Summary
このプロトコルは、200μmの最小幅を達成する、ナノフィブリル化セルロース紙にマイクロチャネルを製造するために、簡単なマイクロエンボス加工操作に便利なプラスチックマイクロモールドを利用する簡単なプロセスについて説明します。
Abstract
ナノフィブリル化セルロースに由来するナノペーパーは、マイクロ流体用途の有望な材料として大きな関心を集めています。その魅力は、非常に滑らかな表面、優れた光透過性、ナノスケールの多孔性を持つ均一なナノファイバーマトリックス、カスタマイズ可能な化学的特性など、さまざまな優れた品質にあります。ナノペーパーベースのマイクロ流体工学が急速に成長しているにもかかわらず、3Dプリンティング、スプレーコーティング、手作業による切断や組み立てなど、ナノペーパー上にマイクロチャネルを作成するために使用される現在の技術は、実用化に不可欠であり、特に汚染に対する感受性など、特定の制限がまだあります。さらに、これらの方法はミリメートルサイズのチャネルの製造に限定されています。本研究では、簡便なマイクロエンボス加工に便利なプラスチックマイクロモールドを用いて、ナノペーパー上にマイクロ流路を作製し、最小幅200μmを実現する簡便なプロセスを紹介します。開発したマイクロ流路は、既存のアプローチを凌駕し、4倍の改善を達成し、45分以内に製造することができます。さらに、製造パラメータが最適化され、アプリケーション開発者に便利なクイックリファレンステーブルが提供されています。表面増強ラマン分光法を用いたローダミンBセンシング用に設計された層流ミキサー、液滴発生器、機能性ナノペーパーベースの分析デバイス(NanoPAD)の概念実証が行われました。特に、NanoPADは検出限界が改善され、並外れた性能を示しました。これらの優れた結果は、ナノペーパーの優れた光学特性と、最近開発された高精度のマイクロエンボス法に起因しており、ナノパッドの集積化と微調整を可能にしています。
Introduction
近年、ナノフィブリル化セルロース(NFC)紙(ナノペーパー)は、フレキシブルエレクトロニクス、エネルギーデバイス、バイオメディカルなどのさまざまな用途で非常に有望な基板材料として浮上しています1,2,3,4。天然植物由来のナノペーパーは、費用対効果が高く、生体適合性があり、生分解性があり、従来のセルロース紙の魅力的な代替品となっています5,6。その優れた特性には、表面粗さが25nm未満の超平滑な表面と緻密なセルロースマトリックス構造が含まれ、高度に構造化されたナノ構造の作成を可能にします7。ナノペーパーの豊富なヒドロキシル基は、そのコンパクトで密集したナノセルロース構造に寄与しています8。ナノペーパーは、優れた光学的透明性と最小限の光学的ヘイズを示すため、光学センサーに適しています。さらに、その固有の親水性は、その厚い構造でもポンプフリーの流れを可能にし、自律的な流体運動を提供します9,10。ナノセルロースは、生体センサー、導電性電子デバイス、細胞培養プラットフォーム、スーパーキャパシタ、バッテリーなどに多様な用途があり、その汎用性と可能性を示しています11,12。特に、ナノセルロースは紙ベースの分析用マイクロ流体デバイス(μPAD)に有望であり、従来のクロマトグラフィー紙に比べて独自の利点があります。
過去10年間で、μPADは、その手頃な価格、生体適合性、ポンプフリー操作、および製造の容易さにより、大きな注目を集めてきました13,14。これらのデバイスは、特にリソースが限られている設定で、効果的なポイントオブケア診断ツールとして登場しました15、16、17。この分野での重要な進歩は、George Whitesides18 と Bingcheng Lin グループ19 によって開拓されたワックス印刷の開発であり、クロマトグラフィー用紙にマイクロチャネルを組み込むことで機能的な μPAD の作成を可能にしました。その後、μPADは急速に進化し、電気化学的手法20、化学発光21、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)22、23、24などのさまざまなバイオセンシング技術が実装され、タンパク質25,26、DNA27,28、RNA29,30、エクソソーム31.これらの成果にもかかわらず、μPADは流速の遅さや溶媒の蒸発などの課題に直面しています。
ナノペーパー上にマイクロチャネルを作成するためのいくつかの方法が提案されています32,33,34。1つのアプローチは、材料に犠牲成分を3Dプリントすることを含むが、それはポンプフリー操作を制限する疎水性コーティングを必要とする33。別の技術では、接着剤を使用してナノペーパーシート間にチャネル層を手動で積み重ねることがありますが、これは労働集約的です32。或いは、予めパターン化されたモールド上にナノセルロース繊維をスプレーコーティングしてマイクロチャネルを作製することもできるが、それは時間と費用のかかるモールド準備を伴います34。特に、これらの方法はミリメートルスケールのマイクロチャネルに限定されており、試薬の量と積分に関するマイクロ流体デバイスの利点が損なわれています。マイクロメートルスケールの分解能を持つシンプルなナノペーパーマイクロチャネルパターニングプロセスの開発は、依然として課題です。
本研究では、実用的なマイクロエンボス加工に基づく独自のナノペーパーマイクロ流路パターニング法について紹介する。このアプローチは、高価な機器や特殊な機器を必要とせず、シンプルで費用対効果が高く、高精度であるため、既存の方法に比べていくつかの利点があります。凸型マイクロチャネル金型は、化学的不活性と焦げ付き防止特性で知られるポリテトラフルオロエチレン(PTFE)フィルムをレーザー切断することによって製造されます。次に、このモールドを使用して、マイクロチャネルをナノペーパーゲルメンブレンにエンボス加工します。ナノペーパーゲルの2層目を上に塗布し、閉じた中空チャネルを作成します。このパターニング技術を用いて、層流ミキサーや液滴発生装置など、ナノペーパー上の基本的なマイクロ流体デバイスが開発されています。さらに、表面増強ラマン顕微鏡(SERS)ナノパッドの作製も実証されています。2つの化学試薬(AgNO3およびNaBH4)をチャネルに導入することにより、銀ナノ粒子ベースのSERS基板をその場で作製し、低い検出限界(LOD)で優れた性能を発揮します。
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Protocol
1. ナノペーパーへのマイクロ流路パターニングのためのマイクロエンボスプロセス
- 金型の準備
注:金型の準備の詳細については、Yuan et al.12 を参照してください。- 材料表のとおりにPTFEフィルムを準備します。
- 準備したPTFEフィルムをレーザーカットして、凸型マイクロチャンネルモールドを作成します(図1A-I)。
注:PTFEモールドの寸法は、線形の一次関数関係でマイクロチャネルの寸法(図2E、F)を決定します。
- ナノペーパーの調製
- 4.0gの(2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-イル)オキシル(TEMPO)酸化NFCゲル( 材料表参照)を蒸留水(最終濃度0.1wt%)に分散させます。
- 懸濁液を120.8 x g で室温で30分間、セルロースフロックが見えなくなるまで激しく攪拌します。
- 透明な懸濁液を真空ろ過し、ナノペーパーゲルを得ます(図1A-II)。
注:この例では、得られたナノペーパーゲルの直径は4cmである。NanoPADは、半径の異なる吸引ろ過装置を選択することで、さまざまな用途に合わせて調整でき、さまざまなスケールでのNanoPADの設計が可能になります。
- ナノペーパーゲルのエンボス加工
- ナノペーパーゲルの表面にPTFEモールドを置きます。
- ナノペーパーゲル(図1A-III)をホットプレスにより、最適な圧力と温度で毎回10分間、ホットプレスでエンボス加工します(図2A-D)。
注:エンボス圧力(250 kPa〜1000 kPa)が高いと製造精度が向上しますが、セルロース構造の損傷を防ぐために1000 kPaを超えないようにしてください。エンボス加工温度(25〜100°C)が高いと、脱水と脱炭が促進され、マイクロチャネルの精度が向上しますが、ゲルのしわや光透過率の低下を避けるために、温度は75°Cを超えてはなりません7。この例では、最適化されたエンボス加工パラメータは 750 kPa および 75 °C でした。
- 離型
- フィルター膜からフィルターナノペーパーゲルの追加層をはがします(図1A-IV)。
- ボンディング
- 剥離した層をナノペーパーゲルのエンボス層の上に貼り付け、2つの層を積層して中空のマイクロチャネル構造を作成します(図1A-V)。
注:繊維懸濁液や乾燥ナノペーパーと比較して、「ゲル状」のナノペーパーの水素結合が強くなると、ナノセルロース繊維の絡み合いと接着性が高まります。その結果、2層の「ゲル状」ナノペーパーは、外力なしに自己拡散によって強固に結合することができます。
- 剥離した層をナノペーパーゲルのエンボス層の上に貼り付け、2つの層を積層して中空のマイクロチャネル構造を作成します(図1A-V)。
- 乾燥
- 2層のナノペーパーゲルを75°Cの乾燥オーブンに約30分間入れます(図1A-VI)。
2. マイクロ流体基盤デバイスの構築
- 層流ミキサーの構造
- ステップ1に従って、直線および曲線のチャネル(図3A)を備えたNanoPADを準備します。
注:この例では、チャネルの寸法は幅1mm、奥行き50μmです。 - 入口ゾーンに赤と青の液滴を同時に追加し、中空チャネルを自動的に通過できるようにします。
注:直線チャネル内の赤と青の溶液の独立した流れと、湾曲したチャネルの端でのそれらの混合は、マイクロ流体デバイスの層のレイノルズ数が低く、せん断応力35によって引き起こされる半径方向の流れに起因する可能性があります。
- ステップ1に従って、直線および曲線のチャネル(図3A)を備えたNanoPADを準備します。
- 液滴発生装置の建設
- ステップ1に従って、T接合チャネルを備えた2インレットNanoPADを調製します(図3D)。
- 水とヘキサデカン(油)という2つの非混合性液体をT接合チャネルの2つの入口ゾーンに導入し、液滴を生成します(図3E)。
注:この例では、Tジャンクションチャネルの寸法は、幅1 mm、長さ25 mm、深さ50 μmです。 - Q1 の速度を 6 μL/分で固定し、Q2 の速度を n × Q 1 (n =1-6 ) に固定します。シリンジポンプを2台使用し、上記の速度に設定して水と油を注入します。この動作は、1 つの単純なスケーリング式 (以下を参照) によって制御されます。
注:この例では、油と色水がチャネル36に注がれました。
ここで、α=1、β=1、Lは液滴の長さ、Wは液滴の幅、Q1およびQ2は、それぞれ水およびヘキサデカンの流量である37,38。
3. In-situ AgNPの成長
- ナノパッドの調製
- ステップ1に従って、収束検出ゾーン(図4A)を備えた2インレットNanoPADを調製します。
- 逐次イオン層吸着・反応過程
- 20 mM AgNO3 溶液と 20 mM NaBH4 溶液を調製します( 材料表を参照)。
- 5 μL の 20 mM AgNO3 溶液を流路の左入口ゾーンに滴下します。
- AgNO3 溶液を反応ゾーンに30秒間留置します。
注: 手順 3.2.2 を繰り返します。および 3.2.3.AgNPが凝集せずに均一に分布するように5回行うことで、より高いバンド強度を説明できる可能性があります。 - 5 μLの蒸留水を流路の左側の入口ゾーンに滴下し、すすぎます。
注:手順3.2.4を繰り返します。洗浄によって過剰で吸着されていないAgイオンを確実に除去するために3回。 - 20 mM NaBH4 溶液 5 μL を流路の右入口ゾーンに添加します。
メモ: 手順 3.2.5 を繰り返します。AgNPが反応ゾーンで均一に生成されるまで。ステップ3に関与する化学反応は、以下の式39で表される:
この例では、高密度で均一で、よく構造化されたAgNPアレイがNanoPAD上に形成されました(図4B)。AgNPの平均直径は55 nmでした(図4C)。
4. SERS測定
- ラマン分光装置の準備
- レーザーをオンにし、ラマン分光計に付属するソフトウェアを起動します( 材料表を参照)。
- ラマン信号の集束と収集には50倍の対物レンズを使用し、励起には532 nmレーザーを使用します。
- 正確な測定のために、スペクトル分解能を 2 cm-1 に設定します。ラマンスペクトルの測定範囲を 400 cm-1 から 600 cm-1 に設定します。
- シリコンウェーハ12を用いてラマン分光器を校正する。
メモ: 手順 4.1 を実行します。ステップ 4.2.
- ローダミンB(RhB)測定
- 4.7 mgのRhB( 材料表を参照)を10 mLのエタノールに溶解し、1 mM RhB溶液を調製します。
- 1 mM の RhB 溶液をエタノールで希釈することにより、10 μM から 0.1 pM の範囲の濃度の一連の RhB 溶液を調製します。
- 5 μLのRhB溶液をNanoPADsチャンネルのインレットゾーンに添加し、乾燥させます。
注:手順4.2.3を繰り返します。ステップ4.2.2で示した異なる濃度のRhB溶液の場合。 - 励起時間を 10 秒、グレーティングを 2 cm-1、サイクル数を 1 に設定します。ラマンスペクトルの測定範囲を 500 cm-1 から 1800 cm-1 に設定します。
- 粗いフォーカスネジと細いフォーカスネジを個別に調整して適切なフォーカスを実現し、 停止 をクリックして位置を保存します。
- 開始をクリックして測定を開始します。
- 測定を7回繰り返し、収集したデータを保存します。
- レーザーをオフにします。
- データ解析
- 保存したデータをデータ解析ソフトウェアにインポートします( 材料表参照)。
- 保存したデータから平均スペクトルを算出します。
- ラインドラフトオプションを選択して、ラマンスペクトルをプロットします。
- ピークアナライザツールを使用して、スペクトルのベースラインを設定します。
- Signal process - Smooth関数を適用して、最終結果を得るためにスペクトルを平滑化します。
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Representative Results
ナノペーパー上にマイクロチャネルパターンを作成するためのユニークな方法は、便利なマイクロエンボス技術を通じて実用的なプラスチックマイクロモールドを利用して考案されました。特筆すべきは、この手法が200μmという小さなスケールでマイクロチャンネルパターニングを達成し、既存の方法32,33,34と比較して4倍の改善を示していることである。パターニングパラメータを微調整した後、提供されたガイドラインは、最小の標準偏差を特徴とする製造プロセスで優れた再現性を示します。幅の変動が観測される最大値はわずか2.5%で、奥行きの変動は9%です。さらに、アプリケーション開発のガイドとして役立つ図2E、Fが含まれています。
開発したSERS-NanoPADの実用化を実証するため、一般的な環境汚染物質で毒性の低い有機化学物質であるローダミンB(RhB)を例として取り上げました。RhB分子をエタノールと直接混合した。この例では、5 μL の分析種溶液を NanoPAD のインレットゾーンに充填し、反応ゾーンのラマンシグナルを測定しました。エタノール中のさまざまな濃度(0.1 pM から 10 μM の範囲)の RhB サンプルのラマンスペクトルを図 5A に示し、ブランクコントロールとして純粋なエタノールを使用しました。測定されたスペクトルでは、C-O-C伸長(1280 cm-1)、キサンテン環パッカリングモード(1200 cm-1)、C-N伸縮(1384 cm-1)、C-C伸縮(1350 cm-1)、C-H伸縮(1520 cm-1)、芳香族C-C伸張(1646 cm-1)40,41などの明確なRhBバンドが観察された。1646 cm-1 のピーク強度は、バックグラウンドノイズが最小限に抑えられ、RhB 濃度に対する感度が高いため、読み取りパラメータ42 として選択されました。検出限界(LOD)の計算には、ブランクコントロールの強度に対応するRhB濃度に、ブランクコントロールのラマン強度の標準偏差の3倍を加えた値を決定することが含まれていました。この計算により、LOD は 0.019 pM になりました。図5Bに、RhB検出の検量線を示します。
図1:ナノペーパー上にマイクロチャネルをパターニングするためのマイクロエンボス加工プロセスの概略図。 (A)マイクロエンボス加工は、金型の準備、ナノペーパーのろ過、エンボス加工、離型、接着、最終乾燥の6つのステップで構成されています。(b)マイクロエンボス加工工程の断面図。この図は、Yuanらの許可を得て転載しています。Copyright 2023 アメリカ化学会12.この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロチャンネルエンボス加工の最適化。 幅と深さの加工精度は、それぞれ(A,B)エンボス圧力と(C,D)乾燥温度の影響を受けます。ナノペーパーマイクロ流体デバイス(n = 5)における(E)チャネル幅および(F)深さの設計要件。(対象:予想されるマイクロ流路の幅と深さ、得られたもの:製造されたマイクロ流路の幅と深さ、設計:PTFEモールドの幅と深さ)。この図は、Yuanらの許可を得て転載しています。Copyright 2023 アメリカ化学会12. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:ナノペーパーマイクロ流路における流体挙動の基礎 。 (A)ナノペーパーマイクロ流体ミキサー及び層流装置の写真。スケールバー = 5 mm。 (B) 中空チャネルに沿ったさまざまな距離でのフローウィッキング。スケールバー = 2 mm。 (C) 中空流路に沿ったキャピラリー性能 (n=5)。(D)T接合チャネル内の液滴と、インレットチューブを備えたエンボス加工されたデバイスの概略図。(E)異なる周波数で動作する液滴発生器。スケールバー = 5 mm。 (F) Q1/Q2 および L/W の流量に対する線形依存性 (n = 5)。この図は、Yuanらの許可を得て転載しています。Copyright 2023 アメリカ化学会12. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:NanoPAD上の低分子の高感度SERSセンシング。 (A)NanoPADの検出ゾーンでのAgNP成長の模式図。(B)AgNP成長後のNanoPADの写真とSERSベースの分子検出の概略図。スケールバー = 1 cm。 (C)NanoPAD上でその場で成長したAgNPのSEM画像は、高密度で組織化されたAgNPアレイを示しています。スケールバー = 500 nm;インセット=100nm。この図は、Yuanらの許可を得て転載しています。Copyright 2023 アメリカ化学会12.この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:SERSによる RhBの検出。 (A)0.1 pM〜10 μMの濃度でのRhBのラマンスペクトル。 (B)1646 cm-1 (n = 5)でのRhBのキャリブレーション。この図は、Yuanらの許可を得て転載しています。Copyright 2023 アメリカ化学会12. この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究の主な目的は、ナノペーパー上にマイクロ流路を作製する簡便な手法を開発することです。この課題に対処するために、PTFEを金型として使用して効率的なエンボス加工技術が考案されました12。温度とエンボス圧力を最適化することで、ナノパッドの信頼性の高い製造プロセスを確立するための一連の実験が行われました。さらに、クイックリファレンステーブルを使用して、さまざまな分野でのNanoPADのアプリケーションを調整する方法が示されました。この方法は効率的で安定していますが、いくつかの課題に直面しました。当初は、金属が滑らかであることから金型として使用されていましたが、接着性ナノペーパーゲルから金属を取り除くのに困難が生じました。最終的に、PTFEは、その焦げ付き防止特性とエンボス加工プロセスでの操作の容易さのために選択されました。もう一つの課題は、中空チャネルの製作でした。「ゲル状」のナノペーパー8 の強力な水素結合は、2層の自己拡散と接着を可能にし、外力のないコンパクトな結合をもたらしました。
開発された方法は、ナノペーパー上にポンプフリーのマイクロチャネルを作製する際に、簡単で時間を節約し、汚染を最小限に抑えることができますが、まだ限界があります。レーザー切断の精度は、PTFE金型の幅を200μmに制限し、その結果、マイクロチャネルの達成可能な精度を200μmに制限します。この限界を克服するために、将来的には3Dプリント金型用のナノプリンターを導入し、その能力を活かして50μmの精度を実現する予定です。さらに改善が必要なもう一つの分野は、3Dマイクロチャンネルの作製です。3Dマイクロチャンネル33,34は、PDMSや通常の紙ベースのデバイスなどの材料を使用した生物医学的、化学的、および電気的検出で広く使用されていますが、ナノペーパー上での3Dマイクロチャネルの作製はまだ新しい分野です。この課題を解決することは、ナノパッドの進歩に大きく貢献します。
本研究では、SERS検出のためのラマンレポーターとして分子を用いることに着目しました。SERSテクノロジー42 は、試薬の使用量が少ない、選択性が高い、サンプル調製が簡単、安定性が高いなど、多くの利点があり、生化学的検出に不可欠な方法です。設計されたNanoPADは、SERSイムノアッセイへの応用が期待されています。さらに、選択的でテーラーメイドされたSERSプラズモンへの関心が高まっています。選択的SERS検出のためにNanoPAD上でこれらのプラズモンを生成する方法を探ることは、ナノペーパー分野における将来の開発のためのエキサイティングな道筋を示しています。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
著者らは、江蘇省高等教育自然科学基金会(22KJB460033)および江蘇省科学技術プログラム-若手学者(BK20200251)のプログラムからの財政的支援に感謝する。この研究は、XJTLU AI大学研究センター、XJTLUの江蘇省データサイエンスおよび認知計算工学研究センター、およびSIP AIイノベーションプラットフォーム(YZCXPT2022103)によって部分的にサポートされています。また、オープンプロジェクト(SKLMS2023019)によるState Key Laboratory for Manufacturing Systems Engineeringと、文部科学省のKey Laboratory of Bionic Engineeringからの支援も認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AgNO3 | Hushi (Shanghai, China) | 7761-88-8 | >99% |
| Ethanol | Hushi (Shanghai, China) | 64-17-5 | >99% |
| Hexadecane | Macklin (Shanghai, China) | 544-76-3 | >99% |
| LabSpec software | Horiba (Japan) | LabSpec5 | |
| Melamine | Macklin (Shanghai, China) | 108-78-1 | >99% |
| NaBH4 | Aladdin (Shanghai, China) | 16940-66-2 | >99% |
| Origin lab software | OriginLab (USA) | ||
| Polyethylene terephthalate (PET) | Myers Industries (Akron, USA) | ||
| Polytetrafluoroethylene films | Shenzhen Huashenglong plastic material Co., Ltd. (Shenzhen, China) | Teflon film | |
| PVDF filter membrane | EMD Millipore Corporation (USA) | VVLP04700 | pore size: 0.1 μm |
| Raman spectrometer | Horiba (Japan) | Xplo RA | |
| Rhodamine B | Macklin (Shanghai, China) | 81-88-9 | >95% |
| Scanning electron microscopy (SEM) | FEI(USA) | Scios 2 HiVac | |
| Silicon wafer | Horiba (Japan) | diameter: 5 mm | |
| TEMPO-oxidized NFC slurry | Tianjin University of Science and Technology | 1.0 wt% solid, carboxylate level 2.0 mmol/g solid, average nanofiber diameter: 10 nm |
References
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