Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Генерация дендритных клеток моноцитарного происхождения с различными сиалированными фенотипами

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65525
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 4,5, 6, 1,2,7
1Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 2UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 3LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade NOVA de Lisboa, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Oncology, Albert Einstein College of Medicine, 6Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark, Zona Industrial da Gandra, 7CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa

Summary

Представлен уникальный комплексный протокол получения десиалированных дендритных клеток человека (mo-DCs) из изолированных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) с использованием терапии сиалидазой. Кроме того, описаны методы оценки фенотипической и функциональной характеристики мо-ДК и оценки того, как лечение сиалидазой улучшает уровень созревания мо-ДК.

Abstract

Сиаловые кислоты представляют собой отрицательно заряженные моносахариды, обычно находящиеся на концах гликанов клеточной поверхности. Благодаря своей гидрофильности и биофизическим характеристикам они участвуют во многих биологических процессах, таких как модуляция иммунного ответа, распознавание собственных и несобственных антигенов, углеводно-белковые взаимодействия и т.д. Клеточное содержание сиаловой кислоты регулируется сиалидазой, которая катализирует удаление остатков сиаловой кислоты. Несколько исследований показали, что сиалогликаны имеют решающее значение в мониторинге иммунного надзора путем взаимодействия с цис- и транс-ингибирующими рецепторами Siglec на иммунных клетках. Кроме того, гликоиммунные контрольные точки при раке становятся важнейшими мишенями для разработки иммунотерапии. Кроме того, дендритные клетки (ДК) рассматриваются как важный компонент иммунотерапии, особенно в исследованиях рака, из-за их уникальной роли в качестве профессиональных антигенпрезентирующих клеток (APC) и их способности запускать адаптивные иммунные реакции и генерировать иммунологическую память. Тем не менее, функция ДК зависит от их полного созревания. Незрелые ДК выполняют противоположную функцию по сравнению со зрелыми ДК и имеют высокое содержание сиаловой кислоты, что еще больше снижает уровень их созревания. Это снижает способность незрелых ДК активировать Т-клетки, что приводит к нарушению иммунного ответа. Следовательно, удаление сиаловой кислоты с клеточной поверхности ДК человека индуцирует их созревание, тем самым увеличивая экспрессию молекул MHC и презентацию антигена. Кроме того, он может восстанавливать экспрессию костимулирующих молекул и IL-12, в результате чего ДК обладают более высокой способностью поляризовать Т-клетки в сторону фенотипа Th1 и специфически активировать цитотоксические Т-клетки для уничтожения опухолевых клеток. Таким образом, сиаловая кислота стала ключевым модулятором ДК и используется в качестве новой мишени для продвижения их терапевтического использования. Это исследование обеспечивает уникальный подход к лечению ДК, полученных из моноцитов in vitro, с помощью сиалидазы, направленный на создание популяций ДК с различными фенотипами сиаловой кислоты на клеточной поверхности и адаптированными профилями созревания и костимуляции.

Introduction

Сиаловые кислотосодержащие гликаны (сиалогликаны) вызвали значительный интерес благодаря своей иммуномодулирующей роли. Моносахарид сиаловой кислоты, который наиболее распространен в организме человека в форме N-ацетилнейраминовой кислоты, представляет собой фундаментальные лиганды для лектинов, играющих признанную роль в иммунологии, такие как селектины и сиглексы. Эти лектины распознают сиалогликаны либо на одной и той же клетке (цис), либо на разных клетках (транс) и играют значительную роль во взаимодействиях между хозяином и патогеном, а также в различной физиологической и патологической клеточной активности 1,2,3. Кроме того, поскольку сиаловая кислота занимает концевые позиции гликоконъюгатов клеточной поверхности, она может скрывать нижележащие структуры, тем самым ингибируя межклеточный контакт посредством неспецифических отталкивающих эффектов или препятствуя обнаружению другимилектинами. Активность различных сиалилтрансфераз (которые переносят сиаловые кислоты) и сиалидаз (которые расщепляют связи сиаловой кислоты) внутри клетки определяет количество сиаловой кислоты, присутствующей на поверхности. Кроме того, растворимые сиалилтрансферазы и сиалидазы, экспрессируемые хозяином или патогенами, могут внешне модифицировать количество сиаловой кислоты на поверхности клетки 5,6.

Аберрантное сиалирование является признаком нескольких патологических состояний. При аутоиммунных заболеваниях гипосиалирование может способствовать неограниченной иммунной активации и повреждению органов, поскольку сиаловая кислота помогает различать аутоантигены и регулировать воспалительные реакции7. И наоборот, гиперсиалирование приводит к чрезмерной экспрессии сиалогликанов, таких как сиалил-Tn, антигены сиалила-Льюиса, полисиаловая кислота и ганглиозиды, что является отличительной чертой некоторых видов рака 8,9. Гиперсиалирование также зависит от увеличения экспрессии специфических ферментов, таких как N-ацетилглюкозаминилтрансфераза (GNT-V), которая генерирует гиперсиалированные три- и/или тетраантеннарные N-связанные гликаны, которые связаны с ростом рака и метастазированием10. Содержание сиаловой кислоты также регулирует стабильность и функцию белка, которые являются ключевыми для роли соответствующих онкогенных игроков11. Таким образом, повышенное сиалирование может способствовать развитию опухоли, метастазированию, лекарственной устойчивости и уклонению от иммунного ответа. Более того, повышенная регуляция сиалогликанов позволяет опухолям взаимодействовать с ингибирующими рецепторами Siglec на иммунных клетках и избегать иммунного надзора. По этой причине сиалогликаны в настоящее время считаются гликоиммунными контрольными точками и привлекательными терапевтическими мишенями. Например, ингибиторы Siglec-иммунной оси уже находятся на ранних стадиях клинических испытаний, поскольку иммуноклеточный рецептор Siglec (связывающий сиаловую кислоту иммуноглобулин-подобный LECtin) играет иммунотормозную роль12.

Ферменты использовались для модуляции гликанического профиля в качестве инструментов для изучения или для терапевтических стратегий13,14. Сиалидаза используется для изменения злокачественности раковых клеток, поскольку сиалированные гликаны, такие как сиалил Lewis X, имеют решающее значение для миграции клеток и метастазирования рака15. В то же время ингибиторы сиалидазы, препятствующие расщеплению сиаловой кислоты, достигли клиник для лечения сиаловых кислотозависимых вирусных инфекций16. В последнее время модуляция сиаловой кислоты приобрела дополнительный интерес из-за критической роли сиаловых кислот в качестве лигандов в сиглек-иммунной оси, что означает, что они предлагают новые средства для уменьшения выхода рака из иммунного ответа. Этот интерес был еще больше усилен вкладом лауреата Нобелевской премии 2022 года Бертоцци и ее команды в несколько стратегий, которые избирательно расщепляют различные сиалогликаны и улучшают противораковый иммунный ответ17. Таким образом, стратегии, основанные на сиалидазе, представляют собой многообещающий метод терапии гликоиммунными контрольными точками. Гликофенотип клеток иммунной системы зависит от типа клеток и их активационного статуса. Что касается Т-клеток, то гликаны играют ключевую роль в патофизиологических стадиях развития Т-клеток и отбора тимоцитов, активности Т-клеток, дифференцировки и пролиферации18. Например, полилактозамин на гликопротеинах влияет на базальные уровни В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов и активацию макрофагов19. У макрофагов отчетливые паттерны экспрессии гликанов играют важную роль в рекрутировании макрофагов в опухолевое микроокружение (ТМЭ)20. Следовательно, экспрессия О-связанных и N-связанных гликанов иммунными клетками может быть использована в качестве потенциальных гликобиомаркеров для терапевтических подходов к лечению рака и аутоиммунных заболеваний.

