Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tuina-interventie in konijnenmodel van knieartrose

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65763
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1, 1, 3, 1, 3, 3
1Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 2Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 3Shandong University of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Het protocol beschrijft een methode voor Tuina-interventie in een konijnenmodel van knieartrose.

Abstract

Artrose van de knie (KOA) wordt voornamelijk gekenmerkt door degeneratieve veranderingen in het kraakbeen van het kniegewricht en de omliggende zachte weefsels. De werkzaamheid van Tuina bij de behandeling van KOA is bevestigd, maar het onderliggende mechanisme moet worden onderzocht. Deze studie heeft tot doel een wetenschappelijk haalbaar KOA-konijnenmodel op te stellen dat is behandeld met Tuina om de onderliggende mechanismen bloot te leggen. Hiervoor werden 18 mannelijke Nieuw-Zeelandse konijnen van 6 maanden oud willekeurig verdeeld in schijn-, model- en Tuina-groepen, met 6 konijnen in elke groep. Het KOA-model is tot stand gekomen door 4% papaïne-oplossing in de holte van het kniegewricht te injecteren. De Tuina-groep werd gedurende 4 weken geïntervenieerd met Tuina in combinatie met de kniegewricht-rotatiecorrectiemethode. Alleen het standaard grijpen en fixeren werd uitgevoerd in schijn- en modelgroepen. Aan het einde van de interventie van 1 week werd het bewegingsbereik (ROM) van het kniegewricht waargenomen en werd kraakbeen hematoxylin-eosine (HE) kleuring uitgevoerd. De studie toont aan dat Tuina de apoptose van chondrocyten kan remmen, kraakbeenweefsel kan herstellen en ROM van het kniegewricht kan herstellen. Concluderend toont deze studie de wetenschappelijke haalbaarheid aan van Tuina-behandeling voor KOA-modelkonijnen, waarbij de potentiële toepassing ervan in de studie van KOA en soortgelijke kniegewrichtgerelateerde aandoeningen wordt benadrukt.

Introduction

Artrose van de knie (KOA) is een degeneratieve ziekte van het kniegewricht, die zich voornamelijk manifesteert door kniepijn, zwelling, vervorming en bewegingsbeperking, met een hoog invaliditeitspercentage en een hogere prevalentie bij vrouwen, met 527,81 miljoen patiënten met artrose wereldwijd in 2019 en de wereldwijde prevalentie ervan is goed voor 60,6% van de totale wereldwijde prevalentie van artrose1. Klinisch wordt de behandeling van KOA meestal onderverdeeld in niet-chirurgische en chirurgische therapieën. Niet-chirurgische therapieën omvatten fysiotherapie, farmacotherapie en bloedplaatjesrijke plasma-injectietherapie 2,3. Tuina is een veelvoorkomende, veilige, betrouwbare en effectieve behandelmethode in de Chinese geneeskunde. Deze studie maakt gebruik van Tuina in combinatie met de roterende correctiemethode van het kniegewricht om KOA te behandelen. Tuina-technieken zoals de roterende kneed- en persmethode kunnen spierweefsel in evenwicht brengen, pijn verminderen, ontstekingsfactorniveaus aanpassen, het weefselmetabolisme verbeteren en gewrichtskraakbeendegeneratie remmen 4,5. De roterende correctiemethode van het kniegewricht kan de uitlijning van de botten en gewrichten van de onderste ledematen aanpassen, de opening van het kniegewricht verbeteren, de normale krachtlijn herstellen en de biomechanica van de onderste ledematen in evenwicht brengen 6,7,8,9. Weerstandsoefeningen kunnen de spiermassa en -kracht vergroten en de vernieuwing van kraakbeenweefsel bevorderen10,11. Een voorlopige studie wees uit dat dit Tuina-protocol significant effectiever is dan orale glucosaminesulfaatcapsules bij de behandeling van KOA, met een sneller begin van de werking en een significante remming van chondrocytendegeneratie en herstel van beschadigd kraakbeenweefsel12. Bij de behandeling van KOA hebben niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen, in vergelijking met Tuina-therapie, bijwerkingen en een onbevredigende werkzaamheid op lange termijn, relatief hoge chirurgische risico's en kosten, en vereisen ze bepaalde indicaties voor chirurgische behandeling, met postoperatieve problemen en periprothetische complicaties13,14,15. In vergelijking met medicamenteuze therapie en chirurgie biedt de behandeling van Tuina voor KOA verschillende voordelen, waaronder minder bijwerkingen, lager risico, verbeterde veiligheid, kosteneffectiviteit en langdurige werkzaamheid. Bovendien kan het effectief pijn in het kniegewricht, zwelling, knallen en bewegingsbeperking verlichten 6,13,16,17.

Het mechanisme van Tuina voor de behandeling van KOA moet echter worden verduidelijkt, wat de verbetering en perfectie van het behandelprotocol voor KOA beperkt. Daarom is het bestuderen van het mechanisme van Tuina-interventie in KOA door middel van dierproeven een effectieve methode. Konijnen hebben, in vergelijking met ratten, een volgzaam temperament en grotere kniegewrichten. De anatomische structuur en de biochemische indexen van het kraakbeen zijn vergelijkbaar met die van mensen, dus het is een geschikt onderwerp voor het bestuderen van het mechanisme van kniegewrichtsaandoeningen door Tuina18. Het KOA-model dat tot stand is gekomen door papaïne in de holte van het kniegewricht van konijnen te injecteren, heeft de voordelen van een korte modelleringstijd, minder trauma, een hoog slagingspercentage, een hoog overlevingspercentage en een vergelijkbaar pathologisch mechanisme als KOA19. Deze studie heeft tot doel een wetenschappelijk haalbaar dierexperimenteel protocol voor Tuina-interventie in KOA vast te stellen en het mechanisme van Tuina te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Affiliated Hospital van de Shandong University of Traditional Chinese Medicine (goedkeuringsnummer: 2020-29).

1. Proefdieren

  1. Fok 18 mannelijke Nieuw-Zeelandse konijnen van 6 maanden oud (2,75 ± 0,25 kg) in standaard eenpersoonskooien (12 uur licht/donkercyclus, temperatuur 20-24 °C, luchtvochtigheid 40%-60%).

2. Methode voor groepering

  1. Selecteer 6 van de 18 Nieuw-Zeelandse konijnen als de schijngroep met behulp van de methode met willekeurige getallen en wijs de resterende 12 konijnen toe aan de modelleringsgroep.
  2. Na succesvol modelleren verdeel je de modelleergroep konijnen in de model- en Tuina-groepen volgens de random number methode, met 6 konijnen in elke groep.
  3. Voer de Tuina interventie uit in de Tuina groep. Voer hetzelfde grijpen en fixeren uit in de schijn- en modelgroep zonder Tuina. Werk om de dag gedurende 4 weken (Figuur 1).

3. Totstandkoming van het KOA-model

  1. Voer in week 1 adaptieve voeding uit aan konijnen in de standaardconditie. Ad libitum toegang tot water en voedsel. Leg konijnen op hun rechterzij in de konijnenfixatieboxen om ze 15 minuten per dag te kalmeren. Bevestig hun hoofden op de kopbevestigingsplaten. Bevestig de bevestigingsplaten en schroeven zodat de konijnen niet kunnen bewegen. Draag beschermende handschoenen bij het vastpakken en vastzetten van de konijnen (Figuur 1).
  2. Leg op dag 1, 4 en 7 van week 2 alle 18 konijnen op hun rechterzij in de konijnenfixatieboxen (Figuur 1). Voer de onderstaande handelingen uit.
  3. Injecteer 3% pentobarbitalnatrium (1 ml/kg) in de marginale oorader van het konijn. Scheer het linkerkniegewricht van het konijn met een scheerapparaat, zodat er geen haar op de onbedekte huid komt.
  4. Desinfecteer het linkerkniegewricht van het konijn van binnenuit met medische jodofoor en 75% alcohol (Figuur 2A).
  5. Buig het linkerkniegewricht van het konijn in een hoek van 60°. Steek een naald (22G, 0,7 mm x 30 mm) van Waixiyan. Injecteer 4% papaïne-oplossing (0,1 ml/kg, gemiddeld 0,275 ml voor een dier van 2,5 kg) in de kniegewrichtholte van de modelleringsgroep. Injecteer een gelijke hoeveelheid 0,9% natriumchloride-oplossing in de schijngroep. Deze injectiedosis wordt door het dier goed verdragen zonder tekenen van pijn of angst te veroorzaken (figuur 2B).
    OPMERKING: Waixiyan (EX-LE5) bevindt zich in de laterale uitsparing van het patellaligament en Neixiyan (EX-LE4) bevindt zich in de mediale uitsparing van het patellaligament20,21,22.
  6. Druk 2 minuten op het gaatje om morsen van de oplossing te voorkomen.
  7. Plaats je handen boven en onder het linkerkniegewricht van het konijn. Buig het kniegewricht van het konijn voorzichtig en passief en strek het 10 keer uit binnen het fysiologische bewegingsbereik (ROM) om de oplossing gelijkmatig in de holte van het kniegewricht te infiltreren15. Observeer het konijn elke 8 uur voor de duur van de modellering. Dien buprenorfine SR (0,18 mg/kg) toe wanneer de konijnen tekenen vertonen van verstoppen, trillen van ledematen, oppervlakkige en snelle ademhaling, of zelfs bijten en krabben.
  8. Observeer in week 7 de linkerknie van het konijn in een gebogen positie als gezwollen, met verhoogde spierspanning rond de knie met knobbeltjes en striae, verhoogde lokale pijnlijke irritatiereactie, verminderde knie-ROM, kreupele gang en verschuiving van het zwaartepunt naar de gezonde kant. Dit bepaalt het succes van het KOA-model (Figuur 1, Figuur 2C)23,24.

4. Tuina manipulatie

  1. Voer een training uit met behulp van het parameterbepalingsinstrument van de Tuina-techniek voordat u Tuina manipuleert. Train 1 uur per dag gedurende 1 maand door dezelfde professional.
    1. Voer de roterende kneed- en persmethode uit met de duim op het Tuina-manipulatiesimulatieplatform met een kracht van 5 N en een frequentie van 60 keer/min (Figuur 3A,C).
    2. Analyseer de kracht in drie richtingen van de X-, Y- en Z-assen met behulp van de Tuina-software voor het verwerken van manipulatieparameters en controleer de omvang, frequentie en actietijd van de kracht die op het scherm wordt weergegeven (Figuur 3B, D).
    3. Evalueer de mechanische parameters van de Tuina-manipulatie en standaardiseer de Tuina-manipulatie met behulp van de software tijdens de training. Handhaaf de gestandaardiseerde roterende kneed- en persmethode met de duim met een kracht van 5 N, een frequentie van 60 keer/min en een continue bedrijfstijd van 10 min. Zie de gestandaardiseerde kwantitatieve golfvorm van de manipulatie in figuur 3B,D 25,26,27.
  2. Leg het konijn op zijn rechterzij in de konijnenfixatiedoos. Aai het konijn zachtjes gedurende 10 seconden om het konijn te kalmeren en te ontspannen21. Voer dan de Tuina interventie uit.
  3. Voer de roterende kneedmethode uit met de duim op de linker peri-kniespieren van het konijn, stijfheid, peesknopen en patella, met op en neer gaande retourmanipulatie met een kracht van 5 N en een frequentie van 60 keer/min gedurende 5 minuten.
  4. Gebruik het duimuiteinde om op Yanglingquan (GB 34), Yinlingquan (SP 9), Waixiyan (EX-LE5), Neixiyan (EX-LE4), Heding (EX-LE2), Xuehai (SP 10), Liangqiu (ST 34) en Weizhong (BL 40) 20,21,22 te drukken, met een kracht van 5 N en een frequentie van 60 keer/min, en werk op elk punt gedurende 30 s.
  5. Voer de roterende correctiemethode uit op het kniegewricht van het konijn en voer dit 3x apart uit voor elk dier in de groep.
    1. Bevestig het dijbeen met één hand. Plaats eerst de andere hand achter het kniegewricht en fixeer vervolgens de laterale en mediale tibiale condylen met respectievelijk de duim en ringvinger. Fixeer de knieholte met de wijs- en middelvinger. Oefen tractie en draaikracht uit.
    2. Bevestig het dijbeen met één hand. Fixeer de mediale en laterale randen van de knieschijf met de duim en pinken van de andere hand. Bevestig de patellabasis met de wijs-, middel- en ringvinger. Oefen draaikracht uit.
    3. Houd de richting van de trekkracht evenwijdig aan de lange as van het scheenbeen en de richting van de torsiekracht in lijn met de richting van de onderste Xiyan. Gebruik vingers om de huid op zijn plaats te houden om wrijving tussen de huid en de vingers te voorkomen.

5. Meting van het kniegewricht ROM

NOTITIE: Kalmeer het konijn voor de meting. De meetstatisticus en de operator verschillen van elkaar.

  1. Meet de mobiliteit van het linkerkniegewricht van konijnen van elke groep aan het begin van het experiment en aan het einde van elke week.
  2. Leg het konijn op zijn rechterzij in de konijnenfixatiebox en zet zijn linkerdijbeen met één hand vast.
  3. Lijn het midden van de cirkel van de medische arthroscoop uit met het laterale midden van het linkerkniegewricht van het konijn. Strek de fixatiearm zo uit dat deze evenwijdig is aan de lijnverlenging die het midden van de cirkel verbindt met de grote trochanter. Strek de mobiele arm zo uit dat deze evenwijdig is aan de lengteas van het scheenbeen.
  4. Plaats de andere hand op de lengteas van het scheenbeen, ongeveer 9 cm van het kniegewricht. Oefen handmatig een koppel van ongeveer 750-850 g uit bij een hoeksnelheid van 3°/s28.
  5. Voer dit uit totdat het kniegewricht van het konijn niet meer beweegt. Noteer het aantal graden dat de goniometer aangeeft wanneer het gewricht stopt met bewegen; dit is de ROM van het kniegewricht. Zorg er bij het lezen voor dat de zichtlijn loodrecht op het oppervlak van de liniaal staat.
  6. Meet ROM voor elke knie 3x en neem de gemiddelde waarde28.

6. Hematoxyline-eosine (HE) kleuring

  1. Monstername
    1. Leg het konijn 1 week na het einde van de ingreep (Figuur 1) op zijn rechterzij in de konijnenfixatiebox (konijnen blijven eerder ontspannen als ze op hun rechterzij liggen). Injecteer pentobarbiton (100 mg/kg) in de marginale ader van het oor van het konijn voor humane euthanasie29,30.
    2. Open de linkerknieholte snel met een scalpel, schaar en hemostatische pincet om het zachte weefsel rond het kraakbeen van het distale dijbeen te verwijderen.
    3. Verzamel een kraakbeenbeenmonster van ongeveer 1 cm x 1 cm van het distale dijbeen met een bijttang en plaats het in zoutoplossing om te reinigen.
  2. Fixatie en ontkalking
    1. Plaats het kraakbeen in 4% paraformaldehyde-oplossing en fixeer het gedurende 72 uur.
    2. Spoel gedurende 12 uur onder stromend water. Ontkalken in ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) ontkalkingsoplossing gedurende 6 weken. Vervang de EDTA-ontkalkingsoplossing om de 3 dagen. Bepaal het eindpunt van ontkalking wanneer het botweefsel zacht en flexibel wordt, gemakkelijk kan worden gebogen en soepel kan worden doorboord met een naald31.
  3. Uitdroging van ingebedde secties
    1. Plaats het monster in een automatische dehydrator voor dehydratatie.
    2. Plaats het gewaxte en bijgesneden weefsel gedurende 1 uur op de bodem van een vierkante container met opgeloste paraffinewas. Plaats ze in een koeloven tot ze zijn afgekoeld en gestold tot harde blokken. Snijd het in paraffine ingebedde weefselblok in een snijmachine tot een dikte van 4 μm.
    3. Vouw de secties open in de bleekmachine, plaats ze op zelfklevende glaasjes, nummer ze en droog ze af met een plakjesbakmachine en oven.
  4. De-waxing en hydratatie
    1. Bak de partjes 60 minuten op 65 °C.
    2. Week de secties 7 minuten in xyleen, gevolgd door nog 2 rondes weken in vers xyleen gedurende elk 7 minuten.
    3. Week de plak 5 minuten in watervrije ethanol, gevolgd door 2 minuten weken in 95% ethanol, 85% ethanol en 75% ethanol.
    4. Week de secties 2 minuten in gedestilleerd water.
  5. Hematoxylinekleuring: Kleuring secties met hematoxyline gedurende 20 s. Spoel secties af onder stromend water. Week secties gedurende 3 s in zoutzuur-ethanolfractionering. Spoel de secties 5 minuten af in kraanwater.
  6. Eosine re-kleuring: Kleurs secties met eosine gedurende 30 s. Spoel secties af met kraanwater.
  7. Uitdroging voor transparantie van het monster
    1. Leg de secties tweemaal gedurende 3 s in 95% ethanol, gevolgd door 3 s in watervrije ethanol.
    2. Leg de plakjes opnieuw 1 minuut in watervrije ethanol, gevolgd door 2 rondes xyleenwas gedurende elk 1 minuut.
  8. Verzegelen van plakjes: Haal de plakjes eruit, laat de neutrale gumsealer vallen, dek af met een dekglaasje en laat de plakjes geurloos drogen in een zuurkast.
  9. Het monster fotograferen: Observeer en fotografeer onder het gezichtsveld van een lichtmicroscoop op 100x.
  10. Evaluatie: Evalueer het kraakbeenweefsel aan de hand van de score van Mankin voor elke groep32.

7. Data-analyse

  1. Analyseer de experimentele gegevens statistisch met behulp van analysesoftware. Wanneer de gegevens werden onderworpen aan een normale verdeling, vergelijkt u twee groepen monsters met een t-toets en meerdere groepen met eenrichtings-ANOVA.
  2. Druk de resultaten uit als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Resultaten weergeven als statistische plots met behulp van commerciële software. De verschillen waren statistisch significant bij p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De mate van beperkte kniebeweging en beschadiging van het kraakbeenweefsel weerspiegelt de ernst van KOA. De ROM van het kniegewricht geeft de mate van beperking van de beweging van het kniegewricht weer. Hoe kleiner de ROM van het kniegewricht, hoe ernstiger de beperking van de beweging van het kniegewricht. Integendeel, hoe groter de ROM van het kniegewricht, hoe normaler de mate van kniebeweging. HE-kleuring om de morfologie en structuur van kraakbeenweefsel te observeren, weerspiegelt de mate van kraakbeenweefselbeschadiging. Hoe onregelmatiger het oppervlak van kraakbeenweefsel, hoe groter de aanwezigheid van scheuren en defecten, hoe lager het aantal chondrocyten, hoe dunner de dikte van de kraakbeenlaag, hoe ongeordender de rangschikking van cellen, hoe ongelijkmatiger de verdeling van cellen, hoe onduidelijker de lagen, hoe minder duidelijk en volledig de vloedlijn, hoe hoger de score van Mankin, hoe ernstiger de schade aan het kraakbeenweefsel van het kniegewricht, en andersom, hoe normaler het kraakbeenweefsel32 is. Bij het vaststellen van het KOA-model kan het succes van modellering worden bepaald door de mate van beperking van de beweging van het kniegewricht van konijnente observeren 23,24. De werkzaamheid van Tuina kan worden bepaald door de verbetering van de mate van beperking van de beweging van het kniegewricht en de mate van beschadiging van het kraakbeenweefsel waar te nemen wanneer het kniegewricht van het konijn wordt ingegrepen door Tuina12.

Na week 7 bleek uit vergelijking van het linkerkniegewricht van de twee groepen konijnen dat de spieren in de modelleringsgroep stijver waren en dat de beweging beperkt was, met een ROM van 74,67° ± 1,21°, wat lager was dan de 140,17° ± 1,33° in de schijngroep, wat wijst op succesvolle modellering (Figuur 2C, Figuur 4).

Na de 12e week van meting en analyse was de ROM van het kniegewricht van de schijngroep, de modelgroep en de Tuina-groep respectievelijk 140,33° ± 1,37°, 76,33° ± 1,37° en 134,33° ± 1,51°, en de mobiliteit van het kniegewricht van de Tuina-groep was significant hoger dan die van de modelgroep (p < 0,01), wat aangeeft dat Tuina de kniegewrichtsfunctie van KOA-konijnen kon verbeteren (Figuur 5).

HE-kleuring van het kraakbeen van het linkerkniegewricht van konijnen in elke groep toonde aan dat het kraakbeenweefseloppervlak van de schijngroep glad en intact was, het aantal chondrocyten was 331,67 ± 13,98, de dikte van de kraakbeenlaag was 259,42 ± 41,97 μm, de cellen waren goed gerangschikt en gelijkmatig verdeeld, de niveaus waren duidelijk, de vloedlijnen waren duidelijk, continu en compleet, en de score van de Mankin was 0,33 ± 0,52. Vergeleken met de schijngroep was het kraakbeenweefseloppervlak van de modelgroep onregelmatig met defecten en scheuren, het aantal chondrocyten was 29,50 ± 8,04, de dikte van de kraakbeenlaag was 103,15 ± 24,64 μm, de cellen waren ongeordend, ongelijk verdeeld, de lagen waren niet helder, de getijdenlijnen waren niet duidelijk en onvolledig, en de score van Mankin was 9,33 ± 1,03. In vergelijking met de modelgroep had het kraakbeen van de Tuina-groep een regelmatig oppervlak, met minder defecten en scheuren, het aantal chondrocyten was 291,83 ± 8,18, de dikte van de kraakbeenlaag was 183,58 ± 15,34 μm, de cellen waren ordelijker gerangschikt, enigszins ongelijk verdeeld, de lagen waren helderder en de getijdenlijnen waren relatief duidelijk en compleet, en de score van Mankin was 3,00 ± 0,63 (Figuur 6)15,23,33. Het aantal cellen, de dikte van de kraakbeenlaag en de score van Mankin in de Tuina-groep waren significant beter dan die in de modelgroep (p < 0,001), wat aangeeft dat Tuina het beschadigde kraakbeenweefsel kon herstellen.

Figure 1
Figuur 1: Protocol voor de vestiging en Tuina van KOA-modelkonijnen. Na het adaptief voeren van konijnen gedurende 1 week, bouwt u het KOA-model gedurende 6 weken op het linkerkniegewricht van konijnen, met injecties van 4% papaïne-oplossing op dag 1, 4 en 7 van het begin van de modellering. Ingrijpen in het linker kniegewricht van de konijnen door Tuina gedurende 4 weken, 1 keer om de dag. Meet na 1 week voeren de ROM van het linkerkniegewricht van de konijnen en neem monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Totstandkoming van het KOA-model . (A) Het linkerkniegewricht van de konijnen werd geprepareerd en gedesinfecteerd. (B) De naald werd ingebracht vanuit Waixiyan en 4% papaïne-oplossing en 0,9% natriumchloride-oplossing werden geïnjecteerd in de kniegewrichtsholte van respectievelijk modellerings- en schijngroepen konijnen. (C) De succesvol gevormde KOA-modelkonijnen met beperkte beweging van het linkerkniegewricht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Training voor Tuina-technieken met behulp van het Tuina-techniekparameterbepalingsinstrument. (A) Train met een duim voor de roterende kneedmethode. (B) De kromming van de roterende kneedmethode met een duim. (C) Train de persmethode met het duimuiteinde. (D) De kromming van de persmethode met het duimuiteinde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Linkerkniegewricht ROM bij konijnen voor en na modellering. De gegevens werden verwerkt door t-test over de schijn- en modelleringsgroepen, en de resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. ns p > 0,05,***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Linker kniegewricht ROM van konijnen. Voor de schijn-, model- en Tuina-groepen werden de gegevens verwerkt door ANOVA en werden de resultaten uitgedrukt als gemiddelde ± SD. In week 1 nam de ROM in alle drie de groepen licht toe. In vergelijking met de schijngroep nam de ROM op het moment van modellering geleidelijk af in de model- en Tuina-groepen (p < 0,001). In tegenstelling tot de modelgroep nam de ROM na interventie geleidelijk toe in de Tuina-groep (p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: HE-kleuring van het kraakbeen van het kniegewricht van konijnen. (A) De HE-kleuring van de schijngroep. (B) De HE-kleuring van de modelgroep. (C) De HE-kleuring van de Tuina-groep. (D) Vergelijking van het aantal chondrocyten tussen groepen. (E) Vergelijking van de dikte van de kraakbeenlaag tussen de groepen. (F) Vergelijking van de score van Mankin tussen groepen. De gegevens werden verwerkt door ANOVA en de resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Na 12 weken, zoals te zien was aan de HE-kleuring, was het kraakbeenweefsel van de groep structureel intact met een normaal aantal cellen en een normale rangschikking; het kraakbeenweefsel van de modelgroep werd structureel vernietigd met een laag celaantal en een wanordelijke rangschikking; het kraakbeenweefsel van de Tuina-groep was intact met een relatief normaal aantal cellen en rangschikking. ***p < 0,001. Schaalbalk = 100 μm. N = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het ontwerp van het experimentele protocol is met name belangrijk om het mechanisme van Tuina bij de behandeling van KOA te onderzoeken. KOA-modellering werd uitgevoerd op konijnen door middel van injectie met papaïne in Waixiyan. Waixiyan bevindt zich in de laterale crypte van het patellaligament, dat gemakkelijk te lokaliseren is, en de gewrichtsruimte tussen het dijbeen en het scheenbeen is hier groot tijdens knieflexie, waardoor het gemakkelijk is om in de holte van het kniegewricht te injecteren en schade aan de omliggende weefsels wordt voorkomen, dus het is gemakkelijk om het KOA-model34 vast te stellen. Tijdens de interventie van Tuina bij KOA-konijnen werden de modelkonijnen op de juiste manier gepositioneerd om de toediening van Tuina te vergemakkelijken. De konijnen werden op hun gezonde kant in de konijnenfixatiedoos geplaatst, met hun hoofd gefixeerd, en hun emoties werden gekalmeerd om hun hele lichaam te ontspannen en niet te worstelen. Om de sterkte en frequentie van Tuina te standaardiseren en de homogeniteit van Tuina-interventies te verbeteren, wordt Tuina uitgevoerd door een operator die een strenge training heeft gevolgd in Tuina-manipulatie door het Tuina-techniek parameterbepalingsinstrument.

De belangrijkste stap in dit protocol is het gebruik van Tuina in combinatie met de roterende correctiemethode van het kniegewricht om KOA te behandelen. Vóór de operatie werd de aangedane onderste extremiteit van het konijn gepalpeerd van de heup tot de enkel, waarbij de nadruk lag op het gebied rond het kniegewricht, waarbij werd gezocht naar peesknopen en spierstijfheid, en vervolgens het kniegewricht werd gebogen en verlengd om de hoogte van Neixiyan en Waixiyan te observeren voor nauwkeurige Tuina-manipulatie. De roterende kneed- en persmethode kan spierspanning en spasmen verminderen, de bloedcirculatie in het kniegewricht verbeteren, het metabolisme van ontstekingsstoffen bevorderen en zwelling en pijn verminderen35,36. Acupunctuurpunten zijn de respons- en behandelingspunten van de ziekte, en GB 34 en EX-LE2 zijn punten met een hoge gevoeligheid voor de behandeling van KOA, en door ze te stimuleren, kunnen ze inwerken op mestcellen, waardoor de afgifte van 5-hydroxytryptamine, tryptase en histamine37 wordt beïnvloed. Uit datamining bleek dat GB 34, SP 9, EX-LE5, EX-LE4, EX-LE2, SP 10, ST 34 en BL 40 allemaal veelgebruikte acupunctuurpunten zijn in de klinische praktijk38,39. Deze punten hebben de effecten van het verlichten van pezen en knopen, het activeren van de bloedcirculatie en het verlichten van pijn38,39. Studies hebben aangetoond dat stimulatie van de bovengenoemde acupunten de serumspiegels van ontstekingsfactoren zoals tumornecrosefactor-α en interleukine-1β kan verlagen en de vernietiging van het chondrocytenskelet kan remmen, waardoor KOA 39,40,41 wordt behandeld.

De roterende correctiemethode van het kniegewricht die wordt uitgevoerd bij actieve weerstandsoefeningen met instelbare krachtniveaus is eenvoudig uit te voeren en vermijdt het potentiële risico op letsel bij het reguleren van de kniestructuur in vergelijking met passieve bewegingstechnieken zoals flexie en compressie. De hoek beïnvloedt het koppel, en een onbalans tussen het interne sluitkoppel van het kniegewricht en het abductiekoppel kan de abnormale gewrichtsbelasting verhogen, wat KOA42,43,44,45 kan veroorzaken. Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat Tuina-interventie met regelmatige weerstandsoefeningen de botdichtheid kan verbeteren, spierspasmen kan verminderen, spiermassa en kracht kan herstellen, pijn kan verminderen en KOA 46,47,48,49,50 effectief kan behandelen. Omdat de konijnenknie kleiner is dan de menselijke knie en geen vrijwillige weerstandsbewegingen kan uitvoeren, werd de oorspronkelijke tweepersoons Tuina veranderd in een eenpersoons Tuina met twee handen om een betere werkzaamheid en bedieningsgemak van de roterende correctiemethode van het kniegewricht onder weerstand12 te garanderen. Nu, door het dijbeen van het konijn met één hand te fixeren om de weerstandsbeweging te simuleren, wordt de andere hand gebruikt om de roterende correctiemethode van het kniegewricht uit te voeren door draai- en trekkracht uit te oefenen op de onderste Xiyan, zodat Waixiyan en Neixiyan zich op dezelfde hoogte bevinden en de relatieve hoogte van het mediale en laterale scheenbeenplateau wordt aangepast. Het kniegewricht kan ook naar binnen en naar buiten worden aangepast om de binnenwaartse en buitenwaartse koppels te reguleren, de axiale uitlijning te bevorderen, de uitlijning van de femorotibiale en femoropatellaire gewrichten aan te passen, de normale krachtstructuur van het kniegewricht te herstellen, de belasting van het kniegewricht te verminderen, de stabiliteit van het kniegewricht te vergroten en de normale mobiliteit en fysiologische functie van het kniegewricht te herstellen42, 43,44,45.

De eerdere klinische studies van het team hebben de werkzaamheid van deze methode bij de behandeling van KOA aangetoond, en dierstudies hebben aangetoond dat het effectiever is dan glucosaminesulfaat bij de behandeling van KOA12. Tuina kan de interleukine 1β (IL-1β) en extracellulaire signaalgereguleerde kinase 1/2 (ERK1/2)-nucleaire transcriptiefactor κB (NF-κB) signaleringsroutes mediëren, de concentratie van IL-1β in het perifere serum en gewrichtsvloeistof van konijnen verlagen, het expressieniveau van B-cellymfoom-2 (Bcl-2) verhogen en de expressieniveaus van ERK1/2, Bcl-2-geassocieerd x-eiwit, NF-KB p65 en cysteïne-aspartaatprotease 3 verlagen. Dit helpt bij het reguleren van de apoptose en proliferatie van chondrocyten en het in evenwicht brengen van de ongeordende interne omgeving van chondrocyten, waardoor de pathologische veranderingen in het kraakbeen worden verbeterd12.

De beperking van deze methode is dat de interventie van Tuina wordt uitgevoerd door een mens in plaats van een machine, en het is moeilijk voor de operator om volledige homogeniteit te bereiken in de sterkte en frequentie van Tuina.

Concluderend kan Tuina de ontsteking van kniegewrichten effectief verminderen, de degeneratie van kniekraakbeen remmen en geleidelijk de normale fysiologische mobiliteit herstellen, en deze studie kan een wetenschappelijk en haalbaar onderzoeksprotocol bieden voor het mechanisme van Tuina-behandeling van kniegewrichtsaandoeningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen mogelijke belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het Shandong Provincial Traditional Chinese Medicine Science and Technology Project (2021Q080) en het Qilu School of Traditional Chinese Medicine Academic School Inheritance Project [Lu-Wei-Letter (2022) 93].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9 % sodium chloride injection Sichuan Keren Pharmaceutical Co. Z22121903
-20°C refrigerator Haier BD-328WL
4 % fixative solution Solarbio P1110
4°C refrigerator Haier SC-315DS
Anhydrous ethanol Sinopharm
Automatic tissue dewatering machine Dakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co. HP30
Blast drying oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co. DHG-9070A
Coverslip Biyuntian FCGF50
Electric thermostat water bath Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co. HWS-26
Embedding freezing table Changzhou Paishijie Medical Equipment Co. BM450
Embedding machine Changzhou Paishijie Medical Equipment Co. BM450A
Ethylenediaminetetraacetic acid decalcification solution Servicebio G1105-500ML
Fluorescent inverted microscope Leica Leica DM IL LED
Hematoxylin-eosin staining kit Cisco Jet EE0012
Hydrochloric acid Laiyang Economic and Technological Development Zone Fine Chemical Plant
Medical joint goniometer KOSLO
Neutral gum Cisco Jet EE0013
Normal-grade male New Zealand rabbit Jinan Xilingjiao Breeding and Breeding Center SCXK (Lu) 2020 0004
Papain(3000 U/mg) Bioss D10366
Pathological tissue bleaching and drying instrument Changzhou Paishijie Medical Equipment Co. PH60
Pet electric clippers Codos CP-3180
Rabbit fixing box any brand
Rotating Slicer Leica 531CM-Y43
Tuina technique parameter determination instrument Shanghai DuKang Instrument Equipment Co. Ltd. ZTC-Equation 1
Ventilator TALY ELECTRIC C32
Xylene Fuyu Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Long, H. B., et al. Prevalence trends of site-specific osteoarthritis from 1990 to 2019: findings from the global burden of disease study 2019. Arthritis & Rheumatology. 74 (7), 1172-1183 (2022).
  2. Tschopp, M., et al. A randomized trial of intra-articular injection therapy for knee osteoarthritis. Investigative Radiology. 58 (5), 355-362 (2023).
  3. Buchanan, W. W., Kean, C. A., Kean, W. F., Rainsford, K. D. Osteoarthritis. Inflammopharmacology. , (2023).
  4. Wang, W. Y., et al. A randomized, parallel control and multicenter clinical trial of evidence-based traditional Chinese medicine massage treatment VS External Diclofenac Diethylamine Emulgel for the treatment of knee osteoarthritis. Trials. 23 (1), 555 (2022).
  5. Wang, M. N., et al. Mechanism of traditional Chinese medicine in treating knee osteoarthritis. Journal of Pain Research. 13, 1421-1429 (2020).
  6. Katz, J. N., Arant, K. R., Loeser, R. F. Diagnosis and treatment of hip and knee osteoarthritis: A review. The Journal of the American Medical Association. 325 (6), 568-578 (2021).
  7. Chang, A., et al. The relationship between toe-out angle during gait and progression of medial tibiofemoral osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 66, 1271-1275 (2007).
  8. Jenkyn, T. R., Hunt, M. A., Jones, I. C., Giffin, J. R., Birmingham, T. B. Toe-out gait in patients with knee osteoarthritis partially transforms external knee adduction moment into flexion moment during early stance phase of gait: a tri-planar kinetic mechanism. Journal of Biomechanics. 41 (2), 276-283 (2008).
  9. Brouwer, G. M., et al. Association between valgus and varus alignment and the development and progression of radiographic osteoarthritis of the knee. Arthritis & Rheumatism. 56 (4), 1204-1211 (2007).
  10. Liao, C. D., et al. Effects of protein supplementation combined with resistance exercise training on walking speed recovery in older adults with knee osteoarthritis and sarcopenia. Nutrients. 15 (7), 1552 (2023).
  11. Thudium, C. S., et al. Cartilage tissue turnover increases with high-compared to low-intensity resistance training in patients with knee OA. Arthritis Research & Therapy. 25 (1), 22 (2023).
  12. Zheng, L. J., et al. Shutiao Jingjin massage can stabilize intracellular environment of rabbit chondrocytes following knee osteoarthritis-induced cartilage injury. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 27, (2023).
  13. Liu, K. Q., et al. Efficacy and safety of Tuina (Chinese therapeutic massage) for knee osteoarthritis: A randomized, controlled, and crossover design clinical trial. Frontiers in Medicine. 10, 997116 (2023).
  14. Wang, Z., et al. Systematic Review and Network Meta-analysis of Acupuncture Combined with Massage in Treating Knee Osteoarthritis. BioMed Research International. 2022, 4048550 (2022).
  15. Li, Y. Y., et al. Therapeutic effect of acupotomy at Sanheyang for cartilage collagen damage in moderate knee osteoarthritis: a rabbit model. Journal of Inflammation Research. 16, 2241-2254 (2023).
  16. Guo, G. X., et al. Cerebral mechanism of Tuina analgesia in management of knee osteoarthritis using multimodal MRI: study protocol for a randomised controlled trial. Trials. 23 (1), 694 (2022).
  17. Perlman, A., et al. Efficacy and safety of massage for osteoarthritis of the knee: a randomized clinical trial. Journal of General Internal Medicine. 34 (3), 379-386 (2019).
  18. Chen, B. J., et al. Aerobic exercise combined with glucosamine hydrochloride capsules inhibited the apoptosis of chondrocytes in rabbit knee osteoarthritis by affecting TRPV5 expression. Gene. 830, 146465 (2022).
  19. Rasheed, M. S., Ansari, S. F., Shahzadi, I. Formulation, characterization of glucosamine loaded transfersomes and in vivo evaluation using papain induced arthritis model. Scientific Reports. 12 (1), 19813 (2002).
  20. Li, Z. R. Experimental acupuncturology. Beijing: China Press of Traditional Chinese Medicine. 2003, 314-319 (2003).
  21. Hu, Y. L. Manual of practical animal acupuncture. Beijing: China Press of Agriculture. 2003, 286-298 (2014).
  22. Liu, J., et al. Effects of "knot-loosing" of acupotomy on motor function and morphological changes of knee joint in knee osteoarthritis rabbits. Zhen Ci Yan Jiu. 46 (2), 129-135 (2021).
  23. Li, Q., et al. The protective effects and mechanism of Ruyi Zhenbao Pill, a Tibetan medicinal compound, in a rat model of osteoarthritis. Journal of Ethnopharmacology. 308, 116255 (2023).
  24. Kwon, M., Nam, D., Kim, J. Pathological characteristics of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis in rats. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 20 (3), 435-446 (2023).
  25. Wang, J. G., Tang, C. L. Experimental Tuina science. Beijing: China Press of Traditional Chinese Medicine. Chinese. , (2017).
  26. Fang, M., Song, B. L. Tuina science. Beijing: China Press of Traditional Chinese Medicine. , (2016).
  27. Jin, X. Y., Yu, Y. Y., Lin, Y. Y., Yang, J. P., Chen, Z. H. Tendon-regulating and bone-setting manipulation promotes the recovery of synovial inflammation in rabbits with knee osteoarthritis via the TLR4-MyD88-NF-κB signaling pathway. Annals of Translational Medicine. 11 (6), 245 (2023).
  28. Wang, M., Liu, C., Xiao, W. Intra-articular injection of hyaluronic acid for the reduction in joint adhesion formation in a rabbit model of knee injury. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy: Official Journal of the ESSKA. 22 (7), 1536-1540 (2014).
  29. Xu, C., et al. Bacterial cellulose membranes used as artificial substitutes for dural defection in rabbits. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10855-10867 (2014).
  30. Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Schaumburg: American Veterinary Medical Association. 2020, (2020).
  31. Amirtham, S. M., Ozbey, O., Kachroo, U., Ramasamy, B., Vinod, E. Optimization of immunohistochemical detection of collagen type II in osteochondral sections by comparing decalcification and antigen retrieval agent combinations. Clinical Anatomy. 33 (3), 343-349 (2020).
  32. Niazvand, F., et al. Curcumin-loaded poly lactic-co-glycolic acid nanoparticles effects on mono-iodoacetate-induced osteoarthritis in rats. Veterinary Research Forum: An International Quarterly Journal. 8 (2), 155-161 (2017).
  33. Liu, A., et al. Intra-articular injection of umbilical cord mesenchymal stem cells loaded with graphene oxide granular lubrication ameliorates inflammatory responses and osteoporosis of the subchondral bone in rabbits of modified papain-induced osteoarthritis. Frontiers in Endocrinology. 12, 822294 (2022).
  34. Hall, M. M. The accuracy and efficacy of palpation versus image-guided peripheral injections in sports medicine. Current Sports Medicine Reports. 12 (5), 296-303 (2013).
  35. Xing, L., et al. Traditional Chinese medicine ointment combined with Tuina therapy in treatment of pain and swelling after total knee arthroplasty. World Journal of Orthopedics. 13 (10), 932-939 (2022).
  36. Xu, H., et al. The effectiveness of Tuina in relieving pain, negative emotions, and disability in knee osteoarthritis: a randomized controlled trial. Pain Medicine. 24 (3), 244-257 (2023).
  37. Ding, N., et al. Mast cells are important regulator of acupoint sensitization via the secretion of tryptase, 5-hydroxytryptamine, and histamine. The Public Library of Science One. 13 (3), e0194022 (2018).
  38. Cai, F. H., Li, F. L., Zhang, Y. C., Li, P. Q., Xiao, B. Research on electroacupuncture parameters for knee osteoarthritis based on data mining. European Journal of Medical Research. 27 (1), 162 (2022).
  39. Mei, Z. G., Cheng, C. G., Zheng, J. F. Observations on curative effect of high-frequency electric sparkle and point-injection therapy on knee osteoarthritis. Journal of Traditional Chinese Medicine. 31 (4), 311-315 (2011).
  40. Xiao, G., et al. Effect of manipulation on cartilage in rats with knee osteoarthritis based on the Rho-associated protein kinase/LIM kinase 1/Cofilin signaling pathways. Journal of Traditional Chinese Medicine. 42 (2), 194-199 (2022).
  41. Wu, M. X., et al. Clinical study on the treatment of knee osteoarthritis of Shen-Sui insufficiency syndrome type by electroacupuncture. Chinese Journal of Integrative Medicine. 16 (4), 291-297 (2010).
  42. Richards, R. E., Andersen, M. S., Harlaar, J., van den Noort, J. C. Relationship between knee joint contact forces and external knee joint moments in patients with medial knee osteoarthritis: effects of gait modifications. Osteoarthritis Cartilage. 26 (9), 1203-1214 (2018).
  43. Shull, P. B., et al. Toe-in gait reduces the first peak knee adduction moment in patients with medial compartment knee osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 46 (1), 122-128 (2013).
  44. Adouni, M., Shirazi-Adl, A. Partitioning of knee joint internal forces in gait is dictated by the knee adduction angle and not by the knee adduction moment. Journal of Biomechanics. 47 (7), 1696-1703 (2014).
  45. Kutzner, I., Trepczynski, A., Heller, M. O., Bergmann, G. Knee adduction moment and medial contact force--facts about their correlation during gait. The Public Library of Science One. 8 (12), e81036 (2013).
  46. Camacho-Cardenosa, A., et al. Resistance circuit training combined with hypoxia stimulates bone system of older adults: a randomized trial. Experimental Gerontology. 169, 111983 (2022).
  47. Babur, M. N., Siddiqi, F. A., Tassadaq, N., Arshad Tareen, M. A., Osama, M. Effects of glucosamine and chondroitin sulfate supplementation in addition to resistance exercise training and manual therapy in patients with knee osteoarthritis: A randomized controlled trial. The Journal of the Pakistan Medical Association. 72 (7), 1272-1277 (2022).
  48. Wang, H. N., et al. Effect of low-load resistance training with different degrees of blood flow restriction in patients with knee osteoarthritis: study protocol for a randomized trial. Trials. 23 (1), 6 (2022).
  49. Cheon, Y. H., et al. Relationship between decreased lower extremity muscle mass and knee pain severity in both the general population and patients with knee osteoarthritis: Findings from the KNHANES V 1-2. The Public Library of Science One. 12 (3), e0173036 (2017).
  50. Murton, A. J., Greenhaff, P. L. Resistance exercise and the mechanisms of muscle mass regulation in humans: acute effects on muscle protein turnover and the gaps in our understanding of chronic resistance exercise training adaptation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (10), 2209-2214 (2013).

Tags

Tuina-interventie Konijnenmodel Artrose van de knie (KOA) Degeneratieve veranderingen Kraakbeen Zachte weefsels Werkzaamheid van Tuina Onderliggend mechanisme Wetenschappelijk haalbaar KOA Konijnenmodel Tuina gecombineerd met roterende correctiemethode voor kniegewricht bewegingsbereik van het kniegewricht (ROM) Chondrocyte apoptose Kraakbeenweefselherstel Herstel van kniegewricht ROM Mogelijke toepassing
Tuina-interventie in konijnenmodel van knieartrose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Zhang, X., Sun, G., Wang, … More

Zhang, S., Zhang, X., Sun, G., Wang, K., Qiao, Y., He, Y., Li, M., Li, H., Zheng, L. Tuina Intervention in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis. J. Vis. Exp. (198), e65763, doi:10.3791/65763 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter