Summary
Protokol, diz osteoartritinin bir tavşan modelinde Tuina müdahalesi için bir yöntemi açıklar.
Abstract
Diz osteoartriti (KOA) temel olarak diz ekleminin kıkırdağında ve çevresindeki yumuşak dokularda dejeneratif değişiklikler ile karakterizedir. Tuina'nın KOA tedavisindeki etkinliği doğrulanmıştır, ancak altta yatan mekanizmanın araştırılması gerekmektedir. Bu çalışma, altta yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için Tuina ile tedavi edilen bilimsel olarak uygulanabilir bir KOA tavşan modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. Bunun için 18, 6 aylık normal dereceli erkek Yeni Zelanda tavşanları, her grupta 6 tavşan olacak şekilde rastgele sahte, model ve Tuina gruplarına ayrıldı. KOA modeli, diz eklem boşluğuna %4'lük papain solüsyonu enjekte edilerek oluşturulmuştur. Tuina grubuna 4 hafta boyunca diz eklemi döner düzeltme yöntemi ile birlikte Tuina ile müdahale edildi. Sahte ve model gruplarında sadece standart kavrama ve sabitleme yapıldı. 1 haftalık girişim sonunda diz eklem hareket açıklığı (ROM) gözlendi ve kıkırdak hematoksilen-eozin (HE) boyaması yapıldı. Çalışma, Tuina'nın kondrosit apoptozunu inhibe edebileceğini, kıkırdak dokusunu onarabileceğini ve diz eklemi ROM'unu eski haline getirebileceğini gösteriyor. Sonuç olarak, bu çalışma, KOA model tavşanlar için Tuina tedavisinin bilimsel fizibilitesini göstererek, KOA ve benzeri diz eklemi ile ilgili durumların çalışmasında potansiyel uygulamasını vurgulamaktadır.
Introduction
Diz osteoartriti (KOA), 2019 yılında dünya çapında 527,81 milyon osteoartritli hasta ile kadınlarda yüksek sakatlık oranı ve daha yüksek prevalans ile diz ekleminin dejeneratif bir hastalığıdır ve küresel prevalansı toplam OA prevalansının %60,6'sını oluşturmaktadır1. Klinik olarak, KOA tedavisi genellikle cerrahi olmayan ve cerrahi tedavilere ayrılır. Cerrahi olmayan tedaviler arasında fizyoterapi, farmakoterapi ve trombositten zengin plazma enjeksiyon tedavisibulunur 2,3. Tuina, Çin tıbbında yaygın, güvenli, güvenilir ve etkili bir tedavi yöntemidir. Bu çalışma, KOA'yı tedavi etmek için diz eklemi döner düzeltme yöntemi ile birlikte Tuina'yı kullanmaktadır. Döner yoğurma ve presleme yöntemi gibi Tuina teknikleri kas dokusunu dengeleyebilir, ağrıyı azaltabilir, inflamatuar faktör seviyelerini ayarlayabilir, doku metabolizmasını iyileştirebilir ve eklem kıkırdak dejenerasyonunu engelleyebilir 4,5. Diz eklemi döner düzeltme yöntemi, alt ekstremite kemiklerinin ve eklemlerinin hizasını ayarlayabilir, diz eklemi boşluğunu iyileştirebilir, normal kuvvet hattını eski haline getirebilir ve alt ekstremite biyomekaniğinidengeleyebilir 6,7,8,9. Direnç egzersizleri kas kütlesini ve gücünü artırabilir ve kıkırdak dokusunun yenilenmesini teşvik edebilir10,11. Bir ön çalışma, bu Tuina protokolünün KOA tedavisinde oral glukozamin sülfat kapsüllerinden önemli ölçüde daha etkili olduğunu, daha hızlı bir etki başlangıcı ve kondrosit dejenerasyonunun önemli ölçüde inhibisyonu ve hasarlı kıkırdak dokusunun onarımı ile önemli ölçüde daha etkili olduğunu bulmuştur12. KOA tedavisinde, Tuina tedavisine kıyasla, steroid olmayan antienflamatuar ilaçların yan etkileri ve tatmin edici olmayan uzun süreli etkinlikleri, nispeten yüksek cerrahi riskleri ve maliyetleri vardır ve cerrahi tedavi için belirli endikasyonlar gerektirir, postoperatif problemler ve periprostetik komplikasyonlar vardır13,14,15. İlaç tedavisi ve cerrahi ile karşılaştırıldığında, KOA için Tuina tedavisi, azaltılmış yan etkiler, daha düşük risk, gelişmiş güvenlik, maliyet etkinliği ve daha uzun süreli etkinlik dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar. Ek olarak, diz eklemi ağrısını, şişmeyi, patlamayı ve kısıtlı hareketi etkili bir şekilde hafifletebilir 6,13,16,17.
Bununla birlikte, KOA tedavisi için Tuina mekanizmasının açıklığa kavuşturulması gerekir, bu da KOA için tedavi protokolünün iyileştirilmesini ve mükemmelliğini sınırlar. Bu nedenle, hayvan deneyleri yoluyla KOA'ya Tuina müdahalesinin mekanizmasını incelemek etkili bir yöntemdir. Tavşanlar, sıçanlara kıyasla uysal bir mizaca ve daha büyük diz eklemlerine sahiptir. Anatomik yapı ve kıkırdak biyokimyasal indeksleri insanlarınkine benzer, bu nedenle diz eklemi hastalığının mekanizmasını incelemek için uygun bir konudur Tuina18. Tavşanların diz eklem boşluğuna papain enjekte edilerek oluşturulan KOA modeli, kısa modelleme süresi, azaltılmış travma, yüksek başarı oranı, yüksek sağkalım oranı ve KOA19'a benzer patolojik mekanizma avantajlarına sahiptir. Bu çalışma, KOA'da Tuina müdahalesi için bilimsel olarak uygulanabilir bir hayvan deney protokolü oluşturmayı ve Tuina'nın mekanizmasını araştırmayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, Shandong Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Bağlı Hastanesi etik komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: 2020-29).
1. Deney hayvanları
- 18, 6 aylık normal dereceli erkek Yeni Zelanda tavşanlarını (2,75 ± 0,25 kg) standart tek kafeslerde (12 saat aydınlık/karanlık döngüsü, sıcaklık 20-24 °C, hava nemi %40-%60) yetiştirin.
2. Gruplama yöntemi
- Rastgele sayı yöntemini kullanarak 18 Yeni Zelanda tavşanından 6'sını sahte grup olarak seçin ve kalan 12 tavşanı modelleme grubuna atayın.
- Başarılı bir modellemeden sonra, modelleme grubu tavşanlarını rastgele sayı yöntemine göre, her grupta 6 tavşan olacak şekilde modele ve Tuina gruplarına bölün.
- Tuina grubunda Tuina müdahalesini gerçekleştirin. Aynı kavrama ve sabitlemeyi Tuina olmadan sahte ve model grubunda gerçekleştirin. 4 hafta boyunca gün aşırı çalıştırın (Şekil 1).
3. KOA modelinin kurulması
- 1. haftada standart durumdaki tavşanlara adaptif besleme yapın. Suya ve yiyeceğe ad libitum erişim. Tavşanları günde 15 dakika sakinleştirmek için tavşan sabitleme kutularına sağ taraflarına yerleştirin. Kafalarını kafa sabitleme plakalarına sabitleyin. Sabitleme plakalarını ve vidaları sabitleyin, böylece tavşanlar hareket edemez. Tavşanları tutarken ve sabitlerken koruyucu eldiven giyin (Şekil 1).
- 2. haftanın 1, 4 ve 7. günlerinde, 18 tavşanın hepsini tavşan sabitleme kutularına sağ taraflarına yerleştirin (Şekil 1). Aşağıda belirtilen işlemleri gerçekleştirin.
- Tavşanın marjinal kulak damarına% 3 pentobarbital sodyum (1 ml / kg) enjekte edin. Tavşanın sol diz eklemini bir hayvan tıraş makinesiyle tıraş edin, böylece açıkta kalan ciltte tüy kalmasın.
- Tıbbi iyodofor ve% 75 alkol kullanarak tavşanın sol diz eklemini içten dışa dezenfekte edin (Şekil 2A).
- Tavşanın sol diz eklemini 60°'de esnetin. Waixiyan'dan bir iğne (22G, 0.7 mm x 30 mm) sokun. Modelleme grubunun diz eklem boşluğuna% 4 papain solüsyonu (0.1 mL / kg, 0.275 kg'lık bir hayvan için ortalama 2.5 mL) enjekte edin. Sahte gruba eşit miktarda% 0.9 sodyum klorür çözeltisi enjekte edin. Bu enjeksiyon dozu, ağrı veya sıkıntı belirtisine neden olmadan hayvan tarafından iyi tolere edilir (Şekil 2B).
NOT: Waixiyan (EX-LE5) patellar ligamanın lateral girintisinde bulunur ve Neixiyan (EX-LE4) patellar ligamanın medial girintisindebulunur 20,21,22. - Çözeltinin dökülmesini önlemek için iğne deliğine 2 dakika basın.
- Ellerinizi tavşanın sol diz ekleminin üstüne ve altına yerleştirin. Tavşanın diz eklemini nazikçe ve pasif olarak esnetin ve çözeltiyi diz eklemi boşluğuna eşit şekilde sızdırmak için fizyolojik hareket aralığı (ROM) içinde 10 kez uzatın15. Modelleme süresince tavşanı her 8 saatte bir gözlemleyin. Tavşanlar saklanma, uzuvlarda titreme, sığ ve hızlı nefes alma, hatta ısırma ve tırmalama belirtileri gösterdiğinde buprenorfin SR (0.18 mg / kg) uygulayın.
- 7. haftada, tavşanın sol dizini şişmiş, diz çevresinde nodüller ve strialar ile artan kas tonusu, artan lokal ağrılı tahriş tepkisi, azalmış diz ROM'u, topal yürüyüş ve ağırlık merkezinin sağlıklı tarafa kayması ile bükülmüş bir pozisyonda gözlemleyin. Bu, KOA modelinin başarısını belirler (Şekil 1, Şekil 2C)23,24.
4. Tuina manipülasyonu
- Tuina manipülasyonundan önce Tuina tekniği parametre belirleme aracını kullanarak eğitim yapın. Aynı profesyonel tarafından 1 ay boyunca günde 1 saat antrenman yapın.
- Döner yoğurma ve presleme yöntemini başparmağınızla Tuina manipülasyon simülasyon platformunda 5 N kuvvet ve 60 kez/dk frekansla gerçekleştirin (Şekil 3A,C).
- Tuina manipülasyon parametre işleme yazılımı ile kuvveti X, Y ve Z eksenlerinin üç yönünde analiz edin ve ekranda görüntülenen kuvvetin büyüklüğünü, frekansını ve etki süresini kontrol edin (Şekil 3B, D).
- Tuina manipülasyonunun mekanik parametrelerini değerlendirin ve eğitim sırasında yazılımı kullanarak Tuina manipülasyonunu standartlaştırın. Başparmakla 5 N'luk bir kuvvetle, 60 kez/dak'lık bir frekansla ve 10 dakikalık sürekli çalışma süresiyle standartlaştırılmış döner yoğurma ve presleme yöntemini koruyun. Şekil 3B,D 25,26,27'deki manipülasyonun standartlaştırılmış kantitatif dalga biçimine bakın.
- Tavşanı sağ tarafına tavşan sabitleme kutusuna yerleştirin. Tavşanı 10 saniye boyunca hafifçe okşayın ve tavşanırahatlatın 21. Ardından Tuina müdahalesini gerçekleştirin.
- Döner yoğurma yöntemini, tavşanın sol diz çevresi kaslarının sertliği, tendon düğümleri ve patella üzerinde, 5 N'luk bir kuvvette ve 5 dakika boyunca 60 kez/dk frekansta yukarı ve aşağı gidiş-dönüş manipülasyonu ile gerçekleştirin.
- Yanglingquan (GB 34), Yinlingquan (SP 9), Waixiyan (EX-LE5), Neixiyan (EX-LE4), Heding (EX-LE2), Xuehai (SP 10), Liangqiu (ST 34) ve Weizhong (BL 40)20,21,22'ye 5 N kuvvetle ve 60 kez/dak frekansla basmak için başparmak ucunu kullanın ve her noktada 30 saniye boyunca çalışın.
- Tavşan diz ekleminde döner düzeltme yöntemini uygulayın ve bunu gruptaki her hayvan için ayrı ayrı 3x uygulayın.
- Femuru bir elinizle sabitleyin. Diğer elinizi önce diz ekleminin arkasına yerleştirin, ardından lateral ve medial tibial kondilleri sırasıyla başparmak ve yüzük parmaklarıyla sabitleyin. Popliteal fossayı işaret ve orta parmaklarla sabitleyin. Çekiş ve büküm kuvveti uygulayın.
- Femuru bir elinizle sabitleyin. Patellanın medial ve lateral kenarlarını diğer elin başparmağı ve küçük parmaklarıyla sabitleyin. Patellar tabanı işaret parmağı, orta ve yüzük parmaklarıyla sabitleyin. Büküm kuvveti uygulayın.
- Çekiş kuvveti yönünü tibianın uzun eksenine paralel ve burulma kuvveti yönünü alt Xiyan'ın yönü ile aynı hizada tutun. Cilt ve parmaklar arasındaki sürtünmeyi önlemek için cildi yerinde tutmak için parmaklarınızı kullanın.
5. Diz eklemi ROM'unun ölçülmesi
NOT: Ölçümden önce tavşanı sakinleştirin. Ölçüm istatistikçisi ve operatörü birbirinden farklıdır.
- Deneyin başında ve her haftanın sonunda her grubun tavşanlarının sol diz ekleminin hareketliliğini ölçün.
- Tavşanı sağ tarafına tavşan sabitleme kutusuna yerleştirin ve sol uyluk kemiğini bir elinizle sabitleyin.
- Tıbbi artroskop çemberinin merkezini, tavşanın sol diz ekleminin lateral merkezi ile hizalayın. Sabitleme kolunu, dairenin merkezini daha büyük trokantere bağlayan hat uzantısına paralel olacak şekilde uzatın. Hareketli kolu, tibianın uzunlamasına eksenine paralel olacak şekilde uzatın.
- Diğer elinizi tibianın uzunlamasına eksenine, diz ekleminden yaklaşık 9 cm uzağa yerleştirin. 750°/s850° açısal hızda yaklaşık 3-28 g torku manuel olarak uygulayın.
- Tavşanın diz eklemi artık hareket etmeyene kadar bunu yapın. Eklem hareket etmeyi bıraktığında açıölçerin gösterdiği derece sayısını kaydedin; bu diz eklemi ROM'udur. Okurken, görüş hattının cetvelin yüzeyine dik olduğundan emin olun.
- Her diz için ROM'u 3x ölçün ve ortalama değeri28 alın.
6. Hematoksilen-eozin (HE) boyama
- Numune koleksiyonu
- Müdahalenin bitiminden 1 hafta sonra (Şekil 1), tavşanı sağ tarafına tavşan sabitleme kutusuna yerleştirin (tavşanların sağ taraflarına yatarken rahat kalma olasılıkları daha yüksektir). İnsancıl ötenazi için tavşanın kulağı marjinal damarına pentobarbiton (100 mg/kg) enjekte edin29,30.
- Distal femur kıkırdağının etrafına yapışan yumuşak dokuyu çıkarmak için sol diz boşluğunu neşter, makas ve hemostatik forseps ile hızlı bir şekilde açın.
- Distal femurdan yaklaşık 1 cm x 1 cm boyutlarında bir kıkırdak-kemik örneği ısırma forseps ile toplayın ve temizlik için tuzlu suya koyun.
- Fiksasyon ve dekalsifikasyon
- Kıkırdağı %4 paraformaldehit çözeltisine yerleştirin ve 72 saat sabitleyin.
- Akan suda 12 saat durulayın. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) dekalsifikasyon solüsyonunda 6 hafta boyunca kireçten arındırın. EDTA dekalsifikasyon solüsyonunu her 3 günde bir değiştirin. Kemik dokusu yumuşak ve esnek hale geldiğinde, kolayca bükülebildiğinde ve bir iğne ile düzgün bir şekilde delindiğinde dekalsifikasyonun son noktasını belirleyin31.
- Gömülü bölümlerin dehidrasyonu
- Numuneyi dehidrasyon için otomatik bir kurutucuya yerleştirin.
- Mumlanmış ve kesilmiş dokuyu 1 saat boyunca çözünmüş parafin mumu içeren kare bir kabın dibine yerleştirin. Soğuyana ve sert bloklar halinde katılaşana kadar bir soğutma fırınına koyun. Parafine gömülü doku bloğunu bir dilimleyicide 4 μm kalınlığa kadar dilimleyin.
- Bölümleri çamaşır suyu makinesinde açın, ardından yapışkan slaytlara yerleştirin, numaralandırın ve bir dilim fırın makinesi ve fırınla kurutun.
- Ağda giderici ve nemlendirme
- Bölümleri 65 °C'de 60 dakika pişirin.
- Bölümleri 7 dakika ksilen içinde bekletin, ardından her biri 7 dakika taze ksilen içinde 2 tur daha bekletin.
- Dilimi susuz etanolde 5 dakika bekletin, ardından her biri 2 dakika %95 etanol, %85 etanol ve %75 etanol içinde bekletin.
- Bölümleri 2 dakika damıtılmış suda bekletin.
- Hematoksilen boyama: Bölümleri 20 saniye boyunca hematoksilen ile boyayın. Bölümleri akan suda durulayın. Bölümleri 3 saniye boyunca hidroklorik asit etanol fraksiyonasyonunda bekletin. Bölümleri musluk suyunda 5 dakika durulayın.
- Eozin yeniden boyama: 30 saniye boyunca eozin ile boyayın. Bölümleri musluk suyuyla durulayın.
- Numunenin şeffaflığı için dehidrasyon
- Bölümleri her biri 3 saniye boyunca iki kez %95 etanol içine yerleştirin, ardından 3 saniye boyunca susuz etanol içine yerleştirin.
- Yine, dilimleri 1 dakika susuz etanol içine koyun, ardından her biri 1 dakika boyunca 2 tur ksilen yıkayın.
- Dilimlerin kapatılması: Dilimleri çıkarın, nötr sakız kapatıcıyı bırakın, bir lamel ile örtün ve dilimleri kokusuz olana kadar çeker ocakta kurumaya bırakın.
- Numunenin fotoğraflanması: 100x'te bir ışık mikroskobunun görüş alanı altında gözlemleyin ve fotoğraflayın.
- Değerlendirme: Kıkırdak dokusunu her grup için Mankin skoru ile değerlendirin32.
7. Veri analizi
- Analiz yazılımı kullanarak deneysel verileri istatistiksel olarak analiz eder. Veriler normal dağılıma tabi tutulduğunda, iki grup örneklemi t-testi ile ve birden fazla grubu tek yönlü ANOVA ile karşılaştırın.
- Sonuçları ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edin. Ticari yazılım kullanarak sonuçları istatistiksel grafikler olarak gösterin. Farklılıklar p < 0.05'te istatistiksel olarak anlamlıydı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kısıtlı diz hareketi ve kıkırdak dokusu hasarının derecesi KOA'nın ciddiyetini yansıtır. Diz ekleminin ROM'u, diz eklemi hareketinin kısıtlanma derecesini yansıtır. Diz eklemi ROM'u ne kadar küçükse, diz eklemi hareketinin kısıtlılığı o kadar ciddi olur. Aksine, diz eklemi ROM'u ne kadar büyükse, diz hareketinin derecesi o kadar normaldir. Kıkırdak dokusunun morfolojisini ve yapısını gözlemlemek için yapılan HE boyama, kıkırdak dokusu hasarının derecesini yansıtır. Kıkırdak dokusunun yüzeyi ne kadar düzensiz olursa, çatlak ve kusurların varlığı o kadar yüksek olur, kondrosit sayısı o kadar az olur, kıkırdak tabakasının kalınlığı o kadar ince olur, hücrelerin düzeni o kadar düzensiz, hücrelerin dağılımı o kadar düzensiz olur, tabakalar ne kadar belirsiz olursa, gelgit çizgisi o kadar az net ve eksiksiz olur, Mankin skoru ne kadar yüksekse, diz ekleminin kıkırdak dokusundaki hasar o kadar ciddi olur ve tam tersi, kıkırdak dokusu o kadar normaldir32. KOA modeli oluşturulurken, tavşan diz eklemi hareketininkısıtlanma derecesi 23,24 gözlemlenerek modellemenin başarısı belirlenebilir. Tuina'nın etkinliği, tavşan diz eklemine Tuina12 tarafından müdahale edildiğinde diz eklemi hareketinin kısıtlılık derecesinin ve kıkırdak doku hasarının derecesinin iyileşmesi gözlemlenerek belirlenebilir.
7. haftadan sonra, iki tavşan grubunun sol diz ekleminin karşılaştırılması, modelleme grubundaki kasların daha sert olduğunu ve hareketin sınırlı olduğunu, 74.67° ± 1.21°'lik bir ROM ile sahte gruptaki 140.17° ± 1.33°'den daha düşük olduğunu ortaya çıkardı ve başarılı modellemeyi düşündürdü.
Ölçüm ve analizin 12. haftasından sonra, sham grubunun, model grubunun ve Tuina grubunun diz eklemi ROM'u sırasıyla 140.33° ± 1.37°, 76.33° ± 1.37° ve 134.33° ± 1.51° idi ve Tuina grubunun diz eklemi hareketliliği model grubundan anlamlı olarak yüksekti (p < 0.01), bu da Tuina'nın KOA tavşanlarının diz eklem fonksiyonunu iyileştirebileceğini gösteriyordu (Şekil 5).
Her gruptaki tavşanların sol diz ekleminin kıkırdağının boyanması, sahte grubun kıkırdak doku yüzeyinin pürüzsüz ve sağlam olduğunu, kondrosit sayısının 331.67 ± 13.98 olduğunu, kıkırdak tabakasının kalınlığının 259.42 ± 41.97 μm olduğunu, hücrelerin iyi düzenlenmiş ve eşit dağılmış olduğunu, seviyelerin net olduğunu, gelgit çizgileri açık, sürekli ve eksiksizdi ve Mankin'in puanı 0.33 ± 0.52 idi. Sham grubu ile karşılaştırıldığında, model grubunun kıkırdak doku yüzeyi defekt ve fissürlerle düzensiz, kondrosit sayısı 29.50 ± 8.04, kıkırdak tabakasının kalınlığı 103.15 ± 24.64 μm, hücreler düzensiz, düzensiz dağılmış, tabakalar net değildi, gelgit çizgileri net ve eksik değildi ve Mankin skoru 9.33 ± 1.03 idi. Model grubuyla karşılaştırıldığında, Tuina grubunun kıkırdağı daha az kusur ve fissür ile düzenli bir yüzeye sahipti, kondrosit sayısı 291.83 ± 8.18, kıkırdak tabakasının kalınlığı 183.58 ± 15.34 μm, hücreler daha düzenli düzenlenmiş, biraz düzensiz dağılmış, katmanlar daha net ve gelgit çizgileri nispeten net ve eksiksizdi, Mankin'in skoru ise 3.00 ± 0.63 (Şekil 6)15,23,33 olarak bulunmuştur. Tuina grubundaki hücre sayısı, kıkırdak tabakası kalınlığı ve Mankin skoru model grubundakilerden anlamlı olarak daha iyiydi (p < 0.001), bu da Tuina'nın hasarlı kıkırdak dokusunu onarabildiğini gösteriyordu.
Şekil 1: KOA model tavşanların kurulması ve Tuina protokolü. Tavşanların 1 hafta boyunca adaptif beslenmesinden sonra, modellemenin başlamasının 1, 4 ve 7. günlerinde% 4 papain solüsyonu enjeksiyonları ile 6 hafta boyunca tavşanların sol diz ekleminde KOA modelini oluşturun. Tavşanların sol diz eklemine Tuina tarafından 4 hafta boyunca iki günde bir 1 kez müdahale edin. 1 haftalık beslenmeden sonra, tavşanların sol diz ekleminin ROM'unu ölçün ve örnekler alın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: KOA modelinin kurulması . (A) Tavşanların sol diz eklemi hazırlandı ve dezenfekte edildi. (B) İğne Waixiyan'dan sokuldu ve sırasıyla% 4 papain çözeltisi ve% 0.9 sodyum klorür çözeltisi, tavşanların modelleme ve sahte gruplarının diz eklem boşluğuna enjekte edildi. (C) Sol diz ekleminin sınırlı hareketi ile başarılı bir şekilde kalıplanmış KOA model tavşanlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tuina tekniği parametre belirleme aracı kullanılarak Tuina teknikleri eğitimi. (A) Başparmağınızla döner yoğurma yöntemi için antrenman yapın. (B) Başparmakla döner yoğurma yönteminin eğrisi. (C) Presleme yöntemini başparmak ucuyla eğitin. (D) Başparmak ucu ile presleme yönteminin eğrisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tavşanlarda modelleme öncesi ve sonrası sol diz eklemi ROM'u. Veriler sham ve modelleme gruplarına ait t-testi ile işlendi ve sonuçlar ortalama ± SD. ns p > 0.05, ***p < 0.001 olarak ifade edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tavşanların sol diz eklemi ROM'u. Sham, model ve Tuina grupları için veriler ANOVA ile işlendi ve sonuçlar ortalama ± SD olarak ifade edildi. 1. haftada, ROM her üç grupta da biraz arttı. Sham grubu ile karşılaştırıldığında, modelleme sırasında model ve Tuina gruplarında ROM giderek azalmıştır (p < 0.001). Model grubunun aksine, Tuina grubuna yapılan müdahaleden sonra ROM kademeli olarak arttı (p < 0.001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Tavşan diz eklemi kıkırdağının HE boyaması. (A) Sahte grubun HE boyaması. (B) Model grubunun HE boyaması. (C) Tuina grubunun HE boyaması. (D) Gruplar arasında kondrosit sayısının karşılaştırılması. (E) Gruplar arasında kıkırdak tabakası kalınlığının karşılaştırılması. (F) Mankin puanının gruplar arasında karşılaştırılması. Veriler ANOVA ile işlendi ve sonuçlar ortalama ± SD olarak ifade edildi. 12 hafta sonra, HE boyamasında görüldüğü gibi, grubun kıkırdak dokusu normal hücre sayısı ve dizilimi ile yapısal olarak sağlamdı; Model grubunun kıkırdak dokusu düşük hücre sayısı ve düzensiz dizilim ile yapısal olarak tahrip edildi; Tuina grubunun kıkırdak dokusu nispeten normal hücre sayısı ve düzenlemesi ile sağlamdı. ***p < 0.001. Ölçek çubuğu = 100 μm. N =6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deneysel protokolün tasarımı, Tuina'nın KOA tedavisindeki mekanizmasını araştırmak için özellikle önemlidir. KOA modellemesi, Waixiyan'da papain enjeksiyonu ile tavşanlar üzerinde gerçekleştirildi. Waixiyan, bulunması kolay olan patellar ligamanın lateral kriptinde bulunur ve diz fleksiyonu sırasında femur ve tibia arasındaki eklem boşluğu burada büyüktür, bu da diz eklemi boşluğuna enjekte edilmesini kolaylaştırır ve çevre dokulara zarar gelmesini önler, bu nedenle KOA modelini oluşturmak kolaydır34. KOA tavşanlarına Tuina müdahalesi sırasında, model tavşanlar Tuina uygulamasını kolaylaştırmak için uygun şekilde konumlandırıldı. Tavşanlar, başları sabit olacak şekilde sağlıklı taraflarındaki tavşan sabitleme kutusuna yerleştirildi ve tüm vücutlarını gevşetmek ve mücadele etmemek için duyguları yatıştırıldı. Tuina'nın gücünü ve sıklığını standartlaştırmak ve Tuina müdahalelerinin homojenliğini artırmak için Tuina, Tuina tekniği parametre belirleme cihazı ile Tuina manipülasyonu konusunda sıkı bir eğitim almış bir operatör tarafından gerçekleştirilir.
Bu protokoldeki en önemli adım, KOA'yı tedavi etmek için diz eklemi döner düzeltme yöntemi ile birlikte Tuina'nın kullanılmasıdır. Ameliyattan önce, tavşanın etkilenen alt ekstremitesi kalçadan ayak bileğine kadar palpe edildi, diz eklemi etrafındaki alana odaklanıldı, tendon düğümleri ve kas sertliği araştırıldı ve ardından hassas Tuina manipülasyonu için Neixiyan ve Waixiyan'ın yüksekliğini gözlemlemek için diz eklemi esnetildi ve uzatıldı. Döner yoğurma ve presleme yöntemi kas gerginliğini ve spazmı serbest bırakabilir, diz eklemindeki kan dolaşımını iyileştirebilir, enflamatuar maddelerin metabolizmasını teşvik edebilir ve şişlik ve ağrıyı azaltabilir35,36. Akupunktur noktaları hastalığın yanıt ve tedavi noktalarıdır ve GB 34 ve EX-LE2 KOA tedavisi için duyarlılığı yüksek noktalardır ve bunları uyararak mast hücrelerine etki edebilirler, böylece 5-hidroksitriptamin, triptaz ve histamin37 salınımını etkilerler. Veri madenciliği, GB 34, SP 9, EX-LE5, EX-LE4, EX-LE2, SP 10, ST 34 ve BL 40'ın klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan akupunktur noktaları olduğunu ortaya koymuştur38,39. Bu noktaların tendon ve düğümleri rahatlatma, kan dolaşımını harekete geçirme ve ağrıyı hafifletme etkileri vardır38,39. Çalışmalar, yukarıdaki akupunktur noktalarının uyarılmasının, tümör nekroz faktörü-α ve interlökin-1β gibi inflamatuar faktörlerin serum seviyelerini azaltabileceğini ve kondrosit iskeletinin yıkımını engelleyebileceğini ve böylece KOA 39,40,41'i tedavi edebileceğini göstermiştir.
Ayarlanabilir kuvvet seviyelerine sahip aktif direnç egzersizleri altında gerçekleştirilen diz eklemi döner düzeltme yöntemi, fleksiyon ve kompresyon gibi pasif hareket tekniklerine kıyasla diz yapısının düzenlenmesinde kolay uygulanabilir ve olası yaralanma riskini önler. Açı torku etkiler ve diz ekleminin iç kapanma torku ile abdüksiyon torku arasındaki dengesizlik anormal eklem yükünü artırabilir ve bu da KOA42,43,44,45'i tetikleyebilir. Bazı çalışmalar, düzenli direnç egzersizi ile Tuina müdahalesinin kemik yoğunluğunu iyileştirebileceğini, kas spazmlarını serbest bırakabileceğini, kas kütlesini ve gücünü geri kazandırabileceğini, ağrıyı azaltabileceğini ve KOA 46,47,48,49,50'yi etkili bir şekilde tedavi edebileceğini göstermiştir. Tavşan dizi, insan dizinden daha küçük olduğundan ve istemli direnç hareketlerini gerçekleştiremediğinden, direnç altında diz eklemi döner düzeltme yönteminin daha iyi etkinliğini ve kullanım kolaylığını sağlamak için orijinal iki kişilik Tuina, tek kişilik, iki elli bir Tuina olarak değiştirildi12. Şimdi, direnç hareketini simüle etmek için tavşanın uyluk kemiğini bir elle sabitleyerek, diğer el, alt Xiyan'a büküm ve çekiş kuvveti uygulayarak diz eklemi döner düzeltme yöntemini gerçekleştirmek için kullanılır, böylece Waixiyan ve Neixiyan aynı yükseklikte olur ve medial ve lateral tibial platonun nispi yüksekliği ayarlanır. Diz eklemi ayrıca içe ve dışa doğru torklarını düzenlemek, eksenel hizalamayı teşvik etmek, femorotibial ve femoropatellar eklemlerin hizalamasını ayarlamak, diz ekleminin normal kuvvet yapısını eski haline getirmek, diz eklemi yükünü azaltmak, diz eklemi stabilitesini artırmak ve diz ekleminin normal hareketliliğini ve fizyolojik işlevini eski haline getirmek için içe ve dışa doğru ayarlanabilir42, 43,44,45.
Ekibin önceki klinik çalışmaları, bu yöntemin KOA tedavisinde etkinliğini göstermiştir ve hayvan çalışmaları, KOA12 tedavisinde glukozamin sülfattan daha etkili olduğunu göstermiştir. Tuina, interlökin 1β (IL-1β) ve hücre dışı sinyal regüle kinaz 1/2 (ERK1 / 2) -nükleer transkripsiyon faktörü κB (NF-κB) sinyal yollarına aracılık edebilir, tavşan periferik serumunda ve eklem sıvısında IL-1β konsantrasyonunu azaltabilir, B hücreli lenfoma-2'nin (Bcl-2) ekspresyon seviyesini arttırır ve ERK1 / 2, Bcl-2 ilişkili x proteini, NF-κB p65 ve sistein aspartat proteaz 3'ün ekspresyon seviyelerini azaltır. Bu, kondrositlerin apoptozunu ve proliferasyonunu düzenlemeye ve düzensiz kondrosit iç ortamını dengelemeye yardımcı olur, böylece kıkırdaktaki patolojik değişiklikleri iyileştirir12.
Bu yöntemin sınırlaması, Tuina'nın müdahalesinin bir makineden ziyade bir insan tarafından gerçekleştirilmesi ve operatörün Tuina'nın mukavemetinde ve frekansında tam bir homojenlik elde etmesinin zor olmasıdır.
Sonuç olarak, Tuina diz eklemlerinin iltihaplanmasını etkili bir şekilde azaltabilir, diz kıkırdağının dejenerasyonunu engelleyebilir ve normal fizyolojik hareketliliği kademeli olarak geri kazanabilir ve bu çalışma, diz eklemi hastalıklarının Tuina tedavisinin mekanizması için bilimsel ve uygulanabilir bir araştırma protokolü sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir potansiyel çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Shandong Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Projesi (2021Q080) ve Qilu Geleneksel Çin Tıbbı Okulu Akademik Okul Miras Projesi [Lu-Wei-Letter (2022) 93] tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % sodium chloride injection | Sichuan Keren Pharmaceutical Co. | Z22121903 | |
| -20°C refrigerator | Haier | BD-328WL | |
| 4 % fixative solution | Solarbio | P1110 | |
| 4°C refrigerator | Haier | SC-315DS | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm | ||
| Automatic tissue dewatering machine | Dakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co. | HP30 | |
| Blast drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co. | DHG-9070A | |
| Coverslip | Biyuntian | FCGF50 | |
| Electric thermostat water bath | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co. | HWS-26 | |
| Embedding freezing table | Changzhou Paishijie Medical Equipment Co. | BM450 | |
| Embedding machine | Changzhou Paishijie Medical Equipment Co. | BM450A | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid decalcification solution | Servicebio | G1105-500ML | |
| Fluorescent inverted microscope | Leica | Leica DM IL LED | |
| Hematoxylin-eosin staining kit | Cisco Jet | EE0012 | |
| Hydrochloric acid | Laiyang Economic and Technological Development Zone Fine Chemical Plant | ||
| Medical joint goniometer | KOSLO | ||
| Neutral gum | Cisco Jet | EE0013 | |
| Normal-grade male New Zealand rabbit | Jinan Xilingjiao Breeding and Breeding Center | SCXK (Lu) 2020 0004 | |
| Papain(3000 U/mg) | Bioss | D10366 | |
| Pathological tissue bleaching and drying instrument | Changzhou Paishijie Medical Equipment Co. | PH60 | |
| Pet electric clippers | Codos | CP-3180 | |
| Rabbit fixing box | any brand | ||
| Rotating Slicer | Leica | 531CM-Y43 | |
| Tuina technique parameter determination instrument | Shanghai DuKang Instrument Equipment Co. Ltd. | ZTC- |
|
| Ventilator | TALY ELECTRIC | C32 | |
| Xylene | Fuyu Reagent |
References
- Long, H. B., et al. Prevalence trends of site-specific osteoarthritis from 1990 to 2019: findings from the global burden of disease study 2019. Arthritis & Rheumatology. 74 (7), 1172-1183 (2022).
- Tschopp, M., et al. A randomized trial of intra-articular injection therapy for knee osteoarthritis. Investigative Radiology. 58 (5), 355-362 (2023).
- Buchanan, W. W., Kean, C. A., Kean, W. F., Rainsford, K. D.
- Wang, W. Y., et al. A randomized, parallel control and multicenter clinical trial of evidence-based traditional Chinese medicine massage treatment VS External Diclofenac Diethylamine Emulgel for the treatment of knee osteoarthritis. Trials. 23 (1), 555 (2022).
- Wang, M. N., et al. Mechanism of traditional Chinese medicine in treating knee osteoarthritis. Journal of Pain Research. 13, 1421-1429 (2020).
- Katz, J. N., Arant, K. R., Loeser, R. F. Diagnosis and treatment of hip and knee osteoarthritis: A review. The Journal of the American Medical Association. 325 (6), 568-578 (2021).
- Chang, A., et al. The relationship between toe-out angle during gait and progression of medial tibiofemoral osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 66, 1271-1275 (2007).
- Jenkyn, T. R., Hunt, M. A., Jones, I. C., Giffin, J. R., Birmingham, T. B. Toe-out gait in patients with knee osteoarthritis partially transforms external knee adduction moment into flexion moment during early stance phase of gait: a tri-planar kinetic mechanism. Journal of Biomechanics. 41 (2), 276-283 (2008).
- Brouwer, G. M., et al. Association between valgus and varus alignment and the development and progression of radiographic osteoarthritis of the knee. Arthritis & Rheumatism. 56 (4), 1204-1211 (2007).
- Liao, C. D., et al. Effects of protein supplementation combined with resistance exercise training on walking speed recovery in older adults with knee osteoarthritis and sarcopenia. Nutrients. 15 (7), 1552 (2023).
- Thudium, C. S., et al. Cartilage tissue turnover increases with high-compared to low-intensity resistance training in patients with knee OA. Arthritis Research & Therapy. 25 (1), 22 (2023).
- Zheng, L. J., et al. Shutiao Jingjin massage can stabilize intracellular environment of rabbit chondrocytes following knee osteoarthritis-induced cartilage injury. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 27, (2023).
- Liu, K. Q., et al. Efficacy and safety of Tuina (Chinese therapeutic massage) for knee osteoarthritis: A randomized, controlled, and crossover design clinical trial. Frontiers in Medicine. 10, 997116 (2023).
- Wang, Z., et al. Systematic Review and Network Meta-analysis of Acupuncture Combined with Massage in Treating Knee Osteoarthritis. BioMed Research International. 2022, 4048550 (2022).
- Li, Y. Y., et al. Therapeutic effect of acupotomy at Sanheyang for cartilage collagen damage in moderate knee osteoarthritis: a rabbit model. Journal of Inflammation Research. 16, 2241-2254 (2023).
- Guo, G. X., et al. Cerebral mechanism of Tuina analgesia in management of knee osteoarthritis using multimodal MRI: study protocol for a randomised controlled trial. Trials. 23 (1), 694 (2022).
- Perlman, A., et al. Efficacy and safety of massage for osteoarthritis of the knee: a randomized clinical trial. Journal of General Internal Medicine. 34 (3), 379-386 (2019).
- Chen, B. J., et al. Aerobic exercise combined with glucosamine hydrochloride capsules inhibited the apoptosis of chondrocytes in rabbit knee osteoarthritis by affecting TRPV5 expression. Gene. 830, 146465 (2022).
- Rasheed, M. S., Ansari, S. F., Shahzadi, I. Formulation, characterization of glucosamine loaded transfersomes and in vivo evaluation using papain induced arthritis model. Scientific Reports. 12 (1), 19813 (2002).
- Li, Z. R.
- Hu, Y. L.
- Liu, J., et al. Effects of "knot-loosing" of acupotomy on motor function and morphological changes of knee joint in knee osteoarthritis rabbits. Zhen Ci Yan Jiu. 46 (2), 129-135 (2021).
- Li, Q., et al. The protective effects and mechanism of Ruyi Zhenbao Pill, a Tibetan medicinal compound, in a rat model of osteoarthritis. Journal of Ethnopharmacology. 308, 116255 (2023).
- Kwon, M., Nam, D., Kim, J. Pathological characteristics of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis in rats. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 20 (3), 435-446 (2023).
- Wang, J. G., Tang, C. L.
- Fang, M., Song, B. L.
- Jin, X. Y., Yu, Y. Y., Lin, Y. Y., Yang, J. P., Chen, Z. H. Tendon-regulating and bone-setting manipulation promotes the recovery of synovial inflammation in rabbits with knee osteoarthritis via the TLR4-MyD88-NF-κB signaling pathway. Annals of Translational Medicine. 11 (6), 245 (2023).
- Wang, M., Liu, C., Xiao, W. Intra-articular injection of hyaluronic acid for the reduction in joint adhesion formation in a rabbit model of knee injury. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy: Official Journal of the ESSKA. 22 (7), 1536-1540 (2014).
- Xu, C., et al. Bacterial cellulose membranes used as artificial substitutes for dural defection in rabbits. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10855-10867 (2014).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Schaumburg: American Veterinary Medical Association. 2020, (2020).
- Amirtham, S. M., Ozbey, O., Kachroo, U., Ramasamy, B., Vinod, E. Optimization of immunohistochemical detection of collagen type II in osteochondral sections by comparing decalcification and antigen retrieval agent combinations. Clinical Anatomy. 33 (3), 343-349 (2020).
- Niazvand, F., et al. Curcumin-loaded poly lactic-co-glycolic acid nanoparticles effects on mono-iodoacetate-induced osteoarthritis in rats. Veterinary Research Forum: An International Quarterly Journal. 8 (2), 155-161 (2017).
- Liu, A., et al. Intra-articular injection of umbilical cord mesenchymal stem cells loaded with graphene oxide granular lubrication ameliorates inflammatory responses and osteoporosis of the subchondral bone in rabbits of modified papain-induced osteoarthritis. Frontiers in Endocrinology. 12, 822294 (2022).
- Hall, M. M. The accuracy and efficacy of palpation versus image-guided peripheral injections in sports medicine. Current Sports Medicine Reports. 12 (5), 296-303 (2013).
- Xing, L., et al. Traditional Chinese medicine ointment combined with Tuina therapy in treatment of pain and swelling after total knee arthroplasty. World Journal of Orthopedics. 13 (10), 932-939 (2022).
- Xu, H., et al. The effectiveness of Tuina in relieving pain, negative emotions, and disability in knee osteoarthritis: a randomized controlled trial. Pain Medicine. 24 (3), 244-257 (2023).
- Ding, N., et al. Mast cells are important regulator of acupoint sensitization via the secretion of tryptase, 5-hydroxytryptamine, and histamine. The Public Library of Science One. 13 (3), e0194022 (2018).
- Cai, F. H., Li, F. L., Zhang, Y. C., Li, P. Q., Xiao, B. Research on electroacupuncture parameters for knee osteoarthritis based on data mining. European Journal of Medical Research. 27 (1), 162 (2022).
- Mei, Z. G., Cheng, C. G., Zheng, J. F. Observations on curative effect of high-frequency electric sparkle and point-injection therapy on knee osteoarthritis. Journal of Traditional Chinese Medicine. 31 (4), 311-315 (2011).
- Xiao, G., et al. Effect of manipulation on cartilage in rats with knee osteoarthritis based on the Rho-associated protein kinase/LIM kinase 1/Cofilin signaling pathways. Journal of Traditional Chinese Medicine. 42 (2), 194-199 (2022).
- Wu, M. X., et al. Clinical study on the treatment of knee osteoarthritis of Shen-Sui insufficiency syndrome type by electroacupuncture. Chinese Journal of Integrative Medicine. 16 (4), 291-297 (2010).
- Richards, R. E., Andersen, M. S., Harlaar, J., van den Noort, J. C. Relationship between knee joint contact forces and external knee joint moments in patients with medial knee osteoarthritis: effects of gait modifications. Osteoarthritis Cartilage. 26 (9), 1203-1214 (2018).
- Shull, P. B., et al. Toe-in gait reduces the first peak knee adduction moment in patients with medial compartment knee osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 46 (1), 122-128 (2013).
- Adouni, M., Shirazi-Adl, A. Partitioning of knee joint internal forces in gait is dictated by the knee adduction angle and not by the knee adduction moment. Journal of Biomechanics. 47 (7), 1696-1703 (2014).
- Kutzner, I., Trepczynski, A., Heller, M. O., Bergmann, G. Knee adduction moment and medial contact force--facts about their correlation during gait. The Public Library of Science One. 8 (12), e81036 (2013).
- Camacho-Cardenosa, A., et al. Resistance circuit training combined with hypoxia stimulates bone system of older adults: a randomized trial. Experimental Gerontology. 169, 111983 (2022).
- Babur, M. N., Siddiqi, F. A., Tassadaq, N., Arshad Tareen, M. A., Osama, M. Effects of glucosamine and chondroitin sulfate supplementation in addition to resistance exercise training and manual therapy in patients with knee osteoarthritis: A randomized controlled trial. The Journal of the Pakistan Medical Association. 72 (7), 1272-1277 (2022).
- Wang, H. N., et al. Effect of low-load resistance training with different degrees of blood flow restriction in patients with knee osteoarthritis: study protocol for a randomized trial. Trials. 23 (1), 6 (2022).
- Cheon, Y. H., et al. Relationship between decreased lower extremity muscle mass and knee pain severity in both the general population and patients with knee osteoarthritis: Findings from the KNHANES V 1-2. The Public Library of Science One. 12 (3), e0173036 (2017).
- Murton, A. J., Greenhaff, P. L. Resistance exercise and the mechanisms of muscle mass regulation in humans: acute effects on muscle protein turnover and the gaps in our understanding of chronic resistance exercise training adaptation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (10), 2209-2214 (2013).