Дендритные клетки (ДК) — это специфические антигенпрезентирующие клетки, обладающие уникальной способностью вызывать иммунные ответы, такие как противораковый иммунитет21. ДК должны подвергнуться повышенной регуляции своих антигенпрезентирующих молекул MHC, чтобы представить антигены Т-клеткам (сигнал 1), костимулирующих молекул для активации Т-клеток (сигнал 2) и провоспалительных цитокинов, таких как IL-12, чтобы запустить пролиферацию Т-хелперов 1-го типа (сигнал 3)22. Полученный иммунный профиль жестко регулируется, и контрольные точки необходимы для предотвращения атаки здоровых клеток. Поскольку ДК могут стимулировать различные иммунные реакции против опухолевых клеток, они используются в качестве клеточных вакцин, и значительное количество клинических исследований продемонстрировали их потенциальную пользу23,24. После того, как FDA одобрило первую вакцину на основе DC в 2010 году, было разработано множество других вакцин на основе DC. Вакцины на основе ДК в основном производятся ex vivo и вводятся пациентам для вызова иммунного ответа против опухолей. Тем не менее, недостаточное или непродолжительное созревание в настоящее время является одним из факторов, ограничивающих клиническую эффективность ДК, и означает, что необходимо использовать дорогостоящие цитокиновые коктейли. Без адекватного созревания ДК не могут активировать Т-клетки в клинических условиях. Вместо этого ДК экспрессируют иммунные контрольные точки и запускают толерогенный иммунный ответ, который предотвращает действие цитотоксических Т-клеток против опухолевых клеток.

ДК человека имеют сильно сиалированные поверхности, и это сиалирование уменьшается по мере созревания и во время общего иммунного ответа27. Созревание ДК может быть индуцировано путем элиминации этих сиаловых кислот с помощью сиалидазы. Дезиалоилирование значительно повышает регуляцию различных цитокинов, в том числе IL-12, за счет транслокации транскрипционного фактора NF-kB в ядро 6,28. Кроме того, дезиалоилирование улучшает перекрестную презентацию антигена через MHC-I и противоопухолевые иммунные ответы29,30. Соответственно, нокаут сиалилтрансфераз ST3Gal.l и ST6Gal.l, которые играют важную роль в сиалировании DC, генерирует более зрелый фенотип у мышиных DCs31.

Лечение сиалидазой представляет собой метод стимуляции всех аспектов созревания ДК, включая повышенную презентацию антигена, увеличение экспрессии костимулирующих молекул и увеличение продукции цитокинов, чтобы устранить упомянутые выше недостатки и позволить ДК вызывать эффективные ответы. В данной статье представлена методика получения жизнеспособных дезиалированных ДК человека с помощью бактериальной сиалидазы. Десиалированные ДК демонстрируют улучшенный профиль созревания и могут быть использованы в качестве клеточных моделей для усиления противоопухолевого иммунного ответа in vitro. ДК получают из моноцитов крови, которые затем дифференцируются in vitro в присутствии цитокина интерлейкина-4 (ИЛ-4) и гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ). В данной работе также описаны лектиновые методы анализа сиаловой кислоты на поверхности клетки и методы иммунофенотипирования уровня созревания ДК. Процедура, описанная здесь, может быть использована для десиализации других типов клеток, что обеспечивает подход к изучению роли сиалогликанов, которые являются жизненно важными гликоиммунными контрольными точками и имеют значение для иммуномодуляции.

Protocol

Клетки были выделены из охристой оболочки здоровых анонимных доноров крови, которые были добровольцами, предоставленными национальным банком крови, Instituto Português do Sangue e da Transplantação (IPST), после получения письменного и информированного согласия донора (IMP.74.52.4). Использование крови было одобрено комитетом по этике (IPST 30072015) в соответствии с директивой 2004/23/EC о стандартах качества и безопасности для донорства, закупки, тестирования, обработки, сохранения, хранения и распределения тканей и клеток человека (Закон Португалии 22/2007, 29 июня). Биобанк IPST собирает и хранит кровь в специальном пластиковом пакете, содержащем цитратфосфат-декстрозу (CPD), консервирующий и антикоагулянтный раствор, для сохранения целостности крови до обработки. Чтобы оценить, подходит ли биологический материал для манипуляций, проводится серологический контроль на бледную трепонему, вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV) и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), все из которых должны быть отрицательными. Для настоящего исследования охристое пальто было предоставлено IPST для исследовательских целей вместе с информацией о дате забора, результатах серологических исследований, группе крови и возрасте донора32 года. Охристая шерсть может оставаться при комнатной температуре максимум 1 день.

1. Получение дендритных клеток, полученных из моноцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что при манипуляциях с периферической кровью человека следует учитывать специальные универсальные меры предосторожности и надлежащую утилизацию материала. Перед началом работы убедитесь, что все необходимые реагенты и материалы подготовлены и готовы к использованию.

  1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови
    1. Получите доступ к человеческой охристой шерсти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Охристый покров является побочным продуктом, полученным из крови, собранной с помощью лейкафереза32, которая обогащается лейкоцитами путем центрифугирования. Все этапы выполнялись в шкафу биобезопасности (БСК) с вертикальной проточной камерой.
    2. Откройте упаковку с охристой костью, разрезав скальпелем герметичную выпускную трубку, и переложите содержимое в пробирку объемом 50 мл. Переложите 7 мл образца охристой оболочки в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте 6 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для выполнения предварительной промывки. Этот начальный этап промывки необходим для того, чтобы очистить образец от значительного количества эритроцитов (эритроцитов) и плазмы, чтобы образец был оптимизирован для градиентного разделения с градиентной средой плотности (см. таблицу материалов).
    3. Центрифугу пробирки при комнатной температуре в течение 10 мин при 1 100 x g в центрифуге с поворотным ротором и выключенным тормозом (см. таблицу материалов).
    4. После центрифугирования лейкоцитарную суспензию (белое кольцо между плазмой и эритроцитами) пипеткой Пастера и переложить ее в новую стерильную коническую пробирку объемом 15 мл.
    5. Наполните лейкоцитарную суспензию до 10 мл PBS, чтобы облегчить следующий этап разделения, и перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз.
    6. Приготовьте раствор среды градиента плотности (плотность: 1,077 г/мл): поместите 3 мл среды градиента плотности в новую стерильную коническую пробирку объемом 15 мл и дайте ей нагреться до комнатной температуры.
    7. Добавьте 5 мл разбавленной лейкоцитарной суспензии (из шага 1.1.5) в коническую пробирку, содержащую среду градиента плотности (5:3), для разделения по градиенту плотности. Добавляйте образец медленно, капля за каплей, используя стенки пробирки, чтобы не нарушить среду градиента плотности.
    8. Градиентная сепарация: Центрифугируют суспензию среды градиента плотности при комнатной температуре в течение 30 мин при давлении 1 100 x g в центрифуге с поворотным ротором и с выключенным тормозом.
    9. После центрифугирования осторожно извлеките конические пробирки из центрифуги. После этого этапа виден ряд четко очерченных слоев, в том числе, начиная снизу: красный слой (эритроциты и гранулоциты), среда градиента плотности, тонкий бледный слой мононуклеарных клеток периферической крови (МПКМ) и плазма.
    10. Собирайте тонкий слой PBMC с помощью пипетки Пастера и избегайте захвата среды градиента плотности ниже или слишком большого количества плазмы сверху. Поместите образец PBMC в новую коническую пробирку объемом 50 мл, наполните ее до 25 мл PBS и перемешайте образец, осторожно пипетируя вверх и вниз.
    11. Центрифугируют образцы при комнатной температуре в течение 10 мин при 600 x g (нормальный тормоз), чтобы смыть остаточные клетки и мусор, и выбросьте надосадочную жидкость, осторожно перевернув пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если загрязнение эритроцитов слишком велико, что наблюдается, когда гранулы клеток или охристая оболочка не полностью отделены или выглядят красноватыми, рекомендуется лизировать оставшиеся эритроциты. В этом случае добавляют 5 мл буфера для лизиса эритроцитов (см. таблицу материалов), тщательно перемешивают и инкубируют в течение 5 мин. Наполните до 40 мл PBS, центрифугируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 мин при 900 x g (нормальный тормоз) и выбросьте надосадочную жидкость, осторожно перевернув пробирку.
    12. Наполните образец до 10 мл PBS и возьмите аликвоту для подсчета клеток. Чтобы удалить тромбоциты, центрифугируйте при комнатной температуре в течение 5 минут при 400 x g (нормальный тормоз) и выбросьте надосадочную жидкость, осторожно перевернув пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии значительного количества тромбоцитов центрифугу при комнатной температуре в течение 10 минут при 200 x g (нормальный тормоз) дважды. Тромбоциты идентифицируются путем визуализации образца во время подсчета клеток.
  2. Выделение моноцитов методом иммуномагнитной сепарации
    1. Приготовьте буфер для микрогранул, добавив PBS 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Стерилизуйте раствор фильтрацией (0,2 мкм) и храните буфер в холодильнике (2-8 °C).
    2. Выделение моноцитов CD14+ методом магнитно-активированной сортировки клеток (MACS).
      1. После подсчета клеток с помощью автоматического счетчика клеток (шаг 1.4.1) рассчитайте необходимый объем буфера микрогранул и иммуномагнитных шариков CD14 (см. таблицу материалов). Следите за тем, чтобы эти растворы оставались на льду. Добавьте 80 мкл буфера микрогранул на 1 x 10 7 клеток и 20 мкл гранул CD14 на 1 x 107 клеток.
      2. Повторно суспендируйте гранулы клеток в ранее определенных объемах и инкубируйте в течение 15 минут при 4 °C (2-8 °C).
        ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если требуется проверка уровня моноцитов в образцах PBMC, выполните проточный цитометрический анализ с использованием красящих антител (например, CD14 [моноклональный TÜK4]). Перейдите к шагу 3.2 для получения подробной информации о проточном цитометрическом анализе.
      3. Добавьте 1-2 мл буфера микрогранул на 1 x 107 клеток, центрифугируйте при комнатной температуре в течение 10 минут при 600 x g (нормальный тормоз), чтобы удалить несвязанные гранулы, и выбросьте надосадочную жидкость, осторожно перевернув пробирку.
      4. Подготовьте столбик LS. Колонки LS содержат ферромагнитные сферы, которые при размещении на магните обеспечивают положительное, мягкое удержание магнитно-меченых ячеек33. Непосредственно перед использованием поместите колонку LS (см. Таблицу материалов) на магнит, смойте 3 мл буфера для микрогранул без полного высыхания и сразу приступайте к следующему шагу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не допускайте высыхания колонны во время процедуры, чтобы не поставить под угрозу урожайность.
      5. Ресуспендируйте клеточную гранулу в буфере микрогранул 500 мкл на 1 x 108 клеток. Если количество клеток превышает 4 x 108, используйте сетчатый фильтр 40 мкм, чтобы предотвратить агрегацию клеток.
      6. Добавьте клеточную суспензию на входное отверстие колонки, поместите коническую пробирку объемом 15 мл под выходное отверстие колонки, чтобы собрать отрицательную фракцию клеток, и промойте колонку три раза буфером для микрогранул объемом 3 мл. Отрицательная фракция состоит из клеток, которые не были собраны бусинами CD14 (т.е. клетки CD14− ).
      7. После окончательной промывки снимите колонку с магнита, поместите ее в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл, пипетку 5 мл буфера микрогранул в входное отверстие колонки и сразу же вставьте поршень шприца во входное отверстие колонки и надавите для дозирования целевых клеток.
      8. Соберите магнитно меченные клетки (CD14+ клетки) и возьмите аликвоту для подсчета клеток, как описано в шаге 1.4.1.
      9. Центрифугируют обе клеточные фракции, клетки CD14− и CD14+ , при комнатной температуре в течение 10 мин при 600 x g (нормальный тормоз). Выбросьте надосадочную жидкость, оставьте фракцию CD14+ для следующих этапов и сохраните фракцию CD14− для будущих анализов, таких как анализ на совместном культивировании, если это необходимо. При необходимости клетки из фракции CD14− могут быть криоконсервированы в RPMI-1640 20% FBS и 10% DMSO при −80 °C.
  3. Дифференцировка моноцитов в дендритные клетки
    1. Готовят полную среду RPMI-1640, добавляя в базовую среду RPMI-1640 (содержащую 11,1 мМ глюкозы) 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% от 2 мМ L-глютамина, 1% заменимых аминокислот (NEAA), 1% пирувата натрия и 1% 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (см. таблицу материалов).
    2. Провести дифференцировку моноцитов в mo-DCs, которая происходит в течение ~5-6 дней.
      1. Рассчитайте объем среды, необходимый для количества полученных CD14+ клеток, и распределите клетки в соответствии со следующей установкой эксперимента.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе клетки были покрыты в концентрации 1,3 x 106 клеток/мл, чтобы учесть гибель клеток и погрешности измерения, и среда была приготовлена путем добавления 1000 Ед/мл GM-CSF и 750 Ед/мл IL-4 (см. Таблицу материалов) в полную среду и тщательного перемешивания.
      2. Добавьте соответствующий объем среды к клеткам CD14+ и ресуспендируйте путем пипетирования вверх и вниз с помощью пипетки Пастера. Распределите клеточную суспензию по 24 лунки (на лунку: 1,3 x 106 клеток/мл) и инкубируйте в культуральном инкубаторе при 37 °C с 5%CO2.
      3. Меняйте питательную среду и дополняйте ее свежими цитокинами каждые 2-3 дня (обычно один раз за процесс дифференцировки). Для этого осторожно удаляют половину питательной среды, не нарушая клетки. Добавляют такое же количество свежей среды с соответствующей концентрацией цитокинов, как описано ранее в примечании к шагу 1.3.2.1, и инкубируют в течение оставшегося периода дифференцировки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: ДК при дифференцировке от моноцитов являются слабо адгезивными клетками. Полностью дифференцированные незрелые mo-DC представляют собой веретенообразные, свободно плавающие и слабо адгезивные клетки. Клетки также могут образовывать розетки, особенно при созревании34.
      4. Для сбора клеток после дифференцировки с помощью микропипетки переносят всю клеточную суспензию в стерильную коническую пробирку и дважды промывают лунки планшета PBS, осторожно постукивая по дну (рис. 1А).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте сбора сильно прилипших клеток, так как это, вероятно, макрофаги. Чтобы избежать неправильного созревания или активации клеток, убедитесь, что с ними обращаются с особой осторожностью.
      5. Центрифугируйте клетки при комнатной температуре в течение 10 минут при 180 x g (нормальный тормоз), чтобы удалить любые остатки или мертвые клетки, и ресуспендируйте в соответствующей среде/буфере для экспериментальной установки.
    3. Выполняют созревание мо-ДК.
      1. В случае, если требуется созревание мо-ДК, используют луночный планшет или колбу, принимая во внимание пример концентрации клеток, который использовался ранее (1,3 x 10 6 клеток/мл), и вводят цитокиновый коктейль, дополняя среду цитокиновым коктейлем, содержащим IL-1β (10 нг/мл),IL-6 (1000 Ед/мл), простагландин E2 (PGE2; 1 мкг/мл), и фактор некроза опухоли α (ФНО-α; 10 нг/мл) (см. таблицу материалов). Инкубируют клетки при 37 °C с 5%СО2 в течение 24 ч или 48 ч.
  4. Подсчет клеток и жизнеспособность
    1. Выполните подсчет клеток и окрашивание трипановым синим.
      1. Для определения количества клеток и жизнеспособности клеточной суспензии берут аликвоту 10 мкл клеточной суспензии и смешивают ее с 10 мкл трипанового синего (разведение 1:1).
      2. Возьмите 10 мкл предыдущей смеси и с помощью автоматического счетчика клеток подсчитают количество клеток в соответствии с инструкциями производителя.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация клеток слишком высока, разбавьте аликвоту, а после подсчета клеток учитывайте коэффициент разбавления в расчетах.
      3. Отрегулируйте номер ячейки и среду/буфер для экспериментальной установки.
    2. Определение жизнеспособности клеток и апоптоза30.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе после лечения сиалидазой (раздел 2) был проведен анализ жизнеспособности.
      1. Окрашивают mo-DC 5 мкг/мл 7-аминоактиномицином D (7-AAD) и аннексином V и определяют апоптоз в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов).
      2. Анализируют результаты с помощью проточной цитометрии29,30.

