Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering av monocyttavlederiverte dendrittiske celler med forskjellige sialylerte fenotyper

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65525
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 4,5, 6, 1,2,7
1Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 2UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 3LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade NOVA de Lisboa, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Oncology, Albert Einstein College of Medicine, 6Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark, Zona Industrial da Gandra, 7CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa

Summary

En unik, omfattende protokoll for å generere de-sialylerte humane monocytavledede dendrittiske celler (mo-DCs) fra isolerte mononukleære celler i perifert blod (PBMC) ved bruk av en sialidasebehandling presenteres. Videre beskrives metoder for å vurdere fenotypisk og funksjonell karakterisering av mo-DCs og evaluere hvordan sialidasebehandling forbedrer modningsnivået til mo-DCs.

Abstract

Sialinsyrer er negativt ladede monosakkarider som vanligvis finnes i enden av celleoverflateglykaner. På grunn av deres hydrofilitet og biofysiske egenskaper er de involvert i en rekke biologiske prosesser, for eksempel modulering av immunresponsen, anerkjennelse av selv- og ikke-selvantigener, karbohydrat-protein-interaksjoner, etc. Det cellulære innholdet av sialinsyre reguleres av sialidase, som katalyserer fjerning av sialinsyrerester. Flere studier har vist at sialo-glykaner er kritiske for å overvåke immunovervåking ved å engasjere seg med cis og transhemmende Siglec-reseptorer på immunceller. På samme måte blir glykoimmunkontrollpunkter i kreft viktige mål for å utvikle immunterapier. I tillegg er dendrittiske celler (DC) tenkt som en viktig komponent i immunterapier, spesielt i kreftforskning, på grunn av deres unike rolle som profesjonelle antigenpresenterende celler (APC) og deres evne til å utløse adaptive immunresponser og generere immunologisk minne. Likevel er DCs funksjon avhengig av full modning. Umodne DC-er har en motsatt funksjon til modne DC-er og et høyt sialinsyreinnhold, noe som ytterligere demper modningsnivået. Dette nedregulerer evnen til umodne DCs til å aktivere T-celler, noe som fører til en kompromittert immunrespons. Følgelig induserer fjerning av sialinsyre fra celleoverflaten til humane DCs deres modning, og øker dermed ekspresjonen av MHC-molekyler og antigenpresentasjon. I tillegg kan det gjenopprette ekspresjonen av co-stimulerende molekyler og IL-12, noe som resulterer i at DCs har en høyere evne til å polarisere T-celler mot en Th1-fenotype og spesifikt aktivere cytotoksiske T-celler for å drepe tumorceller. Derfor har sialinsyre dukket opp som en nøkkelmodulator for DCs og blir brukt som et nytt mål for å fremme terapeutisk bruk. Denne studien gir en unik tilnærming til behandling av in vitro monocyttavledede DCs med sialidase, med sikte på å generere DC-populasjoner med forskjellige celleoverflate sialinsyrefenotyper og skreddersydde modnings- og kostimulerende profiler.

Introduction

Sialinsyrebærende glykaner (sialoglykaner) har fått betydelig interesse på grunn av deres immunmodulerende rolle. Monosakkarid sialinsyre, som er mest utbredt hos mennesker i form av N-acetylneuraminsyre, presenterer grunnleggende ligander for lektiner med en anerkjent rolle i immunologi, som Selectins og Siglecs. Disse lektinene gjenkjenner sialoglykaner enten på samme celle (cis) eller på forskjellige celler (trans) og spiller en betydelig rolle i vertspatogen-interaksjoner og ulike fysiologiske og patologiske cellulære aktiviteter 1,2,3. Videre, siden sialinsyre opptar terminalposisjonene til celleoverflateglykokonjugater, kan den skjule de underliggende strukturene, og dermed hemme celle-til-celle-kontakt via ikke-spesifikke frastøtende effekter eller ved å hindre deteksjon av andre lektiner4. Aktiviteten til en rekke sialyltransferaser (som overfører sialinsyrer) og sialidaser (som spalter sialinsyrebindinger) i cellen bestemmer mengden sialinsyre tilstede på overflaten. I tillegg kan løselige sialyltransferaser og sialidaser uttrykt av verten eller patogener ekstrinsisk modifisere mengden sialinsyre på celleoverflaten 5,6.

Avvikende sialylering er en funksjon av flere patologiske forhold. Ved autoimmune sykdommer kan hyposialylering bidra til uhemmet immunaktivering og organskade, siden sialinsyre bidrar til å diskriminere selvantigener og regulere inflammatoriske responser7. Omvendt resulterer hypersialylering i overekspresjon av sialoglykaner, som sialyl-Tn, sialyl-Lewis-antigener, polysialsyre og gangliosider, som utgjør et kjennetegn for noen kreftformer 8,9. Hypersialylering avhenger også av økt ekspresjon av spesifikke enzymer som N-acetylglukosaminyltransferase (GNT-V), som genererer hypersialylerte tri- og/eller tetraantenner N-bundne glykaner, som har vært assosiert med kreftvekst og metastase10. Sialinsyreinnholdet regulerer også proteinets stabilitet og funksjon, noe som er nøkkelen for rollen til relevante onkogene spillere11. Derfor kan økt sialylering lette tumorutvikling, metastase, stoffresistens og immununnvikelse. Videre gjør oppregulering av sialoglykaner det mulig for svulster å interagere med hemmende Siglec-reseptorer på immunceller og unngå immunovervåking. Av den grunn anses sialoglykaner nå for å være glykoimmune sjekkpunkter og attraktive terapeutiske mål. For eksempel er hemmere av Siglec-immunaksen allerede i tidlige kliniske studier, siden immuncellereseptoren Siglec (sialsyrebindende immunoglobulinlignende LECtin) spiller en immunhemmende rolle12.

Enzymer har blitt brukt til å modulere glykanprofilen som verktøy for studier eller for terapeutiske strategier13,14. Sialidase har blitt brukt til å endre kreftcelle malignitet siden sialylerte glykaner som sialyl Lewis X er kritiske for cellemigrasjon og kreftmetastase15. Samtidig har sialidasehemmere, som hindrer sialinsyrespaltning, nådd klinikker for behandling av sialinsyreavhengige virusinfeksjoner16. Nylig har sialinsyremodulasjon fått ytterligere interesse på grunn av den kritiske rollen som sialinsyrer som ligander i Siglec-immunaksen, noe som betyr at de tilbyr nye midler for å redusere kreftflukt fra immunresponser. Denne interessen ble ytterligere styrket av nobelprisvinneren Bertozzi 2022 og hennes teams bidrag til flere strategier som selektivt spalter ulike sialoglykaner og forbedrer immunresponser mot kreft17. Dermed representerer sialidase-baserte strategier en lovende modalitet for glykoimmunkontrollpunktbehandling. Glykofenotypen av celler i immunsystemet er avhengig av typen celle og deres aktiveringsstatus. Når det gjelder T-celler, har glykaner en nøkkelrolle i de patofysiologiske trinnene for T-celleutvikling og tymocyttvalg, T-celleaktivitet, differensiering og spredning18. For eksempel påvirker polylaktosamin på glykoproteiner basale nivåer av B-lymfocytter og T-lymfocytter og makrofagaktivering19. I makrofager har distinkte glykanuttrykksmønstre en viktig rolle i makrofagrekruttering til tumormikromiljøet (TME)20. Derfor kan uttrykket av O-bundne og N-koblede glykaner av immunceller brukes som potensielle glykobiomarkører for terapeutiske tilnærminger i behandlingen av kreft og autoimmune sykdommer.

