Summary
Vi præsenterer en automatiseret high-throughput metode til kvantificering af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) ved hjælp af levende celleanalysesystem kombineret med en membranpermeabilitetsafhængig dual-dye tilgang.
Abstract
Neutrofiler er myeloide afstamningsceller, der udgør en afgørende del af det medfødte immunsystem. Det sidste årti har afsløret yderligere nøgleroller, som neutrofiler spiller i patogenesen af kræft, autoimmune sygdomme og forskellige akutte og kroniske inflammatoriske tilstande ved at bidrage til initiering og opretholdelse af immundysregulering gennem flere mekanismer, herunder dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er), som er strukturer, der er afgørende for antimikrobielt forsvar. Begrænsninger i teknikker til at kvantificere NET-dannelse på en upartisk, reproducerbar og effektiv måde har begrænset vores evne til yderligere at forstå neutrofilers rolle i sundhed og sygdomme. Vi beskriver en automatiseret, realtids, high-throughput metode til kvantificering af neutrofiler, der gennemgår NET-dannelse ved hjælp af en levende cellebilleddannelsesplatform kombineret med en membranpermeabilitetsafhængig dual-dye-tilgang ved hjælp af to forskellige DNA-farvestoffer til afbildning af intracellulært og ekstracellulært DNA. Denne metode er i stand til at hjælpe med at vurdere neutrofil fysiologi og testmolekyler, der kan målrette NET-dannelse.
Introduction
Neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er) er weblignende kromatinstrukturer ekstruderet fra neutrofiler som reaktion på forskellige inflammatoriske stimuli. NETs består af DNA, histoner og forskellige antimikrobielle proteiner / peptider, som fanger og dræber infektiøse patogener og påkalder inflammatoriske reaktioner1.
Mens NETs er gavnlige for værtsforsvar mod patogener, har de samlet opmærksomhed som en potentiel drivkraft for forskellige autoimmune sygdomme2, trombose3, metaboliske sygdomme4 og metastatisk vækst af kræft5. Som sådan er hæmning af NET-dannelse en potentiel terapeutisk mulighed for disse sygdomme. På trods af nogle lovende NETs-målretningsmolekyler under udvikling6 er der stadig ingen godkendt terapi, der specifikt påvirker denne mekanisme. Dette skyldes, i det mindste delvist, manglen på objektive, upartiske, reproducerbare og kvantificeringsmetoder med høj kapacitet til NET-dannelse.
Vi etablerede og rapporterede en ny metode ved hjælp af en tofarvet live-cellebilleddannelsesplatform 7,8. Time-lapse-billeder af neutrofiler farvet med membrangennemtrængeligt nukleært farvestof og membranuigennemtrængeligt DNA-farvestof analyseres af softwaren, og antallet af præ- og post-NET-dannende neutrofiler tælles på flere tidspunkter. Da plasmamembranens integritet går tabt under NET-dannelse ved regulering af PKCα-medieret Lamin B og CDK4/6-medieret Lamin A/C-demontering9, farves NET-dannende neutrofiler af membranuigennemtrængeligt DNA-farvestof, mens sunde neutrofiler ikke er. Denne metode overvinder problemerne med tidligere rapporterede teknikker til kvantificering af NET-dannelse og giver upartisk, høj kapacitet, reproducerbar og nøjagtig NET-kvantificering på en automatiseret måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Neutrofiler fra raske forsøgspersoner blev opnået efter informeret samtykke blev givet under National Institutes of Health (NIH) Institutional Review Board (IRB) godkendt protokol. Protokollen følger retningslinjerne fra NIH Human Research Ethics Committee.
1. Farvning af neutrofiler og fremstilling af analyseplade
- Tag perifert blod med passende skriftligt informeret samtykke efter retningslinjen for hvert institut og isoler neutrofiler ved hjælp af en hvilken som helst ønsket metode. For eksempel er Ficoll-dextran-metoden10,11 en almindeligt anvendt metode til isolering af neutrofiler fra humant perifert blod.
BEMÆRK: Selvom metoden diskuteret her bruger humane neutrofiler, kan museneutrofiler også analyseres ved hjælp af en lignende protokol. - Resuspender neutrofiler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI; se materialetabel) 1640 medium ved 2,0 x 106 neutrofiler/ml og anbring neutrofil suspension i 1,5 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Vi tilføjer normalt ikke føtalt bovint serum (FBS) til kulturmediet, fordi albumin i FBS kan reducere NET-dannelse12 , og varmestabil nuklease i FBS kan nedbryde NETs13. - Tilsæt membrangennemtrængeligt rødt DNA-farvestof (se materialetabel) ved 1 μL pr. 1,5 ml neutrofil suspension.
- Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter i mørke. Der centrifugeres ved 2500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og supernatanten fjernes.
- Neutrofiler resuspenderes i 1 ml RPMI, centrifugeres derefter ved 2500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og supernatanten fjernes. Gentag 2x (vask i alt 3x).
- Resuspender neutrofiler i 1 ml RPMI og tæl ved hjælp af en celletæller. Fortynd neutrofil suspension til 1,5 x 105 neutrofiler/ml.
- Tilsæt 4 μL 1:100-forfortyndet membranuigennemtrængeligt grønt DNA-farvestof (se materialetabel) pr. 1 ml neutrofil suspension.
- Der anbringes 100 μL neutrofil suspension pr. brønd i en 96-brøndsplade, der er behandlet med klar vævskultur (se materialetabel). Indstil hver betingelse i tre eksemplarer.
BEMÆRK: Vi har tidligere vist7 , at der ikke er nogen forskel i NET-dannelse og kvantificering med denne metode, hvis neutrofiler placeres i plader med eller uden poly-L-lysinbelægning. Derfor er brugen af vævskulturbehandlet plade tilstrækkelig til denne metode. - Der tilsættes 100 μL RPMI indeholdende stimulusreagenser med eller uden inhibitor eller ethvert andet reagens af interesse i de respektive huller. Brug altid positive kontrolbrønde ved at tilføje 500 nM phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) eller 2,5 μM calciumionofor (A23187), 30 μM AKT-hæmmer blev brugt her.
- Placer pladen i det levende celleanalysesystem (se materialetabel), der er anbragt i en 5% CO2 -inkubator.
BEMÆRK: Der kan forekomme kondens på toppen og bunden af pladen et par minutter efter dette trin. Dette kan hæmme korrekt billeddannelse. Tør og fjern kondens grundigt, inden scanningen påbegyndes. Placer pladen i maskinen, start softwaren, indtast scanningsprotokollen, og tør derefter pladen af lige før den første scanning.
2. Scanningsplade til visualisering af NET-dannende neutrofiler
- Start softwaren (se Materialeoversigt for softwareoplysninger). Start Tilføj fartøj ved at trykke på + i øverste venstre hjørne.
- Vælg Scan efter planen. Vælg Ny.
BEMÆRK: Når dette er oprettet, skal du køre den samme scanningsprotokol ved at vælge Kopier forrige og vælge gemt protokol på det næste skærmbillede. - Vælg Standard. Indstil scanningsindstillinger som: Celle-for-celle-indstillinger: Ingen; Billedkanaler: Fase, grøn (anskaffelsestid: 200 ms), rød (anskaffelsestid: 400 ms); Målsætning: 20x.
- Vælg den plade, der bruges, på listen. Vælg beholderplacering, hvor pladen skal placeres på bakken i live-cellebilleddannelsessystemet.
- Vælg huller, hvor prøver er til stede, og beslut, hvor mange billeder der skal tages pr. Brønd. Baseret på antallet af billeder pr. brønd skal du generere en estimeret scanningsvarighed for pladen. Normalt er 4 billeder pr. Brønd tilstrækkelig; Dette kan dog variere afhængigt af forholdene og hyppigheden af scanninger.
- Indtast oplysningerne fra hvert hul (f.eks. celletype og forbindelse) ved at klikke på Opret pladekort for at angive et navn til undersøgelsen.
BEMÆRK: Pladekortet kan udarbejdes og gemmes på forhånd ved hjælp af pladekorteditoren i softwaren. De gemte pladekortdata kan importeres i dette trin. Hvis det ønskes, kan indtastning af pladekortoplysninger springes over og udføres senere. Data kan også fås uden at indtaste oplysninger om pladelayout. Det anbefales dog at indtaste pladeoplysninger for at gøre den efterfølgende analyse lettere. - På det næste skærmbillede skal du vælge Basic Analyzer som analysetype og vælge Analysis Protocol fra rullelisten, som viser tidligere anvendte analysedefinitioner (ikke scanningsprotokoller). Spektral unmixing for både grøn og rød kan efterlades på 0,0 %.
BEMÆRK: Dette trin kan springes over, hvis det ønskes. - Planlæg scanning. For eksperimentet her, scan hver 15-20 min i 8 timer . Indstil starttidspunktet for scanningen ved at trække den hvide og grå bjælke øverst på skærmen.
BEMÆRK: Undgå at scanne for ofte, ellers fungerer maskinen muligvis ikke godt på grund af overophedning. Scanningstiden må ikke overstige 12 timer pr. 24 timer. Der vises muligvis en advarsel, hvis scanningen er for hyppig. - Kontroller scanningsindstillingen på det næste skærmbillede, og tryk på Føj til tidsplan for at starte scanningen. Vent, indtil det første sæt billeder er scannet for at bekræfte, om alt fungerer godt.
- Nogle gange er celler muligvis ikke korrekt fokuseret. I så fald skal du kontrollere, om der er kondens (og tørre i overensstemmelse hermed), pladen er korrekt indstillet på bakken, eller pladens position er korrekt angivet osv. Hvis cellerne stadig flyder og ikke har lagt sig ned til bunden af brønden, skal du vente i ca. 5 minutter, før du scanner.
3. Fastsættelse af analysedefinitionen til kvantificering af NETs
- Åbn undersøgelsen (fartøjet), der skal analyseres på fanen Vis. Tryk på Start analyse til venstre på skærmen. Vælg Opret ny analysedefinition.
- Hvis der tidligere er udført en analyse, skal du bruge den samme analysedefinition med mindre ændringer ved at vælge Kopiér eksisterende analysedefinition. I dette tilfælde skal du gå til trin 3.3. Hvis du bruger analysen uden ændringer, skal du vælge Brug eksisterende analysedefinition. Dette anbefales ikke, fordi niveauet af fluorescens kan variere mellem assays på forskellige dage, og nogle mindre korrektioner er normalt nødvendige.
- Vælg Grundlæggende analysator. Brug alle billedkanaler: Fase, Grøn, Rød og Overlap.
BEMÆRK: Selvom vi normalt bruger grønne og røde objektmasker til at tælle NET'er, er overlappende objektmaske nyttig, når snavs betyder noget. I sådanne tilfælde vil antallet af overlappende objekter blive brugt som tællere i stedet for grønt objektantal (se trin 3.9). Hvis der bruges overlappende objektantal i stedet for grønt objektantal, skal alle røde signaler tælles korrekt. Juster indstillingen af rødt signal for at tælle alle røde objekter med lavt rødt signal på billeder taget i senere tidspunkter, men ikke for at tælle snavs. - Vælg 6 - 8 repræsentative prøvebilleder til træning. For eksperimentet her skal du inkludere følgende billeder:
Billeder taget mellem 0 og 20 minutter for at optimere indstillingen for grønt signal for at kompensere for subtile grønne signaler, der kan genereres i ikke-NET-dannende neutrofiler
Billeder af maksimale NET'er med positiv kontrol, taget mellem 3-6 timer (tiden varierer afhængigt af den anvendte stimulering) for at optimere den grønne signalindstilling til at definere NET-dannende neutrofiler
Billeder taget omkring 1 times tidspunkt for at tælle antallet af samlede celler (farvet med rødt farvestof), da det nukleare røde signal er det stærkeste omkring 1 times tidspunkt (når alle cellerne har slået sig ned til bunden af brønden) og gradvist falder på grund af celledød.
Billeder, der indeholder affald, for at udelukke dem fra at blive talt. - Angiv analysedefinitionen. Røde objekter og grønne genstande svarer til kerner af henholdsvis alle neutrofiler og dem, der danner NET'er. Start med følgende eksempel på og tryk på Vis aktuel eller Vis alle, og modulere hver parameter for at optimere resultaterne:
For grøn: segmentering- Baggrundssubtraktion: Top-Hat; Radius: 100 μM; Tærskel: 0,3 GCU; Kantopdeling: Til; Kantfølsomhed: -20; Oprydning -Hulfyldning: 100 μm2; Juster størrelse 0 pixels; Filtre- Areal: min 20 μm2, max 500 μm2; Excentricitet: max 0,97; Gennemsnitlig intensitet: min 1,00
For rød: segmentering- Baggrundssubtraktion: Top-Hat; Radius: 10 μM; Tærskel: 1,0 GCU; Kantopdeling: TIL; Kantfølsomhed: -50; Oprydning-Hulfyldning: 50 μm2; Juster størrelse 0 pixels; Filtre- Areal: min 20 μm2, max 400 μm2; Gennemsnitlig intensitet: min. 1,5.- Hvis der forekommer for meget grønt signal i neutrofiler, som ikke bør danne NET'er (f.eks. ustimulerede neutrofiler efter 0 minutter, der har lobulerede kerner), kan det skyldes overløb af det røde signal, der registreres i den grønne kanal. I så fald skal du vende tilbage til trin 3.1, åbne Billedlag til venstre på skærmen og fjerne de røde signaler fra den grønne kanal ved hjælp af Spectral Unmixing.
- En anden mulighed er at indstille en brønd til enkeltfarvning med nukleært rødt farvestof for at afklare, hvor meget af det røde signal der skal fjernes fra den grønne kanal. På den anden side påvirker normalt grønt signal, der bløder ind i den røde kanal, ikke analyserne.
BEMÆRK: Det betyder ikke noget, om følsomheden over for rødt signal er lav, og ikke alle røde signaler fanges i de billeder, der tages på senere tidspunkter (f.eks. 6 timers tid). Det maksimale antal røde objekter i hvert billede betragtes som det samlede antal neutrofiler i billedet og vil blive brugt som nævner i trin 3.9. Normalt topper nukleare røde signaler omkring 1 times tidspunkt og mindskes gradvist på grund af celledød (figur 1B). Juster derfor indstillingen af rødt signal for korrekt at tælle røde objekter i billederne med maksimale røde signaler.
- Vælg scanningstider og brønde, der skal analyseres. Normalt skal alle tidspunkter og brønde analyseres. Angiv en etiket til analysedefinitionen.
- Tjek resuméet, og start analysen. Det tager et par timer for afslutningen af analysen (varigheden afhænger af antallet af tidspunkter og brønde). Når den er startet, vises navnet på analysedefinitionen under navnet på undersøgelsen under fanen Vis, og den komplette dato vises, når den er færdig.
- Når den er afsluttet, skal du åbne den analyserede undersøgelse ved at dobbeltklikke på navnet på analysedefinitionen. Åbn Lag til venstre på skærmen, og kontroller, om hver celle er korrekt markeret. Hvis det ikke er markeret korrekt, skal du vende tilbage til trin 3.1 og gentage de efterfølgende trin.
- Klik på Grafmetrics til venstre på skærmen for at eksportere dataene. Vælg Grønt antal, Rødt antal eller Antal overlapninger (pr. billede), og vælg derefter de tidspunkter og brønde, der skal eksporteres. For at vælge gruppering skal du vælge Pladetilknytningsreplikerer , hvis alle brønde er korrekt angivet, når scanningen er udført.
- Eksportér dataene. Beregn procentdelen af NET-dannende celler for hver tilstand/tid ved hjælp af følgende ligning ved hjælp af et passende software.
BEMÆRK: Årsagen til, at nævneren er maksimalt antal røde objekter, er, at antallet af røde objekter topper omkring 1 times tidspunkt og gradvist falder på grund af celledød.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode giver fasekontrast, røde fluorescerende (membrangennemtrængeligt farvestof) og grønne fluorescerende (membranuigennemtrængeligt farvestof) billeder taget på hvert tidspunkt. Sammen med den NET-dannende proces observeres morfologiske ændringer i fasekontrast og røde fluorescerende billeder, og når membranen er brudt, kan grøn fluorescens observeres (figur 1). I dette assay er NET-dannende neutrofiler generelt runde i stedet for at danne weblignende struktur. Dette skyldes, at maskinens opløsning ikke er høj nok til at fange fin weblignende struktur, og membran uigennemtrængelig grøn farvestof pletter kromatin, før det frigives, når membranen er brudt. Vi har tidligere vist7 , at NETs kan visualiseres ved brug af konfokal billeddannelse i 96-brøndpladerne hentet efter 4 timers inkubation.
Når analysedefinitionen er korrekt indstillet, markeres alle neutrofiler i billedet som rødt objekt, og NET-dannende neutrofiler markeres som grønt objekt (figur 2). Maskinen tæller antallet af røde og grønne objekter på hvert tidspunkt. Tidsforløbet for NET-dannelse visualiseres ved at plotte procentdelen af NET-dannende neutrofiler på hvert tidspunkt (figur 3). Potentielle molekyler, der målretter NET-dannelse (f.eks. AKT-hæmmer) kan testes på en høj gennemstrømningsmåde ved hjælp af denne metode.
Figur 1: Morfologiske ændringer i neutrofiler, der gennemgår NET-dannelse. (A) Humane perifere blodneutrofiler, der blev stimuleret med 2,5 μM calciumionofor i 3 timer. (B) Repræsentative enkeltcellevisninger af fasekontrastbillede, rød kanal (membrangennemtrængeligt kernefarvestof), grøn kanal (membranuigennemtrængeligt DNA-farvestof) og fusioneret billede. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative billeder, der viser softwaregenkendelse af neutrofiler og NET'er. Neutrofiler fra humane raske frivillige blev stimuleret med 2,5 μM calciumionofor i 1 time. Overlejrede billeder af fasekontrastbilleddannelse og hvert signal eller maske vises. Kerner blev farvet med (A) membrangennemtrængeligt rødt farvestof, og softwaren genkendte og tællede (B) kerner markeret blåt, mens NET'erne blev farvet med (C) membranuigennemtrængeligt grønt farvestof, og softwaren markerede dem som (D) lilla. Hvis (E) oversensing eller (F) under sensing forekommer, skal parameteren muligvis ændres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Tidsforløb for procentdelen af NET-dannende neutrofiler. Neutrofiler blev stimuleret af 25 nM phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) eller 2,5 μM calciumionofor for at inducere NETs eller efterlades ustimuleret i RPMI. Tilsætning af 30 μM AKT-hæmmer blev udført for at blokere NET-dannelse. Billeder blev opnået af softwaren hvert 20. minut i 6 timer. Procentdelen af NET-dannende celler blev beregnet ved at dividere det grønne objektantal (= antallet af NET-dannende celler) med det røde objektantal (= antallet af alle neutrofiler). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nuværende metoder til kvantificering af NETs ex vivo har flere ulemper, der begrænser vores evne til at studere neutrofiler, NET'er og potentielle terapeutiske mål på en upartisk og high-throughput måde10,14. For eksempel er direkte tælling af NET-dannende celler efter immunofluorescerende farvning, der betragtes som guldstandarden for kvantificering af NET'er, lav gennemstrømning og afhængig af operatørens subjektive opfattelse. Et pladeassay, der detekterer fluorescensen af membranuigennemtrængeligt DNA-farvestof, kvantificerer ekstracellulært DNA som surrogatmarkør for NET'er på en objektiv og høj gennemstrømningsmåde, men da morfologiske oplysninger ikke kan opnås ved denne metode, kan DNA-frigivelse ved andre typer celledød fejlagtigt betragtes som NET'er. På den anden side giver metoden høj kapacitet og objektiv kvantificering af NETs7. I betragtning af at information om morfologiske ændringer af neutrofiler og dets tidsforløb kan opnås, diskrimineres NET'er nøjagtigt fra andre typer celledød. Nylige papirer har foreslået patogen rolle af NETs i forskellige sygdomme 2,3,4,5, og hæmning af NETs betragtes i øjeblikket som et potentielt lovende behandlingsmål6. Metoden vil være gavnlig til at udforske flere NET-målretningsmolekyler på en hurtig og upartisk måde.
Der er flere nøglepunkter for vellykket kvantificering. Valg af membrangennemtrængeligt DNA-bindende farvestof er en meget vigtig faktor for korrekt billeddannelse. Nogle farvestoffer er cytotoksiske, og andre farvestoffer tager tid at trænge ind i kerner. Da NET-dannelsen er relativt hurtig, skal farvestoffet hurtigt trænge ind i kernerne. Vi valgte et nukleart rødt farvestof (se materialetabellen) under hensyntagen til disse faktorer. Antallet af celler i hver brønd er også vigtigt for nøjagtig tælling. Hvis det er for overfyldt, vil grønne og røde signaler fra hver neutrofil overlappe hinanden, hvilket gør det vanskeligt at tælle hver neutrofil separat.
Der er et par begrænsninger for denne metode. Mens intra-assay-variabilitet er fremragende i dette assay, er inter-assay-variabilitet uklar. Dette skyldes, at neutrofiler, selv når de isoleres fra den samme donor med alle betingelser holdt konsistente, virker forskelligt på forskellige dage, og der kan være en vis variation mellem assays udført på en anden dag. Derfor, hvis data fra forskellige dage skal kombineres, er det nødvendigt at omhyggeligt designe assayet: for eksempel at inkludere det samme antal prøver fra sygdoms- og kontrolgrupper hver dag. Hertil kommer, at selv om evalueringen af NET-dannelse er objektiv, når analysedefinitionen er defineret (trin 3), afhænger fastsættelsen af selve definitionen noget af den enkelte operatørs subjektive opfattelse. Trin 3.3 og 3.4 er de kritiske trin til at udelukke subjektive vurderinger og holde variationen mellem assayerne så lille som muligt. Desuden skal en positiv kontrol (f.eks. neutrofiler stimuleret af 500 nM PMA eller 2,5 μM calciumionofor) inkluderes hver gang for at indstille den passende cut-off til at tælle alle NETs.
På den anden side skal det bemærkes, at andre typer celledød kan tælles som NET'er. Når cellemembranen brydes, eller DNA frigives til ekstracellulært rum, observeres grønne signaler. Når celler gennemgår nekrotisk celledød eller apoptotiske celler gennemgår sekundær nekrose, vil deres DNA blive farvet af grønt farvestof7. For at forhindre unøjagtig inkludering af disse typer celledød skal tidsforløb og morfologiske ændringer overvejes. Mens det normalt tager mere end 8 timer for apoptotiske celler at udføre sekundær nekrose, topper NET-dannelsen mellem 3-6 timer efter stimulering15. Forskellige morfologiske ændringer kan ses ved fasekontrastbilleddannelse, hvilket er gavnligt for differentiering af type celledød7.
Samlet set giver metoden os mulighed for nøjagtigt at kvantificere NETs på en høj gennemstrømning og objektiv måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Light Imaging Section i Office of Science and Technology ved National Institute of Arthritis og Muskuloskeletale og hudsygdomme i National Institutes of Health. Denne forskning blev støttet af det intramurale forskningsprogram fra National Institute of Arthritis og muskuloskeletale og hudsygdomme i National Institutes of Health (ZIA AR041199).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J.
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