2. Обработка клеток сиалидазой

ПРИМЕЧАНИЕ: После дифференцировки в mo-DCs, на шестой день, клетки готовы к анализу на лечение сиалидазой.

  1. Учитывая желаемую экспериментальную установку, соберите ~10 x 10 6 mo-DCs из 10 лунок 24-луночных планшетов с разгрузкой 1,3 x 106 клеток/лунку и переложите их в новую стерильную коническую пробирку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предположите некоторую потерю клеток; Как правило, на этой стадии обнаруженная концентрация составляет 1,3 x 106 клеток/мл, поскольку mo-DCs и их предшественники не размножаются и испытывают 20% потерю жизнеспособности при дифференцировке в mo-DC.
  2. Центрифугу при комнатной температуре в течение 5-7 минут при 300 x g (нормальный тормоз) и выбросьте надосадочную жидкость для удаления мертвых клеток и мусора.
  3. Добавить 10 мл среды RPMI-1640 (содержащей 11,1 мМ глюкозы), центрифугу при комнатной температуре в течение 4 мин при 300 x g (нормальный тормоз), вылить надосадочную жидкость, добавить 2 мл RPMI-1640 и тщательно перемешать.
  4. Поместите 1 мл клеток в RPMI-1640 в новые стерильные микропробирки #1 и #2; Каждая микропробирка будет содержать примерно 5 x 106 клеток.
  5. В микропробирку #1 добавьте 500 мЕд сиалидазы из Clostridium perfringens (см. таблицу материалов). В микропробирку #2 добавьте имитированную сиалидазу, которая является отрицательным контролем, чтобы подтвердить, что наблюдаемые эффекты напрямую связаны с удалением сиаловой кислоты и не связаны с артефактами. Обработанная имитацией сиалидаза представляет собой термоинактивированную сиалидазу, которую получают путем кипячения фермента в течение 20 мин при 100 °C.
  6. Выдерживать 60 мин при температуре 37 °C.
  7. После инкубации поместите клетки в новые стерильные конические пробирки объемом 15 мл с той же нумерацией, #1 и #2. Добавьте около 4 мл полной среды RPMI-1640 (содержащей 10% FBS) в обе пробирки, чтобы остановить ферментативную реакцию.
  8. Центрифугу при комнатной температуре в течение 4 мин при 300 x g (нормальный тормоз) и выбросьте надосадочную жидкость.
  9. Добавьте 5 мл полной среды RPMI-1640 в каждую пробирку и распределите по 1 мл клеток на лунку.

3. Определение профиля сиаловой кислоты

  1. Окрашивание лектином
    1. Соберите и промойте клетки при комнатной температуре в течение 5 мин при 300 x g (нормальный тормоз).
    2. Ресуспендант клеток в RPMI-1640 + 10% FBS и распределите клетки (100 000/100 мкл) по микропробиркам.
    3. Проводят окрашивание для проточной цитометрии в RPMI-1640 10% FBS с использованием концентрации 0,01 мг/мл для каждого лектина: лектина Sambucus nigra (SNA), лектина арахисового агглютинина (PNA) и лектина Maackia amurensis (MAA) (см. таблицу материалов). Инкубировать 30 мин при 4 °C.
    4. Промойте клетки 1 мл PBS, содержащего 10% FBS или 10% BSA, и центрифугируйте при комнатной температуре в течение 4 минут при 300 x g (нормальный тормоз).
    5. К клеткам, окрашенным биотинилированными лектинами, добавляют 0,0005 мг/мл стрептавидина-ПЭ (см. таблицу материалов) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Промойте клетки 1 мл PBS и центрифугируйте при комнатной температуре в течение 4 минут при 300 x g (нормальный тормоз).
    6. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в каждую пробирку 300 мкл 2% параформальдегида (PFA 2%). Защищайте пробирки от света и, при необходимости, храните при температуре 4 °C до сбора данных.
    7. Данные получают с помощью проточного цитометра в течение 1 недели после пробоподготовки 29,30.
  2. Проточная цитометрия
    1. Ресуспендируйте клетки в 1 мл PBS и возьмите образец с помощью проточного цитометра для немедленного сбора данных.
    2. Для отсроченного сбора данных ресуспендирование в 300 мкл 2% PFA и получение данных в течение 1 недели.
  3. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
    1. Поместите ячейки на стеклянные стекла диаметром 12 мм, покрытые полилизином, и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Центрифугируйте покровные стекла при комнатной температуре в течение 1 мин при 100 x g (нормальный тормоз), чтобы способствовать адгезии клеток.
    3. Закрепите при комнатной температуре в течение 30 минут с 4% PFA перед стиркой с 1% BSA в PBS.
    4. Используйте FITC-конъюгированный лектин SNA (0,01 мг/мл) для окрашивания α2,6-связанных сиаловых кислот на поверхности клеток (см. таблицу материалов).
    5. Получение изображений с помощью конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов).
    6. После обработки Z-стека выберите репрезентативные изображения конфокального сечения.
    7. Аналитическая количественная оценка интенсивности окрашивания с помощью скорректированной общей клеточной флуоресценции (CTCF).
      ПРИМЕЧАНИЕ: CTCF = Интегральная плотность − (Площадь выбранной ячейки × Средняя флуоресценция фоновых показаний)29.

4. Профилирование созревания mo-DC

  1. Окрашивание антителами и проточная цитометрия
    1. Соберите новый образец интересующих клеток для проведения окрашивания антителами. Промойте клетки при комнатной температуре в течение 5 минут при 300 x g (нормальный тормоз) и распределите клетки по микропробиркам (100 000 клеток в пробирке).
    2. Выполните окрашивание для проточной цитометрии с использованием желаемых антител (ab), MHI-I, MHC-II, CD80 и CD86 (см. таблицу материалов).
    3. Инкубируют флуоресцентно-конъюгированный АТ в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    4. Промойте клетки 1 мл PBS и центрифугируйте при комнатной температуре в течение 5 минут при 300 x g (нормальный тормоз).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете немаркированный ab, добавьте флуоресцентно конъюгированный вторичный ab и инкубируйте в темноте в течение 15 минут в соответствии с инструкциями производителя. Промойте клетки 1 мл PBS и центрифугируйте при комнатной температуре в течение 5 минут при 300 x g (нормальный тормоз).
    5. Ко всем микропробиркам добавьте до 100 мкл PBS, повторно суспендируйте клетки в 300 мкл 2% параформальдегида (PFA 2%) и держите пробирки в темноте при температуре 4 °C до получения данных.
    6. Получение данных с помощью проточного цитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После окрашивания и фиксации образцы могут быть получены методом проточной цитометрии сразу или в течение 1 недели. В этом случае храните пробирки при температуре 4 °C в темноте.

5. Иммуноферментный анализ (ИФА)

ПРИМЕЧАНИЕ: В данной работе продукцию ИФН-γ измеряли с помощью ИФА-анализа в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).

  1. Для покрытия планшета в буфере для покрытия разбавляют захватное антитело (1:100, захватывающее антитело в PBS), переносят по 100 мкл этого рабочего раствора в каждую лунку и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре.
  2. Полностью откажитесь от захватных антител.
  3. Добавьте блокирующий буфер (например, PBS + 2% BSA + 0,05% Tween20) и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре, прежде чем удалить блокирующий буфер.
  4. Добавьте стандарт и образец с соответствующей смесью и разведениями и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре. Промойте пять раз с буфером для стирки.
  5. Добавьте антитела к биотинилированному детектору и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре, после чего выполните пять промывок.
  6. Добавьте поли-HRP-стрептавидин-HS и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего выполните пять промывок с промывочным буфером.
  7. Добавьте субстрат TMB (см. таблицу материалов) и инкубируйте до 60 мин при комнатной температуре с учетом используемой тест-системы. Промойте пять раз с буфером для стирки.
  8. Считывайте образцы на микропланшетном ридере с длиной волны 450 нм.

Representative Results

Выделение моноцитов и дифференцировка моноцитов в mo-DCs
В соответствии с протоколом, МПМК человека выделяли из охристой шерсти с помощью разделения по градиенту плотности со средой градиента плотности и тщательно промывали. Трипановый синий использовали для подсчета жизнеспособных клеток в день выделения, как описано ранее в шаге 1.4.1. В дальнейшем выделение моноцитов CD14+ проводили методом положительного отбора. Для этого PBMC инкубировали с магнитными шариками, содержащими антитело, которое распознает антиген CD14. Отобранные моноциты CD14+ культивировали в среде с добавлением ГМ-КСФ и ИЛ-4 в течение 5-6 дней27 для дифференцировки в незрелые мо-ДК (рис. 1А). Созревание mo-DCs может быть получено путем применения коктейля цитокинов, включая IL-6, IL-1β, TNF-α и PGE235 (рис. 1A).

В процессе дифференцировки в результате стимуляции IL-4 и GMCSF ожидается изменение фенотипа клетки. Данные показывают, что mo-DC теряют экспрессию поверхностного маркера CD14, в основном экспрессируемого моноцитами (рис. 1B), и приобретают значительную экспрессию CD1a, маркера, экспрессируемого ДК человека36,37. mo-DC также получают более высокую экспрессию MHC-II (HLA-DR), антигенпрезентирующей молекулы, экспрессируемой человеческими ДК и другими антигенпрезентирующими клетками38 (рис. 1B).

Содержание сиаловой кислоты на поверхности клеток
Обработка мо-ДК сиалидазой снижает содержание сиаловой кислоты на поверхности мо-ДК, что может быть подтверждено окрашиванием лектинами, которые являются белками, способными связываться с углеводами39. Поскольку используемый фермент удаляет с поверхности клетки как α2,3, так и α2,6-связанные сиаловые кислоты, мо-ДК окрашивали ПНК, которая распознает Т-антиген Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr, а также лектины MAA и SNA, которые связываются с α2,3- и α2,6-сиаловыми кислотами соответственно. Эффективность лечения сиалидазой оценивали методами проточной цитометрии и конфокальной микроскопии (рис. 2). Как показано на рисунке 2А, лечение сиалидазой значительно снижало связывание МАА и СНК при одновременном повышении окрашивания ПНК. Снижение оснастки СНС после лечения сиалидазой было дополнительно подтверждено анализом конфокальной микроскопии, показавшим значительное снижение окрашивания СНС на поверхности клеток (рис. 2Б).

Функциональная характеристика обработанных сиалидазой мо-ДК
Чтобы оценить, как лечение сиалидазой влияет на функции мо-ДК, оценивали уровень созревания мо-ДК после лечения сиалидазой. Как показано на рисунке 3А, лечение сиалидазой приводит к значительному увеличению экспрессии антигенпрезентирующих молекул MHC I и MHC II, а также экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86. Для оценки влияния удаления сиаловой кислоты на способность мо-ДК индуцировать Т-клеточный ответ, обработанные сиалидазой мо-ДК, загруженные лизатами опухолевых клеток, использовали для праймирования аутологичных Т-клеток (рис. 3). Затем профиль полученных Т-клеток был охарактеризован на основе их способности секретировать цитокин Th1 ИФН-γ. Как показано на рисунке 3B, по сравнению с Т-клетками, праймированными полностью сиалированными mo-DC, Т-клетки, праймированные обработанными сиалидазой mo-DC, секретировали значительно более высокие уровни ИФН-γ. Эти результаты свидетельствуют о том, что обработанные сиалидазой мо-ДК обладают улучшенной способностью праймировать аутологичные Т-клетки.

Жизнеспособность клеток
После лечения сиалидазой был проведен анализ на жизнеспособность, чтобы убедиться, что лечение не является цитотоксичным для клеток. После лечения mo-DC окрашивали 7-AAD и Annexin V для выявления нежизнеспособных и апоптотических клеток и анализировали с помощью проточной цитометрии (рис. 4). Данные не показывают существенной разницы в жизнеспособности клеток между необработанными (рис. 4, левая панель) и клетками, получавшими сиалидазу (рис. 4, правая панель).

Figure 1
Рисунок 1: Дифференцировка изолированных моноцитов в mo-DCs. (A) CD14+ моноциты выделяли из охристой оболочки и культивировали в концентрации 1,3 x 106 клеток/мл при 37 °C. Моноциты дифференцировали в среде, дополненной 750 ЕД/мл ИЛ-4 и 1000 ЕД/мл ГМ-КСФ. Микроскопический анализ морфологии моноцитов, выделенных из охристой шерсти человека на 0-е сутки (верхнее изображение). Незрелые мо-ДК; клетки дифференцировали в течение 5 дней с использованием IL-4 и GM-CSF (среднее изображение). Зрелые мо-ДК получали с помощью цитокинов IL-6, IL-1β, TNF-α и PGE2 в течение 24 ч (нижнее изображение). Масштабные линейки: 100 мкм. (B) Клетки анализировали на 0-й, 2-й и 5-й день в течение всего периода дифференцировки с помощью проточной цитометрии. Для характеристики маркеров клеточной поверхности использовали следующие антитела: (a-c) CD14; (Д-Ж) CD1a и (g-i) HLA-DR (MHC класса II). На рисунке показаны репрезентативные гистограммы, по крайней мере, трех независимых анализов. Панель (B) была изменена по Videira et al.40, патент WO2017002045A1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Обработка сиалидазой человеческих mo-DC для удаления α2,6- и α2,3-связанных сиаловых кислот с поверхности клеток . (A) Анализ mo-DCs методом проточной цитометрии с использованием окрашивания лектином для проверки эффективности лечения сиалидазой. Человеческие mo-DC обрабатывали сиалидазой (серые полосы) или оставляли без лечения (белые полосы) и окрашивали лектином SNA (распознавание [2,6]-сиаловых кислот), лектином MAA (распознавание [2,3]-сиаловых кислот) и лектином PNA (распознавание Т-антигена-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr). Значения представляют собой среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) по крайней мере трех независимых анализов. Статистическую значимость определяли с помощью двустороннего парного t-критерия (*P < 0,05 или ***P < 0,0001), ссылаясь на разницу между необработанными и обработанными сиалидазой ДК. Лечение сиалидазой снижало связывание МАА и увеличивало окрашивание ПНК в мо-ДК человека, что обусловлено удалением α(2,3)-связанных сиаловых кислот; удаление α(2,6)-связанных сиаловых кислот после лечения сиалидазой было выявлено по снижению окраски СНС. (B) Конфокальная микроскопия mo-DCs, обработанных сиалидазой и подготовленных на покровных стеклах для наблюдения. Из разных ячеек был собран ряд изображений z-стека и обработан для включения средней интенсивности окрашивания. Масштабные линейки: 20 мкм. Панель (A) была изменена по Silva et al.30; панель (B) была изменена по сравнению с Silva et al.29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Лечение сиалидазой mo-DCs, индуцирующее более высокую экспрессию маркеров созревания. (A) mo-DCs, получавшие сиалидазу, показали более высокий фенотип созревания, чем полностью сиалированные mo-DC. Методом проточной цитометрии оценивали экспрессию нескольких маркеров созревания. Мо-ДК обрабатывали сиалидазой в течение 1 ч при 37 °С; значения графика представляют среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) (среднее ± SEM) по меньшей мере трех независимых анализов. Статистически значимые различия были рассчитаны с помощью t-критерия (*P < 0,05, **P < 0,01), относящегося к разнице между состояниями, не получавшими лечения, и состояниями, получавшими сиалидазу. (Б) Дезиалированные человеческие мо-ДК, нагруженные цельными опухолевыми антигенами, индуцировали специфические Т-клеточные ответы. Мо-ДК обрабатывали сиалидазой в течение 1 ч при 37 °C или оставляли без лечения, после чего загружали лизатами MCF-7 (TL) в качестве источника антигенов цельных опухолевых клеток. Совместное культивирование между mo-DC и аутологичными Т-клетками проводили в течение 4-8 дней в присутствии IL-2 (10 Ед/мл). Т-клетки, праймированные дезиалированными mo-DCs, показали значительно более высокую секрецию цитокина Th1, ИФН-γ. После стимуляции Т-клеток mo-DC цитокины, секретируемые в супернатанты кокультур, измеряли методом ИФА (n = 7). Значения графика представляют концентрацию (пг/мл) (среднее ± SEM). Статистически значимые различия рассчитывали с помощью t-критерия (*P < 0,05). Цифра была изменена по сравнению с Silva et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Отсутствие влияния лечения сиалидазой на жизнеспособность мо-ДК человека. Необработанные mo-DCs (левая панель) и обработанные сиалидазой mo-DC (правая панель) подвергали двойному окрашиванию аннексином V и 7-AAD, и окрашивание анализировали методом проточной цитометрии. Данные не показали существенной разницы в жизнеспособности клеток между необработанными и обработанными сиалидазой клетками, что позволяет предположить, что мо-ДК могут переносить лечение сиалидазой и оставаться жизнеспособными для осуществления своей иммунологической функции. Цифра была изменена по сравнению с Silva et al.30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Выделение моноцитов
В данной рукописи описан протокол получения mo-DC из моноцитов CD14+ , выделенных человеком, (рис. 1A) с последующим проведением лечения сиалидазой для снижения содержания сиаловой кислоты на поверхности этих клеток.

