Summary
このプロトコルは、酷使誘発性腱炎の 生体内 モデルのために、ラットアキレス腱に定量化可能で制御された疲労損傷を誘発するために使用される試験システムを提示します。この手順は、ラットの足首を、カスタム記述のMATLABスクリプトで受動的な足首背屈を実行する関節アクチュエーターに固定することで構成されます。
Abstract
腱鞘炎は、痛みや機能喪失を引き起こす慢性的な腱の状態であり、腱の繰り返しの過負荷と限られた回復時間によって引き起こされます。このプロトコルは、ラットのアキレス腱に受動背屈を介して機械的負荷を周期的に加える試験システムについて説明しています。カスタム記述のコードは、荷重プロトコルの影響を評価するための繰返し荷重前および繰返し荷重後の測定と、フィードバック制御ベースの繰返し疲労荷重レジメンで構成されています。
この研究では、25匹のSprague-Dawleyラットを使用し、グループあたり5匹のラットに500、1,000、2,000、3,600、または7,200サイクルの疲労荷重を受けました。ヒステリシス、ピーク応力、および載荷および除荷係数の繰返し荷重前および繰返し荷重後の測定値の差の割合を計算しました。この結果は、システムが加えられた荷重の数に基づいてアキレス腱にさまざまな程度の損傷を誘発できることを実証しています。このシステムは、疲労による使いすぎによる腱損傷の in vivo モデルのために、定量的および生理学的にさまざまな程度の周期的な負荷をアキレス腱に適用する革新的なアプローチを提供します。
Introduction
腱は筋肉と骨をつなぎ、生涯を通じて毎日反復運動を経験するため、痛みを伴い、制限され、機械的機能が損なわれ、人口の30〜50%に影響を与える過度の怪我をする可能性が高くなっています1。腱鞘炎は、反復的な疲労運動と怪我前のレベルへの不十分な治癒による使いすぎによる怪我と見なされる慢性疾患です。回旋筋腱板、肘、アキレス腱、膝蓋腱など、上肢と下肢の両方が一般的に影響を受けます2,3,4,5。アキレス腱鞘炎は、ランニングやジャンプを含む活動、特に陸上競技、中長距離走、テニス、その他の球技に関与するアスリートによく見られ、ランナーの7〜9%が罹患しています6,7。ランニングやジャンプによる怪我は、アキレス腱や膝蓋腱炎の危険因子である足首の背屈を制限する可能性もあります8,9,10。したがって、腱鞘炎のより良い評価と特徴付けが必要であり、この研究は、使いすぎのアキレス腱損傷に対する受動的な足首背屈のラットモデルとして提供できます。
小動物モデルを用いたこれまでの研究は、腱鞘炎の発症とマーカーの研究を目的としていました。これらには、トレッドミル運動、反復リーチング、直接腱負荷、コラゲナーゼ注射、手術、および in vitro 研究が含まれます11、12、13、14、15、16。文献は、これらの腱鞘炎モデルを採用することによる損傷マーカーの同定から恩恵を受けていますが、制限には、腱の直接負荷の場合のように、生理学的に関連性のない関節運動で腱に負荷をかけること、トレッドミル研究など、加えられた負荷を直接測定しないこと、およびコラゲナーゼ注射の場合のように生理学的過剰使用を使用しないことが含まれます。 とりわけ。そのために、本研究では、アキレス腱に定量的な負荷を非侵襲的に加え、これまでに開発した小動物モデルの腱鞘炎のギャップを埋めるために、使いすぎによる腱炎研究への応用を目指しました。パイロット研究を実施して、システムがさまざまな負荷サイクルにわたって機械的特性に再現性のある変化を引き起こすことを実証しました。このシステムは、生理学的に適切な動きと負荷を可能にし、過剰使用を誘発すると同時に、負荷レジメン中に腱に加えられ、腱が受ける力を定量化して測定します。
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Protocol
この研究は、ベス・イスラエル・ディーコネス・メディカル・センターの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)の承認に従って実施されました。動物は、誘導に5%のイソフルラン、維持に2.5%のイソフルランを使用して麻酔され、低体温症にならないように注意が払われました。
1. 試験システムのセットアップ
- ステッピングモーターで足首のパッシブ回転を制御し、安定した回転とトルクを適用します。ステッピングモーターをマイコンで制御します。3D 位置および方向システムからの入力を使用して、回転角度をマークします。トルクセンサーからの出力を使用して、しきい値の限界に達しない場合に背屈角度を大きくするためのフィードバック制御を提供します。
- まず、マイクロコントローラ、トルクセンサ、3D電磁測位、および方位システムをコンピュータと電源に接続します。自社開発のMATLABコードを使用してカスタムビルドシステムを制御します(図1)。GitHub から MATLAB コード ファイルをダウンロードし、GitHub ページの手順 (https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem) からコードの実行に関する具体的な指示に従います。
- コード ファイルを使用して MATLAB を開きます。PDImfc ソフトウェアを開き、3D 電磁位置決めおよび姿勢システムを MATLAB プログラムに接続します。[ 接続] |連続P&O |StartSockExport()を呼び出します。アプリケーションをバックグラウンドで開いたままにします。
2. 生体外および事後分析
- 6匹の13週齢のSprague-DawleyラットをCO2 吸入と開胸術による二次的な安楽死法で安楽死させる。右アキレス腱を踵骨と筋腱接合部をそのままにして解剖します。-20°Cで凍結して、後で機械的試験を行います。腱を融解し、細かく解剖し、機械的試験の準備をした後、腱の極限引張強度(UTS)を得るために、破断するまで引張荷重を行います(0.1Nまでの予圧、0.1〜1Nの10サイクルのプレコンディショニング、0.1 mm / sの一定変位で破損するまでのランプ)。UTSの15%をシステムの入力として使用し、ステップ3.4で説明するように、後のステップのプレコンディショニングを実行します。
- 5匹の動物の別のグループを、モーメントアームとひずみの測定のために同じ手順で安楽死させます。足首を90°背屈にして左脚のX線撮影を定規の横で行います。フィジーでX線画像を開き、画像内の定規を基準として、MATLABコードの入力として使用する足首関節の回転中心から足首の裏側までの腱モーメントアームを測定し、ステップ2.1で説明したプリコンディショニングの入力力を対応するトルク値に変換し、出力トルクと力の変換をデータ解析に使用します。
- 2本のスプリントをテープで固定し、膝を完全に伸ばして左後肢を固定します。つま先を押して足首を軽く背屈させ、足首の回転が周囲の軟部組織を巻き込むのではなく、孤立した腱によって起こり、緊張状態になるようにします。緊張がかかっていない場合、または膝に動きがある場合は、スプリントをテープで固定し直します。
- アキレス腱の周りの皮膚を切除して腱を露出させます。1/32インチのアルミニウムビーズに接着剤を置き、アキレス腱の筋腱接合部に最も近い遊離腱に置き、生理食塩水を入れた綿棒を使用して余分な接着剤を取り除きます。残りの手順全体を通してアキレス腱に生理食塩水を繰り返し塗布して、組織の湿り気を確保します。
- 荷重をかける前に、デジタルノギスを使用して腱の断面積を測定します。腱を楕円と仮定し、幅と太さを三重に測定します。
- ラットを腹臫位で全身プラットフォームに置きます。足首の周りとつま先の周りに結束バンドで足首を関節アクチュエーターに固定し、膝の分割を2つの結束バンドで固定します。足首が完全に足底屈曲になるように車軸を回転させます。
- 3D電磁位置姿勢システムのデジタイジングペンをコンピューターに接続し、電源をオンにします。
- システムコード(ステップ3で詳細に説明)を指定されたサイクル数だけ実行します(この研究では、6匹の安楽死ラットに7,200サイクルを投与しました)。
- 0、500、1,000、2,000、3,600、および7,200サイクルでex vivoひずみ測定を行い、周期荷重レジメンを一時停止し、3Dデジタイジングペンを交互に3回に分けて使用し、背屈の0〜40°(システムの物理的制約による作動の限界)から5°刻みで踵骨からアルミニウムビーズまでの腱の長さを測定します。
- ステップ2.9で得られた長さを使用して、さまざまな角度での腱のひずみを計算します(初期長さは各サイクル数の背屈0°です)。線形フィットを実行して、各サイクル数における背屈角度とひずみの関係を求めます。この関係を使用して、生の角度データをデータ解析用のひずみに変換します。
- 非圧縮性(体積一定)を想定し、デジタルノギスを用いて背屈40°の腱断面積を、腱長測定を0°、測定断面積を0°として計算します。各サイクル数におけるこの断面積を使用して、データ解析のために力を応力に変換します(応力 = 力 / 断面積)。
3.機械的負荷プロトコル
- 研究のこのセクションでは、25匹の雌のSprague-Dawley11週齢ラットを使用し、それぞれ5匹のラットを500、1,000、2,000、3,600、または7,200サイクルの疲労負荷を受けるようにランダムに割り付けました。
注:前処理、初期キャリブレーション、および事前および事後測定の実行には約15分かかり、繰り返し疲労荷重レジメンにはサイクルあたり1秒かかります。したがって、ラットが麻酔下にある最長時間は約2時間であり、これはIACUCが承認したプロトコルの下で実施されました。 - マイクロコントローラ、トルクセンサ、3D電磁測位、およびオリエンテーションシステムをコンピュータと電源に接続します。自社開発のMATLABコードを使用して、カスタムビルドのシステムを制御します(図1)。
- コンピューターの電源を入れ、コード ファイルを使用して MATLAB を開きます。PDImfc ソフトウェアを開き、3D 電磁位置決めおよび姿勢システムを MATLAB プログラムに接続します。[ 接続] |連続P&O | StartSockExport()を呼び出します。アプリケーションをバックグラウンドで開いたままにします。
- 誘導チャンバー内で吸入することにより、5%イソフルランで麻酔を誘発します。導入後、ノーズコーンアタッチメントを介して2.5%イソフルランで温度を維持し、麻酔を維持するために取り付けられた水ベースの発熱体で動物を全身プラットフォームに固定します。麻酔中の乾燥を防ぐために、目に湿った軟膏を使用してください。
- ラットを腹臫位で全身プラットフォームに置きます。足首の周りとつま先の周りに結束バンドで足首を関節アクチュエーターに固定し、膝の分割を2つの結束バンドで固定します。足首が完全に足底屈曲になるように車軸を回転させます。
注意: 結束バンドが収縮や病変を引き起こさないことを確認し、締め付けに注意し、必要に応じて、結束バンドと皮膚の間にガーゼを置いて保護層にします。 - システムのコードの実行を含む次の手順では、特定の負荷テストに対応するコードの各セクションの [MATLAB で実行] をクリックします。
- ステップ50に基づいて測定されたex vivo プルから破壊試験までのアキレス腱の極限引張応力の値に基づいて、究極の引張応力の15%まで足首を2.1回サイクルします。
- 腱を12°まで3回背屈させて、腱の初期キャリブレーションを行います。ヒステリシス曲線の荷重領域の線形領域の傾きを使用して、曲線の指数領域を計算します。
- 曲線の荷重領域のピークの傾きを計算して曲線の指数領域が得られるまで(自社開発のMATLABコードを使用して計算)、または40°に回転するまで、角度を上げて足首を徐々に背屈させます。
- 最終的に得られた角度で、予荷重ベースラインとして5回の繰り返し機械的測定を実行します。
- 指定したサイクル数(このスタディでは、500、1,000、2,000、3,600、または7,200サイクル)の繰返し疲労荷重レジメンを実行します。
- 50サイクルごとに、ヒステリシス曲線の荷重部分の傾きを計算し(社内で開発したMATLABコードで計算)、指数領域に留まるようにします。背屈角度を1°増やし、この指数関数的な領域に達するまで、すでに40°になっていない限り、40°にします。
- 繰り返し荷重レジメンが完了したら、最初に選択した角度で荷重後の測定として5つの周期的な機械的測定を行い、腱の機械的特性を測定します。
- 結束バンドと添え木を取り外します。動物を回収室に戻します。動物は十分な意識を取り戻すまで放置されず、その後ケージに戻されます。有害な臨床徴候がないか動物を毎日監視し、存在する場合は、72時間ごとに1回、1.2 mg / kgの用量でブプレノルフィンを皮下投与するか、早期安楽死を行います。.CO2吸入による7日間のケージ活動と開胸術による安楽死の二次的手段による動物を安楽死させます。
注:周期的な荷重の適用と機械的測定は、トルクセンサー、3Dプリントされた足首関節アクチュエーターと動物用ベッド、3D電磁位置および姿勢システム、およびシャフトを回転させて背屈を実現するステッピングモーターで構成されるカスタムメイドの治具を使用して取得されました。このシステムは、手順 1.2 で説明した MATLAB スクリプトによって制御されます。トルクセンサと位置・姿勢システムは、システムの負荷プロトコル全体でトルクと位置のデータを取得します。
4. データ分析
- 測定前と測定後のデータを別々に MATLAB に読み込みます。
- 式(1)と(2)を使用して、ステップ2.2で測定したモーメントアームと、ステップ2.11で求めた指定された荷重数で測定した断面積に基づいて、トルクを応力に変換します。
(1)
(2) - ステップ2.10で得られた変換に基づいて角度をひずみに変換します。
- 測定前と測定後のサイクルの平均ヒステリシス(載荷曲線と除荷曲線の間の面積)、ピーク応力(サイクルの最大応力値)、載荷および除荷係数(載荷曲線の最後の50%と除荷曲線の最初の60%の線形フィット)を計算します。
- ステップ4.4から、測定前と測定後のサイクル間の機械的特性の変化率を計算します。
(1)
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Representative Results
適用サイクル数の増加に伴い、 in vivo 腱の機械的特性が大幅に低下しました。500サイクル群では、3,600サイクル群と7,200サイクル群と比較して、ヒステリシスと載荷・除荷弾性率の低減が有意に小さかった(p < 0.05)(図2)。500サイクル群から3,600サイクル群では、サイクルあたりのピークストレスは有意に減少しましたが、500サイクル群と7,200サイクル群の間では有意な減少は見られませんでした。3,600サイクルグループと7,200サイクルグループでは、ヒステリシス、ピーク応力、および載荷および除荷弾性率の一貫したパーセンテージの減少が見られました。ヘマトキシリンとエオシン、およびMassonの腱サンプルのトリクローム染色画像は、より丸みを帯びた細胞、超細胞性、繊維破壊、および繊維の圧着を伴う背屈のサイクルが高い、より高いレベルの微細構造損傷を検証しました(図3)。この論文の結果は、背屈のサイクルが長くなると、アキレス腱の損傷レベルが高まることを示しています。
図1:受動的な足首背屈試験システム。 (A)電源、(B)マイクロコントローラ、(C)ステッピングモーター、(D)トルクセンサー、(E)3D電磁位置姿勢センサー、(F)3Dプリントされたアンクルマウント、(G)3Dプリントされた動物用ベッド、(H)3Dプリントされたノーズコーンホルダー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:代表的な繰返し荷重応力-ひずみ曲線。 ヒステリシス曲線は、0、500、1,000、2,000、3,600、および7,200サイクルで発生します。矢印は、サイクル数の増加に伴ってピーク応力が減少することを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:腱サンプルの代表的な組織学的染色画像。 この研究のために、500、1,000、2,000、3,600、および7,200サイクルグループの腱のヘマトキシリンとエオシン(左)およびMassonのトリクローム(右)染色画像は、適用されたサイクル数を増やすと、より丸みを帯びた細胞、高細胞性(星)、繊維破壊、および繊維の圧着(矢印)をもたらすことを示しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、ラットのアキレス腱に受動的な足首背屈系を周期的に負荷をかける方法を提示し、生体 内 使いすぎ誘発性腱炎モデルを構築した。このシステムの重要性は、アキレス腱を分離し、腱に外科的にアクセスすることなく定量化可能な負荷をかけ、 生体内の 腱の特性を測定する能力にあります。
2010年、Fungらは、特注の試験システムを用いてラットの膝蓋腱疲労モデルを発表した14。彼らの研究は、腱を露出させることによって膝蓋腱に直接負荷をかける方法を提示しました。この方法では、定量化可能な疲労荷重も腱に加えられますが、荷重を直接加えると、皮膚の切開とその後の閉鎖に追加の炎症性創傷治癒反応が生じる可能性があります。私たちの方法では、非侵襲的に加えられた負荷により、測定された生物学的反応は、外的要因ではなく、完全に負荷プロトコルによるものであることを保証します。
このローディングプロトコルの重要な要素は、フィードバック制御ループです。ヒステリシス荷重曲線の傾きを確認し、必要に応じて背屈角度を大きくすることで、システムはアキレス腱を継続的に疲労させます。膝スプリントは、背屈が膝やその他の周囲の軟部組織を動かすのではなく、腱に負担をかけるだけを確実にするため、重要なステップです。スプリントが正しく行われているかどうかを確認するには、スプリント後に足首を手動で作動させて硬い腱を感じ、繰り返し荷重ステップの前に生成されるヒステリシス曲線を監視します。
この研究の限界の1つは、ひずみ値が比較的大きいことです。しかし、それらはヒトのアキレス腱の受動的背屈に匹敵し、アキレス腱と腓腹筋の伸長によって引き起こされる可能性がある18。もう1つの制限は、トルクと応力の間の変換が、 ex vivo で測定された平均腱断面積と足首関節周辺のモーメントアームに限定されることであり、これは動物によって異なる可能性がある。
慢性腱鞘炎の病態と初期段階はまだ解明されていません。年齢やその他の危険因子とともに、過度の使用は慢性腱鞘炎の発症の主な要因です。再現性のある使いすぎによる怪我は、当社のシステムを介して疲労サイクル負荷発作を複数回適用することでシミュレートできます。さらに、このシステムの非侵襲性により、腱の損傷と治癒反応の生物学的および構造的変化を長期間にわたって評価し、腱鞘炎の重要なバイオマーカーを理解することができます。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
Joe Fallon Research Fund、Dr. Louis Meeks BIDMC Sports Medicine Trainee Research Fund、学内助成金(AN)は、すべてBIDMC Orthopaedicsから、またNational Institutes of Health(2T32AR055885 (PMW))からの支援により、資金援助をいただいたことに感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32'' Aluminum beads | |||
| 2.5% isoflurane | |||
| 3D digitizing pen | Polhemus, Vermont, NH, USA | ||
| 3D electromagnetic positioning and orientation sensor | Polhemus, Vermont, NH, USA | ||
| 5% isoflurane | |||
| Customized device: 1) Assembly, sensors, 3D printed animal bed and ankle mount actuator | Assembled as described in manuscript | ||
| MATLAB code | MATLAB, Natick, MA, USA | ||
| Microcontroller | Ivrea, Italy | Arduino UNO, Rev3 | |
| Nose cone | |||
| Scalpel and scalpel holder | No. 11 scalpel | ||
| Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA | 11-13 weeks old | |
| Stepper driver | SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503 | DM542T | |
| Stepper motor | SparkFun Electronics, Niwot, CO 80503 | 23HE30-2804S | |
| Straight forceps | |||
| Torque sensor assembly | Futek Inc., Irvine, CA, USA | FSH03985, FSH04473, FSH03927 | |
| Water heating pad |
References
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