Dendrittiske celler (DC) er spesifikke antigenpresenterende celler med en unik kapasitet til å utløse immunresponser, for eksempel anti-kreftimmunitet21. DCs må gjennomgå en oppregulering av deres antigenpresenterende MHC-molekyler for å presentere antigener til T-celler (signal 1), co-stimulerende molekyler for å aktivere T-celler (signal 2) og proinflammatoriske cytokiner, slik som IL-12, for å utløse type 1 hjelper T-celleproliferasjon (signal 3) 22. Den resulterende immunprofilen er strengt regulert, og sjekkpunkter er avgjørende for å forhindre at friske celler blir angrepet. Siden DCs kan stimulere ulike immunresponser mot tumorceller, brukes de som cellebaserte vaksiner, og et betydelig antall kliniske studier har vist sine potensielle fordeler23,24. Etter at FDA godkjente den første DC-baserte vaksinen i 201025,26, har mange andre DC-baserte vaksiner blitt utviklet. DC-baserte vaksiner produseres hovedsakelig ex vivo og administreres til pasienter for å fremkalle immunresponser mot svulster. Imidlertid er utilstrekkelig eller kortvarig modning for tiden en av faktorene som begrenser den kliniske effekten av DCs og betyr at dyre cytokincocktailer må brukes. Uten tilstrekkelig modning kan DCs ikke aktivere T-celler under kliniske omstendigheter. I stedet uttrykker DC-ene immunkontrollpunkter og utløser en tolerogen immunrespons som forhindrer cytotoksiske T-celler i å virke mot tumorceller.

Humane DCs har tungt sialylerte overflater, og denne sialyleringen avtar ved modning og under en total immunrespons27. Modningen av DCs kan induseres ved å eliminere disse sialinsyrene med sialidase. Desialylering oppregulerer i stor grad forskjellige cytokiner, inkludert IL-12, på grunn av translokasjonen av NF-kB-transkripsjonsfaktoren til kjernen 6,28. I tillegg forbedrer desialylering antigen krysspresentasjon gjennom MHC-I og anti-tumor immunresponser29,30. Følgelig genererer knockouten av sialyltransferasene ST3Gal.l og ST6Gal.l, som har en viktig rolle i DC-sialylering, en mer moden fenotype i murine DCs31.

Sialidasebehandling gir en metode for å stimulere alle aspekter av DC-modning, inkludert økt antigenpresentasjon, økt ekspresjon av kostimulerende molekyler og økt cytokinproduksjon, for å løse manglene nevnt ovenfor og gjøre det mulig for DCs å fremkalle effektive responser. Denne artikkelen presenterer en prosedyre for å oppnå levedyktige desialylerte humane DCs ved bruk av en bakteriell sialidase. De-sialylerte DCs viser en forbedret modningsprofil og kan brukes som cellemodeller for å øke antitumorimmunresponser in vitro. DC-ene oppnås fra blodmonocytter, som deretter differensieres in vitro i nærvær av cytokininterleukin-4 (IL-4) og granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF). Dette arbeidet beskriver også lektinbaserte metoder for å analysere sialinsyre på celleoverflaten og metoder for å immunfenotype DC-modningsnivået. Prosedyren beskrevet her kan brukes til å desialylate andre celletyper, og dermed gi en tilnærming til å undersøke rollen til sialoglykaner, som er viktige glykoimmunkontrollpunkter og relevante for immunmodulering.

Protocol

Cellene ble isolert fra pelsen til friske anonyme blodgivere, som var frivillige fra den nasjonale blodbanken, Instituto Português do Sangue e da Transplantação (IPST), etter at skriftlig og informert donorsamtykke var innhentet (IMP.74.52.4). Blodbruken ble godkjent av den etiske komiteen (IPST 30072015), i henhold til direktiv 2004/23 / EF om standarder for kvalitet og sikkerhet for donasjon, anskaffelse, testing, behandling, bevaring, lagring og distribusjon av humant vev og celler (portugisisk lov 22/2007, 29. juni). IPST-biobanken samler inn og lagrer blod i en spesifikk plastoppsamlingspose som inneholder citratfosfatdekstrose (CPD), en konserverende og antikoagulerende løsning, for å opprettholde blodets integritet frem til behandling. For å vurdere om det biologiske materialet egner seg for manipulasjon, utføres serologisk kontroll for Treponema pallidum, hepatitt B-virus (HBV), hepatitt C-virus (HCV) og humant immunsviktvirus (HIV), som alle må være negative. For denne studien ble buffy-pelsen levert av IPST for undersøkelsesformål, sammen med informasjon om innsamlingsdato, serologiske resultater, blodtype og alder på giveren32. Buffy-pelsen kan forbli ved romtemperatur i maksimalt 1 dag.

1. Innhenting av monocytavledede dendrittiske celler

MERK: Det er viktig å nevne at når humant perifert blod blir manipulert, bør man vurdere spesifikke universelle sikkerhetstiltak og passende materialavhending. Før du starter, må du kontrollere at alle nødvendige reagenser og materialer er forberedt og klare til bruk.

