En unik, omfattende protokoll for å generere de-sialylerte humane monocytavledede dendrittiske celler (mo-DCs) fra isolerte mononukleære celler i perifert blod (PBMC) ved bruk av en sialidasebehandling presenteres. Videre beskrives metoder for å vurdere fenotypisk og funksjonell karakterisering av mo-DCs og evaluere hvordan sialidasebehandling forbedrer modningsnivået til mo-DCs.
Sialinsyrer er negativt ladede monosakkarider som vanligvis finnes i enden av celleoverflateglykaner. På grunn av deres hydrofilitet og biofysiske egenskaper er de involvert i en rekke biologiske prosesser, for eksempel modulering av immunresponsen, anerkjennelse av selv- og ikke-selvantigener, karbohydrat-protein-interaksjoner, etc. Det cellulære innholdet av sialinsyre reguleres av sialidase, som katalyserer fjerning av sialinsyrerester. Flere studier har vist at sialo-glykaner er kritiske for å overvåke immunovervåking ved å engasjere seg med cis og transhemmende Siglec-reseptorer på immunceller. På samme måte blir glykoimmunkontrollpunkter i kreft viktige mål for å utvikle immunterapier. I tillegg er dendrittiske celler (DC) tenkt som en viktig komponent i immunterapier, spesielt i kreftforskning, på grunn av deres unike rolle som profesjonelle antigenpresenterende celler (APC) og deres evne til å utløse adaptive immunresponser og generere immunologisk minne. Likevel er DCs funksjon avhengig av full modning. Umodne DC-er har en motsatt funksjon til modne DC-er og et høyt sialinsyreinnhold, noe som ytterligere demper modningsnivået. Dette nedregulerer evnen til umodne DCs til å aktivere T-celler, noe som fører til en kompromittert immunrespons. Følgelig induserer fjerning av sialinsyre fra celleoverflaten til humane DCs deres modning, og øker dermed ekspresjonen av MHC-molekyler og antigenpresentasjon. I tillegg kan det gjenopprette ekspresjonen av co-stimulerende molekyler og IL-12, noe som resulterer i at DCs har en høyere evne til å polarisere T-celler mot en Th1-fenotype og spesifikt aktivere cytotoksiske T-celler for å drepe tumorceller. Derfor har sialinsyre dukket opp som en nøkkelmodulator for DCs og blir brukt som et nytt mål for å fremme terapeutisk bruk. Denne studien gir en unik tilnærming til behandling av in vitro monocyttavledede DCs med sialidase, med sikte på å generere DC-populasjoner med forskjellige celleoverflate sialinsyrefenotyper og skreddersydde modnings- og kostimulerende profiler.
Sialinsyrebærende glykaner (sialoglykaner) har fått betydelig interesse på grunn av deres immunmodulerende rolle. Monosakkarid sialinsyre, som er mest utbredt hos mennesker i form av N-acetylneuraminsyre, presenterer grunnleggende ligander for lektiner med en anerkjent rolle i immunologi, som Selectins og Siglecs. Disse lektinene gjenkjenner sialoglykaner enten på samme celle (cis) eller på forskjellige celler (trans) og spiller en betydelig rolle i vertspatogen-interaksjoner og ulike fysiologiske og patologiske cellulære aktiviteter 1,2,3. Videre, siden sialinsyre opptar terminalposisjonene til celleoverflateglykokonjugater, kan den skjule de underliggende strukturene, og dermed hemme celle-til-celle-kontakt via ikke-spesifikke frastøtende effekter eller ved å hindre deteksjon av andre lektiner4. Aktiviteten til en rekke sialyltransferaser (som overfører sialinsyrer) og sialidaser (som spalter sialinsyrebindinger) i cellen bestemmer mengden sialinsyre tilstede på overflaten. I tillegg kan løselige sialyltransferaser og sialidaser uttrykt av verten eller patogener ekstrinsisk modifisere mengden sialinsyre på celleoverflaten 5,6.
Avvikende sialylering er en funksjon av flere patologiske forhold. Ved autoimmune sykdommer kan hyposialylering bidra til uhemmet immunaktivering og organskade, siden sialinsyre bidrar til å diskriminere selvantigener og regulere inflammatoriske responser7. Omvendt resulterer hypersialylering i overekspresjon av sialoglykaner, som sialyl-Tn, sialyl-Lewis-antigener, polysialsyre og gangliosider, som utgjør et kjennetegn for noen kreftformer 8,9. Hypersialylering avhenger også av økt ekspresjon av spesifikke enzymer som N-acetylglukosaminyltransferase (GNT-V), som genererer hypersialylerte tri- og/eller tetraantenner N-bundne glykaner, som har vært assosiert med kreftvekst og metastase10. Sialinsyreinnholdet regulerer også proteinets stabilitet og funksjon, noe som er nøkkelen for rollen til relevante onkogene spillere11. Derfor kan økt sialylering lette tumorutvikling, metastase, stoffresistens og immununnvikelse. Videre gjør oppregulering av sialoglykaner det mulig for svulster å interagere med hemmende Siglec-reseptorer på immunceller og unngå immunovervåking. Av den grunn anses sialoglykaner nå for å være glykoimmune sjekkpunkter og attraktive terapeutiske mål. For eksempel er hemmere av Siglec-immunaksen allerede i tidlige kliniske studier, siden immuncellereseptoren Siglec (sialsyrebindende immunoglobulinlignende LECtin) spiller en immunhemmende rolle12.
Enzymer har blitt brukt til å modulere glykanprofilen som verktøy for studier eller for terapeutiske strategier13,14. Sialidase har blitt brukt til å endre kreftcelle malignitet siden sialylerte glykaner som sialyl Lewis X er kritiske for cellemigrasjon og kreftmetastase15. Samtidig har sialidasehemmere, som hindrer sialinsyrespaltning, nådd klinikker for behandling av sialinsyreavhengige virusinfeksjoner16. Nylig har sialinsyremodulasjon fått ytterligere interesse på grunn av den kritiske rollen som sialinsyrer som ligander i Siglec-immunaksen, noe som betyr at de tilbyr nye midler for å redusere kreftflukt fra immunresponser. Denne interessen ble ytterligere styrket av nobelprisvinneren Bertozzi 2022 og hennes teams bidrag til flere strategier som selektivt spalter ulike sialoglykaner og forbedrer immunresponser mot kreft17. Dermed representerer sialidase-baserte strategier en lovende modalitet for glykoimmunkontrollpunktbehandling. Glykofenotypen av celler i immunsystemet er avhengig av typen celle og deres aktiveringsstatus. Når det gjelder T-celler, har glykaner en nøkkelrolle i de patofysiologiske trinnene for T-celleutvikling og tymocyttvalg, T-celleaktivitet, differensiering og spredning18. For eksempel påvirker polylaktosamin på glykoproteiner basale nivåer av B-lymfocytter og T-lymfocytter og makrofagaktivering19. I makrofager har distinkte glykanuttrykksmønstre en viktig rolle i makrofagrekruttering til tumormikromiljøet (TME)20. Derfor kan uttrykket av O-bundne og N-koblede glykaner av immunceller brukes som potensielle glykobiomarkører for terapeutiske tilnærminger i behandlingen av kreft og autoimmune sykdommer.
Dendrittiske celler (DC) er spesifikke antigenpresenterende celler med en unik kapasitet til å utløse immunresponser, for eksempel anti-kreftimmunitet21. DCs må gjennomgå en oppregulering av deres antigenpresenterende MHC-molekyler for å presentere antigener til T-celler (signal 1), co-stimulerende molekyler for å aktivere T-celler (signal 2) og proinflammatoriske cytokiner, slik som IL-12, for å utløse type 1 hjelper T-celleproliferasjon (signal 3) 22. Den resulterende immunprofilen er strengt regulert, og sjekkpunkter er avgjørende for å forhindre at friske celler blir angrepet. Siden DCs kan stimulere ulike immunresponser mot tumorceller, brukes de som cellebaserte vaksiner, og et betydelig antall kliniske studier har vist sine potensielle fordeler23,24. Etter at FDA godkjente den første DC-baserte vaksinen i 201025,26, har mange andre DC-baserte vaksiner blitt utviklet. DC-baserte vaksiner produseres hovedsakelig ex vivo og administreres til pasienter for å fremkalle immunresponser mot svulster. Imidlertid er utilstrekkelig eller kortvarig modning for tiden en av faktorene som begrenser den kliniske effekten av DCs og betyr at dyre cytokincocktailer må brukes. Uten tilstrekkelig modning kan DCs ikke aktivere T-celler under kliniske omstendigheter. I stedet uttrykker DC-ene immunkontrollpunkter og utløser en tolerogen immunrespons som forhindrer cytotoksiske T-celler i å virke mot tumorceller.
Humane DCs har tungt sialylerte overflater, og denne sialyleringen avtar ved modning og under en total immunrespons27. Modningen av DCs kan induseres ved å eliminere disse sialinsyrene med sialidase. Desialylering oppregulerer i stor grad forskjellige cytokiner, inkludert IL-12, på grunn av translokasjonen av NF-kB-transkripsjonsfaktoren til kjernen 6,28. I tillegg forbedrer desialylering antigen krysspresentasjon gjennom MHC-I og anti-tumor immunresponser29,30. Følgelig genererer knockouten av sialyltransferasene ST3Gal.l og ST6Gal.l, som har en viktig rolle i DC-sialylering, en mer moden fenotype i murine DCs31.
Sialidasebehandling gir en metode for å stimulere alle aspekter av DC-modning, inkludert økt antigenpresentasjon, økt ekspresjon av kostimulerende molekyler og økt cytokinproduksjon, for å løse manglene nevnt ovenfor og gjøre det mulig for DCs å fremkalle effektive responser. Denne artikkelen presenterer en prosedyre for å oppnå levedyktige desialylerte humane DCs ved bruk av en bakteriell sialidase. De-sialylerte DCs viser en forbedret modningsprofil og kan brukes som cellemodeller for å øke antitumorimmunresponser in vitro. DC-ene oppnås fra blodmonocytter, som deretter differensieres in vitro i nærvær av cytokininterleukin-4 (IL-4) og granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF). Dette arbeidet beskriver også lektinbaserte metoder for å analysere sialinsyre på celleoverflaten og metoder for å immunfenotype DC-modningsnivået. Prosedyren beskrevet her kan brukes til å desialylate andre celletyper, og dermed gi en tilnærming til å undersøke rollen til sialoglykaner, som er viktige glykoimmunkontrollpunkter og relevante for immunmodulering.
Isolering av monocytter
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å generere mo-DCs fra human-isolerte monocytter CD14+ (figur 1A), etterfulgt av å utføre en sialidasebehandling for å redusere sialinsyreinnholdet på overflaten av disse cellene.
Det er forskjellige måter å skaffe humane DCer på, for eksempel direkte fra perifert blod eller vev eller gjennom differensiering fra forløpere som stamceller eller monocytter. Å skaffe DCs differensiert fra monocytter isolert fra perifert blod er langt enklere på grunn av det enkle å oppnå høye mengder monocytter sammenlignet med andre DC-kilder41. Likevel, for å oppnå en høy prosentandel av isolerte monocytter, må alle protokolltrinnene følges nøye. For eksempel kan tetthetsgradientmediet være giftig for cellene, og for å forhindre celledød må man unngå langvarig cellekontakt med tetthetsgradientmediet og vaske cellene grundig. Cellemanipulering må gjøres så raskt som mulig for å unngå tap av celle levedyktighet. Fra PBMC kan monocytter isoleres gjennom positiv seleksjon ved hjelp av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) -metoden, som er en egnet teknologi for å gi et høyt antall monocytter. I tillegg, sammenlignet med andre monocytseleksjonsmetoder, har mo-DCs avledet fra MACS-isolerte monocytter en større evne til å stimulere antitumor-T-celleaktivitet42. I denne protokollen, når de var isolert, ble monocyttene inkubert med IL-4 og GM-CSF i en periode på 5-6 dager for å oppnå differensiering i umodne mo-DCs (figur 1). Resultatene viste at morfologisk (figur 1A) og fenotypisk (figur 1B) differensierte de isolerte monocyttene i umodne mo-DCer. Videre, gjennom differensieringen, mistet mo-DCene uttrykket av CD14-markører og fikk uttrykket av CD1a og MHC-II (figur 1B), som kreves for antigenpresentasjon til T-celler.
Denne isoleringen og differensieringen av monocytter i mo-DC er begrensninger for denne protokollen. Isolasjonsprosessen er et følsomt trinn som må utføres nøye og raskt for å unngå celledød, og dette trinnet må også gjøres hver gang mo-DCs er nødvendig for et nytt eksperiment. Differensieringsprosessen tar 5-6 dager, noe som gjør det vanskelig å bruke denne metoden for høykapasitetsanalyser. Ikke desto mindre er isolasjonsmetoden og bruk av cytokiner for å skille mo-DCer nyttige for å generere et høyt antall funksjonelle mo-DCer in vitro for eksperimenteringsformål. Mo-DC-ene som genereres i denne protokollen er i stand til å gjennomgå sialidasebehandling, flowcytometri, ELISA, konfokalmikroskopi og så videre, og understreker dermed viktigheten og nytten av denne metoden30.
Umodne mo-DCs og sialidase behandling
Sialidaser er essensielle i sialyleringsregulering og er ansvarlige for å fjerne sialinsyrer fra celleoverflateglykaner. I mo-DCs fører sialinsyrefjerning av sialidase til modning av disse cellene, noe som øker antigen-krysspresentasjon og påfølgende T-celleaktivering og antitumoraktivitet30.
Umodne humane mo-DCer viser et høyt innhold av celleoverflate α(2,6)- og α(2,3)-koblede sialinsyrer27 sammenlignet med modne mo-DCs 31,43. Videre forbedrer fjerning av sialinsyrer ved behandling av mo-DCs med sialidase modningen av DCs 28,30,31. Silidasen som ble valgt for dette eksperimentet var fra bakterien Clostridium perfringens. Likevel produserer andre organismer også sialidaser, som bakteriene Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae eller Salmonella typhimurium44, igle Macrobdella decora45, og til og med Homo sapiens46, og sialidaser fra disse organismene brukes også eksperimentelt. Imidlertid har hver sialidase forskjellige substratspesifisiteter. I tillegg kan bruk av sialidase-enzymet ha sine begrensninger; for eksempel kan manipulering av mo-DCs under behandlingen ytterligere stimulere disse cellene. Videre må mengden sialidase og inkubasjonstidene optimaliseres basert på typen celler som brukes og deres sialinsyresammensetning. Fjerningen av sialinsyre er ikke en permanent effekt, men snarere et forbigående fenomen, fordi cellen vil gjenopprette innholdet av sialinsyre på celleoverflaten. Foruten sialidase finnes det andre metoder for å redusere sialinsyremolekylene på overflaten av celler, for eksempel ved bruk av sialyltransferasehemmere, genutslag av sialyltransferasegener eller metabolsk blokkering av sialinsyre ved bruk av sialinsyremimetika47,48,49. Ikke desto mindre kan disse metodene presentere forskjellige effekter på celler, og i tillegg til desialylering må cellens levedyktighet vurderes. Sialidase-enzymbehandlingen er en praktisk metode for effektivt og forbigående fjerning av celleoverflate sialinsyrer samtidig som cellens levedyktighet opprettholdes.
I dette arbeidet ble sialidase tilsatt de umodne mo-DCene i konsentrasjonen 500 mE/5 x 106 celler/ml, og cellene ble inkubert ved 37 °C i 60 minutter. Behandlingen ble utført ved bruk av RPMI-1640 uten serum for å bevare cellens levedyktighet og unngå interaksjon mellom de sialylerte molekylene som er tilstede i serum30. Sialidasebehandling kan utføres med andre buffere i tillegg til RPMI, for eksempel 50 mM natriumacetat, pH 5,1 (i tilfelle av C. perfingens sialidase) eller PBS50,51,52. Ikke desto mindre er RPMI-1640 det vanligste kulturmediet for DC-er, da det opprettholder konstante eksperimentelle forhold under prosedyren, unngår å indusere modning og reduserer stress som kan være forårsaket av sialidasebuffere eller PBS53,54,55,56. Etter inkubering med sialidase er det viktig å vaske cellene grundig med et serumsupplert medium for å garantere at enzymreaksjonen har stoppet. Tilstedeværelsen av sialylerte molekyler i serum vil konkurrere som substrater for sialidase, og dermed sikre en rask reaksjonsstopp.
Overflatemarkørkarakterisering ved flowcytometri og konfokalmikroskopi
For bestemmelse av sialinsyreprofilen, i protokolldel 3, benyttet vi lektinfarging etterfulgt av flowcytometri og konfokal laserskanningsmikroskopi. For cellefargingsprosedyren ble lektinkonsentrasjonene og inkubasjonsbetingelsene i begge tilfeller optimalisert for å unngå celleagglutinering og død. Det er kritisk å utføre inkubasjonen ved 4 °C i buffere som inneholder minst 2 % av enten FBS eller BSA for å unngå uspesifikk binding av lektinene. I denne protokollen ble RPMI-1640 som inneholdt 10% FBS brukt til å opprettholde konstante eksperimentelle forhold og unngå cellestress. Når det gjelder konfokal mikroskopi, er fiksering av cellene før farging viktig for å bevare morfologien, forhindre autolyse og opprettholde antigenisitet.
Analysen av mo-DC-fenotypen ved flowcytometri viste at sialidasebehandlede mo-DCs hadde en signifikant høyere mengde PNA-lektin bundet til celleoverflaten sammenlignet med MMA- og SNA-lektiner, som avtok etter sialidasebehandlingen (figur 2A). Som forventet økte PNA-fargingen, siden PNA gjenkjenner ikke-sialylerte antigener, i motsetning til MAA og SNA, som binder seg direkte til henholdsvis α2,3- og α2,6-sialinsyrer30. Denne fargingen bekrefter effektiv fjerning av sialinsyrer fra celleoverflaten ved hjelp av denne protokollen. En annen metode som kan brukes til å validere behandlingen og analysere innholdet av sialinsyre på celleoverflaten er lektinfarging etterfulgt av konfokalmikroskopi, som eksemplifisert i figur 2B.
Foruten de tidligere eksemplene, finnes det alternative tilnærminger for å evaluere og karakterisere sialinsyreinnhold, for eksempel lektinprobing ved vestlig blotting. Alternative sialinsyrespesifikke lektiner er også tilgjengelige, for eksempel Siglecs, en gruppe lektiner som har en tydelig preferanse for sialinsyretyper og koblinger57. Foruten å bruke lektiner i begge teknikkene (flowcytometri, mikroskopi eller western blot), er det også mulig å karakterisere sialinsyreinnholdet ved hjelp av antistoffer; For eksempel kan α2,8-sialinsyrer vurderes av antistoffer som klon 735, som er spesifikk for polysialsyre58. I tillegg, etter sialidasebehandling, kan celler funksjonelt testes for deres biologiske eller terapeutiske effektivitet ved å evaluere deres fenotype og evne til å aktivere T-celler40. Faktisk, som vist i eksemplene som ble gitt, viste sialidase-behandlede mo-DCs høyere modningsfenotype, samt et forhøyet uttrykk for antigenpresenterende og co-stimulerende molekyler.
Videre kan sialidase-behandlede mo-DCs lastes med antigener og co-kultureres med T-celler eller andre celler, og kan deretter studeres angående fenotype, cytokinsekresjonsprofil eller andre funksjoner. I eksemplet som er oppgitt, viser dataene at sialidase-behandlede mo-DCs kan lastes med tumorantigener og deretter brukes til å aktivere T-celler. Faktisk viste de resulterende T-cellene økt IFN-γ-sekresjon, noe som er i samsvar med tidligere rapporter om effekten av sialinsyremangel på å øke kapasiteten til mo-DCs for å aktivere T-celler 27,28,29,30,31.
Avslutningsvis viser denne protokollen en gjennomførbar, levedyktig og praktisk metode for å generere mo-DCs for manipulering av sialinsyreinnhold ved behandling med sialidase. Denne protokollen presenterer en metodikk som kan tjene forskjellige formål og applikasjoner. Denne metoden kan ikke bare ha en avgjørende rolle i å forstå rollen som sialinsyrer i modning og respons av immunceller, men kan også brukes som et immunmodulerende verktøy.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner finansiering fra EU-kommisjonen GLYCOTwinning GA 101079417 og EJPRD/0001/2020 EU 825575; Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, under tilskudd FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO), og LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. og Stemmatters ble også finansiert av Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), gjennom Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) for SI I& DT DCMatters prosjekt (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Vi anerkjenner Biolabs anlegg ved FCT-NOVA og GLYCOVID NOVA Saude.
15 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E15-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
24-well plate | Greiner Bio-one | 662 160 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
50 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E50-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) | BioLegend | 420404 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Annexin V | Immunotools | 31490013 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs | |
BSA | Sigma – Aldrich | A3294-100G | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile |
CD14 (Monoclonal TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
CD80 | Immunotools | 21270803 | Maturation Profiling of mo-DCs |
CD86 | Immunotools | 21480863 | Maturation Profiling of mo-DCs |
Cell counting slides and trypan blue | EVE | EVS-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Density gradient medium (Histopaque) | Sigma – Aldrich | 10771-100ML | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
EDTA | Gibco, ThermoFisher | 15400054 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Elisa kit (IFN-γ) | Immunotools | 31673539 | Maturation Profiling of mo-DCs |
EVE automated cell count | NanoEntek | 10027-452 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500064 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-093-864 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-1β | Sigma – Aldrich | I9401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-4 | Miltenyi Biotec | 130-093-919 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-6 | Sigma – Aldrich | SRP3096 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
L-glutamine | Gibco | A2916801 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
LS column and plunger | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin – Biotinylated) | Vector labs | B-1265-1 | Determination of Sialic Acid Profile |
MHC-I (HLA-ABC) | Immunotools | 21159033 | Maturation Profiling of mo-DCs |
MHC-II (HLA-DR) | Immunostep | HLADRA-100T | Maturation Profiling of mo-DCs |
Microtubes | AstiK’s | PCRP-E015-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Neuraminidase (Sialidase) | Roche | 11585886001 | Treatment of Cells with Sialidase |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Paraformaldehyde (PFA 2%) | Polysciences Europe | 25085-1 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Paraformaldehyde (PFA 4%) | Biotium | 22023 | Determination of Sialic Acid Profile |
Pasteur pipettes | Labbox | PIPP-003-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin – FITC) | Vector labs | FL-1071 | Determination of Sialic Acid Profile |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140163 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | NZYTech | MB18201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Sigma – Aldrich | P0409 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
RBC lysis buffer | BioLegend | 420302 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) | Gibco | 31870074 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – Biotinylated) | Vector labs | B-1305-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – FITC) | Vector labs | FL-1301-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
Sodium pyruvate | Thermofisher | 11360-070 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
SpectroMax190 | Molecular Devices | Maturation Profiling of mo-DCs | |
Streptavidin-PE | BioLegend | 405203 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma – Aldrich | T0440 | Maturation Profiling of mo-DCs |
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) | Sigma – Aldrich | H8916 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Zeiss LSM710 confocal microscope | Zeiss | Determination of Sialic Acid Profile |