Summary
Vi presenterar en automatiserad metod med hög genomströmning för att kvantifiera neutrofila extracellulära fällor (NET) med hjälp av det levande cellanalyssystemet, i kombination med en membranpermeabilitetsberoende dual-dye-metod.
Abstract
Neutrofiler är myeloida celler som utgör en viktig del av det medfödda immunförsvaret. Det senaste decenniet har avslöjat ytterligare nyckelroller som neutrofiler spelar i patogenesen av cancer, autoimmuna sjukdomar och olika akuta och kroniska inflammatoriska tillstånd genom att bidra till initiering och vidmakthållande av immundysreglering genom flera mekanismer, inklusive bildandet av neutrofila extracellulära fällor (NET), som är strukturer som är avgörande för antimikrobiellt försvar. Begränsningar i tekniker för att kvantifiera NET-bildning på ett opartiskt, reproducerbart och effektivt sätt har begränsat vår förmåga att ytterligare förstå neutrofilers roll i hälsa och sjukdomar. Vi beskriver en automatiserad, realtidsmetod med hög genomströmning för att kvantifiera neutrofiler som genomgår NET-bildning med hjälp av en levande cellavbildningsplattform i kombination med en membranpermeabilitetsberoende dubbelfärgningsmetod som använder två olika DNA-färgämnen för att avbilda intracellulärt och extracellulärt DNA. Denna metodik kan hjälpa till att bedöma neutrofilfysiologi och testa molekyler som kan rikta in sig på NET-bildning.
Introduction
Neutrofila extracellulära fällor (NET) är nätliknande kromatinstrukturer som extruderas från neutrofiler som svar på olika inflammatoriska stimuli. NET består av DNA, histoner och olika antimikrobiella proteiner/peptider, som fångar och dödar infektiösa patogener och framkallar inflammatoriska svar1.
Även om NET är fördelaktiga för värdförsvar mot patogener, har de fått uppmärksamhet som en potentiell drivkraft för olika autoimmuna sjukdomar2, trombos3, metabola sjukdomar4 och metastaserad tillväxt av cancer5. Hämning av NET-bildning är därför ett potentiellt behandlingsalternativ för dessa sjukdomar. Men trots några lovande NETs-riktade molekyler under utveckling6 finns det fortfarande ingen godkänd terapi som specifikt påverkar denna mekanism. Detta är, åtminstone delvis, hänförligt till bristen på objektiva, opartiska, reproducerbara och storskaliga kvantifieringsmetoder med hög genomströmning för NET-bildning.
Vi etablerade och rapporterade en ny metod som använder en tvåfärgsplattform för avbildning av levande celler 7,8. Time-lapse-bilder av neutrofiler färgade med membranpermeabelt kärnfärgämne och membranogenomträngligt DNA-färgämne analyseras av programvaran, och antalet pre- och post-NET-bildande neutrofiler räknas vid flera tidpunkter. Eftersom plasmamembranets integritet går förlorad under NET-bildning genom reglering av PKCα-medierad Lamin B- och CDK4/6-medierad Lamin A/C-demontering9, färgas NET-bildande neutrofiler av membranogenomträngligt DNA-färgämne medan friska neutrofiler inte färgas. Denna metod övervinner problemen med tidigare rapporterade tekniker för att kvantifiera NET-bildning och ger opartisk, hög genomströmning, reproducerbar och exakt NET-kvantifiering på ett automatiserat sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Neutrofiler från friska försökspersoner erhölls efter att informerat samtycke lämnats enligt National Institutes of Health (NIH) Institutional Review Board (IRB) godkänt protokoll. Protokollet följer riktlinjer från NIH:s etikkommitté för humanforskning.
1. Färgning av neutrofiler och beredning av analysplatta
- Ta perifert blod med lämpligt skriftligt informerat samtycke enligt riktlinjerna för varje institut och isolera neutrofiler med valfri metod. Till exempel är Ficoll-dextran-metoden 10,11 en vanligt förekommande metod för isolering av neutrofiler från humant perifert blod.
OBS: Även om den metod som diskuteras här använder humana neutrofiler, kan även neutrofiler från möss analyseras med hjälp av ett liknande protokoll. - Återsuspendera neutrofiler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI; se materialförteckning) 1640 medium vid 2,0 x 106 neutrofiler/ml och placera neutrofilsuspensionen i 1,5 ml centrifugrör.
OBS: Vi brukar inte tillsätta fetalt bovint serum (FBS) till odlingsmediet eftersom albumin i FBS kan minska NET-bildning12 och värmestabilt nukleas i FBS kan bryta ned NET13. - Tillsätt membranpermeabelt rött DNA-färgämne (se materialförteckning) med 1 μl per 1,5 ml neutrofilsuspension.
- Inkubera i rumstemperatur i 5 min i mörker. Centrifugera vid 2500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och ta bort supernatanten.
- Återsuspendera neutrofiler i 1 ml RPMI, centrifugera sedan vid 2500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och avlägsna supernatant. Upprepa 2x (tvätt totalt 3x).
- Återsuspendera neutrofiler i 1 ml RPMI och räkna med hjälp av en cellräknare. Späd neutrofilsuspensionen till 1,5 x 105 neutrofiler/ml.
- Tillsätt 4 μl 1:100-utspätt membranogenomträngligt grönt DNA-färgämne (se materialtabell) per 1 ml neutrofilsuspension.
- Placera 100 μl neutrofilsuspension per brunn i en klar vävnadskulturbehandlad 96-hålsplatta (se materialtabell). Ange varje villkor i tre exemplar.
OBS: Vi har tidigare visat7 att det inte finns någon skillnad i NET-bildning och kvantifiering med denna metod om neutrofiler placeras i plattor med eller utan poly-L-lysinbeläggning. Därför räcker det med att använda vävnadskulturbehandlad platta för denna metod. - Tillsätt 100 μl RPMI-innehållande stimulusreagenser med eller utan inhibitor, eller något annat reagens av intresse i respektive brunn. Använd alltid positiva kontrollbrunnar genom att tillsätta 500 nM forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) eller 2.5 μM kalciumjonofor (A23187), 30 μM AKT-hämmare användes här.
- Placera plattan i det levande cellanalyssystemet (se materialtabell) som är inrymt i en 5 % CO2 -inkubator.
OBS: Kondens kan uppstå på toppen och botten av plattan några minuter efter detta steg. Detta kan hämma korrekt avbildning. Torka och ta bort kondens noggrant innan skanningen påbörjas. Placera plattan i maskinen, starta programvaran, mata in skanningsprotokollet och torka sedan av plattan strax före den första skanningen.
2. Skanningsplatta för att visualisera NET-bildande neutrofiler
- Starta programvaran (se Materialtabell för mer information om programvaran). Starta Lägg till fartyg genom att trycka på + i det övre vänstra hörnet.
- Välj Skanna enligt schema. Välj Nytt.
OBS: När detta har skapats, kör samma skanningsprotokoll genom att välja Kopiera föregående och välja lagrat protokoll på nästa skärm. - Välj Standard. Ställ in skanningsinställningar som: Cell-för-cell-alternativ: Inga; Bildkanaler: Fas, Grön (Exponeringstid: 200 ms), Röd (Exponeringstid: 400 ms); Mål: 20x.
- Välj den platta som används från listan. Välj kärlplats där plattan ska placeras på brickan i det levande cellavbildningssystemet.
- Välj brunnar där prover finns och bestäm hur många bilder som ska tas per brunn. Baserat på antalet bilder per brunn genererar du en uppskattad genomsökningstid för plattan. Vanligtvis räcker det med 4 bilder per brunn. Detta kan dock variera beroende på förhållandena och frekvensen av skanningar.
- Mata in informationen från varje brunn (t.ex. celltyp och förening) genom att klicka på Skapa plattkarta för att ange ett namn för studien.
OBS: Plåtkartan kan förberedas och sparas i förväg med hjälp av plattkartredigeraren i programvaran. De sparade plåtkartdata kan importeras under detta steg. Om så önskas kan inmatning av information om plattkartan hoppas över och utföras senare. Data kan också erhållas utan att ange information om plattans layout. Det rekommenderas dock att mata in plattinformation för att underlätta den efterföljande analysen. - På nästa skärm väljer du Basic Analyzer som analystyp och väljer Analysis Protocol i listrutan, som visar tidigare använda analysdefinitioner (inte genomsökningsprotokoll). Spektral avblandning för både grönt och rött kan lämnas på 0,0 %.
OBS: Detta steg kan hoppas över om så önskas. - Schemalägg genomsökning. För experimentet här, skanna var 15-20:e minut i 8 timmar. Ställ in starttiden för skanningen genom att dra det vita och grå fältet ovanpå skärmen.
OBS: Undvik att skanna för ofta, annars kanske maskinen inte fungerar bra på grund av överhettning. Skanningstiden bör inte överstiga 12 timmar per 24 timmar. Du kan se en varning om skanningen är för frekvent. - Kontrollera skanningsinställningen på nästa skärm och tryck på Lägg till i schema för att starta skanningen. Vänta tills den första uppsättningen bilder har skannats för att bekräfta om allt fungerar bra.
- Ibland kan det hända att cellerna inte är rätt fokuserade. Kontrollera i så fall om det finns kondens (och torka därefter), att plattan är korrekt inställd på brickan eller att plattans position är korrekt specificerad, etc. Om cellerna fortfarande flyter och inte har lagt sig till botten av brunnen, vänta i cirka 5 minuter innan du skannar.
3. Ställa in analysdefinitionen för att kvantifiera NET
- Öppna studien (kärlet) som ska analyseras på fliken Visa. Tryck på Starta analys till vänster på skärmen. Välj Skapa ny analysdefinition.
- Om en analys har utförts tidigare använder du samma analysdefinition med mindre ändringar genom att välja Kopiera befintlig analysdefinition. Gå i så fall till steg 3.3. Om du använder analysen utan att ändra väljer du Använd befintlig analysdefinition. Detta rekommenderas inte eftersom fluorescensnivån kan variera mellan analyser på olika dagar, och vissa mindre korrigeringar är vanligtvis nödvändiga.
- Välj Grundläggande analys. Använd alla bildkanaler: Fas, Grön, Röd och Överlappning.
OBS: Även om vi vanligtvis använder gröna och röda objektmasker för att räkna NET, är överlappande objektmask användbar när skräp är viktigt. I sådana fall används antalet överlappande objekt som täljare i stället för grönt antal objekt (se steg 3.9). Om överlappande objektantal används i stället för grönt objektantal måste alla röda signaler räknas korrekt. Justera inställningen för röd signal för att räkna alla röda föremål med låg röd signal i bilder tagna vid senare tidpunkter, men inte för att räkna skräp. - Välj 6–8 representativa exempelbilder för träning. Inkludera följande bilder för experimentet här:
Bilder tagna mellan 0 och 20 minuter för att optimera den gröna signalinställningen för att kompensera för subtila gröna signaler som kan genereras i icke-NET-bildande neutrofiler
Bilder av maximalt NET med positiv kontroll, tagna mellan 3-6 timmar (tiden varierar beroende på vilken stimulering som används) för att optimera den gröna signalinställningen för att definiera NET-bildande neutrofiler
Bilder tagna runt 1 timmes tidpunkt för att räkna det totala antalet celler (färgade med rött färgämne) eftersom den kärnröda signalen är starkast runt 1 timmes tidpunkt (när alla celler har lagt sig på botten av brunnen) och gradvis minskar på grund av celldöd.
Bilder som innehåller skräp för att utesluta dem från att räknas. - Ange analysdefinitionen. Röda objekt och gröna objekt korresponderar med kärnor av alla neutrofiler respektive de som bildar NET. Börja med följande exempel på och tryck på Förhandsgranska aktuell eller Förhandsgranska alla och modulera varje parameter för att optimera resultaten:
För grönt: Segmentering - Bakgrundssubtraktion: Top-Hat; Radie: 100 μM; Tröskelvärde: 0,3 GCU; Kantdelning: På; Kantkänslighet: -20; Rengöring -Hålfyllning: 100 μm2; Justera storlek 0 pixlar; Filter- Area: min 20 μm2, max 500 μm2; Excentricitet: max 0,97; Medelintensitet: minst 1,00
För Röd: Segmentering - Bakgrundssubtraktion: Top-Hat; Radie: 10 μM; Tröskelvärde: 1,0 GCU; Kantdelning: PÅ; Kantkänslighet: -50; Fyllning av rensningshål: 50 μm2; Justera storlek 0 pixlar; Filter- Area: min 20 μm2, max 400 μm2; Medelintensitet: minst 1,5.- Om överdriven grön signal visas hos neutrofiler som inte ska bilda NET (t.ex. ostimulerade neutrofiler vid 0 minuter som har lobulerade kärnor), kan det bero på översvämning av den röda signalen som detekterats i den gröna kanalen. Gå i så fall tillbaka till steg 3.1, öppna Bildlager till vänster på skärmen och ta bort de röda signalerna från den gröna kanalen med hjälp av Spectral Unmixing.
- Ett annat alternativ är att ställa in en brunn för enkelfärgning med kärnrött färgämne för att klargöra hur mycket av den röda signalen som ska tas bort från den gröna kanalen. Å andra sidan påverkar vanligtvis inte den gröna signalen som blöder in i den röda kanalen analyserna.
OBS: Det spelar ingen roll om känsligheten för röd signal är låg och inte alla röda signaler fångas i bilderna som tas vid senare tidpunkter (t.ex. 6 timmars tidpunkt). Det maximala antalet röda objekt i varje bild betraktas som det totala antalet neutrofiler i bilden och kommer att användas som nämnare i steg 3.9. Vanligtvis når de röda signalerna en topp runt 1 timmes tidpunkt och minskar gradvis på grund av celldöd (figur 1B). Justera därför inställningen av röd signal för att korrekt räkna röda objekt i bilderna med maximalt antal röda signaler.
- Välj skanningstider och brunnar som ska analyseras. Vanligtvis bör alla tidpunkter och brunnar analyseras. Ange en etikett för analysdefinitionen.
- Kontrollera sammanfattningen och starta analysen. Det tar några timmar att slutföra analysen (varaktigheten beror på antalet tidpunkter och brunnar). När den har startats visas namnet på analysdefinitionen under namnet på studien på fliken Visa och det fullständiga datumet visas när den är klar.
- När den är klar öppnar du den analyserade studien genom att dubbelklicka på analysdefinitionens namn. Öppna Lager till vänster på skärmen och kontrollera om varje cell är korrekt markerad. Om den inte är korrekt markerad, gå tillbaka till steg 3.1 och upprepa de efterföljande stegen.
- Klicka på Diagrammått till vänster på skärmen för att exportera data. Välj Grönt antal, Rött antal eller Överlappningsantal (per bild) och välj sedan de tidpunkter och källor som ska exporteras. För välj gruppering väljer du Plate Map Replicates om alla brunnar är korrekt angivna när skanningen är klar.
- Exportera data. Beräkna procentandelen NET-bildande celler för varje villkor/tidpunkt med hjälp av följande ekvation med hjälp av en lämplig programvara.
OBS: Anledningen till att nämnaren är maximalt antal röda objekt är att antalet röda objekt toppar vid cirka 1 timmes tidpunkt och gradvis minskar på grund av celldöden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod ger faskontrast, röda fluorescerande (membranpermeabelt färgämne) och gröna fluorescerande (membranogenomträngligt färgämne) bilder tagna vid varje tidpunkt. Tillsammans med NET-bildningsprocessen observeras morfologiska förändringar i faskontrast och röda fluorescerande bilder, och när membranet bryts kan grön fluorescens observeras (figur 1). I denna analys är NET-bildande neutrofiler i allmänhet runda, istället för att bilda nätliknande struktur. Detta beror på att maskinens upplösning inte är tillräckligt hög för att fånga upp fin nätliknande struktur och membranogenomträngliga gröna färgämnesfläckar kromatin innan det frigörs när membranet bryts. Vi har tidigare visat7 att NET kan visualiseras med hjälp av konfokal avbildning i de 96-hålsplattor som hämtas efter 4 timmars inkubation.
När analysdefinitionen är korrekt inställd markeras alla neutrofiler i bilden som röda objekt och NET-bildande neutrofiler markeras som gröna objekt (Figur 2). Maskinen räknar antalet röda och gröna objekt vid varje tidpunkt. Tidsförloppet för NET-bildning visualiseras genom att plotta procentandelen NET-bildande neutrofiler vid varje tidpunkt (figur 3). Potentiella molekyler som riktar sig mot NET-bildning (t.ex. AKT-hämmare) kan testas på ett sätt med hög genomströmning med hjälp av denna metod.
Figur 1: Morfologiska förändringar hos neutrofiler som genomgår NET-bildning. (A) Humana neutrofiler i perifert blod som stimulerades med 2,5 μM kalciumjonofor i 3 timmar. (B) Representativa encellsvyer av faskontrastbild, röd kanal (membranpermeabelt kärnfärgämne), grön kanal (membranogenomträngligt DNA-färgämne) och sammanslagen bild. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa bilder som visar programvaruigenkänning av neutrofiler och NET. Neutrofiler från friska frivilliga stimulerades med 2,5 μM kalciumjonofor i 1 timme. Överlagrade bilder av faskontrastavbildning och varje signal eller mask visas. Kärnorna färgades med (A) membranpermeabelt rött färgämne, och programvaran kände igen och räknade (B) kärnor markerade med blått medan näten färgades med (C) membranogenomträngligt grönt färgämne och programvaran markerade dem som (D) lila. Om (E) överavkänning eller (F) underavkänning inträffar kan parametern behöva ändras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Tidsförlopp för procentandelen NET-bildande neutrofiler. Neutrofiler stimulerades av 25 nM forbol, 12-myristat-13-acetat (PMA) eller 2,5 μM kalciumjonofor för att inducera NET eller lämnades ostimulerade i RPMI. Tillsats av 30 μM AKT-hämmare gjordes för att blockera NET-bildning. Bilder erhölls av programvaran var 20:e minut i 6 timmar. Den procentuella andelen NET-bildande celler beräknades genom att dividera det gröna antalet objekt (= antalet NET-bildande celler) med det röda antalet objekt (= antalet neutrofiler). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nuvarande metoder för att kvantifiera NET ex vivo har flera nackdelar som begränsar vår förmåga att studera neutrofiler, NET och potentiella terapeutiska mål på ett opartiskt och storskaligt sätt10,14. Till exempel är direkt räkning av NET-bildande celler efter immunofluorescensfärgning, som anses vara guldstandarden för kvantifiering av NET, låg genomströmning och beroende av operatörens subjektiva syn. En plattanalys som detekterar fluorescensen hos membranogenomträngligt DNA-färgämne kvantifierar extracellulärt DNA som en surrogatmarkör för NET på ett objektivt sätt med hög genomströmning, men eftersom morfologisk information inte kan erhållas med denna metod kan DNA-frisättning genom andra typer av celldöd felaktigt betraktas som NET. Å andra sidan ger metoden hög genomströmning och objektiv kvantifiering av NET7. Med tanke på att information om morfologiska förändringar hos neutrofiler och dess tidsförlopp kan erhållas, är NET korrekt differentierad från andra typer av celldöd. Nyligen publicerade artiklar har föreslagit patogen roll för NET i olika sjukdomar 2,3,4,5, och hämning av NET betraktas för närvarande som ett potentiellt lovande behandlingsmål6. Metoden kommer att vara fördelaktig för att utforska flera NET-målsökande molekyler på ett snabbt och opartiskt sätt.
Det finns flera viktiga punkter för framgångsrik kvantifiering. Val av membranpermeabelt DNA-bindande färgämne är en mycket viktig faktor för korrekt avbildning. Vissa färgämnen är cytotoxiska, och andra färgämnen tar tid att tränga in i kärnor. Eftersom NET-bildningen är relativt snabb måste färgämnet snabbt tränga in i kärnorna. Vi valde ett kärnrött färgämne (se materialtabell) med hänsyn till dessa faktorer. Antalet celler i varje brunn är också viktigt för korrekt räkning. Om det är för trångt kommer gröna och röda signaler för varje neutrofil att överlappa varandra, vilket gör det svårt att räkna varje neutrofil separat.
Det finns några begränsningar för den här metoden. Även om intraanalysvariabilitet är utmärkt i denna analys, är variabiliteten mellan analyserna oklar. Detta beror på att neutrofiler, även när de isoleras från samma donator med alla tillstånd konstanta, beter sig olika på olika dagar och det kan finnas en viss variation mellan analyser som utförs på en annan dag. Därför, om data från olika dagar behöver kombineras, är det nödvändigt att noggrant utforma analysen: till exempel att inkludera samma antal prover från sjukdoms- och kontrollgrupper varje dag. Dessutom, även om utvärderingen av NET-bildningen är objektiv när analysdefinitionen väl har definierats (steg 3), beror fastställandet av själva definitionen i viss mån på varje operatörs subjektiva uppfattning. Steg 3.3 och 3.4 är de kritiska stegen för att utesluta subjektiva bedömningar och hålla variationen mellan analyser så liten som möjligt. En positiv kontroll (t.ex. neutrofiler stimulerade med 500 nM PMA eller 2,5 μM kalciumjonofor) måste också inkluderas varje gång för att ställa in lämplig cut-off för att räkna alla NET.
Å andra sidan måste det noteras att andra typer av celldöd kan räknas som NET. När cellmembranet bryts, eller DNA släpps ut i extracellulärt utrymme, kommer gröna signaler att observeras. När celler genomgår nekrotisk celldöd eller apoptotiska celler genomgår sekundär nekros kommer deras DNA att färgas av grönt färgämne7. För att förhindra att dessa typer av celldöd inkluderas på ett felaktigt sätt måste hänsyn tas till tidsförlopp och morfologiska förändringar. Medan det vanligtvis tar mer än 8 timmar för apoptotiska celler att utföra sekundär nekros, toppar NET-bildningen mellan 3-6 timmar efter stimulering15. Distinkta morfologiska förändringar kan ses genom faskontrastavbildning, vilket är fördelaktigt för differentiering av typ av celldöd7.
Sammantaget gör metoden det möjligt för oss att noggrant kvantifiera NET på ett objektivt sätt med hög genomströmning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Light Imaging Section i Office of Science and Technology vid National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health. Denna forskning stöddes av det intramurala forskningsprogrammet vid National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases vid National Institutes of Health (ZIA AR041199).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J.
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
