Summary
Bu protokol, dekstran sülfat sodyum ile birlikte azometan tarafından indüklenen ülseratif koloproktit ile ilişkili kolorektal kanserin bir fare modelini sağlar. Model, kolorektal kanserin önlenmesi ve tedavisinde geleneksel Çin tıbbı bileşiklerinin etkinliğini değerlendirmek için kullanıldı.
Abstract
Kolorektal kanser (KRK), sindirim sisteminin yaygın bir malignitesidir ve dünya çapında en sık görülen üçüncü malignite ve maligniteye bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni haline gelmiştir. Ülseratif koloproktit (ÜK) prekanseröz bir lezyondur ve ÜK ile ilişkili KRK (ÜK-KRK) KRK'NIN EN SıK GÖRÜLEN ALT TIPIDIR. Bu nedenle, makul bir UC-CRC modeli, yeni ilaç geliştirmenin temel taşı ve garantisidir. Geleneksel Çin tıbbı (TCM), iyi etkinliği nedeniyle UC-CRC tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. TCM'nin klasik bir tonik reçetesi olan Liujunzi kaynatma (LJZD), UC-CRC tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, azometan ve dekstran sülfat sodyum birleştirilerek UC-KRK modeli oluşturulmuş ve LJZD uygulanmıştır. Veriler, LJZD'nin fare vücut ağırlığı, kolorektal uzunluk, patolojik ve inflamatuar faktörler, kolorektal bariyer fonksiyonu ve kanser belirteçlerini kullanarak UC-CRC'de kanser geçişini etkili bir şekilde inhibe edebileceğini doğruladı. Bu protokol, UC-CRC'nin önlenmesi ve tedavisinde TCM'nin etkinliğini değerlendirmek için bir sistem sağlar.
Introduction
Kolorektal kanser (KRK), küresel kanser insidansının %10'unu ve toplam kansere bağlı ölümlerin %9,4'ünü oluşturan, dünyada en sık görülen üçüncü malignite ve ikinci en yaygın ölüm nedeni olan yaygın bir gastrointestinal malignitedir 1,2. Genetik faktörler, kronik inflamasyon, yüksek yağlı diyet, diyabet ve anormal bağırsak florası CRC 3,4 için risk faktörleridir. Bunlar arasında inflamatuar barsak hastalığı, özellikle ülseratif koloproktit (ÜK), CRC 5,6 için açık bir risk faktörüdür. UC ile ilişkili CRC (UC-CRC),CRC 7,8'in tipik adenom-adenokarsinom gelişim modelinden farklı olarak, kolorektumun kronik inflamasyonuna dayanan inflamasyon, atipik hiperplazi ve kanserin bir geçiş sürecidir. Genel popülasyonla karşılaştırıldığında, inflamatuar barsak hastalığı olan hastalarda KRK riski yaklaşık 10-40 kat daha yüksektir9.
Şu anda, cerrahi hala KRK için standart tedavidir ve tümörün konumuna ve evresine bağlı olarak radyasyon tedavisi, sistemik ilaç tedavisi veya her ikisinin bir kombinasyonu mümkündür10. Bu geleneksel tedavi yöntemleri büyük ilerleme kaydetmiş olsa da, KRK'nin yüksek heterojenliği ve nüks oranı nedeniyle prognoz kötüdür ve tedavi etkisi ideal değildir11,12. Bu nedenle, erken teşhis, erken tanı ve kapsamlı tedavi, KRK hastalarının sağkalım oranını iyileştirmenin anahtarıdır ve ÜK'nin KRK'ye dönüşümüne dikkat etmek özellikle önemlidir. Yıllar geçtikçe, geleneksel Çin tıbbı (TCM), sınırlı yan etkileri ve önemli etkinliği nedeniyle UC-CRC veya kronik gastrit tedavisinde büyük ilgi görmüştür. Diyalektik tedaviye dayanarak, çeşitli nesillerden ünlü Çin tıbbı uygulayıcıları, Huangqi Jianzhong kaynatma13, Sijunzi kaynatma14 ve Sishen hapı15 gibi çok sayıda klasik reçete oluşturmuştur.
Liujunzi kaynatma (LJZD), Yi Xue Zheng Zhuan'ın Ming Hanedanlığı'nda derlenen çalışmalarından kaynaklanmaktadır ve TCM16'da klasik bir reçetedir. Tablo 1'de gösterildiği gibi, LJZD, Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Poria cocos (Schw.) Kurt (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao), Narenciye reticulata Blanco (Chenpi) ve Pinellia ternata (Thunb.) Qi'yi yenileme ve dalağı güçlendirme, nemi kurutma ve balgamı çözme etkisine sahip olan Breit (Banxia). Modern klinik uygulamada, genellikle kronik gastrit, mide ülseri ve duodenum ülserlerini tedavi etmek için kullanılır. Modern farmakolojik araştırmalar, LJZD ve modifiye LJZD'nin UC ve sindirim sistemi kanserinin adjuvan tedavisinde yüksek uygulama değerine sahip olduğunu göstermiştir 17,18,19.
Şu anda, UC-CRC fare modellerini oluşturmanın birçok yolu vardır, ancak azoksimetan (AOM)/dekstran sülfat sodyum (DSS) kaynaklı fare modeli en yaygın kullanılan UC-CRC modelidir; klinik semptomlar, morfolojik ve patolojik gözlemler, modelin insan UC-CRC20,21'e çok benzediğini kanıtlamıştır. Temel prensip, önce kimyasal kanserojen AOM ile karsinogenezi indüklemek ve daha sonra bağırsak mukozal epitelinin sürekli hasarını ve onarımını simüle etmek için fareleri sürekli olarak DSS'nin enflamatuar stimülasyon ortamına maruz bırakmak ve böylece bir UC-CRC fare modelioluşturmaktır 22. Bu çalışmanın amacı, kısa dönemde AOM'nin intraperitoneal enjeksiyonu ve DSS'nin siklik stimülasyonu ile UC-KRK'nin fare modelini oluşturmak ve UC-KRK tedavisine bilimsel bir temel sağlamak amacıyla ilacın ve LJZD'nin moleküler mekanizmasının UC-KRK üzerindeki etkisini değerlendirmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan prosedürü, Changchun Çin Tıbbı Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Kayıt numarası: 2021214). Spesifik patojen içermeyen C57BL/6J fareler (8-10 hafta, ağırlık 18-22 g), erkek ve dişi, 22 °C ve %65 bağıl nemde bağımsız olarak havalandırılan kafeslere yerleştirildi. Fareler, suya ve diyete serbestçe erişebildikleri 7 günlük uyarlanabilir beslenmeden sonra deneye başladılar.
1. İlaç hazırlama
- LJZD'nin Hazırlanması
NOT: Kullanılan Çin tıbbı, Changchun Çin Tıbbı Üniversitesi Bağlı Hastanesinden satın alınmış ve gerçek Çin tıbbı olarak tanımlanmıştır (bakınız Tablo 1).- Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) özel bir seramik tencereye koyun (Malzeme Tablosuna bakınız). 1000 mL damıtılmış su ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin (bkz. Şekil 1A).
- Toz 12 g Bir öğütücü ile ince toz haline getirin ve 300 mL damıtılmış suyu başka bir kapta oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
- Yukarıdaki Çin tıbbını özel seramik kapta karıştırın. Karışımı kaynatın ve ardından sadece 300 mL kaynatma kalana kadar orta ateşte tutun. Filtreleme için tıbbi gazlı bez kullanın ve süzüntüyü oda sıcaklığında saklayın.
- 1000 mL damıtılmış su ekleyin ve yukarıdaki kaynatma işlemini bir kez daha tekrarlayın. Tıbbi gazlı bez kullanarak tekrar süzün. Süzüntüyü birleştirin ve sadece 150 mL kalana kadar kaynatın.
- Konsantre sıvıyı 5 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı orta ateşte 30 mL'ye konsantre edin. Son konsantreyi bir tabağa aktarın ve sadece çözünen madde toz olarak kalana kadar elektrikli bir kurutma fırını kullanarak kurutun.
- Yukarıdaki katıyı tartın ve farelerin günlük dozu olan 0.2 mL (114.16 mg / mL) başına 22.85 mg ilaç içeren bir çözelti elde etmek için steril damıtılmış suda çözün.
- 5-amino salisilik asidin hazırlanması
NOT: 5-amino salisilik asit (5-ASA; Malzeme Tablosuna bakınız) UC-CRC üzerinde iyi bir önleyici etkiye sahiptir ve bu çalışmada pozitif bir ilaç olarak kullanılmıştır23.- 1.82 mg / mL 5-ASA çözeltisi elde etmek için 64 mg 5-ASA tozunu 200 mL steril damıtılmış su içinde çözün. Tek bir fare için günlük dozaj 0.2 mL idi.
- AOM enjeksiyon çözeltisinin hazırlanması
- 25 mg AOM tozuna 2,5 mL steril damıtılmış su ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 10 mg / mL AOM stok çözeltisi yapmak için vorteks karıştırıcı ile karıştırın (Malzeme Tablosuna bakınız), kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
- AOM stok çözeltisini steril damıtılmış su ile 10:1'de (1 mg/mL) seyrelterek AOM enjeksiyon çözeltisini hazırlayın.
2. UC-CRC modelinin kurulması
NOT: Deney 4 gruba ayrıldı: kontrol, model, LJZD ve 5-ASA grubu, her grupta 10 fare. Kontrol grubu hariç diğer gruplar AOM ve DSS ile tedavi edildi.
- AOM enjeksiyon çözeltisinin intraperitoneal enjeksiyonu
NOT: 7 gün boyunca uyarlanabilir beslemeden sonra, farelere intraperitoneal enjeksiyon yoluyla AOM enjeksiyon çözeltisi (1 mg / mL) verildi (bkz. Şekil 1B).- Fareyi karnı yukarı ve başı hafifçe aşağı gelecek şekilde tutun. Karın derisini sıkılaştırmak için sırt derisini kavrayın ve cildi 1 mL'lik bir şırınga ile orta karın çizgisinde her iki uyluğun kök çizgisinin kesişiminin yaklaşık 1 cm sağında delin (bkz.
- 1 mL şırınga iğnesini karın orta hattına paralel olacak şekilde derinin altında 3-5 mm mesafeye itin ve iğneyi karın boşluğuna 0,3-0,5 mm 45°'de sokun.
- Uç karın kasından geçtikten sonra, operatör ani bir direnç kaybı hisseder. Ardından, sıvı sızıntısı olup olmadığını gözlemlemek için şırıngayı dışarı ve geriye doğru çekin. Değilse, AOM enjeksiyon solüsyonunu farelere 0.1 mL / 10 g'da yavaşça itin.
- % 2 DSS çözeltisinin döngüsel stimülasyonu
NOT: AOM ile indüklenen her fareye 3, 6 ve 9. haftalarda 500 mL DSS çözeltisi verildi ve fareler bu süre zarfında serbestçe içti.- 10 g DSS'ye 500 mL steril damıtılmış su ekleyerek% 2 DSS çözeltisi hazırlayın (bkz. Bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın ve kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- AOM ile indüklenen her fare, AOM indüksiyonundan sonra 3, 6 ve 9. haftalarda 7 gün boyunca 500 mL% 2 DSS solüsyonunu serbestçe içer.
3. İlaç tedavisi
NOT: Yetişkin insanların günde 63 g LJZD'ye ihtiyacı vardır. Deneysel fare ve insan ilaç dozunun dönüşüm formülüne göre, fareler için eşdeğer deney dozu (mg / kg) = insan dozu (mg / kg) / vücut ağırlığı (60 kg) x 9.1, farelerin günlük dozu yaklaşık 9.6 g / kg idi.
- LJZD ve 5-ASA grubunu, sırasıyla 7. ve 15. haftalarda gastrik gavaj ile 0.1 mL / 10 g hazırlanan LJZD ve 5-ASA solüsyonu ile tedavi edin.
- Farelerde intragastrik uygulama için aşağıdaki prosedürü uygulayın. Fareyi sol elinizde tutun ve sağ elinizde mide perfüzyon aparatını tutun. Şırınga iğnesini ağzına sokun ve farelerin farenksinin arka duvarından aşağı kaydırın. Fareler yutkunurken farenksi aşağı kaydırın ve ilerlemeye devam edin. Bir direnç hissi olduğunda ve şırınga farenkse itilebildiğinde, iğneyi dışarı çekin ve enjeksiyonu tamamlayın.
- Kontrol ve model grubuna aynı miktarda salin uygulayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Her gruptaki fareleri, uygulama süresi boyunca aynı anda günde bir kez uygun ilaçla tedavi edin.
4. UC-CRC modelinin değerlendirilmesi ve LJZD'nin etkinliği
- Hastalık aktivite indeksi skoru
NOT: Tablo 2'ye göre, farelerin kilo kaybı, dışkı viskozitesi ve dışkı kanaması birleştirilerek hastalık aktivite indeksi (DAI) skoru değerlendirildi.- Adaptif beslenmenin başlangıcından ilaç tedavisinin sonuna kadar farelerin ağırlığını günlük olarak kaydedin.
- Her deney faresinin dışkı kıvamını dikkatlice gözlemleyin ve bağırsak hareketlerini üç koşuldan biri olarak kaydedin: normal, gevşek dışkı ve sulu ishal.
- Deney hayvanlarının dışkı kanamasını üç koşuldan biri olarak kaydedin: kanama yok, az kanama ve dışkıda görünür kan.
- Serumda IL-6 seviyesinin saptanması
- Fareleri 9 hafta boyunca LJZD veya 5-ASA ile tedavi edin. Sol elinizle farenin boyun derisini kavrayarak ve yanal dekübit pozisyonunu almak için deney masasına hafifçe bastırarak fareleri sabitleyin. Farelerin bıyıklarını makasla kesin. Kan kontaminasyonunu önlemek için farelerin bıyıklarını makasla dikkatlice kesin ( Malzeme Tablosuna bakın).
NOT: Serbestçe hareket edemeyen farelerin uygun şekilde sabitlendiği kabul edildi. Bu olmazsa, fareler sabitlenmelidir. - % 2 izofluran soluyarak fareyi uyuşturun. Göz küresinin etrafındaki cildi etanol ile sterilize edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Göz küresini tıkalı ve çıkıntılı hale getirmek için yandaki göz derisine hafifçe bastırın.
- Göz küresini bir dirsek cımbızıyla sıkıştırın ve gözbebeklerini doğru ve hızlı bir şekilde çıkarın. Kanın santrifüj tüpüne damlamasına izin verin (bkz. Bu süreçte, kan alımını hızlandırmak için farenin kalbine dokunun.
- Toplanan kanı 30 dakika oda sıcaklığında tutun ve 10 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüj edin. Süpernatanı toplayın ve IL-6 içerik algılama kiti talimatlarına göre IL-6 seviyesini tespit edin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Fareleri 9 hafta boyunca LJZD veya 5-ASA ile tedavi edin. Sol elinizle farenin boyun derisini kavrayarak ve yanal dekübit pozisyonunu almak için deney masasına hafifçe bastırarak fareleri sabitleyin. Farelerin bıyıklarını makasla kesin. Kan kontaminasyonunu önlemek için farelerin bıyıklarını makasla dikkatlice kesin ( Malzeme Tablosuna bakın).
- Kolorektal dokuyu ayırma
- Kan örneklemesinden sonra farelere% 5 aşırı doz izofluran ve servikal çıkık soluyarak ötenazi yapın (bkz.
- Fareleri kriyojenik anatomik bir ortamda tutun. Fareleri sırtüstü pozisyonda hareketsiz hale getirin. Alt karın kıllarını makasla kesin ve etanol ile sterilize edin.
- İki uyluk kökü ile karın orta hattı arasındaki kesişme noktasını göz kapağı forseps ile sıkıştırın (bkz. Makasla yaklaşık 1-1,5 cm enine bir kesi kesin.
- Transvers insizyonun orta noktasından ksifoid sürece doğru karnın medyan çizgisi boyunca uzunlamasına bir kesi yapın.
- Kolorektumu çevreleyen dokudan ayırmak için peri-kolorektal dokuları anüs yönünde çıkarın. Kolorectum'a zarar vermemeye dikkat edin.
- Kolorectum'u tamamen ortaya çıkarmak için karın derisini yanlara doğru itin. Kolorektumu karın boşluğundan göz kapağı forseps ile çıkarın ve segmentleri anüsten çekuma kadar kesin (hariç); Toplam uzunluk yaklaşık 10 cm'dir. Elde edilen kolorektal dokuları 4 °C'de serum fizyolojik içinde saklayın.
- Rektumun uzunluğunun ve ağırlığının değerlendirilmesi
- Kolorectumun içini yıkamak için salini 4 ° C'de 5 mL'lik bir iğne ile çıkarın ( Malzeme Tablosuna bakın). Ardından, dokunun nemini emmek için kolorektumu emici kağıda yerleştirin.
- Kolorektal dokuları tartın ve ardından uzunluklarını ölçmek için A4 kağıda yerleştirin.
- Kolorrektumdaki tümör sayısını ölçün
- Kolorektumu tamamen açmak için uzunlamasına kesin ve kolorrektumdaki tümörlerin sayısını ve boyutunu gözlemleyin.
- Kolorektumun patolojik analizi
- Kolorektum'u 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Sabit rektal dokuyu erimiş parafine gömün ve doku donduran bir mikrotom ile sürekli olarak 5 μm kalınlığında kesit alın.
- Hou ve ark.24 prosedürüne göre, ksilen içindeki bölümleri mumdan arındırın ve ardından seri etanol konsantrasyonları ile kurutun. Hematoksilen çözeltisi ile 5 dakika boyadıktan sonra, bölümleri saf suyla durulayın. Bundan sonra, 1 dakika boyunca% 0.5 eozin çözeltisi ile boyayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Gradyan dehidrasyon ve ksilen şeffaf tedavisini tekrar gerçekleştirin. Kesitleri kapatın ve Xie ve ark.25 tarafından açıklandığı gibi optik mikroskop altında gözlemleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve fotoğraflayın.
- Kolorektumun immünohistokimyasal analizi
- Bölümleri yukarıdaki yönteme göre mumdan arındırın ve kurutun. Gök ve ark.26 tarafından tarif edildiği gibi yüksek basınçlı termal onarım tekniği ile kesitlerdeki antijeni onarın.
- Bölümleri endojen peroksidaz blokerlerinde oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. Bölümleri keçi serumu ile kapatın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Bölümlere birincil antikor ZO-1 (1:1000), Oklüdin (1:1000) ve KI67 (1:500; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Bölümleri PBS tamponu ile durulayın (Malzeme Tablosuna bakınız), genel amaçlı ikincil antikor (1:5000; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Renk geliştirme bölümlerine DAB çözümünü (Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. Bölümleri hematoksilen çözeltisi ile boyayın.
- Bölümleri tekrar kurutun, şeffaflaştırın ve kapatın. Optik mikroskop ile protein ekspresyonunu gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LJZD'nin kaynatma işlemi, Tablo 1'deki ilaçların bileşim oranına ve Şekil 1A'daki TCM'nin kaynatma yöntemine göre hazırlanmıştır. Şekil 1B'de belirtilen zaman noktasına göre, farelere 7. günde intraperitoneal olarak 1 mg/mL AOM enjekte edildi ve farelere3., 6. ve 9. haftalarda %2 DSS içeren içme suyuna serbest erişim sağlandı. UC-CRC fare modeli 15. haftada başarıyla kuruldu. Bu arada, fareler 7. haftadan 15. haftaya kadar gavaj ile LJZD ile tedavi edildi. Veriler, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, UC-CRC model grubunun LJZD tedavisi ile hafifletilen önemli bir kilo kaybına sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 2A, P < 0.01). Çalışmanın sonunda, LJZD tedavisi, UC-CRC model grubuna kıyasla DAI skorunu iyileştirdi (Şekil 2B). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, UC-CRC model grubu daha kısa bir kolorektal uzunluğa sahipti ve bu LJZD tedavisi ile arttı (Şekil 2C, D, P < 0.01). Kolorektal ağırlığın vücut ağırlığına oranı, farelerde KRK gelişimini yansıtır ve daha yüksek bir oran akut tümör gelişimini gösterir27. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubun kolorektal organ indeksi önemli ölçüde artmış ve LJZD tedavisi kolorektal organ indeksini büyük ölçüde azaltmıştır (Şekil 2E, P < 0.05). Ek olarak, LJZD tedavisi kolorektal tümörlerin oluşumunu (Şekil 2F, P < 0.01) ve serum proinflamatuar faktör IL-628 seviyesini de inhibe etti (Şekil 2G, P < 0.05).
Patolojik sonuçlar, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, UC-CRC model grubundaki farelerin daha büyük kolorektal tümörlere sahip olduğunu ve adenokarsinom oluşturduğunu, LJZD tedavisinin ise tümörlerin boyutunu ve derecesini azalttığını doğruladı (Şekil 3). İmmünohistokimyasal veriler, ZO-1 ve Oklüdin29'un yüksek protein ekspresyonu ile gösterildiği gibi, UC-CRC model farelerde LJZD tedavisinin kolorektal bariyer fonksiyonunu arttırdığını göstermiştir (Şekil 4). Buna paralel olarak, LJZD tedavisi kanser belirteci KI6730'un protein ekspresyon seviyelerini baskılamıştır (Şekil 4).
Şekil 1: LJZD'nin hazırlanması ve koloproktit kanserinin bir fare modelinin oluşturulması. A) Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g) ve zencefil ile işlenmiş Ban Xia (9 g) karışımı, 1 saat boyunca oda sıcaklığında 1000 mL damıtılmış suya daldırıldı. 12 g Fuling tozu, oda sıcaklığında 300 mL damıtılmış suya 1 saat batırıldı. Yukarıdaki altı bitkinin karışımı 100 ° C'de 40 dakika kaynatıldı. (B) 7. günde, C57BL / 6J farelerine intraperitoneal olarak 1 mg / mL AOM enjekte edildi. Farelere3., 6. ve 9. haftalarda% 2 DSS ad libitum içeren su verildi. 7 ila 15 hafta arasında, farelere gavaj yoluyla LJZD verildi. Kısaltmalar: AOM, azometan; DAI, hastalık aktivite indeksi; DSS, dekstran sülfat sodyum; LJZD, Liujunzi Kaynatma; w, hafta. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: UC-CRC modelinin değerlendirilmesi ve LJZD'nin etkinliği. (A) LJZD, UC-CRC model farelerde vücut ağırlığını iyileştirdi. (B) LJZD, UC-CRC model farelerde DAI skorlarını hafifletti. (C, D) LJZD, UC-CRC model farelerde kolorektumun uzunluğunu arttırdı. (E) LJZD, UC-CRC model farelerde kolorektumun organ indeksini azalttı. (F) LJZD, koloproktit kanseri model farelerinde kolorektal tümör oluşumunu inhibe etti. (G) UC-CRC model farelerde LJZD baskılanmış serum IL-6 seviyesi. #P< 0.05 ve ##P< 0.01, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında; *P < 0,05 ve **P< 0,01, model grubuyla karşılaştırılmıştır. Veriler ortalama ± standart sapma (n=10) olarak ifade edildi ve tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey testi ile analiz edildi. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bir fark gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farelerde kolorektal dokuların patolojik özelliklerinin hematoksilen-eozin boyama ile değerlendirilmesi. Kontrol grubunda patolojik hasar yoktu. UC-CRC model grubunun tümör dokusu büyüktü ve adenokarsinom ve yüksek dereceli neoplazi oluştururken, LJZD tedavi grubunda az miktarda lokal adenom ve düşük dereceli neoplazinin eşlik ettiği tümör dokusu azalmıştı. Siyah ok, kanser öncesi displastik tümör bezini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: UC-CRC model farelerde LJZD'nin kolorektal bariyer fonksiyonu ve kanser belirteci üzerindeki etkisi. (A) ZO-1, Oklüdin ve KI67'nin immünohistokimyasal görüntüleri. (B) ZO-1, Oklüdin ve KI67'nin protein ekspresyonunun istatistiksel sonuçları. LJZD tedavisi, kolorektal bariyer fonksiyonel proteinleri ZO-1 ve Occludin'in ekspresyonunu arttırırken, UC-CRC model farelerde kanser belirteci KI67 seviyesini azalttı. ## P < 0.01, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında; ** P < 0.01, model grubuyla karşılaştırıldığında. Veriler ortalama ± standart sapma (n=10) olarak ifade edildi ve tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey testi ile analiz edildi. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bir fark gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Bileşen | Pinyin | Ağırlık (g) |
| Codonopsis Radix | Dangşen | 12 |
| Poria hindistan cevizi | Fuling (Fuling) | 12 |
| Atractylodis Macrocephalae Rhizoma | Baizhu Belediyesi | 12 |
| Meyan | Genceco Belediyesi | 6 |
| Kurutulmuş portakal kabuğu | Çenpi Belediyesi | 12 |
| Köksap Pinelliae Preparata | Jiangbanxia Belediyesi | 9 |
Tablo 1: LJZD'deki ilaçların bileşimi ve oranı.
| Eşya | Derece veya semptomlar | Notalar |
| Kilo kaybı | < %1 | 0 |
| 1%-5% | 1 | |
| 5%-10% | 2 | |
| 10%-15% | 3 | |
| ≥15% | 4 | |
| Dışkıda gizli kan testi | Negatif | 0 |
| Pozitif | 2 | |
| Çıplak gözle dışkıda görünür kan | 4 | |
| Dışkı kıvamı | normal | 0 |
| gevşek dışkı | 2 | |
| sulu ishal | 4 |
Tablo 2: Farelerde UC-CRC modeli için hastalık aktivite indeksi skoru.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KRK, her yıl yaklaşık 1.148.000 yeni vaka ve 576.000'den fazla ölümle dünya çapında en yaygın kanserlerden biridir. KRK, kalıtsal, sporadik ve UC-KRK olmak üzere farklı nedenlere göre üç tipe ayrılabilir31. ÜK gibi inflamatuar barsak hastalıkları olan hastalarda KRK insidansı, genel popülasyondan anlamlı olarak daha yüksektir. UC, tipik adenom-adenokarsinomyolu 6'dan farklı olan inflamatuar-kanser yolu yoluyla KRK gelişimini uyarır. Şu anda, UC-KRK'nin nedeni bilinmemektedir, esas olarak uzun süreli tekrarlayan kronik inflamasyondan kaynaklanmaktadır ve mortalite oranı %60'a kadar çıkmaktadır32,33. Son yıllarda araştırmaların sıcak noktası olan UC-CRC için etkili bir tedavi yoktur. UC-CRC'nin moleküler mekanizmasının anlaşılması, UC-CRC'nin erken tespiti ve hassas tedavisi için çok önemlidir.
Şu anda, UC-CRC'nin hayvan modellerini oluşturmak için birçok yöntem vardır ve oluşum mekanizmaları farklıdır. Epitelyal bariyer kusurlarına neden olan IL-10 veya Muc2/4 gen nakavt, farelerde spontan kolite neden olabilir, bu nedenle genellikle UC 34,35,36 ile ilişkili genetik kusurlara dayalı hayvan CRC modelleri oluşturmak için kullanılır. Bununla birlikte, gen nakavtının neden olduğu UC-CRC'nin hayvan modeli, hastalığın tam patogenezini simüle edemez ve çalışma yöntemi karmaşıktır, deney pahalıdır ve bariz sınırlamaları vardır. Kimyasal indüksiyon, UC-CRC hayvan modellerini oluşturmak için klasik ve yaygın yöntemdir 37,38. DSS, AOM ve dimetilhidrazin, UC-CRC'nin yapımı için yaygın olarak kullanılan kimyasal indükleyicilerdir. Bununla birlikte, hayvan modelleri oluşturmak için bu kimyasal reaktifleri tek başına kullanmak uzun zaman alır ve düşük bir başarı oranına sahiptir39. Çalışmalar, AOM ve DSS kombinasyonu ile indüklenen UC-KRK insidansının neredeyse %100'e ulaşabildiğini göstermiştir40. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, AOM / DSS kombinasyonu basit kullanım, güçlü kontrol edilebilirlik, kısa döngü ve yüksek replikasyon hızı avantajlarına sahiptir ve patoloji ve moleküler mekanizma açısından insan UC-CRC'sini daha iyi simüle edebilir40,41,42. UC-CRC modelini oluşturmak için AOM/DSS döngüsü stimülasyonunun kullanılmasının birçok avantajı olmasına rağmen, uzun modelleme süresi, pahalı modelleme reaktifleri gibi dezavantajları da vardır ve yine de insan UC-CRC'nin patogenezini tam olarak simüle edemez.
UC-CRC için potansiyel bir terapötik hedef aramak için, bir UC-CRC modeli oluşturmak için DSS ile indüklenen farelerle birlikte kimyasal bir kanserojen olan AOM'yi kullandık. Bu çalışmada, AOM'ye ve DSS'nin döngüsel stimülasyonuna maruz kalan fareler, değişen derecelerde UC-CRC ile ilişkili semptomlar göstermiştir. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubunun DAI skoru önemli ölçüde artmıştır ve bu durum kilo kaybı, kan dışkısı, gevşek dışkı veya sulu ishal olarak kendini göstermiştir. LJZD ise DAI puanını önemli ölçüde düşürdü. Kolorektum uzunluğunun kısalması, UC-CRC 43,44'te inflamatuar yanıtın önemli bir belirtecidir. Bu çalışmada, model farelerin kolorektum uzunluğu kontrol grubununkinden önemli ölçüde daha kısaydı ve LJZD kısaltılmış kolorektomiyi iyileştirebildi. Kolorektal mukoza, yavaş yavaş kolorektal dokunun atipik hiperplazisine dönüşen ve sonunda kansere neden olan kronik inflamasyon geliştirir45. Bu çalışmada, model grubundaki farelerin kolorektal dokusundaki tümör sayısı, kontrol grubuna göre önemli ölçüde artmış ve buna bağlı olarak kolorektal doku ağırlığı da artmıştır. LJZD tedavisinden sonra, tümör sayısı önemli ölçüde azaldı ve kolorektal ağırlık azaldı. LJZD'nin UC tarafından indüklenen KRK oluşumu üzerinde önemli bir inhibitör etkiye sahip olduğu öne sürülmektedir. Önceki çalışmalar, LJZD'nin inflamasyonu hafifletebileceğini ve TNF-α, IL-6 ve IL-1β ekspresyon seviyelerini in vivo 16,28,46 azaltabileceğini bulmuştur. Bu çalışmada, model grubundaki farelerin serum IL-6 seviyesi arttırıldı, ancak LJZD tedavisinden sonra serum IL-6 üretimi önemli ölçüde inhibe edildi.
Mikroskobik gözlem, rektal dokunun inflamatuar infiltrasyonunu, mukozal bariyerin tahrip edilmesini, mukus sekresyonunun azalmasını, goblet hücrelerinin düzensiz veya kaybolmasını, bağırsak kriptlerinin bozulmasını veya atrofisini ve AOM / DSS ile tedavi edilen farelerde bez yapısında bariz bozukluğu gösterdi. LJZD tedavisinden sonra, kolorektal dokudaki goblet hücrelerinin morfolojisi normaldi, girinti ve bez yapısı düzenliydi ve mukozal bariyerdeki hasar düzeldi. Epitelyal sıkı bağlantı (TJ), esas olarak ZO-1 ve Occludin29 dahil olmak üzere hücre bütünlüğünü ve geçirgenliğini korumak için vazgeçilmez bir mekanik bariyerdir. ÜK-KRK hastalarının kolorektal dokusunda ZO-1 gibi TJ proteinlerinin ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığı bildirilmiştir47,48. Bu çalışma, UC-CRC farelerinin kolorektal mukozal doku yapısının tahrip olduğunu ve dokudaki ZO-1 ve Okkludin ekspresyonunun azaldığını, LJZD'nin ise bu düşüşü tersine çevirebildiğini gösterdi, bu da LJZD'nin ZO-1 ve Occludin'in ekspresyonunu artırarak kolorektal mukozal bariyerin bütünlüğünü koruyabileceğini düşündürdü. Nükleer ilişkili antijen (KI67), hücre döngüsü regülasyonunun önemli bir bileşenidir ve tümör hücrelerinin proliferatif aktivitesinin bir göstergesi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır30,49. Bu çalışmada, KI67 protein ekspresyonu model grubunda kontrol grubuna göre artmış ve kolorektal dokuda önemli tümör hücresi proliferasyonunu göstermiştir. LJZD tedavisinden sonra, KI67 proteininin ekspresyonu azaldı, bu da LJZD'nin UC-CRC üzerinde iyi bir etkiye sahip olduğunu gösterdi.
Özetle, AOM intraperitoneal enjeksiyon ve DSS dolaşım stimülasyonu, kısa sürede etkili bir UC-KRK modeli oluşturabilir ve histopatoloji ve moleküler oluşum mekanizmaları açısından insan UC-KRK'ye benzer. Klasik bir reçete olarak LJZD, DAI skorunu, kolorektal doku ağırlığını ve inflamatuar faktör seviyelerini azaltabilir, kolorektal uzunluğun kısalmasını etkili bir şekilde inhibe edebilir ve UC-CRC farelerinde UC aşamasında rol oynayabilir. Aynı zamanda, TJ proteinlerinin ekspresyonunu artırabilir, kolorektal dokunun patolojik hasarını önemli ölçüde iyileştirebilir, KI67 proteininin ekspresyonunu azaltabilir, doku tümörlerinin insidansını önemli ölçüde azaltabilir ve UC'nin CRC'ye dönüşüm sürecini inhibe edebilir. Bu çalışma UC-KRK tedavisi için yeni bir fikir sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Jilin İl Bilim ve Teknoloji Departmanı (YDZJ202201ZYTS181) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane | Sigma | A5486 | |
| 5-amino salicylic acid | Kuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd | 3819413 | |
| C57BL/6J mice | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd | NO 210726210100853716 | |
| Cover slip | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432C | |
| DAB color development kit | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 2005289 | |
| Dewatering machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JJ-12J | |
| Dextran sulfate sodium | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MB5535 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Hematoxylin-eosin dye | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | B1000 | |
| IL-6 | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd | MM-0163M2 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22-10 | |
| KI67 primary antibody | Google Biotechnology Inc | GB121141 | |
| Neutral gum | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | 10004160 | |
| Object slide | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432A | |
| Occludin primary antibody | Affnity | DF7504 | |
| Orthostatic optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse CI | |
| Pathological microtome | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| ZO-1 primary antibody | Abcam | ab221547 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Tsai, K. Y., et al. Novel heavily fucosylated glycans as a promising therapeutic target in colorectal cancer. J Transl Med. 21 (1), 505 (2023).
- Chen, X., et al. Smoking, genetic predisposition, and colorectal cancer risk. Clin Transl Gastroenterol. 12 (3), e00317 (2021).
- Keum, N., Giovannucci, E. Global burden of colorectal cancer: emerging trends, risk factors and prevention strategies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (12), 713-732 (2019).
- Sninsky, J. A., Shore, B. M., Lupu, G. V., Crockett, S. D. Risk factors for colorectal polyps and cancer. Gastrointest Endosc Clin N Am. 32 (2), 195-213 (2022).
- Rivera, A. P., et al. Ulcerative colitis-induced colorectal carcinoma: A deleterious concatenation. Cureus. 14 (2), e22636 (2022).
- Faye, A. S., Holmer, A. K., Axelrad, J. E.
- Becker, W. R., et al. Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer. Nat Genet. 54 (7), 985-995 (2022).
- Choi, J. K., Kim, D. W., Shin, S. Y., Park, E. C., Kang, J. G. Effect of ulcerative colitis on incidence of colorectal cancer: Results from the nationwide population-based cohort study (2003-2013). J Cancer. 7 (6), 681-686 (2016).
- Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
- Shah, S. C., Itzkowitz, S. H. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mechanisms and management. Gastroenterology. 162 (3), 715.e3-730.e3 (2022).
- Fabregas, J. C., Ramnaraign, B., George, T. J. Clinical updates for colon cancer care in 2022. Clin Colorectal Cancer. 21 (3), 198-203 (2022).
- Hu, J., et al. Pharmacological and molecular analysis of the effects of Huangqi Jianzhong decoction on proliferation and apoptosis in GES-1 cells infected with H. pylori.Front Pharmacol. 13, 1009705 (2022).
- Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
- Zhang, X. Y., et al. Sishen pill maintained colonic mucosal barrier integrity to treat ulcerative colitis via Rho/ROCK signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536679 (2021).
- Wu, X., Dai, Y., Nie, K. Research progress of Liujunzi decoction in the treatment of tumor-associated anorexia. Drug Des Devel Ther. 16, 1731-1741 (2022).
- Han, Y., et al. Liujunzi decoction exerts potent antitumor activity in oesophageal squamous cell carcinoma by inhibiting miR-34a/STAT3/IL-6R feedback loop and modifies antitumor immunity. Phytomedicine. 111, 154672 (2023).
- Chen, D., Zhao, J., Cong, W. Chinese herbal medicines facilitate the control of chemotherapy-induced side effects in colorectal cancer: Progress and perspective. Front Pharmacol. 9, 1442 (2018).
- Wang, M., Wang, S., Su, Q., Ma, T. Effect of combining early chemotherapy with Zhipu Liujunzi decoction under the concept of strengthening and consolidating body resistance for gastric cancer patients and nursing strategy. Contrast Media Mol Imaging. 2021, 2135924 (2021).
- Lin, Y., Koumba, M. H., Qu, S., Wang, D., Lin, L. Blocking NFATc3 ameliorates azoxymethane/dextran sulfate sodium induced colitis-associated colorectal cancer in mice via the inhibition of inflammatory responses and epithelial-mesenchymal transition. Cell Signal. 74, 109707 (2020).
- Yu, C. T., et al. Identification of significant modules and targets of Xian-Lian-Jie-Du decoction based on the analysis of transcriptomics, proteomics and single-cell transcriptomics in colorectal tumor. J Inflamm Res. 15, 1483-1499 (2022).
- Lin, L., Wang, D., Qu, S., Zhao, H., Lin, Y. miR-370-3p alleviates ulcerative colitis-related colorectal cancer in mice through inhibiting the inflammatory response and epithelial-mesenchymal transition. Drug Des Devel Ther. 14, 1127-1141 (2020).
- Qiu, X., Ma, J., Wang, K., Zhang, H. Chemopreventive effects of 5-aminosalicylic acid on inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer and dysplasia: a systematic review with meta-analysis. Oncotarget. 8 (1), 1031-1045 (2017).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. J Ethnopharmacol. 249, 112426 (2020).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Gok, A., et al. Role of reduced Bdnf expression in novel Apc mutant allele-induced intestinal and colonic tumorigenesis in mice. In Vivo. 37 (4), 1562-1575 (2023).
- Lin, Y., et al. Pou3f1 mediates the effect of Nfatc3 on ulcerative colitis-associated colorectal cancer by regulating inflammation. Cell Mol Biol Lett. 27 (1), 75 (2022).
- Xu, W., Zhao, R., Yuan, B. The therapeutic effect of traditional LiuJunZi decoction on ovalbumin-induced asthma in Balb/C mice. Can Respir J. 2021, 6406295 (2021).
- Kaihara, T., et al. Redifferentiation and ZO-1 reexpression in liver-metastasized colorectal cancer: possible association with epidermal growth factor receptor-induced tyrosine phosphorylation of ZO-1. Cancer Sci. 94 (2), 166-172 (2003).
- Lei, H. T., et al. Ki67 testing in the clinical management of patients with non-metastatic colorectal cancer: Detecting the optimal cut-off value based on the restricted cubic spline model. Oncol Lett. 24 (6), 420 (2022).
- Olén, O., et al. Colorectal cancer in ulcerative colitis: a Scandinavian population-based cohort study. Lancet. 395 (10218), 123-131 (2020).
- Arnold, M., et al. Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality. Gut. 66 (4), 683-691 (2017).
- Biller, L. H., Schrag, D. Diagnosis and treatment of metastatic colorectal cancer: A review. Jama. 325 (7), 669-685 (2021).
- Talero, E., et al. Expression patterns of sirtuin 1-AMPK-autophagy pathway in chronic colitis and inflammation-associated colon neoplasia in IL-10-deficient mice. Int Immunopharmacol. 35, 248-256 (2016).
- Qian, Z., et al. Mulberry fruit prevents LPS-induced NF-κB/pERK/MAPK signals in macrophages and suppresses acute colitis and colorectal tumorigenesis in mice. Sci Rep. 5, 17348 (2015).
- Pothuraju, R., et al. Depletion of transmembrane mucin 4 (Muc4) alters intestinal homeostasis in a genetically engineered mouse model of colorectal cancer. Aging. 14 (5), 2025-2046 (2022).
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Zeng, B., et al. Dextran sodium sulfate potentiates NLRP3 inflammasome activation by modulating the KCa3.1 potassium channel in a mouse model of colitis. Cell Mol Immunol. 19 (8), 925-943 (2022).
- Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S.
- Tanaka, T., et al. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Song, J. L., et al. Dietary mixed cereal grains ameliorate the azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colonic carcinogenesis in C57BL/6J mice. J Med Food. 23 (4), 440-452 (2020).
- Zou, Y. F., et al. Effects of Huaier extract on ameliorating colitis-associated colorectal tumorigenesis in mice. Onco Targets Ther. 13, 8691-8704 (2020).
- Luo, X., et al. Obacunone reduces inflammatory signalling and tumour occurrence in mice with chronic inflammation-induced colorectal cancer. Pharm Biol. 58 (1), 886-897 (2020).
- Dai, Y., et al. Liujunzi Decoction ameliorated cisplatin-induced anorexia by inhibiting theJAK-STAT signaling pathway and coordinating anorexigenic and orexigenic neuropeptides in rats. J Ethnopharmacol. 285, 114840 (2022).
- Ghosh, D., Dutta, A., Kashyap, A., Upmanyu, N., Datta, S. PLP2 drives collective cell migration via ZO-1-mediated cytoskeletal remodeling at the leading edge in human colorectal cancer cells. J Cell Sci. 134 (18), jcs253468 (2021).
- Yan, S., et al. Berberine regulates short-chain fatty acid metabolism and alleviates the colitis-associated colorectal tumorigenesis through remodeling intestinal flora. Phytomedicine. 102, 154217 (2022).
- Ma, Y. L., et al. Immunohistochemical analysis revealed CD34 and Ki67 protein expression as significant prognostic factors in colorectal cancer. Med Oncol. 27 (2), 304-309 (2010).