  1. Isolering av mononukleære celler i perifert blod
    1. Få tilgang til den menneskelige buffy pelsen.
      MERK: Buffy pels er et biprodukt avledet fra blod samlet via leukaferese32, som er beriket i hvite blodlegemer gjennom sentrifugering. Alle trinnene ble utført i et biosikkerhetskabinett for vertikalt strømningskammer (BSC).
    2. Åpne buffy coat-emballasjen ved å kutte det forseglede utløpsrøret med en skalpell, og overfør innholdet til et 50 ml rør. Overfør 7 ml buffy coat-prøve per sterilt 15 ml konisk rør, og tilsett 6 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS) for å utføre en foreløpig vask. Dette innledende vasketrinnet er nødvendig for å rengjøre prøven fra den betydelige mengden røde blodlegemer (RBC) og plasma slik at prøven er optimalisert for gradientseparasjon med et tetthetsgradientmedium (se materialfortegnelsen).
    3. Sentrifuger røret ved romtemperatur i 10 minutter ved 1,100 x g i en sentrifuge med en svingrotor og med bremsen av (se materialtabellen).
    4. Etter sentrifugering, samle leukocyttsuspensjonen (den hvite ringen mellom plasma og RBC) med en Pasteur-pipette, og overfør den til et nytt sterilt 15 ml konisk rør.
    5. Fyll leukocyttsuspensjonen opptil 10 ml med PBS for å hjelpe til med neste separasjonstrinn, og bland ved å pipettere forsiktig opp og ned.
    6. Forbered tetthetsgradientmediet (tetthet: 1,077 g/ml) løsning: Plasser 3 ml tetthetsgradientmedium i et nytt sterilt 15 ml konisk rør, og la det varmes til romtemperatur.
    7. Tilsett 5 ml av den fortynnede leukocyttsuspensjonen (fra trinn 1.1.5) i det koniske røret som inneholder tetthetsgradientmediet (5:3) for å utføre separasjon av tetthetsgradient. Tilsett prøven sakte, dråpe for dråpe, ved hjelp av rørveggene for å unngå å forstyrre tetthetsgradientmediet.
    8. Gradientseparasjon: Sentrifuge tetthetsgradienten medium fjæring ved romtemperatur i 30 minutter ved 1,100 x g i en sentrifuge med en svingrotor og med bremsen av.
    9. Etter sentrifugering, fjern forsiktig de koniske rørene fra sentrifugen. Etter dette trinnet er en rekke veldefinerte lag synlige, inkludert følgende, fra bunnen: et rødt lag (RBC og granulocytter), tetthetsgradientmedium, et tynt blekt lag av mononukleære celler i perifert blod (PBMC) og plasma.
    10. Samle det tynne laget av PBMC ved hjelp av en Pasteur-pipette, og unngå å ta opp tetthetsgradientmediet under eller for mye plasma over. Plasser PBMC-prøven i et nytt 50 ml konisk rør, fyll den opp til 25 ml med PBS, og bland prøven ved å pipettere forsiktig opp og ned.
    11. Sentrifuger prøvene ved romtemperatur i 10 minutter ved 600 x g (normal brems) for å vaske av gjenværende celler og rusk, og kast supernatanten ved å snu røret forsiktig.
      MERK: Hvis det er for mye forurensning av røde blodlegemer, som kan observeres når cellepelleten eller buffy-pelsen ikke er helt separert eller virker rødlig, anbefales det å lyse de resterende RBC-ene. I dette tilfellet tilsettes 5 ml RBC-lysisbuffer (se materialfortegnelsen), blandes grundig og inkuberes i 5 minutter. Fyll opptil 40 ml med PBS, sentrifuger prøvene ved romtemperatur i 10 minutter ved 900 x g (normal brems), og kast supernatanten ved å snu røret forsiktig.
    12. Fyll opp prøven til 10 ml med PBS, og ta en aliquot for å telle cellene. For å fjerne blodplater, sentrifuger ved romtemperatur i 5 minutter ved 400 x g (normal brems), og kast supernatanten ved å snu slangen forsiktig.
      MERK: I tilfelle det er et betydelig antall blodplater, sentrifuge ved romtemperatur i 10 minutter ved 200 x g (normal brems) to ganger. Blodplatene identifiseres ved å visualisere prøven mens cellene telles.
  2. Monocytisolering ved immunomagnetisk separasjon
    1. Forbered mikrokulebufferen ved å supplere PBS med 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Steriliser oppløsningen ved filtrering (0,2 μm), og hold bufferen nedkjølt (2-8 °C).
    2. Utfør monocytt CD14+ -isolering ved magnetisk aktivert cellesortering (MACS).
      1. Etter celletelling ved hjelp av en automatisert celleteller (trinn 1.4.1), beregne riktig volum av mikroperlebuffer og CD14 immunomagnetiske perler (se materialtabellen) som kreves. Sørg for at disse løsningene holdes på is. Tilsett 80 μL mikroperlebuffer per 1 x 10 7 celler og 20 μL CD14-perler per 1 x 107 celler.
      2. Resuspender cellepelleten i tidligere bestemt volum, og inkuber i 15 minutter ved 4 °C (2-8 °C).
        MERK: Hvis det er behov for verifisering av monocyttnivåene i PBMC-prøvene, utfør en flowcytometrisk analyse ved bruk av fargeantistoffer (f.eks. CD14 [monoklonal TÜK4]). Følg trinn 3.2 for detaljer om flowcytometrisk analyse.
      3. Tilsett 1-2 ml mikroperlebuffer per 1 x 107 celler, sentrifuger ved romtemperatur i 10 minutter ved 600 x g (normal brems) for å fjerne ubundne perler, og kast supernatanten ved å snu røret forsiktig.
      4. Forbered kolonnen LS. LS-kolonnene inneholder ferromagnetiske kuler som, når de plasseres på en magnet, tillater positiv, skånsom oppbevaring av magnetisk merkede celler33. Umiddelbart før bruk, plasser en LS-kolonne (se materialfortegnelsen) på magneten, skyll med 3 ml mikroperlebuffer uten å tørke helt, og fortsett umiddelbart til neste trinn.
        MERK: La aldri kolonnen tørke ut under prosedyren for å unngå å kompromittere utbyttet.
      5. Resuspender cellepelleten i 500 μL mikroperlebuffer per 1 x 108 celler. Hvis celletallet er høyere enn 4 x 108, bruk en 40 μm cellesil for å forhindre celleaggregering.
      6. Legg cellesuspensjonen til kolonneinnløpet, plasser et 15 ml konisk rør under kolonneutløpet for å samle den negative cellefraksjonen, og vask kolonnen tre ganger med 3 ml mikroperlebuffer. Den negative fraksjonen omfatter cellene som ikke ble samlet med CD14-kulene (dvs. CD14-cellene).
      7. Etter den siste vasken, fjern kolonnen fra magneten, plasser den på et sterilt 15 ml konisk rør, pipett 5 ml mikroperler buffer inn i kolonneinnløpet, og sett sprøytestempelet umiddelbart inn i kolonneinnløpet og trykk for å dispensere målcellene.
      8. Samle de magnetisk merkede cellene (CD14+ -cellene), og ta en alikot for å telle cellene, som beskrevet i trinn 1.4.1.
      9. Sentrifuger begge cellefraksjonene, CD14− og CD14+ celler, ved romtemperatur i 10 min ved 600 x g (normal brems). Kast supernatanten, behold CD14+-fraksjonen for de neste trinnene, og oppbevar CD14-fraksjonen for fremtidige analyser, for eksempel kokulturanalyser, om nødvendig. Om nødvendig kan cellene fra CD14-fraksjonen kryopreserveres i RPMI-1640 20% FBS og 10% DMSO ved -80 ° C.
  3. Monocytdifferensiering i dendrittiske celler
    1. Forbered komplett RPMI-1640 medium ved å supplere RPMI-1640 basemedium (inneholdende 11,1 mM glukose) med 10% føtal bovint serum (FBS), 1% av 2 mM L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 1% natriumpyruvat og 1% av 100 μg / ml penicillin / streptomycin (se materialtabellen).
    2. Utfør monocytdifferensiering i mo-DC, som skjer over ~ 5-6 dager.
      1. Beregn volumet av medium som er nødvendig for antall CD14+ -celler som er oppnådd, og plate cellene i henhold til følgende eksperimentoppsett.
        MERK: I denne protokollen ble cellene belagt med en konsentrasjon på 1,3 x 106 celler / ml for å ta hensyn til celledød og målefeil, og mediet ble fremstilt ved å tilsette 1000 U / ml GM-CSF og 750 U / ml IL-4 (se materialtabellen) i et komplett medium og blande det grundig.
      2. Tilsett riktig volum medium til CD14+ -cellene, og resuspender ved å pipettere opp og ned med en Pasteur-pipette. Plate cellesuspensjonen i 24-brønnsplater (per brønn: 1,3 x 106 celler / ml), og inkuber i en kulturinkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
      3. Bytt kulturmediet, og suppler det med friske cytokiner hver 2-3 dager (vanligvis en gang per differensieringsprosess). For å utføre dette, fjern forsiktig halvparten av kulturmediet uten å forstyrre cellene. Tilsett samme mengde friskt medium med passende konsentrasjon av cytokiner, som beskrevet tidligere i notatet til trinn 1.3.2.1, og inkuber for den gjenværende differensieringsperioden.
        MERK: DCer, når de skiller seg fra monocytter, er løst adherente celler. Fullt differensierte umodne mo-DCer er spindelformede, frittflytende og løst adherente celler. Cellene kan også danne rosetter, spesielt når de er modne34.
      4. For å samle cellene etter differensiering, bruk en mikropipette til å overføre hele cellesuspensjonen til et sterilt konisk rør, og vask brønnene på platen to ganger med PBS, bank forsiktig på bunnen (figur 1A).
        MERK: Unngå å samle de tungt adherente cellene, da disse sannsynligvis er makrofager. For å unngå feil cellemodning eller aktivering, må du sørge for at cellene håndteres med ekstrem forsiktighet.
      5. Sentrifuger cellene ved romtemperatur i 10 minutter ved 180 x g (normal brems) for å fjerne rester eller døde celler, og resuspender i passende medium/buffer for eksperimentelt oppsett.
    3. Utfør modningen av mo-DCs.
      1. I tilfelle modning av mo-DCs er nødvendig, bruk en brønnplate eller kolbe, ta hensyn til cellekonsentrasjonseksemplet som ble brukt tidligere (1,3 x 10 6 celler / ml), og administrer en cytokincocktail ved å supplere mediet med en cytokincocktail som består av IL-1β (10 ng / ml),IL-6 (1000 U / ml), prostaglandin E2 (PGE2; 1 μg / ml), og tumornekrosefaktor-α (TNF-α; 10 ng/ml) (se materialfortegnelsen). Inkuber cellene ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer eller 48 timer.
  4. Celletelling og levedyktighet
    1. Utfør celletelling og trypanblå farging.
      1. For å bestemme antall celler og levedyktigheten til en cellesuspensjon, ta en alikot på 10 μL fra cellesuspensjonen, og bland den med 10 μL trypanblå (1: 1 fortynning).
      2. Ta 10 μL av den forrige blandingen, og bruk den automatiserte celletelleren til å telle antall celler i henhold til produsentens instruksjoner.
        MERK: Hvis konsentrasjonen av celler er for høy, fortynn alikoten, og etter celletellingen, vurder fortynningsfaktoren i beregningene.
      3. Juster cellenummeret og medium/buffer for det eksperimentelle oppsettet.
    2. Bestem cellens levedyktighet og apoptose30.
      MERK: I dette arbeidet, etter sialidasebehandlingen (seksjon 2), ble levedyktighetsanalysen utført.
      1. Beis mo-DCs med 5 μg / ml 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og vedlegg V, og bestem apoptosen i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelsen).
      2. Analyser resultatene ved hjelp av flowcytometri29,30.

2. Behandling av cellene med sialidase

MERK: Etter differensiering i mo-DC, på den sjette dagen, er cellene klare for sialidase-behandlingsanalysen.

  1. Med tanke på ønsket eksperimentelt oppsett, samle ~ 10 x 10 6 mo-DCs fra 10 brønner av 24-brønnplatene med 1,3 x 106 celler / brønn, og overfør dem til et nytt sterilt 15 ml konisk rør.
    MERK: Anta noe celletap; Vanligvis, på dette stadiet, er konsentrasjonen funnet 1,3 x 106 celler / ml fordi mo-DCene og deres forløpere ikke sprer seg og opplever 20% levedyktighetstap under differensiering i mo-DCer.
  2. Sentrifuge ved romtemperatur i 5-7 min ved 300 x g (normal brems), og kast supernatanten for å fjerne døde celler og rusk.
  3. Tilsett 10 ml RPMI-1640 medium (inneholdende 11,1 ml glukose), sentrifuge ved romtemperatur i 4 minutter ved 300 x g (normal brems), kast supernatanten, tilsett 2 ml RPMI-1640 og bland godt.
  4. Plasser 1 ml celler i RPMI-1640 i nye sterile mikrorør, #1 og #2; Hvert mikrorør vil inneholde omtrent 5 x 106 celler.
  5. Til mikrorør #1, tilsett 500 mU sialidase fra Clostridium perfringens (se materialfortegnelsen). Til mikrorør #2, legg til mock-behandlet sialidase, som er en negativ kontroll, for å bekrefte om de observerte effektene er direkte relatert til fjerning av sialinsyre og ikke skyldes artefakter. Den mock-behandlede sialidase er varmeinaktivert sialidase, som oppnås ved å koke enzymet i 20 minutter ved 100 ° C.
  6. Inkuber i 60 minutter ved 37 °C.
  7. Etter inkubering, plasser cellene i nye sterile 15 ml koniske rør med samme numerasjon, #1 og #2. Legg til rundt 4 ml komplett RPMI-1640 medium (inneholdende 10% FBS) til begge rørene for å stoppe den enzymatiske reaksjonen.
  8. Sentrifuger ved romtemperatur i 4 min ved 300 x g (normal brems), og kast supernatanten.
  9. Tilsett 5 ml komplett RPMI-1640 medium til hvert rør, og plate 1 ml celler per brønn.

3. Bestemmelse av sialinsyreprofilen

  1. Lektin farging
    1. Oppsamling og vask cellene ved romtemperatur i 5 min ved 300 x g (normal brems).
    2. Resuspender cellene i RPMI-1640 + 10% FBS, og fordel cellene (100.000/100 μL) i mikrorørene.
    3. Utfør farging for flowcytometri i RPMI-1640 med 10% FBS ved bruk av en konsentrasjon på 0,01 mg/ml for hvert lektin: Sambucus nigra (SNA) lektin, peanøttagglutinin (PNA) lektin og Maackia amurensis (MAA) lektin (se materialtabellen). Inkuber i 30 minutter ved 4 °C.
    4. Vask cellene med 1 ml PBS inneholdende 10% FBS eller 10% BSA, og sentrifuge ved romtemperatur i 4 minutter ved 300 x g (normal brems).
    5. Til cellene farget med biotinylerte lektiner, tilsett 0,0005 mg / ml streptapavidin-PE (se materialtabellen), og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur i mørket. Vask cellene med 1 ml PBS, og sentrifuger ved romtemperatur i 4 minutter ved 300 x g (normal brems).
    6. Kast supernatanten, og tilsett 300 μL 2% paraformaldehyd (PFA 2%) til hvert rør. Beskytt tubene mot lys, og oppbevar ved behov ved 4 °C til datainnsamling.
    7. Innhent dataene ved hjelp av et flowcytometer innen 1 uke etter prøvepreparering29,30.
  2. Flowcytometri
    1. Resuspender cellene i 1 ml PBS, og ta prøven med et flowcytometer for umiddelbar datainnsamling.
    2. For forsinket datainnsamling, resuspendere i 300 μL av 2% PFA, og samle inn dataene innen 1 uke.
  3. Konfokal laserskanningsmikroskopi
    1. Plate cellene på 12 mm diameter polylysinbelagte glassdeksler, og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Sentrifuger dekslene ved romtemperatur i 1 min ved 100 x g (normal brems) for å fremme celleadhesjon.
    3. Fikses ved romtemperatur i 30 min med 4% PFA før vask med 1% BSA i PBS.
    4. Bruk FITC-konjugert SNA-lektin (0,01 mg/ml) for å farge α2,6-koblede sialinsyrer på celleoverflatene (se materialtabellen).
    5. Få bilder på et konfokalmikroskop (se materialfortegnelsen).
    6. Etter Z-stack-behandling velger du representative konfokale tverrsnittsbilder.
    7. Analytisk kvantifisere fargeintensiteten ved hjelp av korrigert total cellefluorescens (CTCF).
      MERK: CTCF = Integrert tetthet - (Areal av valgt celle × Gjennomsnittlig fluorescens av bakgrunnsavlesninger)29.

4. Modningsprofilering av mo-DC-er

  1. Antistofffarging og flowcytometri
    1. Samle en ny prøve av cellene av interesse for å utføre antistofffarging. Vask cellene ved romtemperatur i 5 minutter ved 300 x g (normal brems), og fordel cellene inn i mikrorørene (100 000 celler per rør).
    2. Utfør farging for flowcytometri med ønskede antistoffer (ab), MHI-I, MHC-II, CD80 og CD86 (se materialfortegnelse).
    3. Inkuber fluorescenskonjugert ab i 15 minutter ved romtemperatur i mørket.
    4. Vask cellene med 1 ml PBS, og sentrifuger ved romtemperatur i 5 min ved 300 x g (normal brems).
      MERK: Hvis du bruker umerket ab, tilsett fluorescerende konjugert sekundær ab, og rug i mørket i 15 minutter i henhold til produsentens instruksjoner. Vask cellene med 1 ml PBS, og sentrifuger ved romtemperatur i 5 minutter ved 300 x g (normal brems).
    5. Til alle mikrorørene, legg opp til 100 μL PBS, resuspender cellene i 300 μL 2% paraformaldehyd (PFA 2%), og hold rørene i mørket ved 4 ° C til datainnsamlingen.
    6. Skaff dataene ved hjelp av et flowcytometer.
      MERK: Etter farging og fiksering kan prøvene tas ved flowcytometri umiddelbart eller innen en 1 ukes periode. I så fall skal tubene oppbevares ved 4 °C i mørket.

5. Enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA)

MERK: I dette arbeidet ble IFN-γ-produksjonen målt ved hjelp av ELISA-analysen etter produsentens instruksjoner (se materialfortegnelsen).

  1. For å belegge platen i en beleggbuffer, fortynn fangstantistoffet (1:100, fang antistoff i PBS), overfør 100 μL av denne arbeidsløsningen til hver brønn og inkuber over natten ved romtemperatur.
  2. Kast fangstantistoffet helt.
  3. Legg til blokkeringsbufferen (f.eks. PBS + 2% BSA + 0,05% Tween20), og inkuber i 1 time ved romtemperatur før du fjerner blokkeringsbufferen.
  4. Tilsett standard og prøve, med respektive blanding og fortynninger, og inkuber i 2 timer ved romtemperatur. Vask fem ganger med vaskebuffer.
  5. Tilsett det biotinylerte detektorantistoffet, og inkuber i 2 timer ved romtemperatur, etterfulgt av fem vasker.
  6. Tilsett poly-HRP-streptavidin-HS, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av fem vasker med vaskebuffer.
  7. Tilsett TMB-substrat (se materialfortegnelsen), og inkuber i opptil 60 minutter ved romtemperatur, med tanke på testsystemet som brukes. Vask fem ganger med vaskebuffer.
  8. Les prøvene på en mikroplateleser ved 450 nm.

Representative Results

Monocyttisolering og monocytdifferensiering i mo-DCs
I samsvar med protokollen ble humane PBMCer isolert fra buffy-pelsen ved bruk av tetthetsgradientseparasjon med tetthetsgradientmedium og grundig vasket. Trypanblå ble brukt til å utføre levedyktig celletelling på isolasjonsdagen, som beskrevet tidligere i trinn 1.4.1. Deretter ble CD14+ monocyttisolering utført ved positiv seleksjon. For å oppnå dette ble PBMC inkubert med magnetiske perler som inneholder et antistoff som gjenkjenner CD14-antigenet. De utvalgte CD14+ -monocyttene ble dyrket i et medium supplert med GM-CSF og IL-4 i 5-6 dager27 for å differensiere til umodne mo-DCs (figur 1A). Modningen av mo-DC kan oppnås ved å påføre en cocktail av cytokiner, inkludert IL-6, IL-1β, TNF-α og PGE235 (figur 1A).

Under differensieringsprosessen, som et resultat av IL-4 og GMCSF-stimulering, forventes cellefenotypen å endre seg. Data viser at mo-DCs mister uttrykk for overflatemarkør CD14, hovedsakelig uttrykt av monocytter (figur 1B), og får signifikant uttrykk for CD1a, en markør uttrykt av humane DCs36,37. Mo-DCs oppnår også høyere MHC-II (HLA-DR) uttrykk, et antigenpresenterende molekyl uttrykt av humane DCs og andre antigenpresenterende celler38 (figur 1B).

Innhold av sialinsyre på celleoverflaten
Behandlingen av mo-DCs med sialidase reduserer sialinsyreinnholdet på overflaten av mo-DC, som kan bekreftes ved farging med lektiner, som er proteiner som er i stand til å binde seg til karbohydrater39. Siden enzymet som brukes fjerner både α2,3 og α2,6-koblede sialinsyrer fra celleoverflaten, ble mo-DC farget med PNA, som gjenkjenner T-antigen-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr, samt MAA- og SNA-lektiner, som binder seg til henholdsvis α2,3- og α2,6-sialsyre. Effekten av sialidasebehandlingen ble evaluert ved flowcytometri og konfokalmikroskopi (figur 2). Som vist i figur 2A, reduserte sialidasebehandling signifikant MAA- og SNA-binding samtidig som PNA-farging økte. Reduksjonen i SNA-farging etter sialidasebehandling ble ytterligere bekreftet ved konfokalmikroskopianalyse som viste signifikant redusert SNA-farging på celleoverflaten (figur 2B).

Funksjonell karakterisering av sialidase-behandlede mo-DCs
For å evaluere hvordan sialidasebehandling påvirker mo-DC-funksjonene, ble modningsnivået av mo-DCs vurdert etter sialidasebehandling. Som vist i figur 3A fører sialidasebehandlingen til en signifikant økning i ekspresjonen av de antigenpresenterende molekylene MHC I og MHC II og ekspresjonen av CD80- og CD86-kostimulerende molekyler. For å vurdere effekten av fjerning av sialinsyre på mo-DCs evne til å indusere T-celleresponser, ble sialidasebehandlede mo-DCs lastet med tumorcellelysater brukt til å prime autologe T-celler (figur 3). Deretter ble profilen til de resulterende T-cellene karakterisert basert på deres evne til å utskille Th1-cytokinet IFN-γ. Som vist i figur 3B, sammenlignet med T-celler primet av fullt sialylerte mo-DCer, utskilte T-cellene primet av sialidase-behandlede mo-DCs signifikant høyere nivåer av IFN-γ. Disse resultatene tyder på at sialidase-behandlede mo-DCs har forbedret kapasiteten til å prime autologe T-celler.

Levedyktighet av celler
Etter behandling med sialidase ble det utført en levedyktighetsanalyse for å sikre at behandlingen ikke var cytotoksisk for cellene. Etter behandling ble mo-DC farget med 7-AAD og vedlegg V for å påvise ikke-levedyktige og apoptotiske celler, og analysert med flowcytometri (figur 4). Data viser ingen signifikant forskjell i cellelevedyktighet mellom ubehandlede (figur 4, venstre panel) og sialidasebehandlede celler (figur 4, høyre panel).

Figure 1
Figur 1: Differensiering av isolerte monocytter til mo-DC. (A) CD14+-monocytter ble isolert fra buffy pels og dyrket i en konsentrasjon på 1,3 x 106 celler/ml ved 37 °C. Monocytter ble differensiert i medium supplert med 750 U/ml IL-4 og 1000 U/ml GM-CSF. Mikroskopisk analyse av morfologien til monocytter isolert fra human buffy pels på dag 0 (øverste bilde). Umodne mo-DCs; celler ble differensiert i løpet av en periode på 5 dager ved bruk av IL-4 og GM-CSF (midterste bilde). Modne mo-DCs ble oppnådd ved bruk av IL-6, IL-1β, TNF-α og PGE2 cytokiner i 24 timer (nederste bilde). Skalastenger: 100 μm. (B) Cellene ble analysert på dag 0, dag 2 og dag 5 gjennom hele differensieringsperioden ved hjelp av flowcytometri. Følgende antistoffer ble brukt til å karakterisere celleoverflatemarkører: (a-c) CD14; (VG Nett) CD1a, og (g-i) HLA-DR (MHC klasse II). Figuren viser representative histogrammer for minst tre uavhengige analyser. Panel (B) er modifisert fra Videira et al.40, patent WO2017002045A1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sialidasebehandling av humane mo-DCs for å fjerne α2,6- og α2,3-koblede sialinsyrer fra celleoverflaten. (A) Analyse av mo-DCs ved flowcytometri ved bruk av lektinfarging for å teste effekten av sialidasebehandling. Humane mo-DCs ble behandlet med sialidase (grå barer) eller venstre ubehandlet (hvite barer) og farget med SNA-lektin (gjenkjenner [2,6]-sialinsyrer), MAA-lektin (gjenkjenner [2,3]-sialinsyrer) og PNA-lektin (gjenkjenner T-antigen-Galβ1-3GalNAcα1-Ser / Thr). Verdiene representerer gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av minst tre uavhengige analyser. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av en tosidig paret t-test (*P < 0,05 eller ***P < 0,0001), med henvisning til forskjellen mellom de ubehandlede og sialidasebehandlede DCene. Sialidasebehandling reduserte MAA-bindingen og økte PNA-fargingen i humane mo-DCer, som følge av fjerning av α(2,3)-koblede sialinsyrer; fjerning av α(2,6)-koblede sialinsyrer etter sialidasebehandling ble påvist ved en reduksjon i SNA-farging. (B) Konfokal mikroskopi av mo-DCs behandlet med sialidase og klargjort på coverslips for observasjon. En rekke z-stack-bilder ble samlet inn fra forskjellige celler og behandlet for å inkludere gjennomsnittlig fargeintensitet. Skala barer: 20 μm. Panel (A) er modifisert fra Silva et al.30; panel (B) er modifisert fra Silva et al.29. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sialidasebehandling av mo-DCs som induserer et høyere uttrykk av modningsmarkører. (A) mo-DCs behandlet med sialidase viste en høyere modningsfenotype enn fullt sialylerte mo-DCs. Væskestrømscytometri ble brukt til å evaluere ekspresjon av flere modningsmarkører. Mo-DCs ble behandlet med sialidase i 1 time ved 37 °C; grafverdiene representerer gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) (gjennomsnittlig ± SEM) av minst tre uavhengige analyser. Statistisk signifikante forskjeller ble beregnet med t-test (*P < 0,05, **P < 0,01), med henvisning til forskjellen mellom de ubehandlede og sialidasebehandlede tilstandene. (B) Desialylerte humane mo-DCer lastet med hele tumorantigener induserte spesifikke T-celleresponser. Mo-DCs ble behandlet med sialidase i 1 time ved 37 ° C eller venstre ubehandlet, etterfulgt av belastning med MCF-7 lysater (TL) som en kilde til hele tumorcelleantigener. Samkultur mellom mo-DC og autologe T-celler ble utført i 4-8 dager i nærvær av IL-2 (10 U/ml). T-celler primet med desialylerte mo-DCs viste signifikant høyere sekresjon av Th1-cytokinet, IFN-γ. Etter T-cellestimulering med mo-DC ble cytokinene som ble utskilt i kokultursupernatantene målt med ELISA (n = 7). Grafverdiene representerer konsentrasjonen (pg/ml) (gjennomsnitt ± SEM). Statistisk signifikante forskjeller ble beregnet med t-test (*P < 0,05). Figuren er modifisert fra Silva et al.30. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Manglende innvirkning av sialidasebehandling på levedyktigheten til humane mo-DCs. Ubehandlede mo-DCs (venstre panel) og sialidase-behandlede mo-DCs (høyre panel) ble utsatt for dobbeltfarging med anneksin V og 7-AAD, og fargingen ble analysert med flowcytometri. Dataene viste ingen signifikant forskjell i cellelevedyktighet mellom de ubehandlede og sialidasebehandlede cellene, noe som tyder på at mo-DCs kan tolerere sialidasebehandling og forbli levedyktige for å utøve sin immunologiske funksjon. Figuren er modifisert fra Silva et al.30. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Isolering av monocytter
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å generere mo-DCs fra human-isolerte monocytter CD14+ (figur 1A), etterfulgt av å utføre en sialidasebehandling for å redusere sialinsyreinnholdet på overflaten av disse cellene.

Det er forskjellige måter å skaffe humane DCer på, for eksempel direkte fra perifert blod eller vev eller gjennom differensiering fra forløpere som stamceller eller monocytter. Å skaffe DCs differensiert fra monocytter isolert fra perifert blod er langt enklere på grunn av det enkle å oppnå høye mengder monocytter sammenlignet med andre DC-kilder41. Likevel, for å oppnå en høy prosentandel av isolerte monocytter, må alle protokolltrinnene følges nøye. For eksempel kan tetthetsgradientmediet være giftig for cellene, og for å forhindre celledød må man unngå langvarig cellekontakt med tetthetsgradientmediet og vaske cellene grundig. Cellemanipulering må gjøres så raskt som mulig for å unngå tap av celle levedyktighet. Fra PBMC kan monocytter isoleres gjennom positiv seleksjon ved hjelp av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) -metoden, som er en egnet teknologi for å gi et høyt antall monocytter. I tillegg, sammenlignet med andre monocytseleksjonsmetoder, har mo-DCs avledet fra MACS-isolerte monocytter en større evne til å stimulere antitumor-T-celleaktivitet42. I denne protokollen, når de var isolert, ble monocyttene inkubert med IL-4 og GM-CSF i en periode på 5-6 dager for å oppnå differensiering i umodne mo-DCs (figur 1). Resultatene viste at morfologisk (figur 1A) og fenotypisk (figur 1B) differensierte de isolerte monocyttene i umodne mo-DCer. Videre, gjennom differensieringen, mistet mo-DCene uttrykket av CD14-markører og fikk uttrykket av CD1a og MHC-II (figur 1B), som kreves for antigenpresentasjon til T-celler.

Denne isoleringen og differensieringen av monocytter i mo-DC er begrensninger for denne protokollen. Isolasjonsprosessen er et følsomt trinn som må utføres nøye og raskt for å unngå celledød, og dette trinnet må også gjøres hver gang mo-DCs er nødvendig for et nytt eksperiment. Differensieringsprosessen tar 5-6 dager, noe som gjør det vanskelig å bruke denne metoden for høykapasitetsanalyser. Ikke desto mindre er isolasjonsmetoden og bruk av cytokiner for å skille mo-DCer nyttige for å generere et høyt antall funksjonelle mo-DCer in vitro for eksperimenteringsformål. Mo-DC-ene som genereres i denne protokollen er i stand til å gjennomgå sialidasebehandling, flowcytometri, ELISA, konfokalmikroskopi og så videre, og understreker dermed viktigheten og nytten av denne metoden30.

Umodne mo-DCs og sialidase behandling
Sialidaser er essensielle i sialyleringsregulering og er ansvarlige for å fjerne sialinsyrer fra celleoverflateglykaner. I mo-DCs fører sialinsyrefjerning av sialidase til modning av disse cellene, noe som øker antigen-krysspresentasjon og påfølgende T-celleaktivering og antitumoraktivitet30.

Umodne humane mo-DCer viser et høyt innhold av celleoverflate α(2,6)- og α(2,3)-koblede sialinsyrer27 sammenlignet med modne mo-DCs 31,43. Videre forbedrer fjerning av sialinsyrer ved behandling av mo-DCs med sialidase modningen av DCs 28,30,31. Silidasen som ble valgt for dette eksperimentet var fra bakterien Clostridium perfringens. Likevel produserer andre organismer også sialidaser, som bakteriene Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae eller Salmonella typhimurium44, igle Macrobdella decora45, og til og med Homo sapiens46, og sialidaser fra disse organismene brukes også eksperimentelt. Imidlertid har hver sialidase forskjellige substratspesifisiteter. I tillegg kan bruk av sialidase-enzymet ha sine begrensninger; for eksempel kan manipulering av mo-DCs under behandlingen ytterligere stimulere disse cellene. Videre må mengden sialidase og inkubasjonstidene optimaliseres basert på typen celler som brukes og deres sialinsyresammensetning. Fjerningen av sialinsyre er ikke en permanent effekt, men snarere et forbigående fenomen, fordi cellen vil gjenopprette innholdet av sialinsyre på celleoverflaten. Foruten sialidase finnes det andre metoder for å redusere sialinsyremolekylene på overflaten av celler, for eksempel ved bruk av sialyltransferasehemmere, genutslag av sialyltransferasegener eller metabolsk blokkering av sialinsyre ved bruk av sialinsyremimetika47,48,49. Ikke desto mindre kan disse metodene presentere forskjellige effekter på celler, og i tillegg til desialylering må cellens levedyktighet vurderes. Sialidase-enzymbehandlingen er en praktisk metode for effektivt og forbigående fjerning av celleoverflate sialinsyrer samtidig som cellens levedyktighet opprettholdes.

I dette arbeidet ble sialidase tilsatt de umodne mo-DCene i konsentrasjonen 500 mE/5 x 106 celler/ml, og cellene ble inkubert ved 37 °C i 60 minutter. Behandlingen ble utført ved bruk av RPMI-1640 uten serum for å bevare cellens levedyktighet og unngå interaksjon mellom de sialylerte molekylene som er tilstede i serum30. Sialidasebehandling kan utføres med andre buffere i tillegg til RPMI, for eksempel 50 mM natriumacetat, pH 5,1 (i tilfelle av C. perfingens sialidase) eller PBS50,51,52. Ikke desto mindre er RPMI-1640 det vanligste kulturmediet for DC-er, da det opprettholder konstante eksperimentelle forhold under prosedyren, unngår å indusere modning og reduserer stress som kan være forårsaket av sialidasebuffere eller PBS53,54,55,56. Etter inkubering med sialidase er det viktig å vaske cellene grundig med et serumsupplert medium for å garantere at enzymreaksjonen har stoppet. Tilstedeværelsen av sialylerte molekyler i serum vil konkurrere som substrater for sialidase, og dermed sikre en rask reaksjonsstopp.

Overflatemarkørkarakterisering ved flowcytometri og konfokalmikroskopi
For bestemmelse av sialinsyreprofilen, i protokolldel 3, benyttet vi lektinfarging etterfulgt av flowcytometri og konfokal laserskanningsmikroskopi. For cellefargingsprosedyren ble lektinkonsentrasjonene og inkubasjonsbetingelsene i begge tilfeller optimalisert for å unngå celleagglutinering og død. Det er kritisk å utføre inkubasjonen ved 4 °C i buffere som inneholder minst 2 % av enten FBS eller BSA for å unngå uspesifikk binding av lektinene. I denne protokollen ble RPMI-1640 som inneholdt 10% FBS brukt til å opprettholde konstante eksperimentelle forhold og unngå cellestress. Når det gjelder konfokal mikroskopi, er fiksering av cellene før farging viktig for å bevare morfologien, forhindre autolyse og opprettholde antigenisitet.

Analysen av mo-DC-fenotypen ved flowcytometri viste at sialidasebehandlede mo-DCs hadde en signifikant høyere mengde PNA-lektin bundet til celleoverflaten sammenlignet med MMA- og SNA-lektiner, som avtok etter sialidasebehandlingen (figur 2A). Som forventet økte PNA-fargingen, siden PNA gjenkjenner ikke-sialylerte antigener, i motsetning til MAA og SNA, som binder seg direkte til henholdsvis α2,3- og α2,6-sialinsyrer30. Denne fargingen bekrefter effektiv fjerning av sialinsyrer fra celleoverflaten ved hjelp av denne protokollen. En annen metode som kan brukes til å validere behandlingen og analysere innholdet av sialinsyre på celleoverflaten er lektinfarging etterfulgt av konfokalmikroskopi, som eksemplifisert i figur 2B.

Foruten de tidligere eksemplene, finnes det alternative tilnærminger for å evaluere og karakterisere sialinsyreinnhold, for eksempel lektinprobing ved vestlig blotting. Alternative sialinsyrespesifikke lektiner er også tilgjengelige, for eksempel Siglecs, en gruppe lektiner som har en tydelig preferanse for sialinsyretyper og koblinger57. Foruten å bruke lektiner i begge teknikkene (flowcytometri, mikroskopi eller western blot), er det også mulig å karakterisere sialinsyreinnholdet ved hjelp av antistoffer; For eksempel kan α2,8-sialinsyrer vurderes av antistoffer som klon 735, som er spesifikk for polysialsyre58. I tillegg, etter sialidasebehandling, kan celler funksjonelt testes for deres biologiske eller terapeutiske effektivitet ved å evaluere deres fenotype og evne til å aktivere T-celler40. Faktisk, som vist i eksemplene som ble gitt, viste sialidase-behandlede mo-DCs høyere modningsfenotype, samt et forhøyet uttrykk for antigenpresenterende og co-stimulerende molekyler.

Videre kan sialidase-behandlede mo-DCs lastes med antigener og co-kultureres med T-celler eller andre celler, og kan deretter studeres angående fenotype, cytokinsekresjonsprofil eller andre funksjoner. I eksemplet som er oppgitt, viser dataene at sialidase-behandlede mo-DCs kan lastes med tumorantigener og deretter brukes til å aktivere T-celler. Faktisk viste de resulterende T-cellene økt IFN-γ-sekresjon, noe som er i samsvar med tidligere rapporter om effekten av sialinsyremangel på å øke kapasiteten til mo-DCs for å aktivere T-celler 27,28,29,30,31.

Avslutningsvis viser denne protokollen en gjennomførbar, levedyktig og praktisk metode for å generere mo-DCs for manipulering av sialinsyreinnhold ved behandling med sialidase. Denne protokollen presenterer en metodikk som kan tjene forskjellige formål og applikasjoner. Denne metoden kan ikke bare ha en avgjørende rolle i å forstå rollen som sialinsyrer i modning og respons av immunceller, men kan også brukes som et immunmodulerende verktøy.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner finansiering fra EU-kommisjonen GLYCOTwinning GA 101079417 og EJPRD/0001/2020 EU 825575; Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, under tilskudd FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO), og LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. og Stemmatters ble også finansiert av Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), gjennom Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) for SI I& DT DCMatters prosjekt (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Vi anerkjenner Biolabs anlegg ved FCT-NOVA og GLYCOVID NOVA Saude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tube AstiK’s CTGP-E15-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
24-well plate Greiner Bio-one 662 160 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
50 mL conical tube AstiK’s CTGP-E50-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) BioLegend 420404 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Annexin V Immunotools 31490013 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific  Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
BSA Sigma - Aldrich A3294-100G Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile
CD14 (Monoclonal TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
CD80 Immunotools 21270803 Maturation Profiling of mo-DCs
CD86 Immunotools 21480863 Maturation Profiling of mo-DCs
Cell counting slides and trypan blue EVE EVS-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Centrifuge Eppendorf 5430 R Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Density gradient medium (Histopaque) Sigma - Aldrich 10771-100ML Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
EDTA Gibco, ThermoFisher 15400054 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Elisa kit (IFN-γ) Immunotools 31673539 Maturation Profiling of mo-DCs
EVE automated cell count NanoEntek 10027-452 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500064 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Miltenyi Biotec   130-093-864 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) Miltenyi Biotec 130-050-201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-1β Sigma - Aldrich I9401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-4 Miltenyi Biotec 130-093-919 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-6 Sigma - Aldrich SRP3096 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
L-glutamine Gibco A2916801 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
LS column and plunger Miltenyi Biotec 130-042-401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin - Biotinylated) Vector labs B-1265-1 Determination of Sialic Acid Profile
MHC-I (HLA-ABC) Immunotools 21159033 Maturation Profiling of mo-DCs
MHC-II (HLA-DR) Immunostep HLADRA-100T Maturation Profiling of mo-DCs
Microtubes AstiK’s PCRP-E015-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Neuraminidase (Sialidase) Roche 11585886001 Treatment of Cells with Sialidase
Non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Paraformaldehyde (PFA 2%) Polysciences Europe 25085-1 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Paraformaldehyde (PFA 4%) Biotium 22023 Determination of Sialic Acid Profile
Pasteur pipettes Labbox PIPP-003-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin - FITC) Vector labs FL-1071 Determination of Sialic Acid Profile
Penicillin/streptomycin Gibco 15140163 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) NZYTech   MB18201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Prostaglandin E2 (PGE2) Sigma - Aldrich P0409 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RBC lysis buffer BioLegend 420302 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) Gibco 31870074 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - Biotinylated) Vector labs   B-1305-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - FITC) Vector labs FL-1301-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sodium pyruvate Thermofisher 11360-070 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
SpectroMax190 Molecular Devices Maturation Profiling of mo-DCs
Streptavidin-PE BioLegend   405203 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Tetramethylbenzidine (TMB) Sigma - Aldrich T0440 Maturation Profiling of mo-DCs
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) Sigma - Aldrich H8916 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Zeiss LSM710 confocal microscope Zeiss Determination of Sialic Acid Profile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varki, A., Gagneux, P. Multifarious roles of sialic acids in immunity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1253, 16-36 (2012).
  2. Bochner, B. S., Zimmermann, N. Role of Siglecs and related glycan-binding proteins in immune responses and immunoregulation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 598-608 (2015).
  3. Smith, B. A. H., Bertozzi, C. R. The clinical impact of glycobiology: Targeting selectins, Siglecs and mammalian glycans. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 217-243 (2021).
  4. Schauer, R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current Opinion in Structural Biology. 19 (5), 507-514 (2009).
  5. Manhardt, C. T., Punch, P. R., Dougher, C. W. L., Lau, J. T. Y. Extrinsic sialylation is dynamically regulated by systemic triggers in vivo. Journal of Biological Chemistry. 292 (33), 13514-13520 (2017).
  6. Cabral, M. G., et al. Human dendritic cells contain cell surface sialyltransferase activity. Immunology Letters. 131 (1), 89-96 (2010).
  7. Bordron, A., et al. Hyposialylation must be considered to develop future therapies in autoimmune diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3402 (2021).
  8. Julien, S., Videira, P. A., Delannoy, P. Sialyl-Tn in cancer: (How) did we miss the target. Biomolecules. 2 (4), 435-466 (2012).
  9. Munkley, J. Aberrant sialylation in cancer: Therapeutic opportunities. Cancers. 14 (17), 4248 (2022).
  10. Dennis, J. W., Laferte, S., Waghorne, C., Breitman, M. L., Kerbel, R. S. S1-6 Branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science. 236 (4801), 582-585 (1987).
  11. Pinho, S. S., Reis, C. A. Glycosylation in cancer: Mechanisms and clinical implications. Nature Reviews Cancer. 15 (9), 540-555 (2015).
  12. Manni, M., Läubli, H. Targeting glyco-immune checkpoints for cancer therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 21 (8), 1063-1071 (2021).
  13. Sjögren, J., Lood, R., Nägeli, A. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; Unique tools with broad applications. Glycobiology. 30 (4), 254-267 (2020).
  14. Trastoy, B., et al. Sculpting therapeutic monoclonal antibody N-glycans using endoglycosidases. Current Opinion in Structural Biology. 72, 248-259 (2022).
  15. Pascoal, C., et al. Sialyl LewisX/A and cytokeratin crosstalk in triple negative breast cancer. Cancers. 15 (3), 731 (2023).
  16. von Itzstein, M., et al. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication. Nature. 363 (6428), 418-423 (1993).
  17. Gray, M. A., et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nature Chemical Biology. 16 (12), 1376-1384 (2020).
  18. Fernandes, Â, et al. Glycans as shapers of tumour microenvironment: A sweet driver of T-cell-mediated anti-tumour immune response. Immunology. 168 (2), 217-232 (2023).
  19. Togayachi, A., et al. Polylactosamine on glycoproteins influences basal levels of lymphocyte and macrophage activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15829-15834 (2007).
  20. Park, D. D. Resident and elicited murine macrophages differ in expression of their glycomes and glycan-binding proteins. Cell Chemical Biology. 28 (4), 567-582 (2021).
  21. Steinman, R. M. Dendritic cells and immune-based therapies. Experimental Hematology. 24 (8), 859-862 (1996).
  22. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2 (1), 37-56 (2010).
  23. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  24. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  25. So-Rosillo, R., Small, E. J. Sipuleucel-T (APC8015) for prostate cancer. Expert Review of Anticancer Therapy. 6 (9), 1163-1167 (2006).
  26. Cheever, M. A., Higano, C. S. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: The first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clinical Cancer Research. 17 (11), 3520-3526 (2011).
  27. Videira, P. A., et al. Surface α2-3- and α2-6-sialylation of human monocytes and derived dendritic cells and its influence on endocytosis. Glycoconjugate Journal. 25 (3), 259-268 (2008).
  28. Cabral, M. G., et al. The phagocytic capacity and immunological potency of human dendritic cells is improved by α2,6-sialic acid deficiency. Immunology. 138 (3), 235-245 (2013).
  29. Silva, Z., et al. MHC class I stability is modulated by cell surface sialylation in human dendritic cells. Pharmaceutics. 12 (3), 249 (2020).
  30. Silva, M., et al. Sialic acid removal from dendritic cells improves antigen cross-presentation and boosts anti-tumor immune responses. Oncotarget. 7 (27), 41053-41066 (2016).
  31. Crespo, H. J., et al. Effect of sialic acid loss on dendritic cell maturation. Immunology. 128, 621-631 (2009).
  32. Council of Europe. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Council of Europe. , Strasbourg, France. (2017).
  33. LS Columns. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/Is-columns.html#130-042-401 (2012).
  34. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 07, Unit 7.32 (2012).
  35. Wu, X., Xu, F., Liu, J., Wang, G. Comparative study of dendritic cells matured by using IL-1β, IL-6, TNF-α and prostaglandins E2 for different time span. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (2), 1389-1394 (2017).
  36. Naeim, F., Nagesh Rao, P., Song, S., Phan, R. Chapter 2 - Principles of Immunophenotyping. Atlas of Hematopathology. , Academic Press. Cambridge, MA. 29-56 (2018).
  37. Cernadas, M., Lu, J., Watts, G., Brenner, M. B. CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells. Clinical and Experimental Immunology. 155, 523-533 (2009).
  38. Santambrogio, L., Strominger, J. L. The ins and outs of MHC class II proteins in dendritic cells. Immunity. 25 (6), 857-859 (2006).
  39. Raposo, C. D., Canelas, A. B., Barros, M. T. Human lectins, their carbohydrate affinities and where to find them. Biomolecules. 11 (2), 188 (2021).
  40. Videira, P. A. Q., et al. Patent WO2017002045. A viable cell population, method for production and uses thereof. Portugal patent. , Universidade NOVA de Lisboa. Lisbon, Portugal. (2017).
  41. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. International Journal of Oncology. 20 (2), 247-253 (2002).
  42. Marques, G. S., Silva, Z., Videira, P. A. Antitumor efficacy of human monocyte-derived dendritic cells: Comparing effects of two monocyte isolation methods. Biological Procedures Online. 20, 4 (2018).
  43. Bax, M., et al. Dendritic cell maturation results in pronounced changes in glycan expression affecting recognition by Siglecs and galectins. Journal of Immunology. 179 (12), 8216-8224 (2007).
  44. Chinoy, Z. S., Montembault, E., Moremen, K. W., Royou, A., Friscourt, F. Impacting bacterial sialidase activity by incorporating bioorthogonal chemical reporters onto mammalian cell-surface sialosides. ACS Chemical Biology. 16 (11), 2307-2314 (2021).
  45. Chou, M. -Y., Li, S. -C., Li, Y. -T. Cloning and expression of sialidase L, a NeuAcα2→3Gal-specific sialidase from the leech, Macrobdella decora. Journal of Biological Chemistry. 271 (32), 19219-19224 (1996).
  46. Crespo, H. J., Lau, J. T. Y., Videira, P. A. Dendritic cells: A spot on sialic acid. Frontiers in Immunology. 4, 491 (2013).
  47. Büll, C. Metabolic sialic acid blockade lowers the activation threshold of moDCs for TLR stimulation. Immunology & Cell Biology. 95 (4), 408-415 (2017).
  48. Ohmi, Y., et al. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O -glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology. 31 (5), 557-570 (2021).
  49. Chung, C., et al. Integrated genome and protein editing swaps α-2,6 sialylation for α-2,3 sialic acid on recombinant antibodies from CHO. Biotechnology Journal. 12 (2), 1600502 (2017).
  50. Hyvärinen, S., Meri, S., Jokiranta, T. S. Disturbed sialic acid recognition on endothelial cells and platelets in complement attack causes atypical hemolytic uremic syndrome. Blood. 127 (22), 2701-2710 (2016).
  51. Powell, L. D., Whiteheart, S. W., Hart, G. W. Cell surface sialic acid influences tumor cell recognition in the mixed lymphocyte reaction. Journal of Immunology. 139, 262-270 (1987).
  52. Corfield, A. P., Higa, H., Paulson, J. C., Schauer, R. The specificity of viral and bacterial sialidases for α(2-3)- and α(2-6)-linked sialic acids in glycoproteins. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 744 (2), 121-126 (1983).
  53. Tkachenko, N., Wojas, K., Tabarkiewicz, J., Rolinski, J. Generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes - Comparison of different culture media. Folia Histochemica et Cytobiologica. 43, 25-30 (2005).
  54. Kim, S. J., et al. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes. Cytotherapy. 21 (10), 1049-1063 (2019).
  55. Calmeiro, J., et al. In-depth analysis of the impact of different serum-free media on the production of clinical grade dendritic cells for cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 11, 593363 (2021).
  56. Stamatos, N. M., et al. LPS-induced cytokine production in human dendritic cells is regulated by sialidase activity. Journal of Leukocyte Biology. 88 (6), 1227-1239 (2010).
  57. Lehmann, F., Tiralongo, E., Tiralongo, J. Sialic acid-specific lectins: Occurrence, specificity and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1331-1354 (2006).
  58. Frosch, M., Görgen, I., Boulnois, G. J., Timmis, K. N., Bitter-Suermann, D. NZB mouse system for production of monoclonal antibodies to weak bacterial antigens: Isolation of an IgG antibody to the polysaccharide capsules of Escherichia coli K1 and group B meningococci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (4), 1194-1198 (1985).

Tags

Dendrittiske monocyttceller sialylerte fenotyper sialinsyrer immunresponsmodulering immunovervåkning glykoimmune sjekkpunkter immunterapier dendrittiske celler (DC) antigenpresenterende celler (APC) modning av DC sialinsyreinnhold T-celleaktivering
Generering av monocyttavlederiverte dendrittiske celler med forskjellige sialylerte fenotyper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral,… More

Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral, P., Tanwar, A., Paterson, R. L., Videira, P. A. Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes. J. Vis. Exp. (200), e65525, doi:10.3791/65525 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter