS ve %10 DMSO'da dondurularak saklanabilir.
  3. Dendritik hücrelere monosit farklılaşması
    1. RPMI-1640 baz ortamını (11.1 mM glikoz içeren)% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 2 mM L-glutamin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),% 1 sodyum piruvat ve% 1 100 μg / mL penisilin / streptomisin ile destekleyerek tam RPMI-1640 ortamı hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
    2. ~5-6 gün içinde meydana gelen mo-DC'lere monosit farklılaşması gerçekleştirin.
      1. Elde edilen CD14+ hücre sayısı için gerekli ortam hacmini hesaplayın ve hücreleri aşağıdaki deney düzeneğine göre plakalayın.
        NOT: Bu protokolde, hücre ölümü ve ölçüm hataları dikkate alınarak hücreler 1.3 x 106 hücre/mL konsantrasyonda kaplandı ve besiyeri, 1.000 U/mL GM-CSF ve 750 U/mL IL-4 (Malzeme Tablosuna bakınız) eklenerek hazırlandı ve iyice karıştırıldı.
      2. CD14+ hücrelerine uygun hacimde ortam ekleyin ve bir Pasteur pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 24 oyuklu plakalara (oyuk başına: 1.3 x 106 hücre / mL) yerleştirin ve bir kültür inkübatöründe 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
      3. Kültür ortamını değiştirin ve her 2-3 günde bir taze sitokinlerle destekleyin (genellikle farklılaşma işlemi başına bir kez). Bunu gerçekleştirmek için, hücreleri rahatsız etmeden kültür ortamının yarısını dikkatlice çıkarın. Daha önce adım 1.3.2.1'deki notta açıklandığı gibi, uygun sitokin konsantrasyonuna sahip aynı miktarda taze ortam ekleyin ve kalan farklılaşma süresi boyunca inkübe edin.
        NOT: DC'ler, monositlerden farklılaşırken, gevşek bir şekilde yapışan hücrelerdir. Tamamen farklılaşmış olgunlaşmamış mo-DC'ler, iğ şeklinde, serbest yüzen ve gevşek bir şekilde yapışan hücrelerdir. Hücreler, özellikle olgunlaştığında rozetler de oluşturabilir34.
      4. Farklılaşmadan sonra hücreleri toplamak için, tüm hücre süspansiyonunu steril bir konik tüpe aktarmak için bir mikropipet kullanın ve plakanın kuyucuklarını PBS ile iki kez yıkayın, tabana hafifçe vurun (Şekil 1A).
        NOT: Muhtemelen makrofajlar olduğu için yoğun bir şekilde yapışan hücreleri toplamaktan kaçının. Yanlış hücre olgunlaşmasını veya aktivasyonunu önlemek için, hücrelerin çok dikkatli kullanıldığından emin olun.
      5. Herhangi bir kalıntı veya ölü hücreyi çıkarmak için hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 180 x g'de (normal fren) santrifüjleyin ve deney düzeneği için uygun ortamda/tamponda yeniden süspanse edin.
    3. Mo-DC'lerin olgunlaşmasını gerçekleştirin.
      1. Mo-DC'lerin olgunlaşmasının gerekli olması durumunda, daha önce kullanılan hücre konsantrasyonu örneğini (1.3 x 10 6 hücre/mL) dikkate alarak bir kuyu plakası veya şişesi kullanın ve ortamı IL-1β (10 ng/mL),IL-6 (1.000 U/mL), prostaglandin E2 (PGE2; 1 μg/mL) içeren bir sitokin kokteyli ile destekleyerek bir sitokin kokteyli uygulayın, ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α; 10 ng / mL) (Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile 24 saat veya 48 saat inkübe edin.
  4. Hücre sayımı ve canlılığı
    1. Hücre sayımı ve tripan mavisi boyama gerçekleştirin.
      1. Hücre sayısını ve bir hücre süspansiyonunun canlılığını belirlemek için, hücre süspansiyonundan 10 μL'lik bir alikot alın ve 10 μL tripan mavisi (1: 1 seyreltme) ile karıştırın.
      2. Önceki karışımdan 10 μL alın ve üreticinin talimatlarına göre hücre sayısını saymak için otomatik hücre sayacını kullanın.
        NOT: Hücrelerin konsantrasyonu çok yüksekse, alikotu seyreltin ve hücre sayımından sonra hesaplamalarda seyreltme faktörünü dikkate alın.
      3. Deney düzeneği için hücre numarasını ve ortamı/tamponu ayarlayın.
    2. Hücre canlılığını ve apoptozu belirleyin30.
      NOT: Bu çalışmada, sialidaz tedavisini takiben (bölüm 2), canlılık testi yapılmıştır.
      1. Mo-DC'leri 5 μg / mL 7-aminoaktinomisin D (7-AAD) ve ekin V ile boyayın ve üreticinin talimatlarına göre apoptozu belirleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
      2. Sonuçları akış sitometrisi29,30 kullanarak analiz edin.

2. Hücrelerin sialidaz ile tedavisi

NOT: Mo-DC'lere farklılaştıktan sonra, altıncı günde, hücreler sialidaz tedavi testi için hazırdır.

  1. İstenen deney düzeneğini göz önünde bulundurarak, 1.3 x 106 hücreli/oyuklu 24 oyuklu plakanın 10 kuyusundan ~10 x 106 mo-DC toplayın ve bunları yeni bir steril 15 mL konik tüpe aktarın.
    NOT: Bir miktar hücre kaybı olduğunu varsayın; tipik olarak, bu aşamada, bulunan konsantrasyon 1.3 x 106 hücre/mL'dir, çünkü mo-DC'ler ve öncülleri çoğalmaz ve mo-DC'lere farklılaşma sırasında %20 canlılık kaybı yaşar.
  2. Oda sıcaklığında 300 x g'da (normal fren) 5-7 dakika santrifüjleyin ve ölü hücreleri ve kalıntıları temizlemek için süpernatanı atın.
  3. 10 mL RPMI-1640 ortamı (11.1 mM glikoz içerir) ekleyin, oda sıcaklığında 300 x g'da (normal fren) 4 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın, 2 mL RPMI-1640 ekleyin ve iyice karıştırın.
  4. RPMI-1640'ta 1 mL hücreyi yeni steril mikrotüplere, #1 ve #2'ye yerleştirin; Her mikrotüp yaklaşık 5 x 106 hücre içerecektir.
  5. Mikrotüp #1'e, Clostridium perfringens'ten 500 mU sialidaz ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Mikrotüp #2'ye, gözlenen etkilerin doğrudan sialik asit giderimi ile ilişkili olup olmadığını ve artefaktlardan kaynaklanıp kaynaklanmadığını doğrulamak için negatif bir kontrol olan sahte muamele edilmiş sialidaz ekleyin. Sahte muamele edilmiş sialidaz, enzimin 100 °C'de 20 dakika kaynatılmasıyla elde edilen ısıyla inaktive edilmiş sialidazdır.
  6. 37 °C'de 60 dakika inkübe edin.
  7. İnkübasyondan sonra, hücreleri aynı numaralandırma, #1 ve #2 ile yeni steril 15 mL konik tüplere yerleştirin. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için her iki tüpe yaklaşık 4 mL tam RPMI-1640 ortamı (%10 FBS içerir) ekleyin.
  8. Oda sıcaklığında 300 x g'da (normal fren) 4 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  9. Her tüpe 5 mL tam RPMI-1640 ortamı ekleyin ve oyuk başına 1 mL hücre plakalayın.

3. Sialik asit profilinin belirlenmesi

  1. Lektin boyama
    1. Hücreleri toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da (normal fren) yıkayın.
    2. Hücreleri RPMI-1640 +% 10 FBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri (100.000 / 100 μL) mikrotüplere dağıtın.
    3. Her lektin için 0.01 mg / mL'lik bir konsantrasyon kullanarak% 10 FBS ile RPMI-1640'ta akış sitometrisi için boyama yapın: Sambucus nigra (SNA) lektin, fıstık aglütininin (PNA) lektin ve Maackia amurensis (MAA) lektin (Malzeme Tablosuna bakınız). 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    4. Hücreleri %10 FBS veya %10 BSA içeren 1 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 300 x g'da (normal fren) 4 dakika santrifüjleyin.
    5. Biyotinile lektinlerle boyanmış hücrelere 0.0005 mg / mL streptavidin-PE ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 300 x g'da 4 dakika santrifüjleyin (normal fren).
    6. Süpernatanı atın ve her tüpe 300 μL %2 paraformaldehit (PFA %2) ekleyin. Tüpleri ışıktan koruyun ve gerekirse veri alınana kadar 4 °C'de saklayın.
    7. Numune hazırlandıktan sonraki 1 hafta içinde bir akış sitometresi kullanarak verileri elde edin 29,30.
  2. Akış sitometrisi
    1. Hücreleri 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin ve anında veri toplama için numuneyi bir akış sitometresi ile alın.
    2. Gecikmeli veri alımı için, 300 μL'de %2 PFA'da yeniden askıya alın ve verileri 1 hafta içinde alın.
  3. Konfokal lazer tarama mikroskobu
    1. Hücreleri 12 mm çapında polilisin kaplı cam lameller üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    2. Hücre yapışmasını desteklemek için lamelleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 100 x g'da (normal fren) santrifüjleyin.
    3. PBS'de %1 BSA ile yıkamadan önce %4 PFA ile oda sıcaklığında 30 dakika sabitleyin.
    4. Hücre yüzeylerinde α2,6'ya bağlı sialik asitleri boyamak için FITC ile konjuge SNA lektin (0.01 mg / mL) kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız).
    5. Konfokal mikroskopta görüntüler elde edin ( Malzeme Tablosuna bakın).
    6. Z yığını işlemeden sonra, temsili konfokal kesit görüntülerini seçin.
    7. Düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) kullanarak boyama yoğunluğunu analitik olarak ölçün.
      NOT: CTCF = Entegre yoğunluk − (Seçilen hücrenin alanı × Arka plan okumalarının ortalama floresansı)29.

4. mo-DC'lerin olgunlaşma profili oluşturma

  1. Antikor boyama ve akış sitometrisi
    1. Antikor boyaması yapmak için ilgilenilen hücrelerin yeni bir örneğini toplayın. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da (normal fren) yıkayın ve hücreleri mikrotüplere dağıtın (tüp başına 100.000 hücre).
    2. İstenen antikorları (ab), MHI-I, MHC-II, CD80 ve CD86'yı kullanarak akış sitometrisi için boyama yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    3. Floresan konjuge ab'yi karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
    4. Hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 300 x g'da (normal fren) 5 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Etiketlenmemiş ab kullanıyorsanız, floresan konjuge ikincil ab ekleyin ve üreticinin talimatlarına göre karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 300 x g'da (normal fren) 5 dakika santrifüjleyin.
    5. Tüm mikrotüplere 100 μL'ye kadar PBS ekleyin, hücreleri 300 μL% 2 paraformaldehit (PFA% 2) içinde yeniden süspanse edin ve veri toplanana kadar tüpleri 4 ° C'de karanlıkta tutun.
    6. Bir akış sitometresi kullanarak verileri elde edin.
      NOT: Boyama ve fiksasyondan sonra, numuneler hemen veya 1 haftalık bir süre içinde akış sitometrisi ile alınabilir. Bu durumda tüpleri 4 °C'de karanlıkta saklayın.

5. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA)

NOT: Bu çalışmada, IFN-γ üretimi, üreticinin talimatları izlenerek ELISA testi kullanılarak ölçülmüştür (bkz. Malzeme Tablosu).

  1. Plakayı bir kaplama tamponunda kaplamak için, yakalama antikorunu (1:100, PBS'de yakalama antikoru) seyreltin, bu çalışma çözeltisinin 100 μL'sini her bir oyuğa aktarın ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  2. Yakalama antikorunu tamamen atın.
  3. Engelleme tamponunu ekleyin (örneğin, PBS + %2 BSA + %0,05 Tween20) ve engelleme tamponunu çıkarmadan önce oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  4. İlgili karışım ve seyreltmelerle birlikte standardı ve numuneyi ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Yıkama tamponu ile beş kez yıkayın.
  5. Biyotinile dedektör antikorunu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin, ardından beş yıkama yapın.
  6. Poli-HRP-streptavidin-HS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından yıkama tamponu ile beş yıkama yapın.
  7. TMB substratı ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve kullanılan test sistemini dikkate alarak oda sıcaklığında 60 dakikaya kadar inkübe edin. Yıkama tamponu ile beş kez yıkayın.
  8. Numuneleri 450 nm'de bir mikroplaka okuyucuda okuyun.

Representative Results

Monosit izolasyonu ve mo-DC'lere monosit farklılaşması
Protokole uygun olarak, insan PBMC'leri, yoğunluk gradyanlı ortam ile yoğunluk gradyan ayrımı kullanılarak buffy kaplamadan izole edildi ve iyice yıkandı. Tripan mavisi, daha önce adım 1.4.1'de açıklandığı gibi, izolasyon gününde canlı hücre sayımı yapmak için kullanıldı. Daha sonra pozitif seleksiyon yoluyla CD14+ monosit izolasyonu gerçekleştirildi. Bunu başarmak için, PBMC'ler, CD14 antijenini tanıyan bir antikor içeren manyetik boncuklarla inkübe edildi. Seçilen CD14+ monositleri, olgunlaşmamış mo-DC'lere farklılaşmak için 5-6 gün27 boyunca GM-CSF ve IL-4 ile desteklenmiş bir ortamda kültürlendi (Şekil 1A). Mo-DC'lerin olgunlaşması, IL-6, IL-1β, TNF-α ve PGE235 dahil olmak üzere bir sitokin kokteyli uygulanarak elde edilebilir (Şekil 1A).

Farklılaşma sürecinde IL-4 ve GMCSF stimülasyonu sonucunda hücre fenotipinin değişmesi beklenir. Veriler, mo-DC'lerin esas olarak monositler tarafından eksprese edilen yüzey markörü CD14'ün ekspresyonunu kaybettiğini (Şekil 1B) ve insan DC'leri36,37 tarafından eksprese edilen bir belirteç olan CD1a'nın önemli ekspresyonunu kazandığını göstermektedir. mo-DC'ler ayrıca, insan DC'leri ve diğer antijen sunan hücreler38 tarafından eksprese edilen bir antijen sunan molekül olan daha yüksek MHC-II (HLA-DR) ekspresyonu elde eder (Şekil 1B).

Hücre yüzeyi sialik asit içeriği
Mo-DC'lerin sialidaz ile muamelesi, mo-DC'lerin yüzeyindeki sialik asit içeriğini azaltır, bu da karbonhidratlara bağlanabilen proteinler olan lektinlerle boyanarak doğrulanabilir39. Kullanılan enzim hem α2,3 hem de α2,6-bağlı sialik asitleri hücre yüzeyinden uzaklaştırdığından, mo-DC'ler, T antijeni-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr'yi tanıyan PNA ve ayrıca sırasıyla α2,3- ve α2,6-siyalik'e bağlanan MAA ve SNA lektinleri ile boyandı. Sialidaz tedavisinin etkinliği akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi ile değerlendirildi (Şekil 2). Şekil 2A'da gösterildiği gibi, sialidaz tedavisi PNA boyamasını arttırırken MAA ve SNA bağlanmasını önemli ölçüde azaltmıştır. Sialidaz tedavisinden sonra SNA boyamasındaki azalma, hücre yüzeyinde önemli ölçüde azalmış bir SNA boyaması gösteren konfokal mikroskopi analizi ile daha da doğrulandı (Şekil 2B).

Sialidaz ile muamele edilmiş mo-DC'lerin fonksiyonel karakterizasyonu
Sialidaz tedavisinin mo-DC fonksiyonlarını nasıl etkilediğini değerlendirmek için, sialidaz tedavisinden sonra mo-DC'lerin olgunlaşma seviyesi değerlendirildi. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, sialidaz tedavisi, antijen sunan moleküller MHC I ve MHC II'nin ekspresyonunda ve CD80 ve CD86 ko-stimülatör moleküllerinin ekspresyonunda önemli bir artışa yol açar. Sialik asit gideriminin mo-DC'lerin T hücresi tepkilerini indükleme yeteneği üzerindeki etkisini değerlendirmek için, otolog T hücrelerini hazırlamak için tümör hücresi lizatları ile yüklü sialidaz ile muamele edilmiş mo-DC'ler kullanıldı (Şekil 3). Daha sonra, elde edilen T hücrelerinin profili, Th1 sitokin IFN-γ'yi salgılama kapasitelerine göre karakterize edildi. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, tamamen sialile edilmiş mo-DC'ler tarafından hazırlanan T hücreleri ile karşılaştırıldığında, sialidaz ile muamele edilmiş mo-DC'ler tarafından hazırlanan T hücreleri, önemli ölçüde daha yüksek seviyelerde IFN-γ salgıladı. Bu sonuçlar, sialidaz ile muamele edilmiş mo-DC'lerin otolog T hücrelerini hazırlama kapasitesini artırdığını göstermektedir.

Hücre canlılığı
Sialidaz tedavisinden sonra, tedavinin hücreler için sitotoksik olmadığından emin olmak için bir canlılık testi yapıldı. Tedaviyi takiben, mo-DC'ler cansız ve apoptotik hücreleri tespit etmek için 7-AAD ve Annexin V ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi (Şekil 4). Veriler, tedavi edilmemiş (Şekil 4, sol panel) ve sialidaz ile tedavi edilmiş hücreler (Şekil 4, sağ panel) arasında hücre canlılığında önemli bir fark göstermemektedir.

Figure 1
Şekil 1: İzole monositlerin mo-DC'lere farklılaşması. (A) CD14+ monositleri, buffy coats'tan izole edildi ve 37 °C'de 1.3 x 106 hücre/mL konsantrasyonda kültürlendi. Monositler, 750 U / mL IL-4 ve 1.000 U / mL GM-CSF ile desteklenmiş ortamda farklılaştırıldı. 0. günde insan buffy kürkünden izole edilen monositlerin morfolojisinin mikroskobik analizi (üstteki resim). Olgunlaşmamış mo-DC'ler; hücreler 5 günlük bir süre boyunca IL-4 ve GM-CSF kullanılarak farklılaştırıldı (ortadaki resim). Olgunlaşmış mo-DC'ler, 24 saat boyunca IL-6, IL-1β, TNF-α ve PGE2 sitokinleri kullanılarak elde edildi (alttaki resim). Ölçek çubukları: 100 μm. (B) Hücreler, akış sitometrisi kullanılarak farklılaşma periyodu boyunca 0. gün, 2. gün ve 5. günde analiz edildi. Hücre yüzeyi belirteçlerini karakterize etmek için aşağıdaki antikorlar kullanıldı: (ac) CD14; (d-f) CD1a ve (g-i) HLA-DR (MHC sınıf II). Şekil, en az üç bağımsız tahlilin temsili histogramlarını göstermektedir. Panel (B), Videira et al.40, patent WO2017002045A1'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: α2,6- ve α2,3-bağlı sialik asitleri hücre yüzeyinden uzaklaştırmak için insan mo-DC'lerinin sialidaz işlemi. (A) Sialidaz tedavisinin etkinliğini test etmek için lektin boyama kullanılarak akış sitometrisi ile mo-DC'lerin analizi. İnsan mo-DC'leri sialidaz (gri çubuklar) ile muamele edildi veya işlenmeden bırakıldı (beyaz çubuklar) ve SNA lektin ([2,6]-sialik asitleri tanıyan), MAA lektin ([2,3]-sialik asitleri tanıyan) ve PNA lektin (T antijeni-Galβ1-3GalNAcα1-Ser / Thr'yi tanıyan) ile boyandı. Değerler, en az üç bağımsız testin ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) temsil eder. İstatistiksel anlamlılık, tedavi edilmemiş ve sialidaz ile tedavi edilmiş DC'ler arasındaki farka atıfta bulunarak iki kuyruklu eşleştirilmiş bir t-testi (*P < 0.05 veya ***P < 0.0001) kullanılarak belirlendi. Sialidaz tedavisi, α(2,3)-bağlı sialik asitlerin uzaklaştırılmasından kaynaklanan insan mo-DC'lerinde MAA bağlanmasını azalttı ve PNA boyamasını artırdı; sialidaz tedavisinden sonra α(2,6)-bağlı sialik asitlerin uzaklaştırılması, SNA boyamasında bir azalma ile tespit edildi. (B) Sialidaz ile muamele edilen ve gözlem için lameller üzerinde hazırlanan mo-DC'lerin konfokal mikroskobu. Farklı hücrelerden bir dizi z-yığını görüntüsü toplandı ve ortalama boyama yoğunluğunu içerecek şekilde işlendi. Ölçek çubukları: 20 μm. Panel (A), Silva ve ark.30'dan değiştirilmiştir; panel (B) Silva ve ark.29'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Olgunlaşma belirteçlerinin daha yüksek bir ekspresyonunu indükleyen mo-DC'lerin sialidaz tedavisi . (A) sialidaz ile muamele edilen mo-DC'ler, tamamen sialile edilmiş mo-DC'lerden daha yüksek bir olgunlaşma fenotipi gösterdi. Çeşitli olgunlaşma belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için akış sitometrisi kullanıldı. Mo-DC'ler 37 ° C'de 1 saat boyunca sialidaz ile muamele edildi; grafik değerleri, en az üç bağımsız testin ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) (ortalama ± SEM) temsil eder. İstatistiksel olarak anlamlı farklılıklar, tedavi edilmeyen ve sialidaz ile tedavi edilen durumlar arasındaki farka atıfta bulunan bir t-testi (*P < 0.05, **P < 0.01) kullanılarak hesaplandı. (B) Tüm tümör antijenleri ile yüklü desialile edilmiş insan mo-DC'leri, spesifik T hücresi yanıtlarını indükledi. Mo-DC'ler 37 ° C'de 1 saat boyunca sialidaz ile muamele edildi veya tedavi edilmeden bırakıldı, ardından tüm tümör hücresi antijenlerinin kaynağı olarak MCF-7 lizatları (TL) ile yüklendi. IL-2 (10 U/mL) varlığında 4-8 gün boyunca mo-DC'ler ve otolog T hücreleri arasında ko-kültür yapıldı. Desiyalile mo-DC'lerle astarlanmış T hücreleri, Th1 sitokinin, IFN-γ'nin önemli ölçüde daha yüksek salgılanmasını gösterdi. Mo-DC'ler ile T hücresi stimülasyonunu takiben, ko-kültür süpernatantlarına salgılanan sitokinler ELISA ile ölçüldü (n = 7). Grafik değerleri konsantrasyonu (pg/mL) (ortalama ± SEM) temsil eder. İstatistiksel olarak anlamlı farklılıklar t-testi kullanılarak hesaplandı (*P < 0.05). Şekil Silva ve ark.30'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Sialidaz tedavisinin insan mo-DC'lerinin yaşayabilirliği üzerindeki etkisinin olmaması. İşlenmemiş mo-DC'ler (sol panel) ve sialidaz ile muamele edilmiş mo-DC'ler (sağ panel), ek V ve 7-AAD ile ikili boyamaya tabi tutuldu ve boyama akış sitometrisi ile analiz edildi. Veriler, tedavi edilmemiş ve sialidaz ile tedavi edilmiş hücreler arasında hücre canlılığında önemli bir fark göstermedi, bu da mo-DC'lerin sialidaz tedavisini tolere edebildiğini ve immünolojik fonksiyonlarını uygulamak için canlı kalabileceğini düşündürdü. Şekil Silva ve ark.30'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Monosit izolasyonu
Bu el yazması, insan tarafından izole edilmiş monositler CD14 + 'dan mo-DC'ler üretmek için bir protokolü açıklar (Şekil 1A), ardından bu hücrelerin yüzeyindeki sialik asit içeriğini azaltmak için bir sialidaz tedavisi gerçekleştirir.

İnsan DC'lerini doğrudan periferik kan veya dokulardan veya kök hücreler veya monositler gibi öncüllerden farklılaşma yoluyla elde etmenin farklı yolları vardır. Periferik kandan izole edilen monositlerden farklılaşmış DC'lerin elde edilmesi, diğer DC kaynaklarına kıyasla yüksek miktarlarda monosit elde etme kolaylığı nedeniyle çok daha basittir41. Yine de, yüksek oranda izole edilmiş monosit elde etmek için tüm protokol adımları dikkatle takip edilmelidir. Örneğin, yoğunluk gradyan ortamı hücreler için toksik olabilir ve hücre ölümünü önlemek için, yoğunluk gradyan ortamı ile uzun süreli hücre temasından kaçınılmalı ve hücreler iyice yıkanmalıdır. Hücre canlılığının kaybını önlemek için hücre manipülasyonu mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. PBMC'lerden monositler, çok sayıda monosit elde etmek için uygun bir teknoloji olan manyetik ile aktive edilen hücre sıralama (MACS) yöntemi kullanılarak pozitif seçim yoluyla izole edilebilir. Ek olarak, diğer monosit seçim yöntemleriyle karşılaştırıldığında, MACS ile izole edilmiş monositlerden türetilen mo-DC'ler, anti-tümör T hücresi aktivitesini uyarmak için daha büyük bir yeteneğe sahiptir42. Bu protokolde, izole edildikten sonra, monositler, olgunlaşmamış mo-DC'lere farklılaşmayı sağlamak için 5-6 günlük bir süre boyunca IL-4 ve GM-CSF ile inkübe edildi (Şekil 1). Sonuçlar, morfolojik olarak (Şekil 1A) ve fenotipik olarak (Şekil 1B), izole edilen monositlerin olgunlaşmamış mo-DC'lere farklılaştığını gösterdi. Ayrıca, farklılaşma boyunca, mo-DC'ler CD14 belirteçlerinin ekspresyonunu kaybetti ve T hücrelerine antijen sunumu için gerekli olan CD1a ve MHC-II'nin ekspresyonunu kazandı (Şekil 1B).

Monositlerin mo-DC'lere bu izolasyonu ve farklılaşması, bu protokolün sınırlamalarıdır. İzolasyon işlemi, hücre ölümünü önlemek için dikkatli ve hızlı bir şekilde yürütülmesi gereken hassas bir adımdır ve bu adım, yeni bir deney için mo-DC'lere her ihtiyaç duyulduğunda da yapılmalıdır. Farklılaşma süreci 5-6 gün sürer ve bu da yüksek verimli analizler için bu yöntemin kullanılması açısından zorluk teşkil eder. Bununla birlikte, izolasyon yöntemi ve mo-DC'leri ayırt etmek için sitokinlerin kullanılması, deney amacıyla in vitro olarak çok sayıda fonksiyonel mo-DC üretmek için yararlıdır. Bu protokolde üretilen mo-DC'ler sialidaz tedavisi, akış sitometrisi, ELISA, konfokal mikroskopi vb. Uygulanabilir, böylece bu yöntemin önemi ve kullanışlılığı vurgulanır30.

Olgunlaşmamış mo-DC'ler ve sialidaz tedavisi
Sialidazlar, sialilasyon regülasyonunda esastır ve sialik asitlerin hücre yüzeyindeki glikanlardan uzaklaştırılmasından sorumludur. Mo-DC'lerde, sialidaz ile sialik asidin uzaklaştırılması, bu hücrelerin olgunlaşmasına yol açar, bu da antijen çapraz sunumunu ve ardından T hücresi aktivasyonunu ve anti-tümör aktivitesiniarttırır 30.

Olgunlaşmamış insan mo-DC'leri, olgun mo-DC'lere 31,43 kıyasla yüksek miktarda hücre yüzeyi α(2,6)- ve α(2,3)-bağlı sialik asit27 içeriği gösterir. Ayrıca, mo-DC'leri sialidaz ile işleyerek sialik asitlerin uzaklaştırılması, DC'lerin 28,30,31 olgunlaşmasını iyileştirir. Bu deney için seçilen sialidaz, Clostridium perfringens bakterisindendi.Yine de, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae veya Salmonella typhimurium44, sülük Macrobdella decora45 ve hatta Homo sapiens46 bakterileri gibi diğer organizmalar da sialidazlar üretir ve bu organizmalardan elde edilen sialidazlar da deneysel olarak kullanılır. Bununla birlikte, her sialidaz farklı substrat özelliklerine sahiptir. Ek olarak, sialidaz enziminin kullanılmasının sınırlamaları olabilir; örneğin, tedavi sırasında mo-DC'lerin manipülasyonu bu hücreleri daha da uyarabilir. Ayrıca, sialidaz miktarı ve inkübasyon süreleri, kullanılan hücrelerin tipine ve sialik asit bileşimine göre optimize edilmelidir. Sialik asidin uzaklaştırılması kalıcı bir etki değil, geçici bir fenomendir, çünkü hücre hücre yüzeyindeki sialik asit içeriğini eski haline getirecektir. Sialidazın yanı sıra, sialiltransferaz inhibitörleri, sialiltransferaz genlerinin gen nakavtları veya sialik asit mimetikleri kullanılarak sialik asidin metabolik blokajı gibi hücrelerin yüzeyindeki sialik asit moleküllerini azaltmak için başka yöntemler de vardır47,48,49. Bununla birlikte, bu yöntemler hücreler üzerinde farklı etkiler gösterebilir ve desialilasyonun yanı sıra hücre canlılığı da dikkate alınmalıdır. Sialidaz enzim tedavisi, hücre canlılığını korurken hücre yüzeyindeki sialik asitleri etkili ve geçici olarak uzaklaştırmak için pratik bir yöntemdir.

Bu çalışmada, olgunlaşmamış mo-DC'lere 500 mU / 5 x 106 hücre / mL konsantrasyonunda sialidaz ilave edildi ve hücreler 37 ° C'de 60 dakika inkübe edildi. Tedavi, hücre canlılığını korumak ve serumda bulunan sialillenmiş moleküller arasında herhangi bir etkileşimi önlemek için serumsuz RPMI-1640 kullanılarak gerçekleştirildi30. Sialidaz işlemi, RPMI'nin yanı sıra 50 mM sodyum asetat, pH 5.1 (C. perfingens sialidase durumunda) veya PBS50,51,52 gibi diğer tamponlarla da gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, RPMI-1640, prosedür sırasında sabit deneysel koşulları koruduğu, olgunlaşmayı indüklemekten kaçındığı ve sialidaz tamponları veya PBS 53,54,55,56'nın neden olabileceği stresi azalttığı için DC'ler için en yaygın kültür ortamıdır. Sialidaz ile inkübasyondan sonra, enzim reaksiyonunun durduğunu garanti etmek için hücrelerin serum takviyeli bir ortamla iyice yıkanması çok önemlidir. Serumda sialillenmiş moleküllerin varlığı, sialidaz için substratlar olarak rekabet edecek ve böylece hızlı bir reaksiyon durması sağlayacaktır.

Akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi ile yüzey işaretleyici karakterizasyonu
Sialik asit profilinin belirlenmesi için, protokol bölüm 3'te lektin boyamayı takiben akış sitometrisi ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanıldı. Hücre boyama prosedürü için, her iki durumda da, hücre aglütinasyonunu ve ölümünü önlemek için lektin konsantrasyonları ve inkübasyon koşulları optimize edildi. Lektinlerin spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için inkübasyonun en az %2 FBS veya BSA içeren tamponlarda 4 °C'de gerçekleştirilmesi çok önemlidir. Bu protokolde, sabit deney koşullarını korumak ve hücre stresini önlemek için %10 FBS içeren RPMI-1640 kullanıldı. Konfokal mikroskopi ile ilgili olarak, morfolojiyi korumak, otolizi önlemek ve antijenikliği korumak için boyamadan önce hücrelerin sabitlenmesi esastır.

Mo-DC fenotipinin akış sitometrisi ile analizi, sialidaz ile tedavi edilen mo-DC'lerin, sialidaz tedavisinden sonra azalan MMA ve SNA lektinlerine kıyasla hücre yüzeyine bağlı önemli ölçüde daha yüksek miktarda PNA lektine sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 2A). Beklendiği gibi, PNA boyaması artmıştır, çünkü PNA, sırasıyla α2,3- ve α2,6-sialik asitlere doğrudan bağlanan MAA ve SNA'nın aksine, sialillenmemiş antijenleri tanır30. Bu boyama, bu protokolü kullanarak sialik asitlerin hücre yüzeyinden etkili bir şekilde uzaklaştırıldığını doğrular. Tedaviyi doğrulamak ve hücre yüzeyindeki sialik asit içeriğini analiz etmek için kullanılabilecek başka bir yöntem, Şekil 2B'de örneklendiği gibi lektin boyama ve ardından konfokal mikroskopidir.

Önceki örneklerin yanı sıra, sialik asit içeriğini değerlendirmek ve karakterize etmek için western blotlama ile lektin sondalaması gibi alternatif yaklaşımlar mevcuttur. Sialik asit türleri ve bağları için farklı bir tercihe sahip bir lektin grubu olan Siglecs gibi alternatif sialik aside özgü lektinler de mevcuttur57. Her iki teknikte de (akış sitometrisi, mikroskopi veya western blot) lektin kullanmanın yanı sıra, antikorlar kullanarak sialik asit içeriğini karakterize etmek de mümkündür; Örneğin, α2,8-sialik asitler, polisialik asit58'e özgü olan klon 735 gibi antikorlarla değerlendirilebilir. Ek olarak, sialidaz tedavisinden sonra hücreler, fenotiplerini ve T hücrelerini aktive etme yeteneklerini değerlendirerek biyolojik veya terapötik etkinlikleri açısından işlevsel olarak test edilebilir40. Aslında, verilen örneklerde gösterildiği gibi, sialidaz ile muamele edilmiş mo-DC'ler, daha yüksek olgunlaşma fenotipinin yanı sıra antijen sunan ve ko-uyarıcı moleküllerin yüksek bir ekspresyonunu gösterdi.

Ayrıca, sialidaz ile muamele edilmiş mo-DC'ler antijenlerle yüklenebilir ve T hücreleri veya diğer hücrelerle birlikte kültürlenebilir ve daha sonra fenotip, sitokin sekresyon profili veya diğer özellikler açısından incelenebilir. Verilen örnekte, veriler sialidaz ile muamele edilen mo-DC'lerin tümör antijenleri ile yüklenebileceğini ve daha sonra T hücrelerini aktive etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Aslında, ortaya çıkan T hücreleri, sialik asit eksikliğinin mo-DC'lerin T hücrelerini 27,28,29,30,30,31 aktive etme kapasitesini artırma üzerindeki etkisine ilişkin önceki raporlarla uyumlu olan IFN-γ sekresyonunun arttığını gösterdi.

Sonuç olarak, bu protokol, sialidaz ile muamele yoluyla sialik asit içeriği manipülasyonu için mo-DC'ler oluşturmak için uygulanabilir, uygulanabilir ve pratik bir yöntem göstermektedir. Bu protokol, farklı amaçlara ve uygulamalara hizmet edebilecek bir metodoloji sunar. Bu yöntem, sialik asitlerin bağışıklık hücrelerinin olgunlaşması ve yanıtındaki rolünün anlaşılmasında çok önemli bir role sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda bir immünomodülatör araç olarak da kullanılabilir.

Disclosures

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar veya diğer çıkar çatışmaları beyan etmezler.

Acknowledgments

Yazarlar, Avrupa Komisyonu GLYCOTwinning GA 101079417 ve EJPRD/0001/2020 AB 825575; FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) ve LA/P/0140/2020 (i4HB) hibeleri kapsamında Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portekiz. FCT-NOVA. ve Stemmatters, SI I& için Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) aracılığıyla Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) tarafından da finanse edildi. DT DCMatters projesi (NORTE-01-0247-FEDER-047212). FCT-NOVA ve GLYCOVID NOVA Saude'deki Biolabs tesislerini kabul ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tube AstiK’s CTGP-E15-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
24-well plate Greiner Bio-one 662 160 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
50 mL conical tube AstiK’s CTGP-E50-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) BioLegend 420404 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Annexin V Immunotools 31490013 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific  Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
BSA Sigma - Aldrich A3294-100G Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile
CD14 (Monoclonal TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
CD80 Immunotools 21270803 Maturation Profiling of mo-DCs
CD86 Immunotools 21480863 Maturation Profiling of mo-DCs
Cell counting slides and trypan blue EVE EVS-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Centrifuge Eppendorf 5430 R Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Density gradient medium (Histopaque) Sigma - Aldrich 10771-100ML Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
EDTA Gibco, ThermoFisher 15400054 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Elisa kit (IFN-γ) Immunotools 31673539 Maturation Profiling of mo-DCs
EVE automated cell count NanoEntek 10027-452 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500064 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Miltenyi Biotec   130-093-864 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) Miltenyi Biotec 130-050-201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-1β Sigma - Aldrich I9401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-4 Miltenyi Biotec 130-093-919 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-6 Sigma - Aldrich SRP3096 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
L-glutamine Gibco A2916801 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
LS column and plunger Miltenyi Biotec 130-042-401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin - Biotinylated) Vector labs B-1265-1 Determination of Sialic Acid Profile
MHC-I (HLA-ABC) Immunotools 21159033 Maturation Profiling of mo-DCs
MHC-II (HLA-DR) Immunostep HLADRA-100T Maturation Profiling of mo-DCs
Microtubes AstiK’s PCRP-E015-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Neuraminidase (Sialidase) Roche 11585886001 Treatment of Cells with Sialidase
Non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Paraformaldehyde (PFA 2%) Polysciences Europe 25085-1 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Paraformaldehyde (PFA 4%) Biotium 22023 Determination of Sialic Acid Profile
Pasteur pipettes Labbox PIPP-003-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin - FITC) Vector labs FL-1071 Determination of Sialic Acid Profile
Penicillin/streptomycin Gibco 15140163 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) NZYTech   MB18201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Prostaglandin E2 (PGE2) Sigma - Aldrich P0409 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RBC lysis buffer BioLegend 420302 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) Gibco 31870074 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - Biotinylated) Vector labs   B-1305-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - FITC) Vector labs FL-1301-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sodium pyruvate Thermofisher 11360-070 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
SpectroMax190 Molecular Devices Maturation Profiling of mo-DCs
Streptavidin-PE BioLegend   405203 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Tetramethylbenzidine (TMB) Sigma - Aldrich T0440 Maturation Profiling of mo-DCs
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) Sigma - Aldrich H8916 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Zeiss LSM710 confocal microscope Zeiss Determination of Sialic Acid Profile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varki, A., Gagneux, P. Multifarious roles of sialic acids in immunity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1253, 16-36 (2012).
  2. Bochner, B. S., Zimmermann, N. Role of Siglecs and related glycan-binding proteins in immune responses and immunoregulation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 598-608 (2015).
  3. Smith, B. A. H., Bertozzi, C. R. The clinical impact of glycobiology: Targeting selectins, Siglecs and mammalian glycans. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 217-243 (2021).
  4. Schauer, R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current Opinion in Structural Biology. 19 (5), 507-514 (2009).
  5. Manhardt, C. T., Punch, P. R., Dougher, C. W. L., Lau, J. T. Y. Extrinsic sialylation is dynamically regulated by systemic triggers in vivo. Journal of Biological Chemistry. 292 (33), 13514-13520 (2017).
  6. Cabral, M. G., et al. Human dendritic cells contain cell surface sialyltransferase activity. Immunology Letters. 131 (1), 89-96 (2010).
  7. Bordron, A., et al. Hyposialylation must be considered to develop future therapies in autoimmune diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3402 (2021).
  8. Julien, S., Videira, P. A., Delannoy, P. Sialyl-Tn in cancer: (How) did we miss the target. Biomolecules. 2 (4), 435-466 (2012).
  9. Munkley, J. Aberrant sialylation in cancer: Therapeutic opportunities. Cancers. 14 (17), 4248 (2022).
  10. Dennis, J. W., Laferte, S., Waghorne, C., Breitman, M. L., Kerbel, R. S. S1-6 Branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science. 236 (4801), 582-585 (1987).
  11. Pinho, S. S., Reis, C. A. Glycosylation in cancer: Mechanisms and clinical implications. Nature Reviews Cancer. 15 (9), 540-555 (2015).
  12. Manni, M., Läubli, H. Targeting glyco-immune checkpoints for cancer therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 21 (8), 1063-1071 (2021).
  13. Sjögren, J., Lood, R., Nägeli, A. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; Unique tools with broad applications. Glycobiology. 30 (4), 254-267 (2020).
  14. Trastoy, B., et al. Sculpting therapeutic monoclonal antibody N-glycans using endoglycosidases. Current Opinion in Structural Biology. 72, 248-259 (2022).
  15. Pascoal, C., et al. Sialyl LewisX/A and cytokeratin crosstalk in triple negative breast cancer. Cancers. 15 (3), 731 (2023).
  16. von Itzstein, M., et al. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication. Nature. 363 (6428), 418-423 (1993).
  17. Gray, M. A., et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nature Chemical Biology. 16 (12), 1376-1384 (2020).
  18. Fernandes, Â, et al. Glycans as shapers of tumour microenvironment: A sweet driver of T-cell-mediated anti-tumour immune response. Immunology. 168 (2), 217-232 (2023).
  19. Togayachi, A., et al. Polylactosamine on glycoproteins influences basal levels of lymphocyte and macrophage activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15829-15834 (2007).
  20. Park, D. D. Resident and elicited murine macrophages differ in expression of their glycomes and glycan-binding proteins. Cell Chemical Biology. 28 (4), 567-582 (2021).
  21. Steinman, R. M. Dendritic cells and immune-based therapies. Experimental Hematology. 24 (8), 859-862 (1996).
  22. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2 (1), 37-56 (2010).
  23. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  24. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  25. So-Rosillo, R., Small, E. J. Sipuleucel-T (APC8015) for prostate cancer. Expert Review of Anticancer Therapy. 6 (9), 1163-1167 (2006).
  26. Cheever, M. A., Higano, C. S. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: The first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clinical Cancer Research. 17 (11), 3520-3526 (2011).
  27. Videira, P. A., et al. Surface α2-3- and α2-6-sialylation of human monocytes and derived dendritic cells and its influence on endocytosis. Glycoconjugate Journal. 25 (3), 259-268 (2008).
  28. Cabral, M. G., et al. The phagocytic capacity and immunological potency of human dendritic cells is improved by α2,6-sialic acid deficiency. Immunology. 138 (3), 235-245 (2013).
  29. Silva, Z., et al. MHC class I stability is modulated by cell surface sialylation in human dendritic cells. Pharmaceutics. 12 (3), 249 (2020).
  30. Silva, M., et al. Sialic acid removal from dendritic cells improves antigen cross-presentation and boosts anti-tumor immune responses. Oncotarget. 7 (27), 41053-41066 (2016).
  31. Crespo, H. J., et al. Effect of sialic acid loss on dendritic cell maturation. Immunology. 128, 621-631 (2009).
  32. Council of Europe. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Council of Europe. , Strasbourg, France. (2017).
  33. LS Columns. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/Is-columns.html#130-042-401 (2012).
  34. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 07, Unit 7.32 (2012).
  35. Wu, X., Xu, F., Liu, J., Wang, G. Comparative study of dendritic cells matured by using IL-1β, IL-6, TNF-α and prostaglandins E2 for different time span. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (2), 1389-1394 (2017).
  36. Naeim, F., Nagesh Rao, P., Song, S., Phan, R. Chapter 2 - Principles of Immunophenotyping. Atlas of Hematopathology. , Academic Press. Cambridge, MA. 29-56 (2018).
  37. Cernadas, M., Lu, J., Watts, G., Brenner, M. B. CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells. Clinical and Experimental Immunology. 155, 523-533 (2009).
  38. Santambrogio, L., Strominger, J. L. The ins and outs of MHC class II proteins in dendritic cells. Immunity. 25 (6), 857-859 (2006).
  39. Raposo, C. D., Canelas, A. B., Barros, M. T. Human lectins, their carbohydrate affinities and where to find them. Biomolecules. 11 (2), 188 (2021).
  40. Videira, P. A. Q., et al. Patent WO2017002045. A viable cell population, method for production and uses thereof. Portugal patent. , Universidade NOVA de Lisboa. Lisbon, Portugal. (2017).
  41. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. International Journal of Oncology. 20 (2), 247-253 (2002).
  42. Marques, G. S., Silva, Z., Videira, P. A. Antitumor efficacy of human monocyte-derived dendritic cells: Comparing effects of two monocyte isolation methods. Biological Procedures Online. 20, 4 (2018).
  43. Bax, M., et al. Dendritic cell maturation results in pronounced changes in glycan expression affecting recognition by Siglecs and galectins. Journal of Immunology. 179 (12), 8216-8224 (2007).
  44. Chinoy, Z. S., Montembault, E., Moremen, K. W., Royou, A., Friscourt, F. Impacting bacterial sialidase activity by incorporating bioorthogonal chemical reporters onto mammalian cell-surface sialosides. ACS Chemical Biology. 16 (11), 2307-2314 (2021).
  45. Chou, M. -Y., Li, S. -C., Li, Y. -T. Cloning and expression of sialidase L, a NeuAcα2→3Gal-specific sialidase from the leech, Macrobdella decora. Journal of Biological Chemistry. 271 (32), 19219-19224 (1996).
  46. Crespo, H. J., Lau, J. T. Y., Videira, P. A. Dendritic cells: A spot on sialic acid. Frontiers in Immunology. 4, 491 (2013).
  47. Büll, C. Metabolic sialic acid blockade lowers the activation threshold of moDCs for TLR stimulation. Immunology & Cell Biology. 95 (4), 408-415 (2017).
  48. Ohmi, Y., et al. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O -glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology. 31 (5), 557-570 (2021).
  49. Chung, C., et al. Integrated genome and protein editing swaps α-2,6 sialylation for α-2,3 sialic acid on recombinant antibodies from CHO. Biotechnology Journal. 12 (2), 1600502 (2017).
  50. Hyvärinen, S., Meri, S., Jokiranta, T. S. Disturbed sialic acid recognition on endothelial cells and platelets in complement attack causes atypical hemolytic uremic syndrome. Blood. 127 (22), 2701-2710 (2016).
  51. Powell, L. D., Whiteheart, S. W., Hart, G. W. Cell surface sialic acid influences tumor cell recognition in the mixed lymphocyte reaction. Journal of Immunology. 139, 262-270 (1987).
  52. Corfield, A. P., Higa, H., Paulson, J. C., Schauer, R. The specificity of viral and bacterial sialidases for α(2-3)- and α(2-6)-linked sialic acids in glycoproteins. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 744 (2), 121-126 (1983).
  53. Tkachenko, N., Wojas, K., Tabarkiewicz, J., Rolinski, J. Generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes - Comparison of different culture media. Folia Histochemica et Cytobiologica. 43, 25-30 (2005).
  54. Kim, S. J., et al. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes. Cytotherapy. 21 (10), 1049-1063 (2019).
  55. Calmeiro, J., et al. In-depth analysis of the impact of different serum-free media on the production of clinical grade dendritic cells for cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 11, 593363 (2021).
  56. Stamatos, N. M., et al. LPS-induced cytokine production in human dendritic cells is regulated by sialidase activity. Journal of Leukocyte Biology. 88 (6), 1227-1239 (2010).
  57. Lehmann, F., Tiralongo, E., Tiralongo, J. Sialic acid-specific lectins: Occurrence, specificity and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1331-1354 (2006).
  58. Frosch, M., Görgen, I., Boulnois, G. J., Timmis, K. N., Bitter-Suermann, D. NZB mouse system for production of monoclonal antibodies to weak bacterial antigens: Isolation of an IgG antibody to the polysaccharide capsules of Escherichia coli K1 and group B meningococci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (4), 1194-1198 (1985).

Tags

Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Sialillenmiş Fenotipler Sialik Asitler İmmün Yanıt Modülasyonu İmmün Sürveyans Gliko-immün Kontrol Noktaları İmmünoterapiler Dendritik Hücreler (DC'ler) Antijen Sunan Hücreler (APC) DC'lerin Olgunlaşması Sialik Asit İçeriği T hücresi aktivasyonu
Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral,… More

Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral, P., Tanwar, A., Paterson, R. L., Videira, P. A. Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes. J. Vis. Exp. (200), e65525, doi:10.3791/65525 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter