Summary
시알리다아제 처리를 사용하여 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 탈시알릴화된 인간 단핵구 유래 수지상 세포(mo-DC)를 생성하는 독특하고 포괄적인 프로토콜이 제시됩니다. 또한, mo-DC의 표현형 및 기능적 특성을 평가하고, 시알리다아제 처리가 mo-DC의 성숙 수준을 어떻게 향상시키는지를 평가하는 방법이 기재되어 있다.
Abstract
시알산은 일반적으로 세포 표면 글라이칸의 말단에서 발견되는 음전하를 띤 단당류입니다. 친수성 및 생물물리학적 특성으로 인해 면역 반응 조절, 자가 및 비자 항원 인식, 탄수화물-단백질 상호 작용 등과 같은 수많은 생물학적 과정에 관여합니다. 시알산의 세포 함량은 시알리다아제에 의해 조절되며, 이는 시알산 잔기의 제거를 촉매합니다. 여러 연구에 따르면 시알로-글라이칸은 면역 세포에서 시스 및 트랜스 억제성 시글렉 수용체와 결합하여 면역 감시를 모니터링하는 데 중요한 역할을 합니다. 마찬가지로, 암의 당면역 관문은 면역 요법 개발의 중요한 표적이 되고 있습니다. 또한 수지상세포(DC)는 전문 항원 제시 세포(APC)로서의 고유한 역할과 적응 면역 반응을 유발하고 면역학적 기억을 생성하는 능력으로 인해 면역 요법, 특히 암 연구에서 중요한 구성 요소로 구상되고 있습니다. 그럼에도 불구하고 DC의 기능은 완전한 성숙에 따라 달라집니다. 미성숙 DC는 성숙한 DC와 반대되는 기능을 가지고 있으며 시알산 함량이 높아 성숙 수준을 더욱 약화시킵니다. 이는 미성숙한 DC가 T 세포를 활성화하는 능력을 하향 조절하여 면역 반응을 손상시킵니다. 결과적으로, 인간 DC의 세포 표면에서 시알산을 제거하면 성숙이 유도되어 MHC 분자의 발현과 항원 제시가 증가합니다. 또한 공동 자극 분자와 IL-12의 발현을 복원하여 DC가 T 세포를 Th1 표현형으로 분극시키고 세포 독성 T 세포를 활성화하여 종양 세포를 죽이는 더 높은 능력을 갖도록 할 수 있습니다. 따라서 시알산은 DC의 핵심 조절제로 부상했으며 치료 용도를 발전시키기 위한 새로운 표적으로 사용되고 있습니다. 이 연구는 다양한 세포 표면 시알산 표현형과 맞춤형 성숙 및 공동 자극 프로파일을 가진 DC 집단을 생성하는 것을 목표로 하는 시알리다아제로 시험관 내 단핵구 유래 DC를 치료하는 고유한 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
시알산 운반 글라이칸(sialoglycans)은 면역 조절 역할로 인해 상당한 관심을 받고 있습니다. N-아세틸뉴라민산의 형태로 인간에게 가장 널리 퍼져 있는 단당류 시알산은 셀렉틴(Selectin) 및 시글렉(Siglecs)과 같은 면역학에서 인정된 역할을 하는 렉틴에 대한 기본 리간드를 나타냅니다. 이 렉틴은 동일한 세포(cis) 또는 다른 세포(trans)에 있는 시알로글리칸을 인식하고 숙주-병원체 상호 작용과 다양한 생리학적 및 병리학적 세포 활동에 중요한 역할을 합니다 1,2,3. 또한, 시알산은 세포 표면 당접합체의 말단 위치를 차지하기 때문에 기본 구조를 은폐할 수 있으므로 비특이적 반발 효과를 통해 또는 다른 렉틴에 의한 검출을 방해하여 세포 간 접촉을 억제할 수 있습니다4. 세포 내에서 다양한 시알릴전이효소(시알산을 전달함)와 시알리다아제(시알산결합을 절단함)의 활성은 표면에 존재하는 시알산의 양을 결정합니다. 또한, 숙주 또는 병원체에 의해 발현되는 가용성 시알릴전이효소 및 시알리다아제는 세포 표면 5,6 상의 시알산의 양을 외인적으로 변형시킬 수 있다.
비정상적인 시알릴화는 여러 병리학적 조건의 특징입니다. 자가면역질환에서 시알산은 자가항원을 구별하고 염증 반응을 조절하는 데 도움이 되기 때문에 억제되지 않은 면역 활성화와 장기 손상에 기여할 수 있다7. 반대로, 하이퍼시알릴화는 시알로글리칸, 예를 들어 시알릴-Tn, 시알릴-루이스 항원, 폴리시알산, 강글리오시드의 과발현을 초래하며, 이는 일부 암의 특징을 이룬다8,9. 또한 하이퍼시알릴화는 N-아세틸글루코사미닐전이효소(GNT-V)와 같은 특정 효소의 발현 증가에 의존하는데, 이는 암 성장 및 전이와 관련된 하이퍼시알릴화된 삼중 및/또는 사방암 N-결합 글라이칸을 생성한다10. 시알산 함량은 또한 단백질의 안정성과 기능을 조절하며, 이는 관련 발암 요인의 역할에 핵심적인 역할을 한다11. 따라서 시알릴화가 증가하면 종양 발생, 전이, 약물 내성 및 면역 회피를 촉진할 수 있습니다. 또한, 시알로글리칸의 상향 조절은 종양이 면역 세포의 억제성 시글렉 수용체와 상호 작용하여 면역 감시를 피할 수 있도록 합니다. 이러한 이유로 sialoglycan은 현재 당면역 관문이자 매력적인 치료 표적으로 간주됩니다. 예를 들어, 면역 세포 수용체 시글렉(Siglec, sialic-acid-binding ImmunoGlobulin-like LECtin)이 면역 억제 역할을 하기 때문에 Siglec-면역 축의 억제제는 이미 초기 임상 시험에 있다12.
효소는 연구 또는 치료 전략을 위한 도구로서 글라이칸 프로파일을 조절하는 데 사용되어 왔다13,14. 시알리다아제는 시알릴 루이스 X와 같은 시알릴화 글라이칸이 세포 이동과 암 전이에 중요하기 때문에 암세포 악성종양을 변화시키는 데 사용되어 왔다15. 동시에, 시알산 절단을 방해하는 시알리다아제 억제제는 시알산 의존성 바이러스 감염을 치료하기 위한 클리닉에 도달했다16. 최근 시알산 조절은 시글렉 면역 축에서 리간드로서 시알산의 중요한 역할로 인해 더욱 주목을 받고 있으며, 이는 시글산이 면역 반응으로 인한 암 탈출을 줄이는 새로운 수단을 제공한다는 것을 의미합니다. 이러한 관심은 2022년 노벨상 수상자인 베르토치(Bertozzi)와 그녀의 팀이 다양한 시알로글리칸을 선택적으로 절단하고 항암 면역 반응을 개선하는 몇 가지 전략에 기여하면서 더욱 강화되었습니다17. 따라서, 시알리다아제(sialidase) 기반 전략은 당면역관문요법(glyco-immune checkpoint therapy)을 위한 유망한 양식이다. 면역 체계 세포의 글리코페노타입은 세포의 유형과 활성화 상태에 따라 달라집니다. T 세포와 관련하여, 글라이칸은 T 세포 발달 및 흉선 세포 선택, T 세포 활동, 분화 및 증식의 병태생리학적 단계에서 중요한 역할을 한다18. 예를 들어, 당단백질의 폴리락토사민은 B 림프구와 T 림프구의 기초 수준과 대식세포 활성화에 영향을 미친다19. 대식세포에서 뚜렷한 글라이칸 발현 패턴은 대식세포가 종양 미세환경(TME)으로 이동하는 데 중요한 역할을 합니다20. 따라서 면역 세포에 의한 O-결합 및 N-결합 글라이칸의 발현은 암 및 자가면역 질환 치료의 치료 접근법을 위한 잠재적인 당생물표지자로 사용될 수 있습니다.
수지상세포(Dendritic cell, DC)는 항암 면역과 같은 면역 반응을 유발하는 고유한 능력을 가진 특이적 항원 제시 세포입니다21. DC는 항원 제시 MHC 분자의 상향 조절을 거쳐 T 세포에 항원을 제시하고(신호 1), T 세포를 활성화하는 공동 자극 분자(신호 2) 및 IL-12와 같은 전염증성 사이토카인을 제시하여 유형 1 도우미 T 세포 증식을 유발해야 합니다(신호 3)22. 그 결과 면역 프로필은 엄격하게 조절되며, 건강한 세포가 공격받는 것을 방지하기 위해서는 체크포인트가 필수적입니다. DC는 종양 세포에 대한 다양한 면역 반응을 자극할 수 있기 때문에 세포 기반 백신으로 사용되며, 상당수의 임상 연구에서 잠재적인 이점이 입증되었습니다23,24. FDA가 2010 년 최초의 DC 기반 백신을 승인 한 후25,26 다른 많은 DC 기반 백신이 개발되었습니다. DC 기반 백신은 주로 생체 외에서 생산되어 종양에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 환자에게 투여됩니다. 그러나 불충분하거나 짧은 숙성은 현재 DC의 임상적 효능을 제한하는 요인 중 하나이며 값비싼 사이토카인 칵테일을 사용해야 함을 의미합니다. 적절한 성숙이 없으면 DC는 임상 환경에서 T 세포를 활성화할 수 없습니다. 대신 DC는 면역 관문을 발현하고 세포독성 T 세포가 종양 세포에 작용하는 것을 방지하는 내성 면역 반응을 유발합니다.
인간 DC는 표면이 심하게 시알릴화되어 있으며, 이 시알릴화는 성숙 시 그리고 전반적인 면역 반응 동안 감소한다27. DC의 성숙은 sialidase로 이러한 sialic acids를 제거함으로써 유도 될 수 있습니다. 데시알릴화는 NF-kB 전사 인자가 핵 6,28로 전위되어 IL-12를 포함한 다양한 사이토카인을 크게 상향 조절합니다. 또한, 탈시알릴화는 MHC-I 및 항종양 면역 반응을 통해 항원 교차 발현을 개선한다 29,30. 따라서, DC 시알릴화에 중요한 역할을 하는 시알릴전이효소 ST3Gal.l 및 ST6Gal.l의 녹아웃은 뮤린 DCs(31)에서 보다 성숙한 표현형을 생성한다.
Sialidase 처리는 위에서 언급한 단점을 해결하고 DC가 효과적인 반응을 이끌어낼 수 있도록 항원 제시 증가, 공동 자극 분자 발현 증가, 사이토카인 생산 증가를 포함하여 DC 성숙의 모든 측면을 자극하는 방법을 제공합니다. 이 기사에서는 박테리아 시알리다아제를 사용하여 실행 가능한 탈시알릴화된 인간 DC를 얻는 절차를 제시합니다. 탈시알릴화된 DC는 향상된 성숙 프로파일을 보여주며 체외에서 항종양 면역 반응을 촉진하는 세포 모델로 사용할 수 있습니다. DC는 혈액 단핵구에서 얻은 다음 사이토카인 인터루킨-4(IL-4) 및 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)의 존재 하에 시험관 내에서 분화됩니다. 이 연구는 또한 세포 표면에서 시알산을 분석하기 위한 렉틴 기반 방법과 DC 성숙 수준을 면역 표현형으로 만드는 방법에 대해 설명합니다. 여기에 설명된 절차는 다른 세포 유형을 탈염하는 데 사용할 수 있으므로 중요한 당면역 관문이며 면역 조절과 관련된 시알로글리칸의 역할을 조사하는 접근 방식을 제공합니다.
Protocol
세포는 서면으로 정보에 입각한 기증자 동의를 얻은 후 국립 혈액 은행인 Instituto Português do Sangue e da Transplantação(IPST)에서 제공한 자원 봉사자인 건강한 익명의 헌혈자의 담황색 코트에서 분리되었습니다(IMP.74.52.4). 혈액 사용은 인체 조직과 세포의 기증, 조달, 검사, 처리, 보존, 보관 및 분배를 위한 품질 및 안전 표준에 관한 지침 2004/23/EC에 따라 윤리 위원회(IPST 30072015)의 승인을 받았습니다(포르투갈 법률 22/2007, 6월 29일). IPST 바이오뱅크는 보존 및 항응고제인 구연산염 인산염 포도당(CPD)이 들어 있는 특정 비닐 수집 백에 혈액을 수집하여 보관하여 처리될 때까지 혈액의 무결성을 유지합니다. 생물학적 물질이 조작에 적합한지 평가하기 위해 Treponema pallidum, B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 혈청학적 대조를 수행하며, 모두 음성이어야 합니다. 본 연구를 위해 IPST는 조사 목적으로 버피 코트를 기증자의 수집 날짜, 혈청학적 결과, 혈액형 및 연령에 관한 정보와 함께 제공하였다32. 버피 코트는 최대 1일 동안 실온에 보관할 수 있습니다.
1. 단핵구 유래 수지상세포 획득
알림: 인간의 말초 혈액을 조작할 때 특정 보편적인 안전 예방 조치와 적절한 물질 폐기를 고려해야 한다는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 시작하기 전에 필요한 모든 시약과 재료가 준비되어 사용할 준비가 되었는지 확인하십시오.
- 말초 혈액 단핵 세포의 분리
- 인간 버피 코트를 이용하세요.
참고: 버피 코트는 원심분리를 통해 백혈구에 농축된 백혈구 성분채집술32를 통해 수집된 혈액에서 파생된 부산물입니다. 모든 단계는 수직 유동 챔버 생물 안전 캐비닛(BSC)에서 수행되었습니다. - 밀봉된 배출 튜브를 메스로 절단하여 버피 코트 포장을 열고 내용물을 50mL 튜브에 옮깁니다. 멸균 15mL 코니컬 튜브당 7mL의 버피 코트 샘플을 옮기고 6mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 예비 세척을 수행합니다. 이 초기 세척 단계는 상당한 양의 적혈구(RBC)와 혈장에서 시료를 세척하여 시료가 밀도 그래디언트 배지를 사용한 그래디언트 분리에 최적화되도록 하기 위해 필요합니다( 재료 표 참조).
- 스윙 로터가 있고 브레이크를 끈 상태에서 원심분리기에서 1,100 x g 으로 실온에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다( 재료 표 참조).
- 원심분리 후 파스퇴르 피펫으로 백혈구 현탁액(혈장과 적혈구 사이의 흰색 고리)을 수집하여 새로운 멸균 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 최대 10mL의 백혈구 현탁액을 PBS로 채워 다음 분리 단계를 돕고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
- 밀도 그래디언트 배지 준비(밀도: 1.077g/mL) 용액: 밀도 그래디언트 배지 3mL를 새로운 멸균 15mL 코니컬 튜브에 넣고 실온으로 예열합니다.
- 밀도 그래디언트 배지(5:3)가 들어 있는 원추형 튜브에 희석된 백혈구 현탁액(1.1.5단계에서) 5mL를 추가하여 밀도 그래디언트 분리를 수행합니다. 밀도 구배 매질을 방해하지 않도록 튜브 벽을 사용하여 샘플을 한 방울씩 천천히 추가합니다.
- 그래디언트 분리: 스윙 로터가 있고 브레이크를 끈 상태에서 원심분리기에서 1,100 x g 으로 실온에서 30분 동안 밀도 그래디언트 배지 현탁액을 원심분리합니다.
- 원심분리 후 원심분리기에서 원추형 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 이 단계가 끝나면 아래부터 시작하여 적색 층(RBC 및 과립구), 밀도 구배 배지, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 얇고 창백한 층 및 혈장을 포함하여 잘 정의된 다양한 층을 볼 수 있습니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBMC의 얇은 층을 수집하고, 아래의 밀도 구배 매질이나 위의 플라즈마를 너무 많이 사용하지 마십시오. PBMC 검체를 새 50mL 코니컬 튜브에 넣고 PBS로 최대 25mL를 채운 다음 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 검체를 혼합합니다.
- 샘플을 실온에서 600 x g (일반 브레이크)으로 10분 동안 원심분리하여 잔류 세포와 파편을 씻어내고 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다.
알림: 적혈구 오염이 너무 많으면 세포 펠릿 또는 버피 코트가 완전히 분리되지 않거나 붉게 보일 때 관찰할 수 있으므로 나머지 적혈구를 용해하는 것이 좋습니다. 이 경우 5mL의 RBC 용해 완충액( 재료 표 참조)을 넣고 잘 혼합한 후 5분 동안 배양합니다. PBS로 최대 40mL를 채우고 샘플을 실온에서 900 x g (일반 브레이크)으로 10분 동안 원심분리한 다음 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다. - PBS로 샘플을 10mL까지 채우고 부분 표본을 사용하여 세포를 계산합니다. 혈소판을 제거하려면 실온에서 400 x g (일반 브레이크)으로 5분 동안 원심분리하고 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다.
알림: 혈소판이 많은 경우 실온에서 10분 동안 200 x g (일반 브레이크)으로 원심분리기를 두 번 합니다. 혈소판은 세포를 계수하는 동안 샘플을 시각화하여 식별합니다.
- 인간 버피 코트를 이용하세요.
- 면역자기 분리에 의한 단핵구 분리
- PBS에 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)과 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 보충하여 마이크로비즈 완충액을 준비합니다. 여과(0.2μm)로 용액을 멸균하고 완충액을 냉장(2-8°C)으로 유지합니다.
- MACS(magnetic-activated cell sorting)를 통해 단핵구 CD14+ 분리를 수행합니다.
- 자동 세포 계수기(단계 1.4.1)를 사용하여 세포 계수를 수행한 후 필요한 마이크로비즈 완충액 및 CD14 면역자성 비드( 재료 표 참조)의 적절한 부피를 계산합니다. 이러한 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 1 x 107 세포당 80μL의 마이크로비즈 완충액을 추가하고 1 x 107 세포당 20μL의 CD14 비드를 추가합니다.
- 세포 펠릿을 이전에 측정된 부피에 재현탁시키고 4°C(2-8°C)에서 15분 동안 배양합니다.
참고: PBMC 샘플의 단핵구 수준 확인이 필요한 경우 염색 항체(예: CD14 [Monoclonal TÜK4])를 사용하여 유세포 분석을 수행합니다. 유세포 분석에 대한 자세한 내용은 3.2단계를 따르십시오. - 1 x 107 세포당 1-2mL의 마이크로비즈 완충액을 추가하고 실온에서 600 x g (일반 브레이크)으로 10분 동안 원심분리하여 결합되지 않은 비드를 제거한 다음 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다.
- LS 컬럼을 준비합니다. LS 컬럼은 자석 상에 놓일 때 자기적으로 표지된 세포(33)의 포지티브하고 부드러운 머무름을 허용하는 강자성 구체를 포함한다. 사용 직전에 LS 컬럼( 재료 표 참조)을 자석에 놓고 완전히 건조되지 않고 3mL의 마이크로비즈 완충액으로 헹구고 즉시 다음 단계로 진행합니다.
알림: 수율 저하를 방지하기 위해 절차 중에 컬럼이 마르지 않도록 하십시오. - 세포 펠릿을 1 x 108 세포당 500μL의 마이크로비즈 완충액에 재현탁시킵니다. 세포 수가 4 x 108보다 높으면 40μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포 응집을 방지하십시오.
- 컬럼 주입구에 세포 현탁액을 추가하고, 컬럼 출구 아래에 15mL 코니컬 튜브를 놓아 음성 세포 분획을 수집하고, 3mL의 마이크로비즈 완충액으로 컬럼을 세 번 세척합니다. 음성 분획은 CD14 비드로 수집되지 않은 세포(즉, CD14− 세포)로 구성됩니다.
- 최종 세척 후 자석에서 컬럼을 제거하고 멸균된 15mL 코니컬 튜브에 놓고 5mL의 마이크로비즈 완충액을 컬럼 주입구에 피펫팅한 다음 즉시 주사기 플런저를 컬럼 주입구에 삽입하고 밀어 표적 세포를 분주합니다.
- 1.4.1단계에서 설명한 대로 자기적으로 표지된 세포(CD14+ 세포)를 수집하고 부분 표본을 사용하여 세포를 계수합니다.
- 세포 분획, CD14- 및 CD14+ 세포를 실온에서 600 x g (일반 브레이크)에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 폐기하고, 다음 단계를 위해 CD14+ 분획을 보관하고, 필요한 경우 공동 배양 분석과 같은 향후 분석을 위해 CD14− 분획을 보관합니다. 필요한 경우 CD14− 분획의 세포를 -80°C에서 RPMI-1640 20% FBS 및 10% DMSO로 동결 보존할 수 있습니다.
- 수지상세포로의 단핵구 분화
- RPMI-1640 기본 배지(11.1mM 포도당 포함)에 소 태아 혈청(FBS) 10%, L-글루타민 2mM 1%, 비필수 아미노산(NEAA) 1%, 피루브산 나트륨 1%, 페니실린/스트렙토마이신 1%를 보충하여 완전한 RPMI-1640 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).
- 5~6일 동안 발생하는 mo-DC로 단핵구 분화를 수행합니다.
- 얻어진 CD14+ 세포의 수에 필요한 배지의 부피를 계산하고 다음 실험 설정에 따라 세포를 도장합니다.
참고: 이 프로토콜에서는 세포 사멸 및 측정 오류를 고려하기 위해 세포를 1.3 x 106 cells/mL의 농도로 도말하고, 배지는 1,000U/mL의 GM-CSF와 750U/mL의 IL-4( 재료 표 참조)를 완전한 배지에 첨가하고 완전히 혼합하여 제조되었습니다. - CD14+ 세포에 적절한 양의 배지를 추가하고 파스퇴르 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다. 세포 현탁액을 24웰 플레이트(웰당: 1.3 x 106 cells/mL)에 패팅하고 37°C의 배양 인큐베이터에서 5%CO2로 배양합니다.
- 배양 배지를 교체하고 2-3일마다 신선한 사이토카인을 보충합니다(일반적으로 분화 과정당 한 번). 이를 수행하려면 세포를 방해하지 않고 배양 배지의 절반을 조심스럽게 제거합니다. 앞서 1.3.2.1 단계의 주석에서 설명한 바와 같이 적절한 농도의 사이토카인과 동일한 양의 신선한 배지를 첨가하고 나머지 분화 기간 동안 배양합니다.
참고: DC는 단핵구와 분화할 때 느슨하게 부착된 세포입니다. 완전히 분화된 미성숙 mo-DC는 방추 모양, 자유 부유 및 느슨하게 부착된 세포입니다. 세포는 또한 로제트를 형성할 수 있는데, 특히 성숙할 때34. - 분화 후 세포를 수집하려면 마이크로피펫을 사용하여 전체 세포 현탁액을 멸균 원뿔형 튜브로 옮기고 PBS로 플레이트의 웰을 두 번 세척하고 바닥을 가볍게 두드립니다(그림 1A).
참고: 부착성이 높은 세포는 대식세포일 수 있으므로 수집하지 마십시오. 부적절한 세포 성숙 또는 활성화를 방지하려면 세포를 각별히 주의하여 다루어야 합니다. - 세포를 실온에서 180 x g (일반 브레이크)으로 10분 동안 원심분리하여 잔류물이나 죽은 세포를 제거하고 실험 설정에 적합한 배지/완충액에 재현탁합니다.
- 얻어진 CD14+ 세포의 수에 필요한 배지의 부피를 계산하고 다음 실험 설정에 따라 세포를 도장합니다.
- mo-DC의 성숙을 수행합니다.
- mo-DC의 성숙이 필요한 경우, 기존에 사용했던 세포 농도예(1.3 x 106 cells/mL)를 고려하여 웰 플레이트 또는 플라스크를 사용하고, IL-1β(10 ng/mL), IL-6(1,000 U/mL), 프로스타글란딘 E2(PGE2; 1 μg/mL)를 포함하는 사이토카인 칵테일을 배지에 보충하여 사이토카인 칵테일을 투여하고, 및 종양 괴사 인자 α(TNF-α; 10ng/mL)( 재료 표 참조). 37 ° C에서 5 % CO2 로 24 시간 또는 48 시간 동안 세포를 배양합니다.
- 세포 계수 및 생존력
- 세포 계수 및 트리판 블루 염색을 수행합니다.
- 세포 수와 세포 현탁액의 생존력을 측정하려면 세포 현탁액에서 10μL의 분취액을 채취하여 10μL의 트리판 블루(1:1 희석)와 혼합합니다.
- 이전 혼합물 10μL를 취하고 자동 셀 카운터를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 셀 수를 계산합니다.
알림: 세포 농도가 너무 높으면 부분 표본을 희석하고 세포 계수 후 계산에서 희석 계수를 고려하십시오. - 실험 설정을 위해 세포 수와 매체/완충액을 조정합니다.
- 세포 생존율 및 세포사멸 결정30.
참고: 이 작업에서는 시알리다아제 처리(섹션 2)에 이어 생존도 분석을 수행했습니다.- mo-DC를 5μg/mL 7-aminoactinomycin D(7-AAD) 및 annexin V로 염색하고 제조업체의 지침에 따라 세포사멸을 결정합니다( 재료 표 참조).
- 유세포 분석29,30을 사용하여 결과를 분석합니다.
- 세포 계수 및 트리판 블루 염색을 수행합니다.
2. sialidase를 가진 세포의 처리
참고: mo-DC로 분화한 후 6일째에 세포는 시알리다제 처리 분석을 위한 준비가 됩니다.
- 원하는 실험 설정을 고려하여 1.3 x 10 6 세포/웰이 있는 24웰 플레이트의 10웰에서 ~10 x 106 mo-DC를 수집하여 새로운 멸균 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
참고: 일부 셀 손실을 가정합니다. 전형적으로, 이 단계에서 발견되는 농도는 1.3 x 106 cells/mL인데, 이는 mo-DC와 그 전구체가 증식하지 않고 mo-DC로 분화하는 동안 20%의 생존력 손실을 경험하기 때문입니다. - 실온에서 5 x g (일반 브레이크)에서 7-300분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하여 죽은 세포와 부스러기를 제거합니다.
- RPMI-1640 배지 10mL(포도당 11.1mM 함유)를 넣고 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 4분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 RPMI-1640 2mL를 넣고 잘 섞습니다.
- RPMI-1640에 1mL의 세포를 새로운 멸균 마이크로튜브(#1 및 #2)에 넣습니다. 각 마이크로튜브에는 약 5 x 106 개의 세포가 포함됩니다.
- 마이크로튜브 #1에 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)에서 추출한 시알리다아제 500mU를 첨가합니다( 재료 표 참조). 마이크로튜브 #2에 음성 대조군인 모의 처리된 시알리다아제를 추가하여 관찰된 효과가 시알산 제거와 직접적인 관련이 있고 인공물에 의한 것이 아닌지 확인합니다. 모의 처리된 시알리다아제는 100°C에서 20분 동안 효소를 끓여서 얻어지는 열-불활성화 시알리다아제이다.
- 37°C에서 60분간 배양합니다.
- 배양 후 세포를 동일한 숫자 #1 및 #2를 가진 새로운 멸균 15mL 코니컬 튜브에 넣습니다. 효소 반응을 중지하기 위해 약 4mL의 완전한 RPMI-1640 배지(10% FBS 포함)를 두 튜브에 추가합니다.
- 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 4분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 각 튜브에 5mL의 완전한 RPMI-1640 배지를 추가하고 웰당 1mL의 세포를 플레이트에 담습니다.
3. 시알산 프로파일의 결정
- 렉틴 염색
- 셀을 수집하여 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 5분 동안 세척합니다.
- 세포를 RPMI-1640 + 10% FBS에 재현탁시키고 세포(100,000/100μL)를 마이크로튜브에 분배합니다.
- 각 렉틴에 대해 0.01mg/mL의 농도를 사용하여 10% FBS로 RPMI-1640에서 유세포 분석을 위한 염색을 수행합니다: Sambucus nigra (SNA) 렉틴, 땅콩 응집체(PNA) 렉틴 및 Maackia amurensis ( MAA) 렉틴(재료 표 참조). 4 °C에서 30분간 배양합니다.
- 10% FBS 또는 10% BSA를 함유한 PBS 1mL로 세포를 세척하고 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 4분 동안 원심분리합니다.
- 비오틴화된 렉틴으로 염색된 세포에 0.0005mg/mL streptavidin-PE( 재료 표 참조)를 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. PBS 1mL로 세포를 세척하고 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 4분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 각 튜브에 2% 파라포름알데히드(PFA 2%) 300μL를 추가합니다. 튜브를 빛으로부터 보호하고, 필요한 경우 데이터를 수집할 때까지 4°C에서 보관합니다.
- 샘플 준비 후 1주일 이내에 유세포 분석기를 사용하여 데이터를 수집합니다29,30.
- 유세포 분석
- PBS 1mL에 세포를 재현탁시키고 즉각적인 데이터 수집을 위해 유세포 분석기로 샘플을 획득합니다.
- 지연된 데이터 수집의 경우 2% PFA의 300μL에 재현탁하고 1주일 이내에 데이터를 수집합니다.
- 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경
- 12mm 직경의 폴리리신 코팅된 유리 커버슬립에 세포를 도금하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 커버슬립을 실온에서 100 x g (일반 브레이크)에서 1분 동안 원심분리하여 세포 접착을 촉진합니다.
- PBS에서 30% BSA로 세척하기 전에 4% PFA로 실온에서 1분 동안 고정합니다.
- FITC 복합 SNA 렉틴(0.01mg/mL)을 사용하여 세포 표면의 α2,6 결합 시알산을 염색합니다( 재료 표 참조).
- 컨포칼 현미경으로 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조).
- Z-stack 처리 후 대표적인 컨포칼 단면 이미지를 선택합니다.
- 보정된 총 세포 형광(CTCF)을 사용하여 염색 강도를 분석적으로 정량화합니다.
참고: CTCF = 통합 밀도 − (선택한 셀의 면적 × 배경 판독값의 평균 형광)29.
4. mo-DC의 성숙 프로파일링
- 항체 염색 및 유세포 분석
- 항체 염색을 수행하기 위해 관심 세포의 새로운 샘플을 수집합니다. 세포를 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 5분 동안 세척하고 세포를 마이크로튜브에 분배합니다(튜브당 100,000개 세포).
- 원하는 항체(ab), MHI-I, MHC-II, CD80 및 CD86을 사용하여 유세포 분석을 위한 염색을 수행합니다( 재료 표 참조).
- 어두운 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 형광 복합 ab를 배양합니다.
- 1mL PBS로 셀을 세척하고 실온에서 300 x g(일반 브레이크)에서 5분 동안 원심분리합니다.
참고: 라벨이 없는 ab를 사용하는 경우 형광 복합 2차 ab를 추가하고 제조업체의 지침에 따라 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. PBS 1mL로 세포를 세척하고 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 5분 동안 원심분리합니다. - 모든 마이크로튜브에 최대 100μL의 PBS를 추가하고, 2% 파라포름알데히드(PFA 2%)의 300μL에 셀을 재현탁하고, 데이터를 수집할 때까지 튜브를 4°C의 어두운 곳에 보관합니다.
- 유세포 분석기를 사용하여 데이터를 수집합니다.
참고: 염색 및 고정 후 샘플은 즉시 또는 1주일 이내에 유세포 분석으로 얻을 수 있습니다. 이 경우 튜브를 어두운 곳에서 4°C로 보관하십시오.
5. 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)
참고: 이 작업에서 IFN-γ 생산은 제조업체의 지침에 따라 ELISA 분석을 사용하여 측정되었습니다( 재료 표 참조).
- 코팅 완충액에 플레이트를 코팅하기 위해 포획 항체(1:100, PBS의 포획 항체)를 희석하고 이 작업 용액 100μL를 각 웰로 옮기고 실온에서 밤새 배양합니다.
- 포획 항체는 완전히 폐기하십시오.
- 차단 완충액(예: PBS + 2% BSA + 0.05% Tween20)을 추가하고 차단 완충액을 제거하기 전에 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 표준물질과 샘플을 각각의 혼합물 및 희석액과 함께 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 세척 버퍼로 5회 세탁하십시오.
- 비오틴화 검출기 항체를 넣고 실온에서 2시간 동안 배양한 후 5회 세척합니다.
- poly-HRP-streptavidin-HS를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한 후 세척 완충액으로 5회 세척합니다.
- TMB 기질( 재료 표 참조)을 추가하고 사용 중인 테스트 시스템을 고려하여 실온에서 최대 60분 동안 배양합니다. 세척 버퍼로 5회 세탁하십시오.
- 450nm의 마이크로플레이트 리더에서 샘플을 판독합니다.
Representative Results
단핵구 분리 및 mo-DC로의 단핵구 분화
프로토콜에 따라, 밀도 구배 배지를 사용한 밀도 구배 분리를 사용하여 인간 PBMC를 버피 코트에서 분리하고 철저히 세척했습니다. 트리판 블루는 앞서 1.4.1단계에서 설명한 바와 같이 분리 당일에 생존 가능한 세포 계수를 수행하는 데 사용되었습니다. 이어서, CD14+ 단핵구 분리는 양성 선택(positive selection)을 통해 수행되었습니다. 이를 달성하기 위해 PBMC는 CD14 항원을 인식하는 항체를 포함하는 마그네틱 비드로 배양되었습니다. 선택된 CD14+ 단핵구를 GM-CSF 및 IL-4가 보충된 배지에서 5-6일동안 배양하여 27 미성숙 mo-DC로 분화시켰다(그림 1A). mo-DC의 성숙은 IL-6, IL-1β, TNF-α 및 PGE235 를 포함한 사이토카인 칵테일을 적용하여 얻을 수 있습니다(그림 1A).
분화 과정에서 IL-4 및 GMCSF 자극의 결과로 세포 표현형이 변화할 것으로 예상됩니다. 데이터는 mo-DC가 주로 단핵구에 의해 발현되는 표면 마커 CD14의 발현을 잃고(그림 1B), 인간 DC에 의해 발현되는 마커인 CD1a의 현저한 발현을 얻는다는 것을 보여줍니다36,37. mo-DC는 또한 인간 DC 및 다른 항원-제시 세포에 의해 발현되는 항원-제시 분자인 더 높은 MHC-II(HLA-DR) 발현을 수득한다(38)(도 1B).
세포 표면 시알산 함량
sialidase에 의한 mo-DC의 처리는 mo-DC의 표면상의 시알산 함량을 감소시키는데, 이는 탄수화물에 결합할 수 있는 단백질인 렉틴으로 염색함으로써 확인할 수 있다39. 사용된 효소는 세포 표면에서 α2,3 및 α2,6 결합 시알산을 모두 제거하기 때문에 mo-DC는 T 항원-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr과 각각 α2,3- 및 α2,6-sialic에 결합하는 MAA 및 SNA 렉틴을 인식하는 PNA로 염색되었습니다. 시알리다아제 처리의 효과는 유세포 분석 및 컨포칼 현미경으로 평가되었습니다(그림 2). 그림 2A에서 볼 수 있듯이 시알리다아제 처리는 PNA 염색을 증가시키면서 MAA 및 SNA 결합을 현저히 감소시켰습니다. 시알리다아제 처리 후 SNA 염색의 감소는 세포 표면에서 SNA 염색이 현저히 감소했음을 보여주는 컨포칼 현미경 분석을 통해 추가로 확인되었습니다(그림 2B).
시알리다아제 처리된 mo-DC의 기능적 특성 분석
시알리다아제 처리가 mo-DC 기능에 미치는 영향을 평가하기 위해, 시알리다아제 처리 후 mo-DC의 성숙 수준을 평가하였다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 시알리다아제 처리는 항원 제시 분자 MHC I 및 MHC II의 발현과 CD80 및 CD86 공동 자극 분자의 발현을 크게 증가시킵니다. T 세포 반응을 유도하는 mo-DC의 능력에 대한 시알산 제거의 효과를 평가하기 위해 종양 세포 용해물이 로드된 시알리다아제 처리된 mo-DC를 사용하여 자가 T 세포를 프라이밍했습니다(그림 3). 다음으로, 생성된 T-세포의 프로파일은 Th1 사이토카인 IFN-γ을 분비하는 능력에 기초하여 특성화하였다. 그림 3B에서 볼 수 있듯이 완전히 시알릴화된 mo-DC에 의해 프라이밍된 T 세포와 비교할 때, 시알리다아제 처리된 mo-DC에 의해 프라이밍된 T 세포는 상당히 높은 수준의 IFN-γ를 분비했습니다. 이러한 결과는 시알리다아제(sialidase)를 처리한 mo-DC가 자가 T-세포를 프라이밍하는 능력이 향상되었음을 시사한다.
세포 생존력
시알리다아제 처리 후, 치료가 세포에 세포독성이 없는지 확인하기 위해 생존력 분석을 수행했습니다. 처리 후 mo-DC를 7-AAD 및 Annexin V로 염색하여 생존 불가능한 세포와 자가사멸 세포를 검출하고 유세포 분석법으로 분석했습니다(그림 4). 데이터는 처리되지 않은 세포(그림 4, 왼쪽 패널)와 시알리다아제 처리된 세포(그림 4, 오른쪽 패널) 간에 세포 생존율에 큰 차이가 없음을 보여줍니다.
그림 1: 분리된 단핵구를 mo-DC로 분화. (A) CD14+ 단핵구를 버피 코트에서 분리하고 37°C에서 1.3 x 106 cells/mL의 농도로 배양했습니다. 단핵구는 750 U/mL의 IL-4 및 1,000 U/mL의 GM-CSF가 보충된 배지에서 분화되었습니다. 0일째에 인간 버피 코트에서 분리된 단핵구의 형태에 대한 현미경 분석(상단 이미지). 미성숙한 mo-dc; 세포는 IL-4 및 GM-CSF(중간 이미지)를 사용하여 5일 동안 분화되었습니다. 성숙된 mo-DC는 IL-6, IL-1β, TNF-α 및 PGE2 사이토카인을 24시간 동안 사용하여 수득하였다(아래 이미지). 스케일 바: 100 μm. (B) 세포는 유세포 분석을 사용하여 분화 기간 동안 0일, 2일 및 5일에 분석되었습니다. 세포 표면 마커를 특성화하기 위해 다음 항체를 사용하였다: (a-c) CD14; (디에프) CD1a 및 (g-i) HLA-DR (MHC 클래스 II). 이 그림은 최소 3개의 독립적인 분석의 대표 히스토그램을 보여줍니다. 패널 (B)는 Videira et al.40, 특허 WO2017002045A1에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세포 표면에서 α2,6- 및 α2,3 결합 시알산을 제거하기 위한 인간 mo-DC의 Sialidase 처리. (A) 시알리다아제 처리의 효능을 테스트하기 위해 렉틴 염색을 사용한 유세포 분석에 의한 mo-DC 분석. 인간 mo-DC를 시알리다아제(회색 막대)로 처리하거나 처리하지 않은 채(흰색 막대)로 두고, SNA 렉틴([2,6]-시알산 인식), MAA 렉틴([2,3]-시알산 인식) 및 PNA 렉틴(T 항원-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr 인식)으로 염색했습니다. 이 값은 최소 3개의 독립적인 분석의 평균 형광 강도(MFI)를 나타냅니다. 통계적 유의성은 미처리 DC와 시알리다아제 처리된 DC의 차이를 참조하여 양측 쌍체 t-검정(*P < 0.05 또는 ***P < 0.0001)을 사용하여 결정되었습니다. Sialidase 처리는 α(2,3) 연결된 시알산의 제거로 인해 인간 mo-DC에서 MAA 결합을 감소시키고 PNA 염색을 증가시켰습니다. 시알리다아제 처리 후 α(2,6)-결합 시알산의 제거는 SNA 염색의 감소에 의해 검출되었다. (B) 시알리다아제로 처리하고 관찰을 위해 커버슬립에 준비한 mo-DC의 컨포칼 현미경. 다양한 세포에서 다양한 z-stack 이미지를 수집하고 평균 염색 강도를 포함하도록 처리했습니다. 눈금 막대: 20 μm. 패널 (A)는 Silva et al.30; 패널 (B)는 Silva et al.29에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성숙 마커의 더 높은 발현을 유도하는 mo-DC의 Sialidase 처리. (A) 시알리다아제로 처리된 mo-DC는 완전히 시알릴화된 mo-DC보다 더 높은 성숙 표현형을 나타냈다. 유세포 분석은 여러 성숙 마커의 발현을 평가하는 데 사용되었습니다. mo-DC를 37°C에서 1시간 동안 시알리다아제로 처리하였다; 그래프 값은 최소 3개의 독립적인 분석의 평균 형광 강도(MFI)(평균 ± SEM)를 나타냅니다. 통계적으로 유의한 차이는 t-검정(*P < 0.05, **P < 0.01)을 사용하여 계산되었으며, 이는 치료되지 않은 상태와 시알리다아제 처리된 조건의 차이를 나타냅니다. (B) 전체 종양 항원이 장착된 건조화된 인간 mo-DC는 특이적 T-세포 반응을 유도했습니다. mo-DC를 37°C에서 1시간 동안 시알리다아제로 처리하거나 처리하지 않은 상태로 방치한 후, 전체 종양 세포 항원의 공급원으로서 MCF-7 용해물(TL)을 로딩했습니다. mo-DC와 자가 T-세포 사이의 공동 배양은 IL-2(10U/mL)의 존재 하에 4-8일 동안 수행되었습니다. 탈시알릴화된 mo-DC를 프라이밍한 T 세포는 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 분비가 상당히 높은 것으로 나타났습니다. mo-DC를 이용한 T-세포 자극 후, 공동배양 상층액으로 분비된 사이토카인을 ELISA(n=7)로 측정하였다. 그래프 값은 농도(pg/mL)(평균 ± SEM)를 나타냅니다. 통계적으로 유의한 차이는 t-검정(*P < 0.05)을 사용하여 계산되었습니다. 이 그림은 Silva et al.30에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 시알리다아제 처리가 인간 mo-DC의 생존력에 미치는 영향 부족. 처리되지 않은 mo-DC(좌측 패널) 및 시알리다아제-처리된 mo-DC(우측 패널)를 annexin V 및 7-AAD로 이중 염색하고, 염색을 유세포 분석에 의해 분석하였다. 이 데이터는 처리되지 않은 세포와 시알리다아제 처리된 세포 간의 세포 생존율에 큰 차이가 없음을 보여주었으며, 이는 mo-DC가 시알리다아제 처리를 견딜 수 있고 면역학적 기능을 발휘할 수 있음을 시사합니다. 이 그림은 Silva et al.30에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
단핵구 분리
이 원고는 인간이 분리한 단핵구 CD14+ (그림 1A)에서 mo-DC를 생성한 후 이러한 세포 표면의 시알산 함량을 줄이기 위해 시알리다아제 처리를 수행하는 프로토콜을 설명합니다.
말초 혈액 또는 조직에서 직접 또는 줄기 세포 또는 단핵구와 같은 전구체와의 분화를 통해 인간 DC를 얻는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 말초 혈액으로부터 분리된 단핵구로부터 분화된 DC를 얻는 것은 다른 DC 공급원에 비해 많은 양의 단핵구를 쉽게 얻을 수 있기 때문에 훨씬 더 간단하다(41). 그럼에도 불구하고 높은 비율의 분리된 단핵구를 얻으려면 모든 프로토콜 단계를 주의 깊게 따라야 합니다. 예를 들어, 밀도 구배 배지는 세포에 독성이 있을 수 있으며, 세포 사멸을 방지하기 위해 밀도 구배 배지와의 장기간 세포 접촉을 피하고 세포를 철저히 세척해야 합니다. 세포 조작은 세포 생존력의 손실을 피하기 위해 가능한 한 빨리 수행되어야 합니다. PBMC에서 단핵구는 많은 수의 단핵구를 생성하는 데 적합한 기술인 MACS(magnetic-activated cell sorting) 방법을 사용하여 양성 선택을 통해 분리할 수 있습니다. 또한, 다른 단핵구 선택 방법과 비교하여, MACS-분리 단핵구로부터 유래된 mo-DC는 항-종양 T-세포 활성을 자극하는 더 큰 능력을 갖는다42. 이 프로토콜에서 단핵구를 분리한 후 IL-4 및 GM-CSF로 5-6일 동안 배양하여 미성숙 mo-DC로 분화했습니다(그림 1). 그 결과, 형태학적으로(그림 1A) 및 표현형적으로(그림 1B) 분리된 단핵구가 미성숙한 mo-DC로 분화되었음을 보여주었습니다. 또한, 분화 전반에 걸쳐 mo-DC는 CD14 마커의 발현을 잃고 T 세포에 대한 항원 제시에 필요한 CD1a 및 MHC-II의 발현을 얻었습니다(그림 1B).
이러한 단핵구를 mo-DC로 분리하고 분화하는 것은 이 프로토콜의 한계입니다. 분리 공정은 세포 사멸을 방지하기 위해 신중하고 신속하게 실행되어야 하는 민감한 단계이며, 이 단계는 새로운 실험을 위해 mo-DC가 필요할 때마다 수행해야 합니다. 분화 공정은 5-6일이 소요되며, 이는 고처리량 분석에 이 방법을 사용하는 데 어려움이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 분리 방법과 사이토카인을 사용하여 mo-DC를 분화시키는 것은 실험 목적으로 in vitro 에서 많은 수의 기능적 mo-DC를 생성하는 데 유용합니다. 이 프로토콜에서 생성된 mo-DC는 시알리다아제 처리, 유세포 분석, ELISA, 공초점 현미경 검사 등을 거칠 수 있으며, 따라서 이 방법(30)의 중요성과 유용성을 강조한다.
미성숙 mo-DC 및 sialidase 처리
Sialidase는 시알릴화 조절에 필수적이며 세포 표면 글라이칸에서 시알산을 제거하는 역할을 합니다. mo-DC에서, 시알리다아제에 의한 시알산 제거는 이들 세포의 성숙을 유도하고, 이는 항원-교차 제시 및 후속 T-세포 활성화 및 항-종양 활성을 증가시킨다(30).
미성숙한 인간 mo-DC는 성숙한 mo-DCs31,43에 비해 세포 표면 α(2,6)- 및 α(2,3)-결합 시알산27의 높은 함량을 나타낸다. 또한, mo-DC를 시알리다아제로 처리하여 시알산을 제거하면 DC 28,30,31의 성숙이 향상됩니다. 이 실험을 위해 선택된 시알리다아제는 박테리아 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)에서 추출한 것입니다.그럼에도 불구하고 박테리아 Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae 또는 Salmonella typhimurium44, 거머리 Macrobdella decora45 및 심지어 Homo sapiens46와 같은 다른 유기체도 sialidase를 생산하며 이러한 유기체의 sialidase도 실험적으로 사용됩니다. 그러나, 각 sialidase에는 다른 기질 특이성이 있습니다. 게다가, sialidase 효소를 사용하는 것은 그것의 한계가 있을 수 있습니다; 예를 들어, 치료 중 mo-DC의 조작은 이러한 세포를 더욱 자극할 수 있습니다. 또한 시알리다아제의 양과 배양 시간은 사용되는 세포의 유형과 시알산 조성에 따라 최적화되어야 합니다. 시알산 제거는 영구적인 효과가 아니라 일시적인 현상으로, 세포가 세포 표면 시알산 함량을 회복하기 때문입니다. 시알리다아제 외에, 시알릴전이효소 억제제, 시알릴전이효소 유전자의 유전자 녹아웃, 또는 시알산 모방체를 이용한 시알산의 대사 봉쇄와 같은 세포 표면의 시알산 분자를 환원시키는 다른 방법들이있다 47,48,49. 그럼에도 불구하고 이러한 방법은 세포에 뚜렷한 영향을 미칠 수 있으며 탈시알릴화 외에도 세포 생존력을 고려해야 합니다. 시알리다아제 효소 처리는 세포 생존력을 유지하면서 세포 표면 시알산을 효과적이고 일시적으로 제거하기 위한 실용적인 방법입니다.
본 연구에서, 시알리다아제를 500 mU/5 x 106 cells/mL의 농도로 미성숙 mo-DC에 첨가하고, 세포를 37°C에서 60분 동안 배양하였다. 치료는 세포 생존력을 보존하고 혈청(30)에 존재하는 시알릴화된 분자 사이의 어떠한 상호작용도 피하기 위해 혈청 없이 RPMI-1640을 사용하여 수행하였다. Sialidase 처리는 50mM 아세트산 나트륨, pH 5.1 (C. perfingens sialidase의 경우) 또는 PBS50,51,52와 같은 RPMI 이외의 다른 완충액으로 수행 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 RPMI-1640은 절차 중에 일정한 실험 조건을 유지하고, 성숙 유도를 방지하며, 시알리다아제 완충액 또는 PBS53,54,55,56으로 인해 발생할 수 있는 스트레스를 줄이기 때문에 DC에 가장 일반적인 배양 배지입니다. 시알리다아제로 배양한 후에는 효소 반응이 멈췄는지 확인하기 위해 혈청 보충 배지로 세포를 철저히 세척하는 것이 중요합니다. 혈청에 있는 sialylated 분자의 존재는 sialidase를 위한 기질로 경쟁할 것입니다, 따라서 급속한 반응 정지를 확신하.
유세포 분석 및 공초점 현미경을 통한 표면 마커 특성 분석
시알산 프로파일을 측정하기 위해 프로토콜 섹션 3에서는 렉틴 염색에 이어 유세포 분석 및 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용했습니다. 세포 염색 절차의 경우, 두 경우 모두 렉틴 농도와 배양 조건을 최적화하여 세포 응집과 사멸을 방지했습니다. 렉틴의 비특이적 결합을 피하기 위해 FBS 또는 BSA의 최소 2%를 함유한 완충액에서 4°C에서 배양을 수행하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서는 일정한 실험 조건을 유지하고 세포 스트레스를 피하기 위해 10% FBS를 함유한 RPMI-1640을 사용했습니다. 컨포칼 현미경의 경우, 형태를 보존하고 자가분해를 방지하며 항원성을 유지하기 위해 염색 전에 세포를 고정하는 것이 필수적입니다.
유세포 분석에 의한 mo-DC 표현형 분석은 시알리다아제 처리 후 감소한 MMA 및 SNA 렉틴에 비해 시알리다아제 처리된 mo-DC가 세포 표면에 결합된 PNA 렉틴의 양이 훨씬 더 많다는 것을 보여주었습니다(그림 2A). 예상대로, PNA는 각각 α2,3- 및 α2,6-시알산에 직접 결합하는 MAA 및 SNA와 달리 비-시알릴화 항원을 인식하기 때문에 PNA 염색이 증가했다30. 이 염색은 이 프로토콜을 사용하여 세포 표면에서 시알산을 효과적으로 제거하는 것을 확인합니다. 처리를 검증하고 세포 표면 시알산 함량을 분석하는 데 사용할 수 있는 또 다른 방법은 그림 2B에 예시된 바와 같이 렉틴 염색 후 공초점 현미경 검사입니다.
전자의 예 외에도, 시알산 함량을 평가하고 특성화하기 위한 대안적인 접근법이 존재하며, 예를 들어 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의한 렉틴 프로빙(lectin probing)이 있습니다. 대안적인 시알산-특이적 렉틴(siglecs)도 이용 가능한데, 예를 들어 시글렉(Siglecs)은 시알산 유형 및 결합에 대한 뚜렷한 선호도를 갖는 렉틴의 그룹이다(57). 두 기술 중 하나(유세포 분석, 현미경 또는 웨스턴 블롯)에서 렉틴을 사용하는 것 외에도 항체를 사용하여 시알산 함량을 특성화하는 것도 가능합니다. 예를 들어, α2,8-시알산은 폴리시알산58에 특이적인 클론 735와 같은 항체에 의해 평가될 수 있다. 또한, 시알리다제 처리 후, 세포는 그들의 표현형 및 T-세포를 활성화시키는 능력을 평가함으로써 그들의 생물학적 또는 치료적 효율에 대해 기능적으로 시험될 수 있다(40). 실제로, 제공된 실시예에서 볼 수 있듯이, 시알리다아제-처리된 mo-DC는 항원-제시 및 공동-자극 분자의 상승된 발현뿐만 아니라 더 높은 성숙 표현형을 보여주었다.
또한, 시알리다아제 처리된 mo-DC는 항원과 함께 로드되고 T 세포 또는 다른 세포와 공동 배양될 수 있으며, 그 후 표현형, 사이토카인 분비 프로파일 또는 기타 특징에 대해 연구할 수 있습니다. 제공된 예에서, 데이터는 시알리다아제로 처리된 mo-DC에 종양 항원을 로드한 다음 T 세포를 활성화하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 실제로, 생성된 T 세포는 IFN-γ 분비가 증가된 것으로 나타났으며, 이는 시알산 부족이 T 세포 27,28,29,30,31을 활성화하는 mo-DC의 용량을 높이는 데 미치는 영향에 대한 이전 보고와 일치합니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 시알리다아제 처리에 의한 시알산 함량 조작을 위한 mo-DC를 생성하는 실현 가능하고 실행 가능하며 실용적인 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다양한 목적과 응용 프로그램을 제공할 수 있는 방법론을 제공합니다. 이 방법은 면역 세포의 성숙 및 반응에서 시알산의 역할을 이해하는 데 중요한 역할을 할 수 있을 뿐만 아니라 면역 조절 도구로도 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익 또는 기타 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 유럽연합 집행위원회(European Commission)의 GLYCOTwinning GA 101079417 및 EJPRD/0001/2020 EU 825575의 자금 지원을 인정합니다. FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020(UCIBIO) 및 LA/P/0140/2020(i4HB). FCT-노바. Stemmatters는 또한 SI I&를 위해 Programa Operacional Regional do Norte(Norte 2020)를 통해 Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional(FEDER)에서 자금을 지원받았습니다. DT DCMatters 프로젝트(NORTE-01-0247-FEDER-047212). 우리는 FCT-NOVA 및 GLYCOVID NOVA Saude의 Biolabs 시설을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E15-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662 160 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
| 50 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E50-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) | BioLegend | 420404 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Annexin V | Immunotools | 31490013 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs | |
| BSA | Sigma - Aldrich | A3294-100G | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile |
| CD14 (Monoclonal TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| CD80 | Immunotools | 21270803 | Maturation Profiling of mo-DCs |
| CD86 | Immunotools | 21480863 | Maturation Profiling of mo-DCs |
| Cell counting slides and trypan blue | EVE | EVS-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
| Density gradient medium (Histopaque) | Sigma - Aldrich | 10771-100ML | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| EDTA | Gibco, ThermoFisher | 15400054 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Elisa kit (IFN-γ) | Immunotools | 31673539 | Maturation Profiling of mo-DCs |
| EVE automated cell count | NanoEntek | 10027-452 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500064 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
| Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-093-864 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Interleukin (IL)-1β | Sigma - Aldrich | I9401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Interleukin (IL)-4 | Miltenyi Biotec | 130-093-919 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Interleukin (IL)-6 | Sigma - Aldrich | SRP3096 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| L-glutamine | Gibco | A2916801 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| LS column and plunger | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin - Biotinylated) | Vector labs | B-1265-1 | Determination of Sialic Acid Profile |
| MHC-I (HLA-ABC) | Immunotools | 21159033 | Maturation Profiling of mo-DCs |
| MHC-II (HLA-DR) | Immunostep | HLADRA-100T | Maturation Profiling of mo-DCs |
| Microtubes | AstiK’s | PCRP-E015-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
| Neuraminidase (Sialidase) | Roche | 11585886001 | Treatment of Cells with Sialidase |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Paraformaldehyde (PFA 2%) | Polysciences Europe | 25085-1 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
| Paraformaldehyde (PFA 4%) | Biotium | 22023 | Determination of Sialic Acid Profile |
| Pasteur pipettes | Labbox | PIPP-003-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin - FITC) | Vector labs | FL-1071 | Determination of Sialic Acid Profile |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140163 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | NZYTech | MB18201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Sigma - Aldrich | P0409 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420302 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) | Gibco | 31870074 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
| Sambucus nigra lectin (SNA lectin - Biotinylated) | Vector labs | B-1305-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
| Sambucus nigra lectin (SNA lectin - FITC) | Vector labs | FL-1301-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
| Sodium pyruvate | Thermofisher | 11360-070 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| SpectroMax190 | Molecular Devices | Maturation Profiling of mo-DCs | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405203 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
| Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma - Aldrich | T0440 | Maturation Profiling of mo-DCs |
| Tumour necrosis factor-α (TNF-α) | Sigma - Aldrich | H8916 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
| Zeiss LSM710 confocal microscope | Zeiss | Determination of Sialic Acid Profile |
References
- Varki, A., Gagneux, P. Multifarious roles of sialic acids in immunity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1253, 16-36 (2012).
- Bochner, B. S., Zimmermann, N. Role of Siglecs and related glycan-binding proteins in immune responses and immunoregulation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 598-608 (2015).
- Smith, B. A. H., Bertozzi, C. R. The clinical impact of glycobiology: Targeting selectins, Siglecs and mammalian glycans. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 217-243 (2021).
- Schauer, R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current Opinion in Structural Biology. 19 (5), 507-514 (2009).
- Manhardt, C. T., Punch, P. R., Dougher, C. W. L., Lau, J. T. Y. Extrinsic sialylation is dynamically regulated by systemic triggers in vivo. Journal of Biological Chemistry. 292 (33), 13514-13520 (2017).
- Cabral, M. G., et al. Human dendritic cells contain cell surface sialyltransferase activity. Immunology Letters. 131 (1), 89-96 (2010).
- Bordron, A., et al. Hyposialylation must be considered to develop future therapies in autoimmune diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3402 (2021).
- Julien, S., Videira, P. A., Delannoy, P. Sialyl-Tn in cancer: (How) did we miss the target. Biomolecules. 2 (4), 435-466 (2012).
- Munkley, J. Aberrant sialylation in cancer: Therapeutic opportunities. Cancers. 14 (17), 4248 (2022).
- Dennis, J. W., Laferte, S., Waghorne, C., Breitman, M. L., Kerbel, R. S. S1-6 Branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science. 236 (4801), 582-585 (1987).
- Pinho, S. S., Reis, C. A. Glycosylation in cancer: Mechanisms and clinical implications. Nature Reviews Cancer. 15 (9), 540-555 (2015).
- Manni, M., Läubli, H. Targeting glyco-immune checkpoints for cancer therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 21 (8), 1063-1071 (2021).
- Sjögren, J., Lood, R., Nägeli, A. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; Unique tools with broad applications. Glycobiology. 30 (4), 254-267 (2020).
- Trastoy, B., et al. Sculpting therapeutic monoclonal antibody N-glycans using endoglycosidases. Current Opinion in Structural Biology. 72, 248-259 (2022).
- Pascoal, C., et al. Sialyl LewisX/A and cytokeratin crosstalk in triple negative breast cancer. Cancers. 15 (3), 731 (2023).
- von Itzstein, M., et al. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication. Nature. 363 (6428), 418-423 (1993).
- Gray, M. A., et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nature Chemical Biology. 16 (12), 1376-1384 (2020).
- Fernandes, Â, et al. Glycans as shapers of tumour microenvironment: A sweet driver of T-cell-mediated anti-tumour immune response. Immunology. 168 (2), 217-232 (2023).
- Togayachi, A., et al. Polylactosamine on glycoproteins influences basal levels of lymphocyte and macrophage activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15829-15834 (2007).
- Park, D. D. Resident and elicited murine macrophages differ in expression of their glycomes and glycan-binding proteins. Cell Chemical Biology. 28 (4), 567-582 (2021).
- Steinman, R. M. Dendritic cells and immune-based therapies. Experimental Hematology. 24 (8), 859-862 (1996).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2 (1), 37-56 (2010).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- So-Rosillo, R., Small, E. J. Sipuleucel-T (APC8015) for prostate cancer. Expert Review of Anticancer Therapy. 6 (9), 1163-1167 (2006).
- Cheever, M. A., Higano, C. S. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: The first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clinical Cancer Research. 17 (11), 3520-3526 (2011).
- Videira, P. A., et al. Surface α2-3- and α2-6-sialylation of human monocytes and derived dendritic cells and its influence on endocytosis. Glycoconjugate Journal. 25 (3), 259-268 (2008).
- Cabral, M. G., et al. The phagocytic capacity and immunological potency of human dendritic cells is improved by α2,6-sialic acid deficiency. Immunology. 138 (3), 235-245 (2013).
- Silva, Z., et al. MHC class I stability is modulated by cell surface sialylation in human dendritic cells. Pharmaceutics. 12 (3), 249 (2020).
- Silva, M., et al. Sialic acid removal from dendritic cells improves antigen cross-presentation and boosts anti-tumor immune responses. Oncotarget. 7 (27), 41053-41066 (2016).
- Crespo, H. J., et al. Effect of sialic acid loss on dendritic cell maturation. Immunology. 128, 621-631 (2009).
- Council of Europe. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Council of Europe. , Strasbourg, France. (2017).
- LS Columns. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/Is-columns.html#130-042-401 (2012).
- Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 07, Unit 7.32 (2012).
- Wu, X., Xu, F., Liu, J., Wang, G. Comparative study of dendritic cells matured by using IL-1β, IL-6, TNF-α and prostaglandins E2 for different time span. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (2), 1389-1394 (2017).
- Naeim, F., Nagesh Rao, P., Song, S., Phan, R. Chapter 2 - Principles of Immunophenotyping. Atlas of Hematopathology. , Academic Press. Cambridge, MA. 29-56 (2018).
- Cernadas, M., Lu, J., Watts, G., Brenner, M. B. CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells. Clinical and Experimental Immunology. 155, 523-533 (2009).
- Santambrogio, L., Strominger, J. L. The ins and outs of MHC class II proteins in dendritic cells. Immunity. 25 (6), 857-859 (2006).
- Raposo, C. D., Canelas, A. B., Barros, M. T. Human lectins, their carbohydrate affinities and where to find them. Biomolecules. 11 (2), 188 (2021).
- Videira, P. A. Q., et al. Patent WO2017002045. A viable cell population, method for production and uses thereof. Portugal patent. , Universidade NOVA de Lisboa. Lisbon, Portugal. (2017).
- Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. International Journal of Oncology. 20 (2), 247-253 (2002).
- Marques, G. S., Silva, Z., Videira, P. A. Antitumor efficacy of human monocyte-derived dendritic cells: Comparing effects of two monocyte isolation methods. Biological Procedures Online. 20, 4 (2018).
- Bax, M., et al. Dendritic cell maturation results in pronounced changes in glycan expression affecting recognition by Siglecs and galectins. Journal of Immunology. 179 (12), 8216-8224 (2007).
- Chinoy, Z. S., Montembault, E., Moremen, K. W., Royou, A., Friscourt, F. Impacting bacterial sialidase activity by incorporating bioorthogonal chemical reporters onto mammalian cell-surface sialosides. ACS Chemical Biology. 16 (11), 2307-2314 (2021).
- Chou, M. -Y., Li, S. -C., Li, Y. -T. Cloning and expression of sialidase L, a NeuAcα2→3Gal-specific sialidase from the leech, Macrobdella decora. Journal of Biological Chemistry. 271 (32), 19219-19224 (1996).
- Crespo, H. J., Lau, J. T. Y., Videira, P. A. Dendritic cells: A spot on sialic acid. Frontiers in Immunology. 4, 491 (2013).
- Büll, C. Metabolic sialic acid blockade lowers the activation threshold of moDCs for TLR stimulation. Immunology & Cell Biology. 95 (4), 408-415 (2017).
- Ohmi, Y., et al. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O -glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology. 31 (5), 557-570 (2021).
- Chung, C., et al. Integrated genome and protein editing swaps α-2,6 sialylation for α-2,3 sialic acid on recombinant antibodies from CHO. Biotechnology Journal. 12 (2), 1600502 (2017).
- Hyvärinen, S., Meri, S., Jokiranta, T. S. Disturbed sialic acid recognition on endothelial cells and platelets in complement attack causes atypical hemolytic uremic syndrome. Blood. 127 (22), 2701-2710 (2016).
- Powell, L. D., Whiteheart, S. W., Hart, G. W. Cell surface sialic acid influences tumor cell recognition in the mixed lymphocyte reaction. Journal of Immunology. 139, 262-270 (1987).
- Corfield, A. P., Higa, H., Paulson, J. C., Schauer, R. The specificity of viral and bacterial sialidases for α(2-3)- and α(2-6)-linked sialic acids in glycoproteins. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 744 (2), 121-126 (1983).
- Tkachenko, N., Wojas, K., Tabarkiewicz, J., Rolinski, J. Generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes - Comparison of different culture media. Folia Histochemica et Cytobiologica. 43, 25-30 (2005).
- Kim, S. J., et al. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes. Cytotherapy. 21 (10), 1049-1063 (2019).
- Calmeiro, J., et al. In-depth analysis of the impact of different serum-free media on the production of clinical grade dendritic cells for cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 11, 593363 (2021).
- Stamatos, N. M., et al. LPS-induced cytokine production in human dendritic cells is regulated by sialidase activity. Journal of Leukocyte Biology. 88 (6), 1227-1239 (2010).
- Lehmann, F., Tiralongo, E., Tiralongo, J. Sialic acid-specific lectins: Occurrence, specificity and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1331-1354 (2006).
- Frosch, M., Görgen, I., Boulnois, G. J., Timmis, K. N., Bitter-Suermann, D. NZB mouse system for production of monoclonal antibodies to weak bacterial antigens: Isolation of an IgG antibody to the polysaccharide capsules of Escherichia coli K1 and group B meningococci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (4), 1194-1198 (1985).
