Summary
Et beskyttelsesassay blev udviklet til at overvåge retinal vaskulaturens modstandsdygtighed over for døden fra diabetes / diabetisk retinopati-relaterede fornærmelser såsom oxidativ stress og cytokiner.
Abstract
Diabetisk retinopati (DR) er en kompleks og progressiv okulær sygdom karakteriseret ved to forskellige faser i dets patogenese. Den første fase involverer tab af beskyttelse mod diabetes-induceret skade på nethinden, mens den anden fase centrerer sig om akkumulering af denne skade. Traditionelle analyser fokuserer primært på evaluering af kapillær degeneration, hvilket er tegn på skadens sværhedsgrad, i det væsentlige rettet mod anden fase af DR. De giver dog kun indirekte indsigt i, om de beskyttende mekanismer i retinal vaskulatur er blevet kompromitteret. For at løse denne begrænsning blev der udviklet en ny tilgang til direkte vurdering af nethindens beskyttelsesmekanismer - specifikt dens modstandsdygtighed over for diabetesinducerede fornærmelser som oxidativ stress og cytokiner. Denne beskyttelsesanalyse, selvom den oprindeligt var designet til diabetisk retinopati, har potentialet til bredere anvendelser i både fysiologiske og patologiske sammenhænge. Sammenfattende indebærer forståelse af patogenesen af diabetisk retinopati at anerkende de to faser af beskyttelsestab og skadeakkumulering, hvor dette innovative beskyttelsesassay tilbyder et værdifuldt værktøj til forskning og potentielt strækker sig til andre medicinske tilstande.
Introduction
Diabetisk retinopati (DR) er en af de mikrovaskulære komplikationer af diabetes mellitus (DM) og den førende årsag til blindhed hos personer i den erhvervsaktive alder i udviklede lande1. Store risikofaktorer for diabetisk retinopati er varigheden og graden af hyperglykæmi 2,3,4. Mens DM forårsager dysfunktion af både de vaskulære og neurale komponenter i nethinden5, er diagnosen DR baseret på morfologiske træk ved retinal vaskulatur6.
Hyperglykæmi-induceret oxidativt stress er en af drivkræfterne bag DR-patogenese7. Øget oxidativ stress forårsager udbredt skade, hvilket kompromitterer mitokondriernes funktionalitet og derved yderligere øger niveauet af reaktive iltarter. Disse hændelser ledsages af lækage af retinale kar, en stigning i niveauet af inflammatoriske cytokiner og død af både neurale og vaskulære celletyper i nethinden. Tab af vaskulære celler og dermed funktionaliteten af det omfattende kapillærnetværk i nethinden resulterer i hypoxi, en potent stimulus for en række reaktioner5. Sådanne reaktioner omfatter øget ekspression af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), der driver både permeabilitet og angiogenese, kardinale træk ved de avancerede, synstruende stadier af DR - diabetisk makulaødem og proliferativ diabetisk retinopati6.
Visse træk ved DR tyder på, at en organisme (både patienter og forsøgsdyr) har en iboende evne til at modstå denne indikation. Patienter oplever flere årtier med DM, før de udvikler synstruende DR 8,9,10,11,12,13. Mens gnavermodeller af DM ikke udvikler de avancerede, synstruende stadier af DR14, gør den indledende/milde form af DR, der manifesterer sig, det først efter en periode på uger eller måneder påDM 15,16. Desuden er DR progressiv hos både patienter og forsøgsdyr, og retinal dysfunktion / skade øges, når varigheden af DM forlænges. Endelig udvikler nogle patienter med DM aldrig DR. I visse tilfælde skyldes det, at sådanne personer ikke oplever diabetes længe nok til, at DR kan udvikle sig. I andre tilfælde skyldes det, at de udviser ekstraordinær modstand mod DR; som det er tilfældet med deltagere i medaljeundersøgelsen, der ikke udvikler DR efter 50 år eller mere medDM 17. På trods af en sådan overbevisende støtte til eksistensen af beskyttelse mod DR og dens enorme translationelle relevans er mekanismen bag beskyttelse ikke blevet aggressivt undersøgt.
Beskyttelsesanalysen beskrevet heri blev udviklet for at lette undersøgelsen af, hvorfor DR er forsinket fra begyndelsen af DM i diabetiske mus. De vigtigste trin i denne analyse, der anvendes på DM- og ikke-DM-mus, inkluderer (1) levering af en submaksimal dødsfremkaldende fornærmelse mod øjet (ex vivo eller in vivo), (2) isolering af retinal vaskulatur, (3) farvning af vaskulaturen med TUNEL og DAPI, (4) fotografering af de resulterende billeder og kvantificering af procentdelen af TUNEL / DAPI dobbeltpositive arter.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Office of Animal Care and Institutional Biosafety ved University of Illinois i Chicago. Syv uger gamle C57/BL6/J-hanmus blev anbragt i gruppebure i et patogenfrit miljø i en 12 timers lys/mørk cyklus og gav gratis adgang til mad og vand. Mus blev aflivet ved CO2 kvælning, og øjnene blev enukleeret og behandlet straks18. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel). De væsentlige værktøjer, der er nødvendige for undersøgelsen, er vist i figur 1.
1. Levering af den dødsfremkaldende fornærmelse
- Udfør oxidativ stress med TBH (ex vivo).
- Aflive musene efter institutionelt godkendte protokoller og enukleere deres øjne18 (figur 2A).
- Sæt øjenkuglerne direkte i individuelle brønde i en 24-brøndplade indeholdende DMEM + 1% BSA, med eller uden 5 mM tert-butylhydroperoxid (TBH) (se materialetabel); Der inkuberes i 1 time ved 37 °C. En positiv kontrolprøve behandles med DNase (50 E/100 μL) i 10 minutter for at fragmentere DNA.
BEMÆRK: Dosis af TBH (det middel, der inducerer oxidativt stress) blev valgt til at inducere et let detekterbart og submaksimalt niveau af celledød inden for de isolerede retinale kar18. - Fastgør øjnene i 10% bufret formalin natten over (mindst 16 timer).
- Brug cytokincocktail til at fremkalde betændelse (in vivo).
- Bedøv musene med en intraperitoneal injektion af 100 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin.
- Brug en tilpasset 33 G nål (se materialetabel) til at injicere 1 μL / øje af cytokincocktailen i glaslegemet; injektionsstedet er 2-3 mm fra limbussen (figur 2B).
BEMÆRK: Cytokincocktailen indeholder 1: 1: 1-forhold på 1 μg / ml TNF-α, 1 μg / ml IL-1β og 1500 U / μL IFN-γ18 (se materialetabel). - 24 timer efter injektionen aflives musene (efter institutionelt godkendte protokoller), enukleerer deres øjne og fikserer med 10% bufret formalin natten over.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause efter fiksering i maksimalt 1 uge og derefter genstartes senere.
2. Nethindeisolering
- Skær øjeæblet op.
- Brug lige tang til at gribe synsnerven forsigtigt (figur 2C). Hold en mikrokniv med den anden hånd for at lave et snit på 2-3 mm bageste til limbus.
- Skift fra mikrokniven til mikrosaksen for at skære parallelt med limbussen, mens du roterer øjeæblet sammen med synsnerven, indtil øjeæblet er skåret i to halvdele.
- Kassér den forreste halvdel af øjet, inklusive linsen (figur 2C).
- Fjern sclera.
- Brug lige tang til forsigtigt at løfte sclera 1-3 mm ud af nethinden.
- Brug mikrosaks til at lave to radiale snit i sclera-delen af vejen til synsnerven. Undgå at skære den underliggende nethinde.
- Brug et par buede tang til at gribe fat i scleralklappen og rive den af nethinden. RPE-laget kommer af med scleraen.
- Vask nethinden.
- Brug en mikrospatel til at overføre den isolerede nethinden til en brønd i en 24-brøndskål, der er fyldt med dobbeltdestilleret vand.
- Ryst forsigtigt fadet ved midt-moderat hastighed ved stuetemperatur. Skift vandet hvert 30. minut til 1 time, mindst 4-5 gange, og lad det derefter stå natten over.
3. Retinal vaskulatur isolering
- Fordøjelse: Udskift det dobbeltdestillerede vand med 800 μL YL trypsinopløsning (3% trypsin i 0,1 M Tris buffer (pH 7,8)). Der inkuberes ved 37 °C med let eller ingen omrystning i 4 timer og15 minutter 19 (figur 2D).
BEMÆRK: Undgå hurtig omrystning, da dette kan beskadige vaskulaturen. - Overførsel: Dyp den brede ende af en glasoverførselspipet med YL trypsinopløsning for at overføre nethinden til en 35 mm petriskål indeholdende fnugfrit, dobbeltdestilleret vand.
- Fjern det ydre nukleare lag (fotoreceptorer) (figur 2E).
- Vend retina-halvkuglen nedadvendt. Brug den lige enkelthårsbørste til forsigtigt at trykke nethinden mod bunden af skålen.
- Brug sløjfebørsten til forsigtigt at børste nethindens fotoreceptorer væk. Penselstrøgene påføres i en retning fra synsnerven mod periferien af nethinden. Fotoreceptorerne kan løsne sig i store lagner, fordi de ikke er forankret til resten af nethinden af blodkar.
- Brug af en 200 μL pipette til at opsamle og kassere arkene af neuralt væv.
- Fjern glaslegemet.
- Vend retina-halvkuglen, så den vender opad. Brug et par buede tang (A) til at gribe glaslegemet så meget som muligt under et dissekermikroskop.
BEMÆRK: Glaslegemet ligner et ark gennemsigtigt væv, der er fastgjort til synsnerven eller nethinden. - Brug en anden buet tang (B) til at gribe fat i enden af glaslegemet, hvor den forbinder synsnerven. Fjern glaslegemet ved at trække pincet A væk fra pincet B.
- Kassér glaslegemet. Undersøg resten af glaslegemet, og gentag dette trin for at fjerne alt glaslegemet, da resterne vil hindre de næste trin.
- Vend retina-halvkuglen, så den vender opad. Brug et par buede tang (A) til at gribe glaslegemet så meget som muligt under et dissekermikroskop.
- Fjern det resterende neurale og gliavæv (figur 2F).
- Vend retina-halvkuglen, så den vender nedad igen. Brug igen den lige børste til forsigtigt at trykke nethinden mod bunden af skålen (brug ikke spidsen af håret).
- Brug sløjfebørsten til forsigtigt at børste over vaskulaturen fra synsnervehovedet mod periferien for at fjerne det resterende neurale væv20.
- Drej nethinden langsomt med den lige børste og brug sløjfebørsten til at fjerne alle de små bidder af neuralt væv på retinal vaskulatur, indtil det vaskulære netværk er godt rengjort (figur 2G, H).
4. Montering af den isolerede retinale vaskulatur på et mikroskopglas
- Placer et mikroskopglas.
- Anbring en ren monteringskassette (se materialetabel) under et dissekeringsmikroskop. Fyld kassetten med dobbeltdestilleret vand.
- Brug en sort baggrund under dissekeringsmikroskopet for at hjælpe med at generere kontrast for at se den oplyste gennemsigtige vaskulatur.
- Brug tang til at placere et rent, mærket mikroskopglas i bunden af monteringskassetten.
- Overfør retinal vaskulatur.
- Dyp den brede ende af en glasoverførselspipet med YL trypsinopløsning.
- Overfør den rensede retinale vaskulatur og løsn forsigtigt vaskulaturen i det dobbeltdestillerede vand inde i monteringskassetten og over mikroskopglasset.
- Monter retinal vaskulaturen.
BEMÆRK: Mens vaskulaturen flyder over mikroskopobjektglasset, får den isolerede vaskulatur sin normale skålform.- Brug sløjfebørsten til at vende retina-halvkuglen opad og skub forsigtigt vaskulaturen ned på glasglasset, og brug derefter håret til at klæbe den åbne vaskulatur ned på midten af diaset. Vaskulaturen skal holde sig til diaset, når det rører ved.
- Monter vaskulaturen fladt ved at børste det skålformede nethindekar fra synsnerven til periferien.
- Gentag børstningen i alle retninger, indtil vaskulaturen klæber helt til diaset.
- Lufttør retinal vaskulatur.
- Når hele retinal vaskulatur er fastgjort til diaset, skal du tage glideren ud af vandet enten ved forsigtigt at løfte den ene kant eller ved langsomt at dræne vand i hjørnet af kassetten for at minimere strømme og derefter trække det ud (figur 2I).
BEMÆRK: Vaskulaturen bliver let synlig, når den en gang er lufttørret (figur 2J). - Marker omkredsen af retinal vaskulatur på bagsiden af diaset med en markørpen.
- Fortsæt med at plette prøven uden pause.
- Når hele retinal vaskulatur er fastgjort til diaset, skal du tage glideren ud af vandet enten ved forsigtigt at løfte den ene kant eller ved langsomt at dræne vand i hjørnet af kassetten for at minimere strømme og derefter trække det ud (figur 2I).
5. Dødsdetektion med TUNEL-farvning
BEMÆRK: For detaljer om denne procedure henvises til Zheng et al.21. Repræsentative billeder af iskæmi +/- oksestressinducerede apoptotiske legemer i isolerede retinale kar er afbildet i figur 3.
- Rehydrer den isolerede vaskulatur med PBS. Skyl det 3 gange i PBS og inkuber derefter med 1% Triton X-100 i PBS i 2 minutter på is for at permeabilisere den isolerede vaskulatur.
- Skyl objektglassene to gange med PBS for at fjerne den resterende Triton X-100. Området omkring prøven tørres.
- Der tilsættes 50 μL TUNEL reaktionsblanding (se materialetabel) på prøven. Inkuber objektglasset i befugtet atmosfære i 60 minutter ved 37 °C i mørke.
- Skyl objektglasset 3 gange med PBS for at fjerne TUNEL-reaktionsblandingen. Området omkring prøven tørres.
- Tilsæt en dråbe DAPI-monteringsmedier for at plette kernerne med DAPI, og monter prøven med et dækglas. Opbevares mørkt ved 4 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause i op til 1 uge, før der tages billeder. - Fotografer den resulterende vaskulatur med et konfokal fluorescensmikroskop (se materialetabel). Optag seks til otte tilfældigt udvalgte felter i den fjerne periferi omkring synsnerven (figur 4).
BEMÆRK: Repræsentative billeder af cytokininducerede apoptotiske legemer i isolerede retinale kar er illustreret i figur 5. - Analyser resultaterne.
- For ex vivo, TBH-behandlede prøver, udfør følgende trin.
- Tæl antallet af apoptotiske legemer (TUNEL/DAPI dobbeltpositive arter) i hvert felt ved hjælp af billede J (se materialetabel). Gennemsnittet af de apoptotiske legemer i alle felterne i en enkelt prøve tælles.
- Beregn foldændringen i antallet af apoptotiske legemer mellem et tilfældigt udvalgt par ikke-DM- og DM-prøver.
- Find ud af, om der er en statistisk signifikant forskel ved hjælp af den tohalede elev-t-test18.
BEMÆRK: Plet kontrol- og eksperimentelle prøver (ikke-DM og DM) ved samme lejlighed, fordi omfanget af TUNEL-farvning kan variere, selv når det gøres på samme måde. Da op til 10 nethinden kan rengøres og monteres om dagen af en erfaren bruger, skal du planlægge at behandle et lige antal kontrol- og eksperimentelle nethinder, før du starter denne protokol.
- For in vivo, cytokiner cocktailbehandlede prøver, udfør følgende trin.
- Tæl manuelt antallet af apoptotiske legemer (TUNEL/DAPI dobbeltpositive arter) i hele retinal vaskulatur.
- Beregn foldændringen i antallet af apoptotiske legemer mellem et tilfældigt udvalgt par ikke-DM- og DM-prøver.
- Find ud af, om der er en statistisk signifikant forskel ved hjælp af den tosidede elev-t-test.
- For ex vivo, TBH-behandlede prøver, udfør følgende trin.
Representative Results
Den vellykkede isolering af retinal vaskulatur resulterer i en flad montering af hele netværket af musens retinale vaskulatur med den arkitektoniske integritet intakt (figur 2J). Ved farvning med periodisk syre-schiff hæmatoxylin (PASH) er det muligt at skelne mellem de to vaskulære celletyper: endotelceller (EC'er) og pericytter (PC'er) (figur 6). Endotelcellekernerne er aflange, let farvede og befinder sig helt inden for karvæggene. Pericytkerner er cirkulære, tæt farvede og stikker ud fra kapillærvæggene. De PASH-farvede prøver afslører også acellulære kapillærer, som mangler kerner.
Tilgangen til at fremkalde døden blev styret af følgende begrundelse. Det blev spekuleret i, at beskyttelsen var begrænset, dvs. kunne blive overvældet af en meget stærk dødsfremkaldende fornærmelse. Derfor blev fornærmelser (både iskæmi / oxidativ stress og cytokiner18) optimeret, så de ville fremkalde en let påviselig stigning, men alligevel submaksimalt omfang af død (figur 3 og figur 5).
Det er vigtigt at fremhæve, at tilstedeværelsen af TUNEL-positive kerner var betinget af den specifikke type fornærmelse, der blev anvendt til at udløse celledød. Den iskæmi / oxidative stress fornærmelse førte til et sporvognsspor mønster af celleapoptose, som illustreret i figur 3, mens cytokinfornærmelsen resulterede i et særskilt og veldefineret mønster, som afbildet i figur 5. Begge mønstre kan observeres i retinale kar fra DR-patienter22, hvilket tyder på, at begge typer midler inducerer celledød hos mennesker. Desuden giver de observerede morfologiske sondringer et middel til at evaluere, om patologi blev drevet af oxidativ stress eller cytokiner.
Figur 1: Værktøjer til isolering af musens retinale vaskulatur. Fra venstre mod højre: monteringskassetten, to enkelthårsbørster, en omvendt overførselspipette, mikrospatel, to buede pincet, fjedersaks, mikrokniv og tang med lige spidser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk, der viser de vigtigste trin i at levere en dødsfremkaldende fornærmelse og derefter isolere retinal vaskulatur fra et museøje. (A) Induktion af iskæmi/oxidativ skade, ex vivo. Efter enukleation udsættes øjet for iskæmi i nærvær af TBH. B) In vivo administration (intravitreal injektion) af cytokiner. (C) Skæring af øjeæblet i to halvdele. (D) Retinal enzymisk fordøjelse: fjernelse af sclera og vask af nethinden i dobbeltdestilleret vand natten over. Inkubation i YL-trypsinopløsning ved 37 °C i 4 timer og 15 minutter i et hul i en plade med 24 huller. (E) Fjernelse af fotoreceptorer. (F) Fjernelse af det resterende neurale og gliavæv. (G) Renset skålformet vaskulært netværk vendt opad. (H) Isoleret vaskulært netværk i en 35 mm skål med sort baggrund på scenen af et dissekerende mikroskop. (I) Fladmonteret retinal vaskulatur på et dias. J) Lufttørret retinal vaskulatur på et objektglas. Dette tal er ændret fra Li et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Påvisning af apoptotiske legemer i museretinale kar behandlet ex vivo med iskæmi +/- TBH. Repræsentative billeder af iskæmi +/- ox stress-induceret apoptotiske kroppe i isolerede retinale kar. Overskriften på hver kolonne angiver farvningen. (A-C) Retinale fartøjer isoleret fra øjenkugler, der gennemgik 1 time iskæmi alene. (D-F) Samme som (A-C), bortset fra 1 times fornærmelse var en kombination af iskæmi og oxidativ stress (5 mM TBH). De røde pile peger på repræsentative TUNEL/DAPI dobbeltpositive arter. (G-I) Positiv kontrol behandlet med DNase. Skalabjælke = 50 μm. Dette tal er ændret fra Li et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Illustration af feltudvælgelse til kvantificering af resultater. En 5 x 5 flisescanning af retinal vaskulatur med sammensmeltning af TUNEL og DAPI signal. Valget af seks til otte felter i den fjerne periferi omkring synsnerven er vist med røde firkanter. Forstørrelse, 200x. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Påvisning af apoptotiske legemer i museretinale kar som reaktion på intravitreal injektion af cytokiner (in vivo administration). Repræsentative billeder af cytokin-inducerede apoptotiske legemer i isolerede retinale kar. Overskriften på hver kolonne angiver farvningen. (A-C) Billeder af retinale kar isoleret fra mus intravitvirkelig injiceret med PBS. (D-F) Samme som (A-C), bortset fra at en cytokincocktail blev injiceret sammen med PBS. De røde pile peger på repræsentative TUNEL-positive arter. Skalastænger = 100 μm. Dette tal er ændret fra Li et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Et repræsentativt billede af en PASH-farvet retinale kar. Retinale kar i en mus, der oplevede 20 ugers STZ-induceret DM, blev isoleret som beskrevet i figur 2, farvet med PASH og afbildet, mens de var oplyst med synligt lys. Pericytkerner i kapillærer har tendens til at være mere cirkulære og tæt farvede (blå pile), mens aflange og mindre tæt farvede kerner er diagnostiske af endotelceller (røde pile). Den gule pil peger på en acellulær kapillær. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
I denne undersøgelse blev der etableret et assay for at detektere resistens / sårbarhed af retinal vaskulatur til døden induceret af DM / DR-relaterede fornærmelser såsom iskæmi / oxidativ stress og cytokiner. Dette manuskript giver en detaljeret beskrivelse af dette assay, som er en modifikation af flere offentliggjorte protokoller 19,20,21.
Protokollen omfatter flere afgørende faser. For det første er det bydende nødvendigt at omhyggeligt dissekere nethinden, sikre bevarelsen af det vaskulære netværk og forhindre betydelige tårer. Dette kan opnås ved at lave et snit 2-3 mm bageste til limbus, da nethinden klæber tæt til ora serrata, og det er udfordrende at adskille det. For det andet skal du belægge alle instrumenter, der kommer i kontakt med karrene (f.eks. Enkelthårsbørster, overførsel af pipet og tang) med trypsin ved at dyppe disse værktøjer i YL-trypsinopløsningen under hele proceduren. Dette forhindrer vaskulaturen i at klæbe til de instrumenter, der anvendes i denne protokol. For det tredje, fordi mikrovaskulaturen er næsten usynlig under normalt lys, kræves øget årvågenhed under snavsaspiration og overførsel til mikroskopets dias for at forhindre utilsigtet tab.
En passende grad af enzymatisk fordøjelse af de forskellige lag af nethinden er afgørende; Utilstrækkelig fordøjelse forhindrer adskillelse af neuronalt væv fra det vaskulære netværk, mens overdreven fordøjelse opløser vaskulær plexus. Forskellige fordøjelsestider fra 1 h19 til natten over 23 er blevet rapporteret. Baseret på observationer giver en fordøjelsestid på 4 timer og 15 minutter de mest gunstige resultater sammenlignet med varigheder på 2 timer, 3 timer og 4 timer. Forlængelse af fordøjelsen ud over dette punkt vil sandsynligvis ikke forbedre processen og kan i stedet kompromittere vaskulaturens integritet.
I tilfælde, hvor den fordøjede nethinden klæber til enkelthårsbørsten, dyppes håret i YL trypsinopløsning flere gange. Dette reducerer børstens klæbrige områder. Hvis hårbørsten stadig klæber til det vaskulære væv, skal du inspicere det for resterende fragmenter af glaslegeme og fjerne dem med tang.
Det optimale tidspunkt for fuldstændig fjernelse af glaslegemet er efter eliminering af fotoreceptorerne, men før fjernelse af det resterende neurale og gliavæv. Nethinden opretholder stivhed, indtil fotoreceptorer fjernes. Ekstraktion af glaslegemet på dette stadium kan potentielt rive nethinden / vaskulaturen. De delikate lag af resterende neurale og gliavæv spiller en afgørende rolle i bevarelsen af den buede form af den vaskulære struktur. De forhindrer nethinden i at rive i midten, når glaslegemet løsnes fra synsnerven.
Hvis den isolerede vaskulatur slet ikke klæber til mikroskopglasset, indikerer det, at den del af diaset, hvor vedhæftning forventes at forekomme, er snavset. Prøv at flytte fartøjerne hen over lysbilledets overflade for at finde et klæbrigt sted, skift til et andet lysbillede eller rengør lysbilledet omhyggeligt, og prøv igen. Hvis karrene holder sig til rutsjebanen, før de folder sig ud i deres skållignende form, skal du løfte vaskulaturen fra rutsjebanen for at lade den flyde frit i vandet igen. Gør dette trin med tang, der gentagne gange er dyppet i YL trypsinopløsningen.
Der er rapporteret om flere alternative teknikker til isolering af vaskulaturen, som ikke ville være egnede til den beskyttelsesanalyse, der er beskrevet heri. For eksempel er osmotisk lysis blevet anvendt til at isolere vaskulaturen fra ikke-fikserede nethindeprøver, hvilket letter biokemiske undersøgelser af vævet24,25. Denne procedure bevarer dog muligvis ikke vaskulaturens anatomi såvel som den tilgang, der anvendes i denne artikel. Tilsvarende, mens vævsprintmetoden til isolering af store segmenter af mikrovaskulatur muliggør analyse af vaskulaturens elektrotoniske arkitektur26, genvindes hele vaskulærsengen typisk ikke.
Denne analyse blev udviklet, fordi eksisterende tilgange til overvågning af kapillær degeneration ikke behandler spørgsmålet om beskyttelse. Kapillær degeneration, som opstår efter langvarig DM, indikerer, om DR har udviklet sig. Ud over at diagnosticere DR er dette resultat nyttigt til at vurdere, om et middel / terapi forhindrer DR. Imidlertid taler eksisterende kapillærdegenerationsassays ikke til agensens underliggende virkningsmekanisme. Et sådant middel kan forhindre patologiske hændelser, der driver DR, såsom øget oxidativ stress eller cytokiner. Alternativt kan midlet håndhæve beskyttelsen ved at øge modstandsdygtigheden over for oxidativt stress og cytokiner og/eller fremme reparation af skader. Dette nye beskyttelsesassay kan bruges til at bestemme, om den gavnlige effekt af en given terapi indebærer håndhævelse af det endogene system, der beskytter mod DM-relateret død.
En ulempe ved denne beskyttelsesanalyse er, at den ikke skelner mellem de to celletyper i retinale kar: endotelceller (EC'er) og pericytter (PC'er). Mens udseendet af deres kerner i PASH-farvede sektioner er celletypespecifikt (figur 6), viser ikke alle kerner diagnostiske funktioner. Ca. 30% af kernerne kan ikke entydigt defineres som EC eller PC, i det mindste delvist, fordi de todimensionale billeder opnået fra PASH-farvede prøver ufuldstændigt løser den tredimensionelle struktur af vaskulær plexus. Denne hindring kunne overvindes ved yderligere analyse såsom immunofluorescerende farvning med celletypespecifikke markører. Sådanne billeder, der adskiller de to celletyper, kunne farves sammen med TUNEL for at bestemme modstanden/sårbarheden af hver af de vaskulære celletyper.
Denne vaskulære analyse giver ingen oplysninger om den neurale nethinden. Der kan udvikles yderligere assays for at tilvejebringe sådanne oplysninger. For eksempel, i stedet for at isolere retinal vaskulatur, kunne en enkelt cellesuspension af hele nethinden genereres og derefter analyseres (ved fluorescerende aktiveret cellesortering) for modstand / sårbarhed. Inkluderingen af celletypespecifikke markører (både neurale og vaskulære) sammen med indikatorer for celledød ville give et mere komplet billede af de retinale celletyper, der har kapacitet til beskyttelse mod DM / DR-medieret død.
Afslutningsvis giver beskyttelsesanalysen beskrevet heri en stærk tilgang til at undersøge den mekanisme, der er ansvarlig for forsinkelsen mellem DM's begyndelse og manifestationen af DR hos mus.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at rapportere.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Illinois Society to Prevent Blindness, National Institute of Health (EY031350 and EY001792) og et ubegrænset tilskud fra Research to Prevent Blindness Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
| 24-well plates | Falcon | 353047 | |
| 33 G needle | Hamilton | customized | |
| Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
| C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
| Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
| Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
| Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
| Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
| Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
| Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
| Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
| Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
| Periodic acid | Sigma | 3951 | |
| Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
| Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
| Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
| Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
| Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
| Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
| Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
| Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
| TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
| Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
| Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
| Xylene | Sigma | 65351-M | |
| YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
| Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
- Lee, R., Wong, T. Y., Sabanayagam, C. Epidemiology of diabetic retinopathy, diabetic macular edema and related vision loss. Eye Vis (Lond). 2, 21 (2015).
- Lima, V. C., Cavalieri, G. C., Lima, M. C., Nazario, N. O., Lima, G. C. Risk factors for diabetic retinopathy: A case-control study. Int J Retina Vitreous. 2, 21 (2016).
- Sabanayagam, C., Yip, W., Ting, D. S., Tan, G., Wong, T. Y. Ten emerging trends in the epidemiology of diabetic retinopathy. Ophthalmic Epidemiol. 23 (4), 209-222 (2016).
- Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
- Wong, T., Cheung, C., Larsen, M., Sharma, S., Simó, R.
- Wu, M. Y., Yiang, G. T., Lai, T. T., Li, C. J. The oxidative stress and mitochondrial dysfunction during the pathogenesis of diabetic retinopathy. Oxid Med Cell Longev. 2018, 3420187 (2018).
- Hietala, K., Harjutsalo, V., Forsblom, C., Summanen, P., Groop, P. H. Age at onset and the risk of proliferative retinopathy in type 1 diabetes. Diabetes Care. 33 (6), 1315-1319 (2010).
- Aiello, L. P., et al.
- Klein, R., Klein, B. E., Moss, S. E., Davis, M. D., Demets, D. L. The wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years. Arch Ophthalmol. 102 (4), 520-526 (1984).
- Nathan, D. M., et al. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med. 329 (14), 977-986 (1993).
- Clustering of long-term complications in families with diabetes in the diabetes control and complications trial. The diabetes control and complications trial research group. Diabetes. 46 (11), 1829-1839 (1997).
- Cruickshanks, K. J., Moss, S. E., Klein, R., Klein, B. E. Physical activity and proliferative retinopathy in people diagnosed with diabetes before age 30 yr. Diabetes Care. 15 (10), 1267-1272 (1992).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: From molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5 (4), 444-456 (2012).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. J Neurophysiol. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Sergeys, J., et al. Longitudinal in vivo characterization of the streptozotocin-induced diabetic mouse model: Focus on early inner retinal responses. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (2), 807-822 (2019).
- Sun, J. K., et al. Protection from retinopathy and other complications in patients with type 1 diabetes of extreme duration: The joslin 50-year medalist study. Diabetes Care. 34 (4), 968-974 (2011).
- Li, Y., et al. The slow progression of diabetic retinopathy is associated with transient protection of retinal vessels from death. Int J Mol Sci. 24 (13), 10869 (2023).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. 76, e50489 (2013).
- Veenstra, A., et al. Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).
- Zheng, L., Gong, B., Hatala, D. A., Kern, T. S. Retinal ischemia and reperfusion causes capillary degeneration: Similarities to diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 361-367 (2007).
- Mizutani, M., Kern, T. S., Lorenzi, M. Accelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy. J Clin Invest. 97 (12), 2883-2890 (1996).
- Weerasekera, L. Y., Balmer, L. A., Ram, R., Morahan, G. Characterization of retinal vascular and neural damage in a novel model of diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3721-3730 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53 (9), 2404-2411 (2004).
- Podestà, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am J Pathol. 156 (3), 1025-1032 (2000).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