Существуют различные способы получения ДК человека, например, непосредственно из периферической крови или тканей или путем дифференцировки из предшественников, таких как стволовые клетки или моноциты. Получение ДК, дифференцированных из моноцитов, выделенных из периферической крови, гораздо проще из-за простоты получения больших количеств моноцитов по сравнению сдругими источниками ДК. Тем не менее, для получения высокого процента выделенных моноцитов необходимо тщательно соблюдать все этапы протокола. Например, среда градиента плотности может быть токсичной для клеток, и для предотвращения гибели клеток необходимо избегать длительного контакта клеток со средой градиента плотности и тщательно промывать клетки. Манипуляции с клетками должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы избежать потери жизнеспособности клеток. Из PBMC моноциты могут быть выделены путем положительного отбора с использованием метода магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS), который является подходящей технологией для получения большого количества моноцитов. Кроме того, по сравнению с другими методами селекции моноцитов, mo-DCs, полученные из моноцитов, изолированных MACS, обладают большей способностью стимулировать противоопухолевую активность Т-клеток42. В этом протоколе после выделения моноциты инкубировали с IL-4 и GM-CSF в течение 5-6 дней для достижения дифференцировки в незрелые mo-DC (рис. 1). Результаты показали, что морфологически (рис. 1А) и фенотипически (рис. 1Б) изолированные моноциты дифференцировались в незрелые мо-ДК. Кроме того, в процессе дифференцировки mo-DC теряли экспрессию маркеров CD14 и приобретали экспрессию CD1a и MHC-II (рис. 1B), которые необходимы для презентации антигена Т-клеткам.

Такая изоляция и дифференцировка моноцитов в mo-DC являются ограничениями этого протокола. Процесс выделения является чувствительным этапом, который должен быть выполнен осторожно и быстро, чтобы избежать гибели клеток, и этот шаг также должен выполняться каждый раз, когда для нового эксперимента требуются mo-DC. Процесс дифференциации занимает 5-6 дней, что представляет сложность с точки зрения использования этого метода для высокопроизводительного анализа. Тем не менее, метод выделения и использование цитокинов для дифференциации mo-DC полезны для получения большого количества функциональных mo-DC in vitro в экспериментальных целях. Мо-ДК, полученные в этом протоколе, могут подвергаться лечению сиалидазой, проточной цитометрии, ИФА, конфокальной микроскопии и т.д., что подчеркивает важность и полезность этого метода30.

Лечение незрелыми мо-ДК и сиалидазой
Сиалидазы играют важную роль в регуляции сиалирования и отвечают за удаление сиаловых кислот из гликанов клеточной поверхности. В mo-DC удаление сиаловой кислоты сиалидазой приводит к созреванию этих клеток, что увеличивает перекрестную презентацию антигена и последующую активацию Т-клеток и противоопухолевую активность30.

Незрелые человеческие мо-ДК демонстрируют высокое содержание поверхностных α(2,6)- и α(2,3)-связанных сиаловых кислот27 по сравнению со зрелыми мо-ДК31,43. Кроме того, удаление сиаловых кислот путем обработки мо-ДК сиалидазой улучшает созревание ДК 28,30,31. Сиалидаза, выбранная для этого эксперимента, была взята из бактерии Clostridium perfringens. Тем не менее, другие организмы также продуцируют сиалидазы, такие как бактерии Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae или Salmonella typhimurium44, пиявка Macrobdella decora45 и даже Homo sapiens46, и сиалидазы из этих организмов также используются экспериментально. Однако каждая сиалидаза имеет свою субстратную специфичность. Кроме того, использование фермента сиалидазы может иметь свои ограничения; Например, манипуляции с мо-ДК во время лечения могут дополнительно стимулировать эти клетки. Кроме того, количество сиалидазы и время инкубации должны быть оптимизированы в зависимости от типа используемых клеток и их состава сиаловой кислоты. Удаление сиаловой кислоты является не постоянным эффектом, а скорее преходящим явлением, потому что клетка восстанавливает содержание сиаловой кислоты на своей поверхности. Помимо сиалидазы, существуют и другие методы уменьшения молекул сиаловой кислоты на поверхности клеток, такие как использование ингибиторов сиалтрансферазы, нокауты генов сиалтрансферазы или метаболическая блокада сиаловой кислоты с помощью миметиков сиаловой кислоты47,48,49. Тем не менее, эти методы могут оказывать различное воздействие на клетки, и, помимо десиалирования, необходимо учитывать жизнеспособность клеток. Лечение ферментом сиалидазы является практическим методом эффективного и временного удаления сиаловых кислот с поверхности клеток при сохранении жизнеспособности клеток.

В этой работе сиалидазу добавляли к незрелым мо-ДК в концентрации 500 мЕд/5 х 106 кл/мл, и клетки инкубировали при 37 °С в течение 60 мин. Лечение проводили с использованием RPMI-1640 без сыворотки, чтобы сохранить жизнеспособность клеток и избежать любого взаимодействия между сиалированными молекулами, присутствующими в сыворотке30. Лечение сиалидазой может быть выполнено с другими буферами, помимо RPMI, такими как 50 мМ ацетата натрия, pH 5,1 (в случае C. perfingens sialidase) или PBS50,51,52. Тем не менее, RPMI-1640 является наиболее распространенной питательной средой для ДК, поскольку он поддерживает постоянные экспериментальные условия во время процедуры, избегает индуцирования созревания и снижает любой стресс, который может быть вызван сиалидазными буферами или PBS 53,54,55,56. После инкубации с сиалидазой очень важно тщательно промыть клетки средой с добавлением сыворотки, чтобы гарантировать, что ферментная реакция остановилась. Присутствие сиалированных молекул в сыворотке будет конкурировать в качестве субстратов для сиалидазы, обеспечивая тем самым быструю остановку реакции.

Характеристика поверхностных маркеров методами проточной цитометрии и конфокальной микроскопии
Для определения профиля сиаловой кислоты в разделе 3 протокола использовали окрашивание лектином с последующей проточной цитометрией и конфокальной лазерной сканирующей микроскопией. Для процедуры окрашивания клеток в обоих случаях концентрации лектина и условия инкубации были оптимизированы, чтобы избежать агглютинации и гибели клеток. Крайне важно проводить инкубацию при 4 °C в буферах, содержащих не менее 2% ФБС или БСА, чтобы избежать неспецифического связывания лектинов. В этом протоколе RPMI-1640, содержащий 10% FBS, использовался для поддержания постоянных условий эксперимента и избежания клеточного стресса. Что касается конфокальной микроскопии, фиксация клеток перед окрашиванием имеет важное значение для сохранения морфологии, предотвращения аутолиза и поддержания антигенности.

