Summary
Denne protokol giver en musemodel af ulcerøs coloproctitis-associeret kolorektal cancer induceret af azomethan kombineret med dextransulfatnatrium. Modellen blev brugt til at evaluere effekten af traditionelle kinesiske medicinforbindelser til forebyggelse og behandling af kolorektal cancer.
Abstract
Kolorektal cancer (CRC) er en almindelig malignitet i fordøjelsessystemet og er blevet den tredje mest almindelige malignitet på verdensplan og den næststørste årsag til malignitetsrelateret død. Cololoproctitis ulcerosa (UC) er en precancerøs læsion, og UC-associeret CRC (UC-CRC) er den mest almindelige undertype af CRC. Derfor er en fornuftig UC-CRC-model hjørnestenen og garantien for udvikling af nye lægemidler. Traditionel kinesisk medicin (TCM) har været meget udbredt i behandlingen af UC-CRC på grund af dets gode effekt. Som en klassisk tonic recept af TCM, Liujunzi decoction (LJZD) har været meget udbredt i behandlingen af UC-CRC. I denne undersøgelse blev en UC-CRC-model etableret ved at kombinere azomethan og dextransulfatnatrium, og LJZD blev administreret. Dataene bekræftede, at LJZD effektivt kan hæmme kræftovergang i UC-CRC ved hjælp af musens kropsvægt, kolorektal længde, patologiske og inflammatoriske faktorer, kolorektal barrierefunktion og kræftmarkører. Denne protokol giver et system til evaluering af effekten af TCM i forebyggelse og behandling af UC-CRC.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) er en almindelig gastrointestinal malignitet, den tredje mest almindelige malignitet og den næsthyppigste dødsårsag i verden, der tegner sig for 10% af den globale kræftforekomst og 9,4% af den samlede kræftrelaterede død 1,2. Genetiske faktorer, kronisk inflammation, fedtfattig kost, diabetes og unormal tarmflora er risikofaktorer for CRC 3,4. Blandt dem er inflammatorisk tarmsygdom, især ulcerøs coloproctitis (UC), en klar risikofaktor for CRC 5,6. UC-associeret CRC (UC-CRC) er en overgangsproces med inflammation, atypisk hyperplasi og kræft baseret på kronisk betændelse i kolorektum, som adskiller sig fra den typiske adenom-adenocarcinom-udviklingsmodel for CRC 7,8. Sammenlignet med den generelle befolkning er risikoen for CRC ca. 10-40 gange højere hos patienter med inflammatorisk tarmsygdom9.
I øjeblikket er kirurgi stadig standardbehandlingen for CRC, og afhængigt af tumorens placering og stadium er strålebehandling, systemisk lægemiddelbehandling eller en kombination af begge mulige10. Selvom disse traditionelle behandlingsmetoder har gjort store fremskridt på grund af CRC's høje heterogenitet og gentagelsesrate, er prognosen dårlig, og behandlingseffekten er ikke ideel11,12. Derfor er tidlig påvisning, tidlig diagnose og omfattende behandling nøglen til at forbedre overlevelsesraten for CRC-patienter, og det er især vigtigt at være opmærksom på transformationen af UC til CRC. I årenes løb har traditionel kinesisk medicin (TCM) tiltrukket stor opmærksomhed i behandlingen af UC-CRC eller kronisk gastritis på grund af dets begrænsede bivirkninger og betydelige effektivitet. Baseret på dialektisk behandling har berømte kinesiske medicinudøvere fra forskellige generationer skabt et stort antal klassiske recepter, såsom Huangqi Jianzhong decoction13, Sijunzi decoction14 og Sishen pille15.
Liujunzi decoction (LJZD) stammer fra værkerne af Yi Xue Zheng Zhuan udarbejdet i Ming-dynastiet og er en klassisk recept i TCM16. Som vist i tabel 1 består LJZD af seks traditionelle urter, herunder Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Poria cocos (Schw.) Ulv (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) og Pinellia ternata (Thunb.) Breit (Banxia), som har den virkning at genopfylde qi og styrke milten, tørre fugt og løse slim. I moderne klinisk praksis bruges det ofte til behandling af kronisk gastritis, mavesår og duodenale sår. Moderne farmakologisk forskning har vist, at LJZD og modificeret LJZD har høj applikationsværdi i adjuverende behandling af UC og kræft i fordøjelseskanalen 17,18,19.
På nuværende tidspunkt er der mange måder at konstruere UC-CRC-musemodeller på, men azoxymethan (AOM)/dextransulfatnatrium (DSS) induceret musemodel er den mest udbredte UC-CRC-model; de kliniske symptomer, morfologiske og patologiske observationer har vist, at modellen ligner meget human UC-CRC20,21. Det grundlæggende princip er først at inducere kræftfremkaldende med kemisk kræftfremkaldende stof AOM og derefter kontinuerligt udsætte mus for DSS's inflammatoriske stimuleringsmiljø for at simulere den kontinuerlige skade og reparation af tarmslimhindepitel og derved konstruere en UC-CRC-musemodel22. Formålet med denne undersøgelse er at etablere en musemodel af UC-CRC ved intraperitoneal injektion af AOM og cyklisk stimulering af DSS på kort sigt og at evaluere virkningen af lægemidlet og den molekylære mekanisme af LJZD på UC-CRC for at tilvejebringe et videnskabeligt grundlag for behandling af UC-CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøget er godkendt af den etiske komité ved Changchun University of Chinese Medicine (rekordnummer: 2021214). Specifikke patogenfrie C57BL/6J-mus (8-10 uger, vægt 18-22 g), han- og hunmus, blev anbragt i uafhængigt ventilerede bure ved 22 °C og 65 % relativ luftfugtighed. Musene begyndte forsøget efter 7 d adaptiv fodring, hvor de havde fri adgang til vand og kost.
1. Forberedelse af lægemidler
- Fremstilling af LJZD
BEMÆRK: Den anvendte kinesiske medicin blev købt fra det tilknyttede hospital ved Changchun University of Chinese Medicine og blev identificeret som ægte kinesisk medicin (se tabel 1).- Kom Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) i en specialiseret keramisk gryde (se materialetabel). Der tilsættes 1000 ml destilleret vand og blødlægges ved stuetemperatur i 1 time (se figur 1A).
- Pulver 12 g Opfylding i fint pulver med en kværn og blød i 300 ml destilleret vand i en anden beholder i 1 time ved stuetemperatur.
- Bland ovennævnte kinesiske medicin i den specialiserede keramiske gryde. Kog blandingen og hold derefter på medium flamme, indtil der kun er 300 ml afkogning tilbage. Brug medicinsk gasbind til filtrering og bevar filtratet ved stuetemperatur.
- Tilsæt 1000 ml destilleret vand og gentag ovenstående afkogningsoperation igen. Filtrer igen ved hjælp af medicinsk gasbind. Kombiner filtratet og kog det, indtil der kun er 150 ml tilbage.
- Den koncentrerede væske centrifugeres ved 10.000 x g i 5 minutter, og den opnåede supernatant koncentreres yderligere til 30 ml ved middel varme. Overfør det endelige koncentrat til et fad og tør det ved hjælp af en elektrisk tørreovn, indtil kun det opløste stof forbliver som pulver.
- Vej ovennævnte faste stof og opløs det i sterilt destilleret vand for at opnå en opløsning indeholdende 22,85 mg lægemiddel pr. 0,2 ml (114,16 mg / ml), hvilket er den daglige dosis af mus.
- Fremstilling af 5-aminosalicylsyre
BEMÆRK: 5-aminosalicylsyre (5-ASA; se materialetabel) har en god forebyggende effekt på UC-CRC, og det blev brugt som et positivt lægemiddel i dette studie23.- 64 mg 5-ASA pulver opløses i 200 ml sterilt destilleret vand for at opnå 1,82 mg/ml 5-ASA opløsning. Den daglige dosis for en enkelt mus var 0,2 ml.
- Fremstilling af AOM injektionsopløsning
- Tilsæt 2,5 ml sterilt destilleret vand i 25 mg AOM-pulver (se materialetabellen), og bland med hvirvelblander (se materialetabellen) for at fremstille 10 mg/ml AOM-stamopløsning, opbevar ved -20 °C indtil brug.
- Klargør AOM-injektionsopløsningen ved at fortynde AOM-stamopløsningen med sterilt destilleret vand ved 10:1 (1 mg/ml).
2. Etablering af UC-CRC-modellen
BEMÆRK: Eksperimentet blev opdelt i 4 grupper: kontrol, model, LJZD og 5-ASA-gruppe, 10 mus i hver gruppe. Bortset fra kontrolgruppen blev de andre grupper behandlet med AOM og DSS.
- Intraperitoneal injektion af AOM injektionsopløsning
BEMÆRK: Efter adaptiv fodring i 7 d fik mus AOM-injektionsopløsning (1 mg/ml) ved intraperitoneal injektion (se figur 1B).- Hold musen med maven oppe og hovedet lidt nedad. Tag fat i ryghuden for at stramme mavehuden og gennembor huden ca. 1 cm til højre for skæringspunktet mellem rodlinjen på begge lår på midten af maven med en 1 ml sprøjte (se materialetabel).
- Tryk 1 ml kanylen til en afstand på 3-5 mm under huden, hold den parallelt med bugmidterlinjen, og stik kanylen 0,3-0,5 mm ind i bughulen ved 45°.
- Når spidsen passerer gennem mavemusklen, registrerer operatøren et pludseligt tab af modstand. Træk derefter sprøjten udad og bagud for at observere, om der forekommer væskeudsivning. Hvis ikke, skubbes AOM-injektionsopløsningen langsomt ind i musene ved 0,1 ml/10 g.
- Cyklisk stimulering af 2% DSS-opløsning
BEMÆRK: Hver AOM-induceret mus fik 500 ml DSS-opløsning i uge 3, 6 og 9, og musene drak frit i denne periode.- Forbered 2% DSS-opløsning ved at tilsætte 500 ml sterilt destilleret vand til 10 g DSS (se materialetabel). Bland med en hvirvelblander og opbevar ved 4 °C indtil brug.
- Hver AOM-induceret mus drikker 500 ml 2% DSS-opløsning frit i 7 d i uge 3, 6 og 9 efter AOM-induktion.
3. Narkotikabehandling
BEMÆRK: Voksne mennesker har brug for 63 g LJZD om dagen. Ifølge omregningsformlen for eksperimentel lægemiddeldosis hos mus og mennesker, ækvivalent eksperimentel dosis for mus (mg/kg) = human dosis (mg/kg)/legemsvægt (60 kg) x 9,1, var den daglige dosis mus ca. 9,6 g/kg.
- LJZD- og 5-ASA-gruppen behandles med 0,1 ml/10 g af den tilberedte LJZD- og 5-ASA-opløsning med gastrisk sonde i henholdsvis uge 7 og uge 15.
- Ved intragastrisk administration hos mus skal du udføre følgende procedure. Hold musen i venstre hånd, og hold maveperfusionsapparatet i højre hånd. Indsæt kanylen i munden og skub den ned ad bagvæggen i musens svælg. Skub ned i svælget, mens musene sluger og fortsæt med at bevæge dig fremad. Når der var en følelse af modstand, og sprøjten kunne skubbes ind i svælget, skal du trække nålen ud og fuldføre injektionen.
- Behandl kontrol- og modelgruppen med samme mængde saltvand (se materialetabel).
- Behandl musene i hver gruppe med passende lægemiddel en gang dagligt på samme tid i administrationsperioden.
4. Evaluering af UC-CRC-model og effekt af LJZD
- Score for sygdomsaktivitetsindeks
BEMÆRK: Ifølge tabel 2 blev sygdomsaktivitetsindekset (DAI) score evalueret ved at kombinere vægttab, fækal viskositet og afføringsblødning hos musene.- Optag musenes vægt dagligt fra begyndelsen af adaptiv fodring til afslutningen af lægemiddelbehandlingen.
- Overhold fækal konsistens af hver eksperimentel mus omhyggeligt og registrer afføringen som en af de tre betingelser: normal, løs afføring og vandig diarré.
- Optag fækal blødning af forsøgsdyr som en af de tre betingelser: ingen blødning, lidt blødning og synligt blod i afføringen.
- Påvisning af IL-6 niveau i serum
- Behandl mus med LJZD eller 5-ASA i 9 uger. Fastgør musene ved at tage fat i musens halshud med venstre hånd og tryk forsigtigt på forsøgsbordet for at tage den laterale decubitusposition. Skær musenes knurhår af med en saks. Skær musenes knurhår af med en saks omhyggeligt (se materialetabellen) for at forhindre blodforurening.
BEMÆRK: Mus, der ikke kunne vrikke frit, blev anset for at være korrekt fastgjort. Hvis dette ikke sker, skal musene rettes. - Bedøv musen ved indånding af 2% isofluran. Steriliser huden omkring øjeæblet med ethanol (se materialetabel). Tryk forsigtigt på øjenhuden på siden for at gøre øjeæblet overbelastet og fremspringende.
- Klem øjeæblet med en albuepincet og fjern øjenkuglerne nøjagtigt og hurtigt. Lad blodet dryppe ned i centrifugalrøret (se materialetabel). I processen skal du trykke på musens hjerte for at fremskynde blodindsamlingen.
- Opbevar det opsamlede blod ved stuetemperatur i 30 minutter og centrifuger det ved 3.500 x g i 10 minutter. Supernatanten opsamles, og IL-6-niveauet registreres i henhold til instruktionerne i IL-6-indholdsdetekteringssættet (se materialetabellen).
- Behandl mus med LJZD eller 5-ASA i 9 uger. Fastgør musene ved at tage fat i musens halshud med venstre hånd og tryk forsigtigt på forsøgsbordet for at tage den laterale decubitusposition. Skær musenes knurhår af med en saks. Skær musenes knurhår af med en saks omhyggeligt (se materialetabellen) for at forhindre blodforurening.
- Adskillelse af kolorektalt væv
- Aflive musene efter blodprøvetagning ved at inhalere 5% overdoseret isofluran og cervikal dislokation (se materialetabel) i overensstemmelse med dyreetik.
- Hold musene i et kryogent anatomisk miljø. Immobiliser musene i liggende stilling. Skær underlivet hår med en saks og steriliser det med ethanol.
- Klem skæringspunktet mellem de to lårrødder og bugmidterlinjen med øjenlågspincet (se materialetabel). Skær et tværgående snit ca. 1-1,5 cm med en saks.
- Klip et langsgående snit langs medianlinjen af maven fra midtpunktet af det tværgående snit mod xiphoidprocessen.
- Fjern perikolorektalvævene i retning af anus for at adskille kolorektum fra det omgivende væv. Pas på ikke at beskadige kolorektumet.
- Skub underlivets hud til siderne for fuldt ud at udsætte kolorektumet. Fjern kolorektum fra bukhulen med øjenlågspincet og afskær segmenterne fra anus til cecum (udelukkende); Den samlede længde er ca. 10 cm. Det fremstillede kolorektal væv opbevares i saltvand ved 4 °C.
- Evaluering af endetarmens længde og vægt
- Udtræk saltvand ved 4 °C med en 5 ml kanyle (se materialetabel) for at skylle indersiden af kolorektummet. Placer derefter kolorektum på absorberende papir for at absorbere vævets fugtighed.
- Vej kolorektal væv og læg dem derefter på A4-papir for at måle deres længde.
- Mål antallet af tumorer i kolorektum
- Skær kolorektum i længderetningen for fuldt ud at udfolde det og observere antallet og størrelsen af tumorerne i kolorektumet.
- Patologisk analyse af kolorektum
- Fastgør kolorektum i 4% paraformaldehyd i 24 timer. Det faste rektale væv anbringes i smeltet paraffin og snittes kontinuerligt med en tykkelse på 5 μm ved hjælp af et vævsfrysende mikrotom.
- Ifølge proceduren i Hou et al.24 afvokses sektionerne i xylen og dehydreres derefter med serielle koncentrationer af ethanol. Efter farvning med hæmatoxylinopløsning i 5 minutter skylles sektionerne med rent vand. Derefter plettes med 0,5% eosinopløsning i 1 min(se materialetabel).
- Udfør gradientdehydrering og xylen gennemsigtig behandling igen. Forsegl sektionerne og observer dem under det optiske mikroskop (se materialetabel) og fotografi, som beskrevet af Xie et al.25.
- Immunohistokemisk analyse af kolorektum
- Afvoks og dehydrer sektionerne i henhold til ovenstående metode. Antigenet repareres i sektionerne med højtrykstermisk reparationsteknik, som beskrevet af Gok et al.26.
- Blødgør sektionerne i endogene peroxidaseblokkere ved stuetemperatur i 15 minutter. Forsegl sektionerne med gedeserum (se materialetabel).
- Der tilsættes det primære antistof ZO-1 (1:1000), Occludin (1:1000) og KI67 (1:500; se materialetabel) til afsnittene og inkuberes natten over ved 4 °C. Sektionerne skylles med PBS-buffer (se materialetabel), der tilsættes sekundært antistof til generelle formål (1:5000; se materialetabel) og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
- Tilføj DAB-løsningen (se Materialetabel) til afsnittene for farveudvikling. Modfarve sektionerne med hæmatoxylinopløsning.
- Dehydrere, gennemsigtige og forsegle sektionerne igen. Overhold ekspressionen af protein ved hjælp af det optiske mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afkogningen af LJZD blev fremstillet i overensstemmelse med sammensætningsforholdet mellem lægemidler i tabel 1 og afkogningsmetoden for TCM i figur 1A. Ifølge det tidspunkt, der er angivet i figur 1B, blev mus intraperitonealt injiceret med 1 mg / ml AOM på den 7. dag, og mus fik fri adgang til drikkevand indeholdende 2% DSS i 3., 6. og 9. uge. UC-CRC-musemodellen blev etableret med succes i den 15. uge. I mellemtiden blev mus behandlet med LJZD med sonde fra uge 7 til uge 15. Dataene viste, at sammenlignet med kontrolgruppen havde UC-CRC-modelgruppen et signifikant vægttab, som blev lindret ved LJZD-behandling (figur 2A, P < 0,01). Ved afslutningen af forsøget forbedrede LJZD-behandlingen DAI-scoren sammenlignet med UC-CRC-modelgruppen (figur 2B). Sammenlignet med kontrolgruppen havde UC-CRC-modelgruppen en kortere kolorektal længde, som blev øget ved LJZD-behandling (figur 2C, D, P < 0,01). Forholdet mellem kolorektal vægt og kropsvægt afspejler udviklingen af CRC hos mus, og et højere forhold indikerer akut tumorudvikling27. Sammenlignet med kontrolgruppen blev modelgruppens kolorektalorganindeks signifikant øget, og LJZD-behandling reducerede kolorektalorganindekset kraftigt (figur 2E, P < 0,05). Derudover hæmmede LJZD-behandling også dannelsen af kolorektal tumorer (figur 2F, P < 0, 01) og niveauet af serum proinflammatorisk faktor IL-628 (figur 2G, P < 0, 05).
Patologiske resultater bekræftede, at musene i UC-CRC-modelgruppen sammenlignet med kontrolgruppen havde større kolorektal tumorer og havde dannet adenokarcinom, mens LJZD-behandling reducerede tumorernes størrelse og kvalitet (figur 3). Immunohistokemiske data viste, at LJZD-behandling forbedrede kolorektal barrierefunktion i UC-CRC-modelmus, som indikeret ved forhøjet proteinekspression af ZO-1 og Occludin29 (figur 4). Parallelt undertrykte LJZD-behandling proteinekspressionsniveauerne af kræftmarkøren KI6730 (figur 4).
Figur 1: Forberedelse af LJZD og etablering af en musemodel af coloproctitis cancer.( A) Blandingen af Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g) og ingefærforarbejdet Ban Xia (9 g) blev nedsænket i 1000 ml destilleret vand ved stuetemperatur i 1 time. 12 g Fuling-pulveret blev gennemblødt i 300 ml destilleret vand ved stuetemperatur i 1 time. Blandingen af ovennævnte seks urter blev decoceret ved 100 °C i 40 min. (B) På dag 7 blev C57BL/6J-mus intraperitonealt injiceret med 1 mg/ml AOM. Mus fik vand indeholdende 2% DSS ad libitum i 3., 6. og 9. uge. Fra 7 til 15 uger fik mus LJZD med sonde. Forkortelser: AOM, azomethan; DAI, sygdomsaktivitetsindeks; DSS, dextransulfatnatrium; LJZD, Liujunzi afkog; W, uge. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Evaluering af UC-CRC-model og effekt af LJZD. (A) LJZD forbedret kropsvægt i UC-CRC modelmus. (B) LJZD lindrede DAI-scorer i UC-CRC-modelmus. (C, D) LJZD øgede længden af kolorektum i UC-CRC modelmus. (E) LJZD reducerede orgelindekset for kolorektum i UC-CRC-modelmus. (F) LJZD hæmmede kolorektal tumorigenese i coloproctitis cancer model mus. (G) LJZD undertrykt serum IL-6 niveau i UC-CRC model mus. #P< 0,05 og ##P< 0,01 sammenlignet med kontrolgruppen; *P < 0,05 og **P< 0,01 sammenlignet med modelgruppen. Data blev udtrykt som gennemsnittet ± standardafvigelser (n = 10) og blev analyseret ved envejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukeys test. P < 0,05 indikerede en statistisk signifikant forskel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Evaluering af de patologiske egenskaber ved kolorektal væv hos mus ved hæmatoxylin-eosinfarvning. Der var ingen patologisk skade i kontrolgruppen. Tumorvævet i UC-CRC-modelgruppen var stort og havde dannet adenokarcinom og højgradig neoplasi, mens LJZD-behandlingsgruppen havde reduceret tumorvæv ledsaget af en lille mængde lokalt adenom og lavgradig neoplasi. Den sorte pil repræsenterer den precancerøse dysplastiske tumorkirtel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Effekt af LJZD på kolorektal barrierefunktion og kræftmarkør i UC-CRC modelmus. a) Immunohistokemiske billeder af ZO-1, Occludin og KI67. B) Statistiske resultater af proteinekspression af ZO-1, Occludin og KI67. LJZD-behandling øgede ekspressionen af kolorektal barrierefunktionelle proteiner ZO-1 og Occludin, mens niveauet af kræftmarkør KI67 faldt i UC-CRC-modelmus. ## P < 0,01 sammenlignet med kontrolgruppen; ** P < 0,01 sammenlignet med modelgruppen. Data blev udtrykt som gennemsnittet ± standardafvigelser (n = 10) og blev analyseret ved envejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukeys test. P < 0,05 indikerede en statistisk signifikant forskel. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komponenter | Pinyin | Vægt (g) |
| Codonopsis Radix | Dangshen | 12 |
| Poria kokos | Opfyldelse | 12 |
| Atractylodis makrocephalae rhizoma | Baizhu | 12 |
| Lakrids | Ganção | 6 |
| Tørret appelsinskal | Chenpi | 12 |
| Rhizome Pinelliae Preparata | Jiangbanxia | 9 |
Tabel 1: Sammensætning og andel af lægemidler i LJZD.
| Elementer | Grad eller symptomer | Score |
| Vægttab | < 1% | 0 |
| 1%-5% | 1 | |
| 5%-10% | 2 | |
| 10%-15% | 3 | |
| ≥15% | 4 | |
| Fækal okkult blodprøve | Negativ | 0 |
| Positiv | 2 | |
| synligt blod i afføringen med det blotte øje | 4 | |
| Fækal konsistens | normal | 0 |
| løs afføring | 2 | |
| vandig diarré | 4 |
Tabel 2: Sygdomsaktivitetsindeksscore for UC-CRC-modellen i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRC er en af de mest almindelige kræftformer på verdensplan med ca. 1.148.000 nye tilfælde og mere end 576.000 dødsfald hvert år. CRC kan opdeles i tre typer efter forskellige årsager, herunder arvelig, sporadisk og UC-CRC31. Forekomsten af CRC hos patienter med inflammatoriske tarmsygdomme som UC er signifikant højere end i den generelle befolkning. UC stimulerer udviklingen af CRC gennem den inflammatoriske kræftvej, som adskiller sig fra den typiske adenom-adenocarcinomvej6. På nuværende tidspunkt er årsagen til UC-CRC ukendt, hovedsageligt forårsaget af langvarig tilbagevendende kronisk inflammation med en dødelighed på op til 60%32,33. Der er ingen effektiv behandling for UC-CRC, som har været hotspot for forskning i de senere år. Forståelse af den molekylære mekanisme i UC-CRC er afgørende for tidlig påvisning og præcis behandling af UC-CRC.
I øjeblikket er der mange metoder til at konstruere dyremodeller af UC-CRC, og dannelsesmekanismerne er forskellige. IL-10 eller Muc2/4 genknockout, der resulterer i epitelbarrieredefekter, kan fremkalde spontan colitis hos mus, så det bruges ofte til at konstruere dyre-CRC-modeller baseret på genetiske defekter forbundet med UC 34,35,36. Ikke desto mindre kan dyremodellen af UC-CRC induceret af genknockout ikke simulere sygdommens komplette patogenese, og dens driftsmetode er kompleks, eksperimentet er dyrt, og det har åbenlyse begrænsninger. Kemisk induktion er den klassiske og almindelige metode til konstruktion af UC-CRC dyremodeller37,38. DSS, AOM og dimethylhydrazin er alle almindeligt anvendte kemiske induktorer til konstruktion af UC-CRC. Imidlertid tager det lang tid at bruge disse kemiske reagenser alene til at etablere dyremodeller og har en lav succesrate39. Undersøgelser har vist, at forekomsten af UC-CRC induceret af kombinationen af AOM og DSS kan nå næsten 100%40. Sammenlignet med andre metoder har kombinationen af AOM / DSS fordelene ved enkel betjening, stærk kontrollerbarhed, kort cyklus og høj replikationshastighed og kan bedre simulere human UC-CRC med hensyn til patologi og molekylær mekanisme 40,41,42. Selvom brugen af AOM / DSS-cyklusstimulering til konstruktion af UC-CRC-model har mange fordele, har den også ulemperne ved lang modelleringstid, dyre modelleringsreagenser og kan stadig ikke fuldt ud simulere patogenesen af human UC-CRC.
For at søge et potentielt terapeutisk mål for UC-CRC brugte vi AOM, et kemisk kræftfremkaldende stof, i kombination med DSS-inducerede mus til at etablere en UC-CRC-model. I denne undersøgelse viste mus udsat for AOM og cyklisk stimulering af DSS varierende grader af UC-CRC-relaterede symptomer. Sammenlignet med kontrolgruppen blev modelgruppens DAI-score signifikant øget, hvilket blev manifesteret som vægttab, blodafføring, løs afføring eller vandig diarré. Mens LJZD reducerede DAI-scoren betydeligt. Forkortet kolorektumlængde er en vigtig markør for inflammatorisk respons i UC-CRC43,44. I denne undersøgelse var modelmusenes kolorektumlængde signifikant kortere end kontrolgruppens, og LJZD kunne forbedre det forkortede kolorektum. Kolorektal slimhinden udvikler kronisk betændelse, som gradvist udvikler sig til atypisk hyperplasi af kolorektal væv og til sidst forårsager kræft45. I denne undersøgelse steg antallet af tumorer i kolorektalvævet hos mus i modelgruppen signifikant sammenlignet med kontrolgruppen, og tilsvarende steg kolorektal vævsvægt også. Efter LJZD-behandling faldt antallet af tumorer signifikant, og kolorektalvægten faldt. Det foreslås, at LJZD har en signifikant hæmmende virkning på dannelsen af CRC induceret af UC. Tidligere undersøgelser har vist, at LJZD kan lindre betændelse og reducere ekspressionsniveauerne af TNF-α, IL-6 og IL-1β in vivo 16,28,46. I dette studie blev serum-IL-6-niveauet hos mus i modelgruppen øget, men produktionen af serum IL-6 blev signifikant hæmmet efter LJZD-behandling.
Mikroskopisk observation viste inflammatorisk infiltration af rektalt væv, ødelæggelse af slimhindebarrieren, reduktion af slimudskillelse, uregelmæssig eller forsvinden af bægerceller, forvrængning eller atrofi af tarmkrypter og åbenlys forstyrrelse af kirtelstruktur hos AOM / DSS-behandlede mus. Efter LJZD-behandling var morfologien af bægerceller i kolorektalt væv normal, strukturen af fordybning og kirtel var regelmæssig, og skaden på slimhindebarrieren blev forbedret. Epiteltæt kryds (TJ) er en uundværlig mekanisk barriere for at opretholde celleintegritet og permeabilitet, hovedsageligt inklusive ZO-1 og Occludin29. Det er blevet rapporteret, at ekspressionen af TJ-proteiner såsom ZO-1 i kolorektalt væv hos UC-CRC-patienter er signifikant reduceret 47,48. Denne undersøgelse viste, at den kolorektal slimhindevævsstruktur hos UC-CRC-mus blev ødelagt, og ekspressionen af ZO-1 og Occludin i vævet faldt, mens LJZD kunne vende dette fald, hvilket tyder på, at LJZD kan beskytte integriteten af den kolorektal slimhindebarriere ved at øge ekspressionen af ZO-1 og Occludin. Nukleart associeret antigen (KI67) er en væsentlig komponent i cellecyklusregulering og anvendes i vid udstrækning som indikator for proliferativ aktivitet af tumorceller30,49. I denne undersøgelse blev KI67-proteinekspression øget i modelgruppen sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket indikerer signifikant tumorcelleproliferation i kolorektalt væv. Efter LJZD-behandling blev ekspressionen af KI67-protein reduceret, hvilket viste, at LJZD havde en god effekt på UC-CRC.
Sammenfattende kan AOM intraperitoneal injektion og DSS-cirkulationsstimulering effektivt etablere en UC-CRC-model på kort tid og ligner human UC-CRC med hensyn til histopatologi og molekylære dannelsesmekanismer. Som en klassisk recept kan LJZD reducere DAI-score, kolorektal vævsvægt og inflammatoriske faktorniveauer, effektivt hæmme forkortelsen af kolorektal længde og spille en rolle i UC-stadiet hos UC-CRC-mus. Samtidig kan det øge ekspressionen af TJ-proteiner, forbedre den patologiske skade på kolorektal væv betydeligt, reducere ekspressionen af KI67-protein, reducere forekomsten af vævstumorer signifikant og hæmme transformationsprocessen af UC til CRC. Denne undersøgelse giver en ny idé til behandling af UC-CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Jilin Provincial Department of Science and Technology (YDZJ202201ZYTS181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane | Sigma | A5486 | |
| 5-amino salicylic acid | Kuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd | 3819413 | |
| C57BL/6J mice | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd | NO 210726210100853716 | |
| Cover slip | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432C | |
| DAB color development kit | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 2005289 | |
| Dewatering machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JJ-12J | |
| Dextran sulfate sodium | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MB5535 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Hematoxylin-eosin dye | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | B1000 | |
| IL-6 | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd | MM-0163M2 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22-10 | |
| KI67 primary antibody | Google Biotechnology Inc | GB121141 | |
| Neutral gum | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | 10004160 | |
| Object slide | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432A | |
| Occludin primary antibody | Affnity | DF7504 | |
| Orthostatic optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse CI | |
| Pathological microtome | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| ZO-1 primary antibody | Abcam | ab221547 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Tsai, K. Y., et al. Novel heavily fucosylated glycans as a promising therapeutic target in colorectal cancer. J Transl Med. 21 (1), 505 (2023).
- Chen, X., et al. Smoking, genetic predisposition, and colorectal cancer risk. Clin Transl Gastroenterol. 12 (3), e00317 (2021).
- Keum, N., Giovannucci, E. Global burden of colorectal cancer: emerging trends, risk factors and prevention strategies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (12), 713-732 (2019).
- Sninsky, J. A., Shore, B. M., Lupu, G. V., Crockett, S. D. Risk factors for colorectal polyps and cancer. Gastrointest Endosc Clin N Am. 32 (2), 195-213 (2022).
- Rivera, A. P., et al. Ulcerative colitis-induced colorectal carcinoma: A deleterious concatenation. Cureus. 14 (2), e22636 (2022).
- Faye, A. S., Holmer, A. K., Axelrad, J. E.
- Becker, W. R., et al. Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer. Nat Genet. 54 (7), 985-995 (2022).
- Choi, J. K., Kim, D. W., Shin, S. Y., Park, E. C., Kang, J. G. Effect of ulcerative colitis on incidence of colorectal cancer: Results from the nationwide population-based cohort study (2003-2013). J Cancer. 7 (6), 681-686 (2016).
- Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
- Shah, S. C., Itzkowitz, S. H. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mechanisms and management. Gastroenterology. 162 (3), 715.e3-730.e3 (2022).
- Fabregas, J. C., Ramnaraign, B., George, T. J. Clinical updates for colon cancer care in 2022. Clin Colorectal Cancer. 21 (3), 198-203 (2022).
- Hu, J., et al. Pharmacological and molecular analysis of the effects of Huangqi Jianzhong decoction on proliferation and apoptosis in GES-1 cells infected with H. pylori.Front Pharmacol. 13, 1009705 (2022).
- Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
- Zhang, X. Y., et al. Sishen pill maintained colonic mucosal barrier integrity to treat ulcerative colitis via Rho/ROCK signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536679 (2021).
- Wu, X., Dai, Y., Nie, K. Research progress of Liujunzi decoction in the treatment of tumor-associated anorexia. Drug Des Devel Ther. 16, 1731-1741 (2022).
- Han, Y., et al. Liujunzi decoction exerts potent antitumor activity in oesophageal squamous cell carcinoma by inhibiting miR-34a/STAT3/IL-6R feedback loop and modifies antitumor immunity. Phytomedicine. 111, 154672 (2023).
- Chen, D., Zhao, J., Cong, W. Chinese herbal medicines facilitate the control of chemotherapy-induced side effects in colorectal cancer: Progress and perspective. Front Pharmacol. 9, 1442 (2018).
- Wang, M., Wang, S., Su, Q., Ma, T. Effect of combining early chemotherapy with Zhipu Liujunzi decoction under the concept of strengthening and consolidating body resistance for gastric cancer patients and nursing strategy. Contrast Media Mol Imaging. 2021, 2135924 (2021).
- Lin, Y., Koumba, M. H., Qu, S., Wang, D., Lin, L. Blocking NFATc3 ameliorates azoxymethane/dextran sulfate sodium induced colitis-associated colorectal cancer in mice via the inhibition of inflammatory responses and epithelial-mesenchymal transition. Cell Signal. 74, 109707 (2020).
- Yu, C. T., et al. Identification of significant modules and targets of Xian-Lian-Jie-Du decoction based on the analysis of transcriptomics, proteomics and single-cell transcriptomics in colorectal tumor. J Inflamm Res. 15, 1483-1499 (2022).
- Lin, L., Wang, D., Qu, S., Zhao, H., Lin, Y. miR-370-3p alleviates ulcerative colitis-related colorectal cancer in mice through inhibiting the inflammatory response and epithelial-mesenchymal transition. Drug Des Devel Ther. 14, 1127-1141 (2020).
- Qiu, X., Ma, J., Wang, K., Zhang, H. Chemopreventive effects of 5-aminosalicylic acid on inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer and dysplasia: a systematic review with meta-analysis. Oncotarget. 8 (1), 1031-1045 (2017).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. J Ethnopharmacol. 249, 112426 (2020).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Gok, A., et al. Role of reduced Bdnf expression in novel Apc mutant allele-induced intestinal and colonic tumorigenesis in mice. In Vivo. 37 (4), 1562-1575 (2023).
- Lin, Y., et al. Pou3f1 mediates the effect of Nfatc3 on ulcerative colitis-associated colorectal cancer by regulating inflammation. Cell Mol Biol Lett. 27 (1), 75 (2022).
- Xu, W., Zhao, R., Yuan, B. The therapeutic effect of traditional LiuJunZi decoction on ovalbumin-induced asthma in Balb/C mice. Can Respir J. 2021, 6406295 (2021).
- Kaihara, T., et al. Redifferentiation and ZO-1 reexpression in liver-metastasized colorectal cancer: possible association with epidermal growth factor receptor-induced tyrosine phosphorylation of ZO-1. Cancer Sci. 94 (2), 166-172 (2003).
- Lei, H. T., et al. Ki67 testing in the clinical management of patients with non-metastatic colorectal cancer: Detecting the optimal cut-off value based on the restricted cubic spline model. Oncol Lett. 24 (6), 420 (2022).
- Olén, O., et al. Colorectal cancer in ulcerative colitis: a Scandinavian population-based cohort study. Lancet. 395 (10218), 123-131 (2020).
- Arnold, M., et al. Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality. Gut. 66 (4), 683-691 (2017).
- Biller, L. H., Schrag, D. Diagnosis and treatment of metastatic colorectal cancer: A review. Jama. 325 (7), 669-685 (2021).
- Talero, E., et al. Expression patterns of sirtuin 1-AMPK-autophagy pathway in chronic colitis and inflammation-associated colon neoplasia in IL-10-deficient mice. Int Immunopharmacol. 35, 248-256 (2016).
- Qian, Z., et al. Mulberry fruit prevents LPS-induced NF-κB/pERK/MAPK signals in macrophages and suppresses acute colitis and colorectal tumorigenesis in mice. Sci Rep. 5, 17348 (2015).
- Pothuraju, R., et al. Depletion of transmembrane mucin 4 (Muc4) alters intestinal homeostasis in a genetically engineered mouse model of colorectal cancer. Aging. 14 (5), 2025-2046 (2022).
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Zeng, B., et al. Dextran sodium sulfate potentiates NLRP3 inflammasome activation by modulating the KCa3.1 potassium channel in a mouse model of colitis. Cell Mol Immunol. 19 (8), 925-943 (2022).
- Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S.
- Tanaka, T., et al. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Song, J. L., et al. Dietary mixed cereal grains ameliorate the azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colonic carcinogenesis in C57BL/6J mice. J Med Food. 23 (4), 440-452 (2020).
- Zou, Y. F., et al. Effects of Huaier extract on ameliorating colitis-associated colorectal tumorigenesis in mice. Onco Targets Ther. 13, 8691-8704 (2020).
- Luo, X., et al. Obacunone reduces inflammatory signalling and tumour occurrence in mice with chronic inflammation-induced colorectal cancer. Pharm Biol. 58 (1), 886-897 (2020).
- Dai, Y., et al. Liujunzi Decoction ameliorated cisplatin-induced anorexia by inhibiting theJAK-STAT signaling pathway and coordinating anorexigenic and orexigenic neuropeptides in rats. J Ethnopharmacol. 285, 114840 (2022).
- Ghosh, D., Dutta, A., Kashyap, A., Upmanyu, N., Datta, S. PLP2 drives collective cell migration via ZO-1-mediated cytoskeletal remodeling at the leading edge in human colorectal cancer cells. J Cell Sci. 134 (18), jcs253468 (2021).
- Yan, S., et al. Berberine regulates short-chain fatty acid metabolism and alleviates the colitis-associated colorectal tumorigenesis through remodeling intestinal flora. Phytomedicine. 102, 154217 (2022).
- Ma, Y. L., et al. Immunohistochemical analysis revealed CD34 and Ki67 protein expression as significant prognostic factors in colorectal cancer. Med Oncol. 27 (2), 304-309 (2010).
