Summary
Este protocolo descreve um processo simples que utiliza micromoldes plásticos convenientes para operações simples de microgravação para fabricar microcanais em papel celulose nanofibrilada, atingindo uma largura mínima de 200 μm.
Abstract
O nanopapel, derivado da celulose nanofibrilada, tem gerado considerável interesse como um material promissor para aplicações microfluídicas. Seu apelo reside em uma gama de excelentes qualidades, incluindo uma superfície excepcionalmente lisa, excelente transparência óptica, uma matriz de nanofibras uniforme com porosidade em nanoescala e propriedades químicas personalizáveis. Apesar do rápido crescimento da microfluídica à base de nanopapel, as técnicas atuais usadas para criar microcanais em nanopapel, como impressão 3D, revestimento por spray ou corte e montagem manual, que são cruciais para aplicações práticas, ainda possuem certas limitações, notadamente a suscetibilidade à contaminação. Além disso, esses métodos são restritos à produção de canais de tamanho milimétrico. Este estudo introduz um processo simples que utiliza micromoldes plásticos convenientes para operações simples de microgravação para fabricar microcanais em nanopapel, alcançando uma largura mínima de 200 μm. O microcanal desenvolvido supera as abordagens existentes, alcançando uma melhoria de quatro vezes, e pode ser fabricado em 45 minutos. Além disso, os parâmetros de fabricação foram otimizados e uma conveniente tabela de referência rápida é fornecida para desenvolvedores de aplicativos. A prova de conceito para um misturador laminar, gerador de gotículas e dispositivos analíticos funcionais baseados em nanopapel (NanoPADs) projetados para detecção de Rodamina B usando espectroscopia Raman aprimorada por superfície foi demonstrada. Notavelmente, os NanoPADs exibiram desempenho excepcional com limites de detecção aprimorados. Esses resultados excepcionais podem ser atribuídos às propriedades ópticas superiores do nanopapel e ao método de microgravação preciso recentemente desenvolvido, permitindo a integração e o ajuste fino dos NanoPADs.
Introduction
Recentemente, o papel de celulose nanofibrilada (NFC) (nanopaper) tem emergido como um substrato altamente promissor para diversas aplicações, tais como eletrônica flexível, dispositivos de energia e biomédicos 1,2,3,4. Derivado de plantas naturais, o nanopapel é econômico, biocompatível e biodegradável, tornando-se uma alternativa atraente ao papel celulósico tradicional 5,6. Suas propriedades excepcionais incluem uma superfície ultralisa com rugosidade superficial inferior a 25 nm e uma estrutura de matriz de celulose densa, permitindo a criação de nanoestruturas altamente estruturadas7. Abundantes grupos hidroxila de nanopapel contribuem para sua estrutura de nanocelulose compacta e firmemente embalada8. O nanopaper exibe excelente transparência óptica e mínima neblina óptica, tornando-o adequado para sensores ópticos. Além disso, sua hidrofilicidade inerente permite escoamento livre de bombas, mesmo com sua estrutura espessa, proporcionando movimentação autônoma de fluidos 9,10. A nanocelulose tem diversas aplicações em sensores biológicos, dispositivos eletrônicos condutores, plataformas de cultura celular, supercapacitores, baterias, entre outros, mostrando sua versatilidade e potencial11,12. Particularmente, a nanocelulose é promissora para dispositivos microfluídicos analíticos baseados em papel (μPADs), oferecendo vantagens únicas em relação ao papel de cromatografia convencional.
Na última década, os μPADs têm recebido atenção significativa devido ao seu preço acessível, biocompatibilidade, operação livre de bomba e facilidade de produção13,14. Esses dispositivos têm emergido como ferramentas diagnósticas efetivas no local de atendimento, particularmente em ambientes com recursos limitados15,16,17. Um avanço significativo nesse campo foi o desenvolvimento da impressão em cera, pioneira por George Whitesides18 e pelo grupo Bingcheng Lin19, possibilitando a criação de μPADs funcionais por meio da incorporação de microcanais em papel cromatográfico. Posteriormente, os μPADs evoluíram rapidamente, e várias técnicas de biosensoriamento, incluindo métodos eletroquímicos20, quimioluminescência21 e ensaio imunoenzimático (ELISA)22,23,24, foram implementadas com sucesso para a detecção de diversos biomarcadores, como proteínas25,26, DNAs27,28, RNAs29,30, e Exossomos31. Apesar dessas conquistas, os μPADs ainda enfrentam desafios, incluindo velocidades de fluxo lentas e evaporação de solventes.
Vários métodos têm sido propostos para a criação de microcanais em nanopapel32,33,34. Uma abordagem envolve a impressão 3D de ingredientes sacrificiais no material, mas requer um revestimento hidrofóbico que limita a operação livre de bomba33. Outra técnica envolve o empilhamento manual de camadas de canais entre folhas de nanopapel usando cola, o que é trabalhoso32. Alternativamente, fibras de nanocelulose com revestimento por spray em moldes pré-padronizados podem criar microcanais, mas envolve a preparação de moldes demorada e cara34. Notavelmente, esses métodos são limitados a microcanais em escala milimétrica, comprometendo as vantagens dos dispositivos microfluídicos em relação ao consumo e integração do volume de reagentes. Desenvolver um processo simples de padronização de microcanais de nanopapel com resolução em escala micrométrica continua sendo um desafio.
Este estudo apresenta um método único de padronização de microcanais de nanopapel baseado em microgravação prática. A abordagem oferece várias vantagens sobre os métodos existentes, pois não requer equipamentos caros ou especializados, é simples, econômica e altamente precisa. Um molde convexo de microcanal é fabricado por corte a laser de um filme de politetrafluoretileno (PTFE), conhecido por sua inércia química e propriedades antiaderentes. Este molde é então usado para gravar microcanais em uma membrana de gel de nanopapel. Uma segunda camada de gel de nanopapel é aplicada na parte superior para criar canais ocos fechados. Usando esta técnica de padronização, dispositivos microfluídicos fundamentais em nanopapel são desenvolvidos, incluindo um misturador laminar e um gerador de gotículas. Além disso, a fabricação de NanoPADs de microscopia Raman aprimorada por superfície (SERS) é demonstrada. A criação in situ de um substrato SERS baseado em nanopartículas de prata é obtida pela introdução de dois reagentes químicos (AgNO3 e NaBH4) nos canais, resultando em um desempenho notável com baixos limites de detecção (LODs).
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Protocol
1. Processo de microgravação para padronização de microcanais em nanopapel
- Preparação do molde
NOTA: Consulte Yuan et al.12 para obter detalhes sobre a preparação do molde.- Prepare um filme de PTFE conforme indicado na Tabela de Materiais.
- Corte a laser do filme de PTFE preparado para fazer um molde de microcanal convexo (Figura 1A-I).
NOTA: As dimensões do molde de PTFE determinam as dimensões do microcanal (Figura 2E,F) em uma relação linear de função de primeira ordem.
- Preparação de nanopapel
- Dispersar 4,0 g de gel NFC oxido (2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-il)oxil (TEMPO) (ver Tabela de Materiais) em água destilada (concentração final de 0,1% em peso).
- Agite fortemente a suspensão a 120,8 x g durante 30 minutos à temperatura ambiente até que não seja visível nenhum floco de celulose.
- Filtre a vácuo a suspensão transparente para obter um gel de nanopapel (Figura 1A-II).
NOTA: Neste exemplo, o diâmetro do gel de nanopapel obtido é de 4 cm. Os NanoPADs podem ser adaptados para várias aplicações, selecionando dispositivos de filtração por sucção com diferentes raios, permitindo o projeto de NanoPADs em diferentes escalas.
- Relevo de gel de nanopapel
- Coloque o molde de PTFE na superfície do gel de nanopapel.
- Colocar em relevo o gel de nanopapel (Figura 1A-III) usando o molde de PTFE pela prensa quente por 10 min cada vez sob pressão e temperatura otimizadas (Figura 2A-D).
NOTA: A maior pressão de gravação (250 kPa a 1000 kPa) melhora a precisão de fabricação, mas não deve exceder 1000 kPa para evitar danos à estrutura de celulose. Temperaturas de gravação mais altas (25-100 °C) aumentam a precisão do microcanal, promovendo desidratação e descarbonetação, mas as temperaturas não devem exceder 75 °C para evitar o enrugamento do gel e a redução da transmitância da luz7. Neste exemplo, os parâmetros de gravação otimizados foram 750 kPa e 75 °C.
- Desmoldagem
- Retire uma camada adicional de gel de nanopapel filtrante da membrana do filtro (Figura 1A-IV).
- Ligação
- Fixar a camada descascada sobre a camada em relevo de gel de nanopapel, empilhando as duas camadas para criar uma estrutura oca de microcanais (Figura 1A-V).
NOTA: A ligação de hidrogênio mais forte em nanopapel 'gel-like' em comparação com a suspensão de fibra e nanopaper seco aumenta o emaranhamento e a adesão de fibras de nanocelulose. Consequentemente, duas camadas de nanopapel "gel-like" podem se ligar firmemente através da auto-difusão sem força externa.
- Fixar a camada descascada sobre a camada em relevo de gel de nanopapel, empilhando as duas camadas para criar uma estrutura oca de microcanais (Figura 1A-V).
- Secagem
- Colocar as duas camadas de gel de nanopapel em estufa de secagem a 75 °C por aproximadamente 30 min (Figura 1A-VI).
2. Construção de dispositivos microfluídicos fundamentais
- Construção de misturador laminar
- Prepare os NanoPADs com canais retos e curvos (Figura 3A) seguindo o passo 1.
Observação : neste exemplo, as dimensões dos canais são 1 mm de largura e 50 μm de profundidade. - Adicione gotículas vermelhas e azuis nas zonas de entrada simultaneamente, permitindo o fluxo através do canal oco automaticamente.
NOTA: O sucesso do escoamento independente das soluções vermelha e azul em um canal reto e sua mistura no final do canal curvo pode ser atribuído ao baixo número de camadas de Reynolds em dispositivos microfluídicos e ao fluxo radial induzido pela tensão de cisalhamento35.
- Prepare os NanoPADs com canais retos e curvos (Figura 3A) seguindo o passo 1.
- Construção de gerador de gotículas
- Prepare os NanoPADs de duas entradas com um canal de junção T (Figura 3D) de acordo com a etapa 1.
- Introduzir água e hexadecano (óleo), dois líquidos imiscíveis, nas zonas de duas entradas do canal de junção T para gerar gotículas (Figura 3E).
Observação : neste exemplo, as dimensões do canal de junção T são 1 mm de largura, 25 mm de comprimento e 50 μm de profundidade. - Fixar a velocidade de Q 1 em 6 μL/min, e a velocidade de Q2 em n × Q 1 (n =1-6). Use duas bombas de seringa e coloque-as na velocidade acima para injetar água e óleo. Esse comportamento é governado pela equação de escala simples (fornecida abaixo).
NOTA: Neste exemplo, óleo e água colorida foram despejados no canal36.
Onde α = 1, β = 1, L é o comprimento, W é a largura da gota e Q1 e Q2 são as vazões de água e hexadecano, respectivamente37,38.
3. Crescimento in situ da AgNP
- Preparação de nanoPADs
- Prepare NanoPADs de duas entradas com uma zona de detecção convergente (Figura 4A) de acordo com a etapa 1.
- Processo sucessivo de adsorção e reação da camada iônica
- Preparar uma solução de AgNO3 de 20 mM e uma solução de NaBH4 de 20 mM (ver Tabela de Materiais).
- Lançar 5 μL da solução de AgNO3 de 20 mM na zona de entrada esquerda do canal de fluxo.
- Permitir que a solução de AgNO3 permaneça na zona de reação por 30 s.
Observação : repita as etapas 3.2.2. e 3.2.3. cinco vezes para garantir a distribuição uniforme das AgNPs sem aglomeração, o que poderia explicar a maior intensidade de banda. - Lançar 5 μL de água destilada na zona de entrada esquerda do canal de fluxo para enxágue.
NOTA: Repita o passo 3.2.4. três vezes para garantir a remoção de íons Ag excessivos e não adsorvidos através da lavagem. - Adicionar 5 μL da solução de NaBH4 a 20 mM à zona de entrada direita do canal de fluxo.
Observação : repita a etapa 3.2.5. até que as AgNPs sejam geradas uniformemente na zona de reação. As reações químicas envolvidas na etapa 3 são representadas pela seguinte fórmula39:
Neste exemplo, arranjos de AgNP densos, uniformes e bem estruturados foram formados sobre os NanoPADs (Figura 4B). O diâmetro médio das AgNPs foi de 55 nm (Figura 4C).
4. Medição de SERS
- Preparação do sistema de espectroscopia Raman
- Ligue o laser e inicie o software que acompanha o espectrômetro Raman (consulte a Tabela de Materiais).
- Empregar uma objetiva de 50x para focar e coletar sinais Raman e um laser de 532 nm para excitação.
- Ajuste a resolução espectral para 2 cm-1 para medição precisa. Defina a faixa de medição do espectro Raman de 400 cm-1 a 600 cm−1.
- Calibrar o espectrômetro Raman usando um wafer de silício12.
Observação : execute a etapa 4.1. para a etapa 4.2.
- Medição da rodamina B (RhB)
- Dissolver 4,7 mg de RhB (ver Tabela de Materiais) em 10 ml de etanol para preparar uma solução de 1 mM de RhB.
- Preparar uma série de soluções de RhB com concentrações que variam de 10 μM a 0,1 pM diluindo a solução de 1 mM RhB no etanol.
- Adicione 5 μL da solução de RhB na zona de entrada do canal de NanoPADs e deixe secar.
NOTA: Repita o passo 4.2.3. para soluções de RhB de diferentes concentrações indicadas na etapa 4.2.2. - Defina o tempo de excitação para 10 s, a grade para 2 cm−1 e o número de ciclos para 1. Defina a faixa de medição do espectro Raman de 500 cm-1 a 1800 cm−1.
- Ajuste o parafuso de foco grosso e o parafuso de foco fino individualmente para obter o foco adequado e, em seguida, clique em parar para salvar a posição.
- Clique em iniciar para iniciar a medição.
- Repita as medições sete vezes e salve os dados coletados.
- Desligue o laser.
- Análise de dados
- Importe os dados salvos para o software de análise de dados (consulte Tabela de Materiais).
- Calcule o espectro médio a partir dos dados salvos.
- Selecione a opção de rascunho de linha para plotar espectros Raman.
- Utilize a ferramenta Analisador de pico para definir a linha de base dos espectros.
- Aplique o processo Signal - Função suave para suavizar os espectros para resultados finais.
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Representative Results
Um método único para criar padrões de microcanais em nanopapel foi desenvolvido utilizando os práticos micromoldes de plástico através da conveniente técnica de microgravação. Notadamente, esse método realiza padronização de microcanais em uma escala tão pequena quanto 200 μm, o que representa uma melhora de quatro vezes em relação aos métodos existentes32,33,34. Após o ajuste fino dos parâmetros de padronização, as diretrizes fornecidas apresentam excelente repetibilidade no processo de fabricação, caracterizada por desvios-padrão mínimos. A maior variação observada na largura é de apenas 2,5%, enquanto para a profundidade, é de 9%. Além disso, a Figura 2E,F foi incluída para servir como um guia para o desenvolvimento de aplicativos.
Para demonstrar as aplicações práticas dos SERS-NanoPADs desenvolvidos, a Rodamina B (RhB), um poluente ambiental comum e químico orgânico de baixa toxicidade, foi selecionada como exemplo. As moléculas de RhB foram misturadas diretamente com o etanol. Neste exemplo, 5 μL da solução do analito foram preenchidos na zona de entrada de NanoPADs, e o sinal Raman na zona de reação foi então medido. Os espectros Raman das amostras de RhB em várias concentrações em etanol (variando de 0,1 pM a 10 μM) são mostrados na Figura 5A, com etanol puro usado como controle em branco. Bandas claras de RhB são observadas nos espectros medidos, incluindo o alongamento C-O-C (1280 cm-1), o modo de encaixe do anel xanteno (1200 cm-1), o alongamento C-N (1384 cm-1), o alongamento C-C (1350 cm-1), o alongamento C-H (1520 cm-1) e o alongamento aromático C-C (1646 cm-1)40,41. Devido à sensibilidade da intensidade de pico de 1646 cm-1 à concentração de RhB com mínimo ruído de fundo, optou-se por como parâmetro de leitura42. O cálculo do limite de detecção (LOD) envolveu a determinação da concentração de RhB correspondente à intensidade do controle em branco mais três vezes o desvio padrão da intensidade Raman do controle em branco. Esse cálculo gerou um LOD de 0,019 pM. A Figura 5B mostra a curva de calibração para detecção de RhB.
Figura 1: Representação esquemática do processo de microgravação para padronização de microcanais em nanopapel. (A) O processo de microgravação compreende seis etapas: preparação do molde, filtração do nanopapel, gravação, liberação do molde, colagem e secagem final. (B) Visão transversal do processo de microgravação. A figura é reproduzida com permissão de Yuan et al. Direitos autorais 2023 American Chemical Society12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Otimização de gravação em relevo microcanal. A precisão de fabricação de larguras e profundidades é afetada pela pressão de relevo (A,B) e temperatura de secagem (C,D), respectivamente. Requisitos de projeto para (E) larguras de canal e (F) profundidades em dispositivos microfluídicos de nanopapel (n = 5). (O alvo: as larguras e profundidades de microcanal esperadas; o obtido: as larguras e profundidades de microcanais fabricados; o projetado: as larguras e profundidades de moldes de PTFE). A figura é reproduzida com permissão de Yuan et al. Direitos autorais 2023 American Chemical Society12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fundamentos do comportamento fluídico no microcanal de nanopapel. (A) Fotografias do misturador microfluídico de nanopapel e do dispositivo de fluxo laminar. Barras de escala = 5 mm. (B) Escoamento a diferentes distâncias ao longo do canal oco. Barra de escala = 2 mm. (C) Desempenho capilar ao longo do canal oco (n=5). (D) Ilustração esquemática das gotículas dentro do canal de junção T e do dispositivo em relevo com os tubos de entrada. (E) Gerador de gotículas trabalhando em diferentes frequências. Barras de escala = 5 mm. (F) Dependência linear das vazões de Q1/Q2 e L/W (n = 5). A figura é reproduzida com permissão de Yuan et al. Direitos autorais 2023 American Chemical Society12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Sensoriamento sensível de pequenas moléculas em NanoPADs. (A) Esquema de crescimento de AgNP na zona de detecção dos NanoPADs. (B) Fotografia de NanoPADs após crescimento de AgNPs e esquema da detecção de moléculas baseadas em SERS. Barra de escala = 1 cm. (C) Imagem de MEV das AgNPs cultivadas in situ em NanoPADs mostra uma matriz de AgNPs densa e organizada. Barra de escala = 500 nm; inset = 100 nm. A figura é reproduzida com permissão de Yuan et al. Direitos autorais 2023 American Chemical Society12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Detecção de RhB baseada em SERS . (A) Espectros Raman de RhB em concentrações de 0,1 pM a 10 μM. (B) Calibração de RhB a 1646 cm-1 (n=5). A figura é reproduzida com permissão de Yuan et al. Direitos autorais 2023 American Chemical Society12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O foco principal deste estudo é desenvolver um método simples para a fabricação de microcanais em nanopapel. Uma eficiente técnica de gravação em relevo foi desenvolvida usando PTFE como molde para enfrentar esse desafio12. Otimizando a temperatura e a pressão de gravação, uma série de experimentos foi conduzida para estabelecer um processo de fabricação confiável para NanoPADs. Adicionalmente, foi demonstrado o uso de uma tabela de referência rápida para ajustar as aplicações de NanoPADs em diferentes campos. Embora esse método seja eficiente e estável, alguns desafios foram encontrados. Inicialmente, os metais eram utilizados como moldes devido à sua suavidade, mas surgiram dificuldades em removê-los do gel adesivo de nanopapel. Por fim, o PTFE foi escolhido por suas propriedades antiaderentes e facilidade de operação no processo de gravação em relevo. Outro desafio enfrentado foi a fabricação de canais ocos. As fortes ligações de hidrogênio no nanopapel 'gel-like'8 permitiram a autodifusão e adesão de duas camadas, resultando em ligações compactas sem forças externas.
Embora o método desenvolvido seja simples, economize tempo e minimize a contaminação ao fabricar microcanais sem bomba em nanopapel, ainda há limitações. A precisão do corte a laser restringe a largura dos moldes de PTFE a 200 μm, consequentemente limitando a precisão alcançável dos microcanais a 200 μm. Para superar essa limitação, a implementação de uma nanoimpressora para moldes de impressão 3D é planejada em empreendimentos futuros, alavancando sua capacidade de atingir uma precisão de 50 μm. Outra área que necessita de mais melhorias é a fabricação de microcanais 3D. Enquanto os microcanais 3D 33,34 encontraram uso extensivo em detecção biomédica, química e elétrica usando materiais como PDMS e dispositivos regulares baseados em papel, a fabricação de microcanais3D em nanopapel ainda é um campo emergente. Resolver este desafio contribuirá significativamente para o avanço dos NanoPADs.
Este estudo concentrou-se no uso de moléculas como repórteres Raman para detecção de SERS. A tecnologia SERS42 oferece inúmeras vantagens, incluindo o uso mínimo de reagentes, alta seletividade, preparação simples da amostra e excelente estabilidade, tornando-se um método crucial para a detecção bioquímica. Os NanoPADs projetados têm aplicações potenciais em imunoensaios SERS. Além disso, há um interesse crescente em plasmons SERS seletivos e adaptados. Explorar métodos para gerar esses plasmons em NanoPADs para detecção seletiva de SERS representa um caminho empolgante para o desenvolvimento futuro no campo do nanopapel.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio financeiro dos programas da Fundação de Ciências Naturais do Ensino Superior de Jiangsu (22KJB460033) e do Programa de Ciência e Tecnologia de Jiangsu - Jovem Acadêmico (BK20200251). Este trabalho também é parcialmente apoiado pelo Centro de Pesquisa da Universidade XJTLU AI, Centro de Pesquisa de Engenharia da Província de Jiangsu de Ciência de Dados e Computação Cognitiva na XJTLU e plataforma de inovação SIP AI (YZCXPT2022103). Também é reconhecido o apoio do Laboratório Chave Estadual para Engenharia de Sistemas de Manufatura via projeto aberto (SKLMS2023019) e do Laboratório Chave de Engenharia Biônica, Ministério da Educação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AgNO3 | Hushi (Shanghai, China) | 7761-88-8 | >99% |
| Ethanol | Hushi (Shanghai, China) | 64-17-5 | >99% |
| Hexadecane | Macklin (Shanghai, China) | 544-76-3 | >99% |
| LabSpec software | Horiba (Japan) | LabSpec5 | |
| Melamine | Macklin (Shanghai, China) | 108-78-1 | >99% |
| NaBH4 | Aladdin (Shanghai, China) | 16940-66-2 | >99% |
| Origin lab software | OriginLab (USA) | ||
| Polyethylene terephthalate (PET) | Myers Industries (Akron, USA) | ||
| Polytetrafluoroethylene films | Shenzhen Huashenglong plastic material Co., Ltd. (Shenzhen, China) | Teflon film | |
| PVDF filter membrane | EMD Millipore Corporation (USA) | VVLP04700 | pore size: 0.1 μm |
| Raman spectrometer | Horiba (Japan) | Xplo RA | |
| Rhodamine B | Macklin (Shanghai, China) | 81-88-9 | >95% |
| Scanning electron microscopy (SEM) | FEI(USA) | Scios 2 HiVac | |
| Silicon wafer | Horiba (Japan) | diameter: 5 mm | |
| TEMPO-oxidized NFC slurry | Tianjin University of Science and Technology | 1.0 wt% solid, carboxylate level 2.0 mmol/g solid, average nanofiber diameter: 10 nm |
References
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