Анализ фенотипа mo-DC методом проточной цитометрии показал, что обработанные сиалидазой mo-DC имели значительно большее количество лектина ПНК, связанного с поверхностью клетки, по сравнению с лектинами MMA и SNA, которое уменьшилось после лечения сиалидазой (рис. 2A). Как и ожидалось, окрашивание ПНА увеличилось, так как ПНК распознает несиалированные антигены, в отличие от МАА и СНК, которые связываются непосредственно с α2,3- и α2,6-сиаловыми кислотами соответственно30. Это окрашивание подтверждает эффективное удаление сиаловых кислот с поверхности клетки с помощью этого протокола. Другим методом, который может быть использован для валидации лечения и анализа содержания сиаловой кислоты на поверхности клеток, является окрашивание лектинами с последующей конфокальной микроскопией, как показано на рисунке 2B.

Помимо предыдущих примеров, существуют альтернативные подходы к оценке и характеристике содержания сиаловой кислоты, такие как зондирование лектинов методом вестерн-блоттинга. Также доступны альтернативные лектины, специфичные для сиаловой кислоты, такие как Siglecs, группа лектинов, которые имеют явное предпочтение типам и связям сиаловой кислоты57. Помимо использования лектинов в любом из методов (проточная цитометрия, микроскопия или вестерн-блоттинг), также можно охарактеризовать содержание сиаловой кислоты с помощью антител; Например, α2,8-сиаловые кислоты могут быть оценены с помощью антител, таких как клон 735, который специфичен для полисиаловой кислоты58. Кроме того, после лечения сиалидазой клетки могут быть функционально протестированы на их биологическую или терапевтическую эффективность путем оценки их фенотипа и способности активировать Т-клетки40. На самом деле, как показано в приведенных примерах, обработанные сиалидазой мо-ДК показали более высокий фенотип созревания, а также повышенную экспрессию антигенпрезентирующих и костимулирующих молекул.

Кроме того, обработанные сиалидазой мо-ДК могут быть загружены антигенами и культивированы совместно с Т-клетками или другими клетками, а затем могут быть изучены в отношении фенотипа, профиля секреции цитокинов или других особенностей. В приведенном примере данные показывают, что обработанные сиалидазой мо-ДК могут быть загружены опухолевыми антигенами, а затем использованы для активации Т-клеток. Фактически, полученные Т-клетки показали повышенную секрецию ИФН-γ, что согласуется с предыдущими сообщениями о влиянии нехватки сиаловой кислоты на повышение способности мо-ДК активировать Т-клетки 27,28,29,30,31.

В заключение, этот протокол показывает осуществимый, жизнеспособный и практичный метод получения mo-DCs для манипулирования содержанием сиаловой кислоты путем лечения сиалидазой. Этот протокол представляет собой методологию, которая может служить различным целям и приложениям. Этот метод может не только сыграть решающую роль в понимании роли сиаловых кислот в созревании и ответе иммунных клеток, но и может быть использован в качестве иммуномодулирующего инструмента.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов или иных конфликтов интересов.

Acknowledgments

Авторы выражают признательность за финансирование со стороны Европейской комиссии GLYCOTwinning GA 101079417 и EJPRD/0001/2020 EU 825575; Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal в рамках грантов FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) и LA/P/0140/2020 (i4HB). ПКТ-НОВА. и Stemmatters также финансировались Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) в рамках Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) для SI I& Проект DT DCMatters (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Мы выражаем признательность биолабораториям FCT-NOVA и GLYCOVID NOVA Saude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tube AstiK’s CTGP-E15-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
24-well plate Greiner Bio-one 662 160 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
50 mL conical tube AstiK’s CTGP-E50-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) BioLegend 420404 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Annexin V Immunotools 31490013 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific  Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
BSA Sigma - Aldrich A3294-100G Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile
CD14 (Monoclonal TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
CD80 Immunotools 21270803 Maturation Profiling of mo-DCs
CD86 Immunotools 21480863 Maturation Profiling of mo-DCs
Cell counting slides and trypan blue EVE EVS-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Centrifuge Eppendorf 5430 R Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Density gradient medium (Histopaque) Sigma - Aldrich 10771-100ML Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
EDTA Gibco, ThermoFisher 15400054 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Elisa kit (IFN-γ) Immunotools 31673539 Maturation Profiling of mo-DCs
EVE automated cell count NanoEntek 10027-452 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500064 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Miltenyi Biotec   130-093-864 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) Miltenyi Biotec 130-050-201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-1β Sigma - Aldrich I9401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-4 Miltenyi Biotec 130-093-919 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-6 Sigma - Aldrich SRP3096 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
L-glutamine Gibco A2916801 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
LS column and plunger Miltenyi Biotec 130-042-401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin - Biotinylated) Vector labs B-1265-1 Determination of Sialic Acid Profile
MHC-I (HLA-ABC) Immunotools 21159033 Maturation Profiling of mo-DCs
MHC-II (HLA-DR) Immunostep HLADRA-100T Maturation Profiling of mo-DCs
Microtubes AstiK’s PCRP-E015-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Neuraminidase (Sialidase) Roche 11585886001 Treatment of Cells with Sialidase
Non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Paraformaldehyde (PFA 2%) Polysciences Europe 25085-1 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Paraformaldehyde (PFA 4%) Biotium 22023 Determination of Sialic Acid Profile
Pasteur pipettes Labbox PIPP-003-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin - FITC) Vector labs FL-1071 Determination of Sialic Acid Profile
Penicillin/streptomycin Gibco 15140163 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) NZYTech   MB18201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Prostaglandin E2 (PGE2) Sigma - Aldrich P0409 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RBC lysis buffer BioLegend 420302 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) Gibco 31870074 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - Biotinylated) Vector labs   B-1305-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - FITC) Vector labs FL-1301-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sodium pyruvate Thermofisher 11360-070 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
SpectroMax190 Molecular Devices Maturation Profiling of mo-DCs
Streptavidin-PE BioLegend   405203 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Tetramethylbenzidine (TMB) Sigma - Aldrich T0440 Maturation Profiling of mo-DCs
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) Sigma - Aldrich H8916 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Zeiss LSM710 confocal microscope Zeiss Determination of Sialic Acid Profile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varki, A., Gagneux, P. Multifarious roles of sialic acids in immunity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1253, 16-36 (2012).
  2. Bochner, B. S., Zimmermann, N. Role of Siglecs and related glycan-binding proteins in immune responses and immunoregulation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 598-608 (2015).
  3. Smith, B. A. H., Bertozzi, C. R. The clinical impact of glycobiology: Targeting selectins, Siglecs and mammalian glycans. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 217-243 (2021).
  4. Schauer, R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current Opinion in Structural Biology. 19 (5), 507-514 (2009).
  5. Manhardt, C. T., Punch, P. R., Dougher, C. W. L., Lau, J. T. Y. Extrinsic sialylation is dynamically regulated by systemic triggers in vivo. Journal of Biological Chemistry. 292 (33), 13514-13520 (2017).
  6. Cabral, M. G., et al. Human dendritic cells contain cell surface sialyltransferase activity. Immunology Letters. 131 (1), 89-96 (2010).
  7. Bordron, A., et al. Hyposialylation must be considered to develop future therapies in autoimmune diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3402 (2021).
  8. Julien, S., Videira, P. A., Delannoy, P. Sialyl-Tn in cancer: (How) did we miss the target. Biomolecules. 2 (4), 435-466 (2012).
  9. Munkley, J. Aberrant sialylation in cancer: Therapeutic opportunities. Cancers. 14 (17), 4248 (2022).
  10. Dennis, J. W., Laferte, S., Waghorne, C., Breitman, M. L., Kerbel, R. S. S1-6 Branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science. 236 (4801), 582-585 (1987).
  11. Pinho, S. S., Reis, C. A. Glycosylation in cancer: Mechanisms and clinical implications. Nature Reviews Cancer. 15 (9), 540-555 (2015).
  12. Manni, M., Läubli, H. Targeting glyco-immune checkpoints for cancer therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 21 (8), 1063-1071 (2021).
  13. Sjögren, J., Lood, R., Nägeli, A. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; Unique tools with broad applications. Glycobiology. 30 (4), 254-267 (2020).
  14. Trastoy, B., et al. Sculpting therapeutic monoclonal antibody N-glycans using endoglycosidases. Current Opinion in Structural Biology. 72, 248-259 (2022).
  15. Pascoal, C., et al. Sialyl LewisX/A and cytokeratin crosstalk in triple negative breast cancer. Cancers. 15 (3), 731 (2023).
  16. von Itzstein, M., et al. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication. Nature. 363 (6428), 418-423 (1993).
  17. Gray, M. A., et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nature Chemical Biology. 16 (12), 1376-1384 (2020).
  18. Fernandes, Â, et al. Glycans as shapers of tumour microenvironment: A sweet driver of T-cell-mediated anti-tumour immune response. Immunology. 168 (2), 217-232 (2023).
  19. Togayachi, A., et al. Polylactosamine on glycoproteins influences basal levels of lymphocyte and macrophage activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15829-15834 (2007).
  20. Park, D. D. Resident and elicited murine macrophages differ in expression of their glycomes and glycan-binding proteins. Cell Chemical Biology. 28 (4), 567-582 (2021).
  21. Steinman, R. M. Dendritic cells and immune-based therapies. Experimental Hematology. 24 (8), 859-862 (1996).
  22. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2 (1), 37-56 (2010).
  23. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  24. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  25. So-Rosillo, R., Small, E. J. Sipuleucel-T (APC8015) for prostate cancer. Expert Review of Anticancer Therapy. 6 (9), 1163-1167 (2006).
  26. Cheever, M. A., Higano, C. S. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: The first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clinical Cancer Research. 17 (11), 3520-3526 (2011).
  27. Videira, P. A., et al. Surface α2-3- and α2-6-sialylation of human monocytes and derived dendritic cells and its influence on endocytosis. Glycoconjugate Journal. 25 (3), 259-268 (2008).
  28. Cabral, M. G., et al. The phagocytic capacity and immunological potency of human dendritic cells is improved by α2,6-sialic acid deficiency. Immunology. 138 (3), 235-245 (2013).
  29. Silva, Z., et al. MHC class I stability is modulated by cell surface sialylation in human dendritic cells. Pharmaceutics. 12 (3), 249 (2020).
  30. Silva, M., et al. Sialic acid removal from dendritic cells improves antigen cross-presentation and boosts anti-tumor immune responses. Oncotarget. 7 (27), 41053-41066 (2016).
  31. Crespo, H. J., et al. Effect of sialic acid loss on dendritic cell maturation. Immunology. 128, 621-631 (2009).
  32. Council of Europe. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Council of Europe. , Strasbourg, France. (2017).
  33. LS Columns. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/Is-columns.html#130-042-401 (2012).
  34. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 07, Unit 7.32 (2012).
  35. Wu, X., Xu, F., Liu, J., Wang, G. Comparative study of dendritic cells matured by using IL-1β, IL-6, TNF-α and prostaglandins E2 for different time span. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (2), 1389-1394 (2017).
  36. Naeim, F., Nagesh Rao, P., Song, S., Phan, R. Chapter 2 - Principles of Immunophenotyping. Atlas of Hematopathology. , Academic Press. Cambridge, MA. 29-56 (2018).
  37. Cernadas, M., Lu, J., Watts, G., Brenner, M. B. CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells. Clinical and Experimental Immunology. 155, 523-533 (2009).
  38. Santambrogio, L., Strominger, J. L. The ins and outs of MHC class II proteins in dendritic cells. Immunity. 25 (6), 857-859 (2006).
  39. Raposo, C. D., Canelas, A. B., Barros, M. T. Human lectins, their carbohydrate affinities and where to find them. Biomolecules. 11 (2), 188 (2021).
  40. Videira, P. A. Q., et al. Patent WO2017002045. A viable cell population, method for production and uses thereof. Portugal patent. , Universidade NOVA de Lisboa. Lisbon, Portugal. (2017).
  41. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. International Journal of Oncology. 20 (2), 247-253 (2002).
  42. Marques, G. S., Silva, Z., Videira, P. A. Antitumor efficacy of human monocyte-derived dendritic cells: Comparing effects of two monocyte isolation methods. Biological Procedures Online. 20, 4 (2018).
  43. Bax, M., et al. Dendritic cell maturation results in pronounced changes in glycan expression affecting recognition by Siglecs and galectins. Journal of Immunology. 179 (12), 8216-8224 (2007).
  44. Chinoy, Z. S., Montembault, E., Moremen, K. W., Royou, A., Friscourt, F. Impacting bacterial sialidase activity by incorporating bioorthogonal chemical reporters onto mammalian cell-surface sialosides. ACS Chemical Biology. 16 (11), 2307-2314 (2021).
  45. Chou, M. -Y., Li, S. -C., Li, Y. -T. Cloning and expression of sialidase L, a NeuAcα2→3Gal-specific sialidase from the leech, Macrobdella decora. Journal of Biological Chemistry. 271 (32), 19219-19224 (1996).
  46. Crespo, H. J., Lau, J. T. Y., Videira, P. A. Dendritic cells: A spot on sialic acid. Frontiers in Immunology. 4, 491 (2013).
  47. Büll, C. Metabolic sialic acid blockade lowers the activation threshold of moDCs for TLR stimulation. Immunology & Cell Biology. 95 (4), 408-415 (2017).
  48. Ohmi, Y., et al. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O -glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology. 31 (5), 557-570 (2021).
  49. Chung, C., et al. Integrated genome and protein editing swaps α-2,6 sialylation for α-2,3 sialic acid on recombinant antibodies from CHO. Biotechnology Journal. 12 (2), 1600502 (2017).
  50. Hyvärinen, S., Meri, S., Jokiranta, T. S. Disturbed sialic acid recognition on endothelial cells and platelets in complement attack causes atypical hemolytic uremic syndrome. Blood. 127 (22), 2701-2710 (2016).
  51. Powell, L. D., Whiteheart, S. W., Hart, G. W. Cell surface sialic acid influences tumor cell recognition in the mixed lymphocyte reaction. Journal of Immunology. 139, 262-270 (1987).
  52. Corfield, A. P., Higa, H., Paulson, J. C., Schauer, R. The specificity of viral and bacterial sialidases for α(2-3)- and α(2-6)-linked sialic acids in glycoproteins. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 744 (2), 121-126 (1983).
  53. Tkachenko, N., Wojas, K., Tabarkiewicz, J., Rolinski, J. Generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes - Comparison of different culture media. Folia Histochemica et Cytobiologica. 43, 25-30 (2005).
  54. Kim, S. J., et al. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes. Cytotherapy. 21 (10), 1049-1063 (2019).
  55. Calmeiro, J., et al. In-depth analysis of the impact of different serum-free media on the production of clinical grade dendritic cells for cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 11, 593363 (2021).
  56. Stamatos, N. M., et al. LPS-induced cytokine production in human dendritic cells is regulated by sialidase activity. Journal of Leukocyte Biology. 88 (6), 1227-1239 (2010).
  57. Lehmann, F., Tiralongo, E., Tiralongo, J. Sialic acid-specific lectins: Occurrence, specificity and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1331-1354 (2006).
  58. Frosch, M., Görgen, I., Boulnois, G. J., Timmis, K. N., Bitter-Suermann, D. NZB mouse system for production of monoclonal antibodies to weak bacterial antigens: Isolation of an IgG antibody to the polysaccharide capsules of Escherichia coli K1 and group B meningococci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (4), 1194-1198 (1985).

Tags

Дендритные клетки полученные из моноцитов сиалированные фенотипы сиаловые кислоты модуляция иммунного ответа иммунный надзор гликоиммунные контрольные точки иммунотерапия дендритные клетки (ДК) антигенпрезентирующие клетки (АПК) созревание ДК содержание сиаловой кислоты активация Т-клеток
Генерация дендритных клеток моноцитарного происхождения с различными сиалированными фенотипами
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral,… More

Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral, P., Tanwar, A., Paterson, R. L., Videira, P. A. Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes. J. Vis. Exp. (200), e65525, doi:10.3791/65525 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter