Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करके वायरस से संक्रमित मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर्स की लाइव कैल्शियम इमेजिंग

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66132
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research, Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल वायरस से संक्रमित मानव आंतों के ऑर्गेनोइड में कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है और विश्लेषण के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Abstract

कैल्शियम सिग्नलिंग लगभग हर ऊतक का एक अभिन्न नियामक है। आंतों के उपकला के भीतर, कैल्शियम स्रावी गतिविधि, एक्टिन गतिशीलता, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, स्टेम सेल प्रसार और कई अन्य अनियंत्रित सेलुलर कार्यों के नियमन में शामिल है। जैसे, आंतों के उपकला के भीतर कैल्शियम सिग्नलिंग गतिशीलता मानचित्रण होमोस्टेटिक सेलुलर प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है और विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए अद्वितीय प्रतिक्रियाओं का अनावरण कर सकता है। मानव आंतों के ऑर्गेनोइड (एचआईओ) आंतों के उपकला का अध्ययन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट, मानव-व्युत्पन्न मॉडल हैं और इस प्रकार कैल्शियम गतिशीलता की जांच के लिए एक उपयोगी प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह पत्र आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) के साथ एचआईओ को स्थिर रूप से स्थानांतरित करने, लाइव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी करने और कैल्शियम संकेतों को सार्थक रूप से चिह्नित करने के लिए इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, 3-आयामी HIO को लेंटवायरस के साथ GCaMP6s, एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन-आधारित साइटोसोलिक GECI को स्थिर रूप से व्यक्त करने के लिए ट्रांसड्यू किया गया था। इंजीनियर HIO को तब एकल-कोशिका निलंबन में फैलाया गया और मोनोलेयर के रूप में वरीयता दी गई। भेदभाव के बाद, एचआईओ मोनोलेयर्स रोटावायरस से संक्रमित थे और / या कैल्शियम प्रतिक्रिया को उत्तेजित करने के लिए ज्ञात दवाओं के साथ इलाज किया गया था। एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप एक तापमान नियंत्रित, humidified लाइव-इमेजिंग कक्ष के साथ फिट संक्रमित या दवा इलाज monolayers की लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए अनुमति दी. इमेजिंग के बाद, अधिग्रहित छवियों का स्वतंत्र रूप से उपलब्ध विश्लेषण सॉफ्टवेयर, इमेजजे का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। कुल मिलाकर, यह काम एचआईओ में सेलुलर सिग्नलिंग को चिह्नित करने के लिए एक अनुकूलनीय पाइपलाइन स्थापित करता है।

Introduction

कैल्शियम एक व्यापक रूप से संरक्षित दूसरा संदेशवाहक है जो सेलुलर फिजियोलॉजीको विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। शारीरिक स्थितियों में इसके मजबूत चार्ज, छोटे आकार और उच्च घुलनशीलता को देखते हुए, कैल्शियम प्रोटीन रचना का एक आदर्श मैनिपुलेटर है। यह कैल्शियम को एंजाइमेटिक, ट्रांसक्रिप्शनल या पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों में विद्युत रासायनिक संकेतों को स्थानांतरित करने का एक शक्तिशाली साधन बनाता है। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) और प्लाज्मा झिल्ली में सख्त कैल्शियम एकाग्रता ढाल एक उच्च ड्राइविंग बल बनाते हैं जो साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता में तेजी से बदलाव की अनुमति देता है। बफरिंग और सक्रिय परिवहन दोनों सहित कई तंत्र, इस ढाल को कसकर बनाए रखते हैं। जबकि सामान्य सेलुलर कार्यों के लिए आवश्यक है, यह रखरखाव ऊर्जावान रूप से महंगा है, जिससे यह विशेष रूप से तनाव 2 की स्थिति में अतिसंवेदनशील हो जाता है।

जैसे, साइटोसोल के भीतर कैल्शियम का डिसरेग्यूलेशन कई प्रकार के सेलुलर तनाव का एक निकट-सार्वभौमिक संकेत है। चयापचय संबंधी गड़बड़ी, विषाक्त पदार्थ, रोगजनकों, यांत्रिक क्षति, और आनुवंशिक गड़बड़ी सभी कैल्शियम सिग्नलिंग को बाधित कर सकते हैं। उत्तेजना के बावजूद, पूरे सेल स्तर पर, साइटोसोलिक कैल्शियम में निरंतर, अनियंत्रित वृद्धि एपोप्टोसिस और अंततः परिगलन 3,4 को बढ़ावा दे सकती है। कम आयाम या उच्च आवृत्ति के साइटोसोलिक कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन, हालांकि, अलग-अलग प्रभाव हैं2. इसी तरह, कैल्शियम में उतार-चढ़ाव के परिणाम स्थानिक माइक्रोडोमेन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं जिसमें वे होते हैं5. कैल्शियम के स्तर की निगरानी इसलिए गतिशील संकेतन प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन इसके लिए अपेक्षाकृत उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ नमूना लेने की आवश्यकता होती है।

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) लाइव-सेल सिस्टम6 में निरंतर नमूने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले जीईसीआई में से कुछ जीएफपी-आधारित कैल्शियम-उत्तरदायी फ्लोरोसेंट प्रोटीन हैं जिन्हें जीसीएएमपी7 के रूप में जाना जाता है। विहित GCaMP तीन अलग-अलग प्रोटीन डोमेन का एक संलयन है: एक गोलाकार रूप से अनुमति GFP (cpGFP), शांतोडुलिन और M136। शांतोडुलिन डोमेन कैल्शियम को बांधने पर एक रचना परिवर्तन से गुजरता है, जिससे एम 13 के साथ इसकी बातचीत की अनुमति मिलती है। शांतोडुलिन-एम 13 इंटरैक्शन सीपीजीएफपी में एक रचनात्मक परिवर्तन को प्रेरित करता है जो उत्तेजना पर इसके फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को बढ़ाता है। जैसे, कैल्शियम एकाग्रता में वृद्धि GCaMP प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि के साथ संबंधित है। ये सेंसर साइटोसोलिक हो सकते हैं या विशिष्ट जीवों को लक्षित कर सकते हैं8.

अधिकांश ऊतकों के समान, कैल्शियम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल एपिथेलियम के भीतर विभिन्न कार्यों को नियंत्रित करता है। आंतों के उपकला पोषक तत्व और द्रव अवशोषण के लिए अभिन्न अंग है, लेकिन रोगज़नक़ आक्रमण या विषाक्त अपमान से बचने के लिए एक तंग बाधा और प्रतिरक्षा इंटरफ़ेस भी बनाना चाहिए। कैल्शियम पर निर्भर रास्ते इनमहत्वपूर्ण कार्यों के लगभग सभी 9,10,11 को प्रभावित. हालांकि, आंतों के उपकला के भीतर कैल्शियम सिग्नलिंग एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में आशाजनक क्षमता के साथ एक अस्पष्टीकृत सीमा बनी हुई है। जबकि विवो में आंतों के उपकला के भीतर कैल्शियम गतिशीलता की निगरानी चुनौतियों पेश करने के लिए जारी है, मानव आंतों के organoids (HIOs) प्रयोग12 के लिए एक अनुकूलनीय पूर्व विवो प्रणाली की पेशकश. HIO 3 आयामी (3 डी) मानव आंतों स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न spheroids और, भेदभाव पर, देशी आंतों उपकला12 की सेलुलर विविधता के बहुत पुनरावृत्ति कर रहे हैं.

यह प्रोटोकॉल एचआईओ को इंजीनियर करने के लिए व्यापक तरीकों का वर्णन करता है जो जीईसीआई को व्यक्त करते हैं और फिर इंजीनियर एचआईओ को लाइव-सेल कैल्शियम इमेजिंग के लिए मोनोलेयर के रूप में तैयार करते हैं। यह वायरल संक्रमण को एक पैथोलॉजिकल हेरफेर के उदाहरण के रूप में प्रस्तुत करता है जो कैल्शियम सिग्नलिंग को बाधित करता है और इन परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए एक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी मानव आंतों के ऑर्गेनोइड (एचआईओ) और प्रतिनिधि प्रयोगों को टेक्सास मेडिकल सेंटर डाइजेस्टिव डिजीज एंटरॉइड कोर द्वारा प्राप्त और बनाए गए मानव ऊतक से प्राप्त किया गया था। सभी नमूने बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार एकत्र किए गए थे।

1. सामग्री और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. ऑर्गेनॉइड रखरखाव के लिए, सेल-कल्चर को 24-वेल प्लेट्स, बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (बीएमएम), 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों और 1.5 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों का इलाज किया जाता है।
    1. विकास कारकों (सीएमजीएफ-) के बिना पूर्ण मीडिया तैयार करने के लिए, उन्नत डीएमईएम एफ 12 के 500 एमएल में 1 एम एचईपीईएस के 5 एमएल, 100x एंटीबायोटिक-एंटीमायोटिक के 5 एमएल, 100x ग्लूटामाइन पूरक के 5 एमएल जोड़ें।
    2. Wnt-, R-spondin-, और Noggin युक्त (WRNE) मीडिया तैयार करने के लिए, बराबर भागों CMGF- और Wnt-वातानुकूलित मीडिया को मिलाएं, Noggin वातानुकूलित माध्यम, मात्रा द्वारा 10%, R-spondin वातानुकूलित माध्यम, मात्रा से 20%, 50 ng/mL मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक, 10 मिमी निकोटिनामाइड, 10 एनएम [Leu15]-Gastrin I, 500 एनएम A-83-01, 10 माइक्रोन SB202190, 1x B27 पूरक, 1x N2 पूरक, और 1 मिमी N-acetylcysteine।
  2. लेंटिवायरल पारगमन के लिए, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए, सीएमजीएफ- 10% एफबीएस, बाँझ 1x पीबीएस, पॉलीब्रीन, 10 माइक्रोन वाई -27632, लेंटवायरस, उच्च वेंट डब्ल्यूआरएनई + 10 माइक्रोन वाई -27632 के साथ तैयार करें
  3. ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर्स उत्पन्न करने के लिए, ग्लास बॉटम 10-वेल सेल कल्चर स्लाइड, एफबीएस, कोलेजन IV (डी-आयनित (डीआई) एच2ओ में 1 मिलीग्राम/एमएल), बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स, 1x पीबीएस में 0.5 एमएम ईडीटीए, 1x पीबीएस में 5 एमएम ईडीटीए, एंजाइमैटिक पृथक्करण बफर, सीएमजीएफ- 10% एफबीएस, डब्ल्यूआरएनई + 10 माइक्रोन वाई -27632 के साथ तैयार करें।
  4. ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर्स के वायरल संक्रमण के लिए, ट्रिप्सिन, रोटावायरस स्टॉक, सीएमजीएफ-, 25 जी सुई, बाँझ 1x पीबीएस, और फिनोल रेड-फ्री भेदभाव मीडिया तैयार करें।
    1. फिनोल लाल मुक्त भेदभाव मीडिया तैयार करने के लिए, फिनोल लाल मुक्त सेल संस्कृति मीडिया के 500 एमएल ले, 100x एमईएम गैर आवश्यक अमीनो एसिड के 5 एमएल, 100x एल ग्लूटामाइन के 5 एमएल, 100 एनएम सोडियम पाइरूवेट के 5 एमएल, और 1 एम एचईपीईएस के 7.5 एमएल जोड़ें।
  5. ऑर्गेनोइड के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए, 4% फॉर्मलाडेहाइड (1x पीबीएस में पतला 16% फॉर्मलाडेहाइड), ट्राइटन एक्स -100 (1x पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स-100), बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (1x पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन), एनएच4सीएल समाधान (50 मिमी), डीएपीआई (1x पीबीएस में 1 माइक्रोग्राम/एमएल डीएपी समाधान) तैयार करें।

2. आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर को व्यक्त करने के लिए इंजीनियरिंग ऑर्गेनोइड

नोट: यह प्रोटोकॉल 24-अच्छी तरह से प्लेट13 पर बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (बीएमएम) के 30 माइक्रोन में चढ़ाया गया 3-आयामी मानव आंतों के ऑर्गेनोइड के एक एकल कुएं को स्थानांतरित करने के चरणों का वर्णन करता है। अधिकांश लाइनों में प्रति कुएं लगभग 400,000 कोशिकाएं होंगी। एक दूसरा, गैर-ट्रांसड्यूड अच्छी तरह से नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाना चाहिए। बर्फ पर सभी अभिकर्मकों और सेल निलंबन रखें.

  1. अंतिम मार्ग से 2-5 दिनों के बाद, HIO के दो कुओं से रखरखाव WRNE माध्यम को हटा दें। अच्छी तरह से प्रति 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 300 माइक्रोन के साथ बदलें और प्लेट से बीएमएम को अलग करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे 5x विंदुक करें। 4 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें.
  2. सीएमजीएफ के 500 माइक्रोन- + 10% एफबीएस प्रति अच्छी तरह से जोड़ें। एफबीएस के साथ 1 एमएल कम-बाइंड पिपेट टिप को 2x ऊपर और नीचे एफबीएस के 1 एमएल को पाइप करके प्री-कोट करें। एफबीएस को कई युक्तियों पर फिर से उपयोग किया जा सकता है। पूर्व लेपित टिप के साथ, HIO ऊपर और नीचे 10x विंदुक.
  3. प्रत्येक कुएं की सामग्री को अपने स्वयं के पूर्व-लेपित 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। सीएमजीएफ के अतिरिक्त 500 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला- और संबंधित ट्यूब में धोने जोड़ें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए झूलते बाल्टी अपकेंद्रित्र में 100 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला और किसी भी अवशिष्ट बीएमएम निकालें.
  5. 1x पीबीएस के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें। 4 कुल ट्यूबों के लिए दो microcentrifuge ट्यूबों में प्रत्येक ट्यूब विभाजित. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  6. प्रत्येक ट्यूब को 1x पीबीएस में एक अतिरिक्त समय और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र को फिर से निलंबित करें।
  7. पारगमन माध्यम और नियंत्रण माध्यम (तालिका 1) के 400 माइक्रोन तैयार करें। नियंत्रण माध्यम के 200 माइक्रोन में 2 ट्यूबों और ट्रांसडक्शन माध्यम के 200 माइक्रोन में 2 ट्यूबों को फिर से निलंबित करें।
  8. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। समय-समय पर एक लेपित टिप के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा पुन: निलंबित करें (उदाहरण के लिए, 2 घंटे पोस्ट ट्रांसडक्शन (एचपीटी), 12 एचपीटी, 18 एचपीटी) वर्दी पारगमन को प्रोत्साहित करने के लिए।
  9. 24 घंटे के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  10. धोने के लिए 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  11. एक बर्फ-ठंडा 200 माइक्रोन पिपेट टिप का उपयोग करके, बीएमएम के 30 माइक्रोन में 4 छर्रों में से प्रत्येक को फिर से निलंबित करें। धीरे विंदुक ऊपर और नीचे समान रूप से फैलाने के लिए.
  12. प्रत्येक ट्यूब की सामग्री को 24-अच्छी प्लेट पर अपने स्वयं के कुएं में प्लेट करें। बीएमएम को हाईडब्ल्यूएनटी डब्ल्यूआरएन + 10μM वाई -27632 के 500 माइक्रोन जोड़ने से पहले जमने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  13. ट्रांसड्यूड HIO को 1 सप्ताह के लिए बढ़ने दें, हर दूसरे दिन मीडिया (HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632) को ताज़ा करें। 1 सप्ताह के बाद, माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरोसेंट सूचक की अभिव्यक्ति की जांच करें। यदि संकेत मजबूत है, तो दवा चयन शुरू करें। यदि सिग्नल कमजोर है, तो ऊपर वर्णित अनुसार पारगमन दोहराएं।
  14. एक बार लाइन स्थापित हो जाने के बाद, एगोनिस्ट उपचार के माध्यम से प्रतिदीप्ति सूचक के कार्य को सत्यापित करें। 100nM ADP GCaMP सत्यापन के लिए एक विश्वसनीय एगोनिस्ट है। प्रारंभिक सत्यापन के लिए 3D ऑर्गेनोइड का परीक्षण करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. एक मार्ग के बाद, एक अलग इमेजिंग-नीचे प्लेट पर बीएमएम में ऑर्गेनोइड का एक अच्छा (या एकाधिक) प्लेट करें। इमेजिंग करते समय अतिरिक्त ओवरलैप से बचने के लिए सामान्य घनत्व के लगभग 1/3 पर ऑर्गेनोइड को प्लेट करें। एगोनिस्ट उपचार के बाद इन एचआईओ को पारित करना जारी न रखें, क्योंकि बाँझपन सुनिश्चित करना मुश्किल है।
    2. HIO को पोस्ट-पैसेज को ठीक होने के लिए 2-3 दिनों का समय दें। इमेजिंग से पहले, फिनोल लाल मुक्त भेदभाव मीडिया के लिए मीडिया स्विच.
    3. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का प्रयोग, छवियों के साथ एक 3 मिनट चलाने के लिए हर 5 s 488 एनएम उत्तेजना और एक FITC/GFP फिल्टर सेट का उपयोग कर अधिग्रहीत की स्थापना की. इमेजिंग के 30 एस के बाद, 100 एनएम एडीपी या वाहन नियंत्रण जोड़ें। इमेजिंग जारी रखें जब तक संकेत निकट-आधार रेखा पर वापस न आ जाए, ~ 2 मिनट। ADP उपचार के साथ GCaMP प्रतिदीप्ति में एक क्षणिक, ~ 2 गुना वृद्धि सफल पारगमन और बायोसेंसर फ़ंक्शन को इंगित करती है। पारगमन दक्षता के अधिक सटीक अनुमान के लिए, भाग 3 में वर्णित प्रक्रिया के माध्यम से उत्पन्न monolayers का उपयोग कर इमेजिंग के साथ एगोनिस्ट परीक्षण दोहराएँ.

3. लाइव प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए HIO monolayers की तैयारी

  1. कोलेजन चतुर्थ के साथ एक 10 अच्छी तरह से इमेजिंग नीचे कक्ष स्लाइड के सभी कुओं कोट. ऐसा करने के लिए, बाँझ विआयनीकृत पानी के 960 माइक्रोन के साथ 1 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन IV के 34 माइक्रोन मिलाएं। प्रत्येक अच्छी तरह से पतला कोलेजन चतुर्थ समाधान के 95 माइक्रोन जोड़ें और 0.5-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. 3D HIO के 4 कुओं से WRNE रखरखाव माध्यम निकालें। HIO को उनके अंतिम मार्ग से 5-7 दिन का होना चाहिए।
    नोट: 1 10-अच्छी तरह से प्लेट को आमतौर पर ~ 1.25 x 106 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। यह आम तौर पर बीएमएम के 30 माइक्रोन में चढ़ाया 3 डी HIO के 2-4 कुओं की आवश्यकता है, लेकिन घनत्व के आधार पर अलग अलग होगा.
  3. अच्छी तरह से प्रति 1x पीबीएस + 0.5 एमएम ईडीटीए के 500 माइक्रोन जोड़ें। एक पूर्व लेपित 1 एमएल टिप के साथ, पिपेट ऊपर और नीचे धीरे प्लेट से बीएमएम अलग करने के लिए. निलंबन को पूर्व-लेपित 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, एक ही ट्यूब में कुओं की तरह संयोजन करें।
  4. पीबीएस + 0.5 एमएम ईडीटीए के अतिरिक्त 500 माइक्रोन के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला और अवशिष्ट बीएमएम निकालें.
  5. एक पूर्व लेपित टिप का प्रयोग, पीबीएस + 5 मिमी EDTA के 3 एमएल में शेष गोली resuspended (ध्यान दें कि यह पहले धोने की तुलना में 10x अधिक EDTA है).
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला और अवशिष्ट बीएमएम निकालें. एंजाइमी पृथक्करण बफर के 2 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस मनका/पानी स्नान में सेते हैं. मिश्रण करने के लिए धीरे से सीएमजीएफ- + 10% एफबीएस और पिपेट के 3 एमएल जोड़ें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें. सीएमजीएफ के 1 एमएल जोड़ें-
  9. यंत्रवत् एकल कोशिकाओं में HIO को तोड़ने के लिए एक पूर्व लेपित टिप 80x-100x के साथ सख्ती से विंदुक ऊपर-नीचे। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  10. WRNE + 10 μM Y-27632 के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें। 1 एमएल निलंबन के लिए एक सेल गिनती प्राप्त करें।
  11. 1.25 x 105 कोशिकाओं /100 μL (1.25 x 106 कोशिकाओं/mL) की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए WRNE + 10μM Y-27632 के साथ सेल निलंबन को पतला करें।
  12. एक 200 माइक्रोन विंदुक का प्रयोग, चरण 1 में तैयार थाली से कोलेजन समाधान को हटा दें, के रूप में कोलेजन अब अच्छी तरह से के नीचे करने के लिए बस गया है. विंदुक टिप के साथ अच्छी तरह से के तल को छूने से बचें.
  13. एक पूर्व लेपित 200 माइक्रोन विंदुक टिप का उपयोग करके, अच्छी तरह से प्रति चरण 3.11 (1.25 x 105 कोशिकाओं) से सेल समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  14. एक 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए सेते हैं. 24 घंटे के बाद, सभी कुओं से संस्कृति माध्यम को हटा दें और इसे प्रति अच्छी तरह से भेदभाव माध्यम के 100 माइक्रोन के साथ बदलें।
    नोट: इस बिंदु तक, कोशिकाओं को प्लेट का पालन करना चाहिए। ध्यान दें कि मोनोलेयर संभवतः संगम या पूरी तरह से प्लानर नहीं होगा।
  15. स्लाइड वापस 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें. भेदभाव माध्यम हर 24 घंटे ताज़ा जब तक मोनोलेयर संगम है. यह आमतौर पर चढ़ाना से 3-5 दिनों की आवश्यकता होती है। इस बिंदु के बाद, मोनोलेयर डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार हैं।

4. HIO मोनोलेयर्स का वायरल संक्रमण

  1. वायरस इनोकुलम तैयार करें। यदि आवश्यक हो, तो ट्रिप्सिन वायरस स्टॉक को सक्रिय करता है। रोटावायरस के लिए, वायरस स्टॉक में 10 माइक्रोग्राम / एमएल वर्थिंगटन के ट्रिप्सिन जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    1. सक्रिय वायरस स्टॉक दो निम्न विधियों में से एक का उपयोग कर पतला.
      1. यदि केवल एक वायरल तनाव का उपयोग करके संक्रमित कोशिकाओं की अधिकतम संख्या का लक्ष्य है, तो सक्रिय वायरल स्टॉक के 50 माइक्रोन को 50 माइक्रोन सीएमजीएफ- के साथ मिलाएं।
      2. यदि कई उपभेदों की तुलना करते हैं, तो संक्रमण की समान बहुलता (एमओआई) प्राप्त करने के लिए इनोकुलम तैयार करें। वांछित MOI के लिए आवश्यक प्रति वायरस स्टॉक की मात्रा निर्धारित करने के लिए निम्न सूत्र का उपयोग करें। सीएमजीएफ जोड़ें- अच्छी तरह से प्रति 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए गणना की गई वायरस स्टॉक की मात्रा में।
        Equation 1
        नोट: 5.46 मिमी (96-अच्छी तरह से प्लेट) के व्यास के साथ एक कुएं में चढ़ाया गया एक एकल एचआईओ मोनोलेयर में लगभग 200,000 कोशिकाएं होती हैं। मोनोलेयर्स में संक्रमण की खराब दक्षता के कारण, एक उच्च एमओआई (प्रति सेल 100-1 मिलियन वायरल कण) को प्राथमिकता दी जाती है। इष्टतम एमओआई को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
    2. धीरे एक 200 एमएल विंदुक का उपयोग HIO monolayer से मीडिया को हटाने के द्वारा monolayers संक्रमित. वायरस इनोकुलम या मॉक इनोकुलम के 100 एमएल के साथ बदलें।
      1. चूंकि अधिकांश रोटावायरस स्टॉक MA104 कोशिकाओं में प्रचारित होते हैं, इसलिए मॉक इनोकुलम के लिए एक असंक्रमित MA104 सेल लाइसेट का उपयोग करें। संक्रमित कुओं के लिए इस्तेमाल वायरस स्टॉक की मात्रा के बराबर मात्रा का उपयोग करें और अच्छी तरह से प्रति 100 एमएल की अंतिम मात्रा के लिए सीएमजीएफ जोड़ें।
      2. वायरस के लिए जो कोशिकाओं को बेसोलेटरल रूप से संक्रमित करते हैं, जैसे कि रोटावायरस14, मोनोलेयर को स्कोर करने के लिए 25G सुई का उपयोग करें। मोनोलेयर की लंबाई में एक एकल स्कोर बनाना सबसे आसान है, नीचे से कुएं के ऊपर तक। धीरे गति की दिशा के विपरीत, बेवल पक्ष के साथ एक कोण पर मोनोलेयर में सुई दबाएं, और इसे निशान बनाने के लिए मोनोलेयर की लंबाई में खींचें (चित्रा 2ए)।
    3. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं। वायरस को हटा दें और इनोकुलम का मजाक उड़ाएं। मोनोलेयर्स को एक बार 1x पीबीएस से धो लें।
    4. फिनोल लाल मुक्त भेदभाव मीडिया के 100 माइक्रोन जोड़ें। छवि के लिए तैयार होने तक एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्लाइड रखें. वायरल संक्रमण के कैनेटीक्स के आधार पर इष्टतम इमेजिंग विंडो अलग-अलग होगी। रोटावायरस के लिए, संक्रमण के बाद 6-8 घंटे में इमेजिंग शुरू करें।

5. सीए2+ संक्रमित मोनोलेयर्स की इमेजिंग

  1. स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-हीट करें। 0.02 एल/मिनट पर आर्द्रीकृत सीओ2 चलाएं। इनक्यूबेटर कक्ष में संक्रमित monolayers के साथ स्लाइड प्लेस और ढक्कन सील.
  2. ब्राइटफ़ील्ड (BF) रोशनी और 20x उद्देश्य का उपयोग करके, मोनोलेयर के भीतर देखने के क्षेत्रों के X और Y निर्देशांक का चयन करें जिन्हें इमेज किया जाएगा। यह देखने में स्कोर क्षेत्र के साथ अंक का चयन करने के लिए सबसे अच्छा है, के रूप में सबसे संक्रमित कोशिकाओं खरोंच के पास हो जाएगा.
  3. इमेजिंग मापदंडों का अनुकूलन करें और 488 एनएम उत्तेजना का उपयोग करके एक छवि प्राप्त करें। फोटोटॉक्सिसिटी को कम करने के लिए, प्रकाश स्रोत को 50 एमएस एक्सपोजर समय के साथ 50% पावर पर सेट करें। उपयुक्त अधिग्रहण पैरामीटर भिन्न हो सकते हैं और कई अधिग्रहण प्राप्त करके अनुकूलित किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि कोई पिक्सेल संतृप्त नहीं है। फ्लोरोसेंट कैल्शियम सेंसर की संपूर्ण गतिशील रेंज का पता लगाने के लिए आवश्यकतानुसार एक्सपोज़र समय और प्रकाश शक्ति को समायोजित करें।
  4. यदि अन्य फ्लोरोफोर्स (जैसे, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए वायरस) का उपयोग कर रहे हैं, तो इन चैनलों पर अनुकूलन दोहराएं। इमेजिंग पाश सेट करें और हर चयनित एक्स पर एक 488 एनएम छवि प्राप्त करने, वाई एक 1 मिनट पाश में समन्वय. इस लूप को लगातार इमेज करें। फ्लोरोसेंटली टैग किए गए वायरस का उपयोग करते समय, हर 10वें लूप (यानी, 1 छवि / 10 मिनट) उपयुक्त चैनल पर एक छवि प्राप्त करें।
  5. ~ 18 घंटे के लिए छवियों ले लीजिए. यदि फ्लोरोसेंट टैग के बिना वायरस का उपयोग कर रहे हैं, तो मोनोलेयर को ठीक करें और संक्रमित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना करें। नीचे वर्णित के रूप में इमेजिंग रन पूरा करने के बाद इस प्रदर्शन.
    1. इमेजिंग मीडिया निकालें और 1x पीबीएस में 4% फॉर्मलाडेहाइड के 100 माइक्रोन के साथ बदलें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    2. लगानेवाला निकालें और 10 मिनट के लिए 50 एमएम एनएच4सीएल के 100 माइक्रोन के साथ बुझाने एनएच4सीएल निकालें कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए 1x पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 के 100 माइक्रोन के साथ मोनोलेयर को पारगम्य करें।
    3. पारगम्यता बफर निकालें। 1 घंटे के लिए 1x पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के 100 माइक्रोन के साथ ब्लॉक।
    4. अवरुद्ध समाधान निकालें। 1x पीबीएस में अनुशंसित/अनुकूलित एकाग्रता के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। प्रति अच्छी तरह से एंटीबॉडी समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    5. कोमल कमाल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें। 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें।
    6. फ्लोरोसेंट-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें जो 1x पीबीएस में अनुशंसित/अनुकूलित एकाग्रता के लिए पतला हो। अच्छी तरह से प्रति 100 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं.
      नोट: FPBase15 माध्यमिक का चयन करने में मदद करने के लिए एक महान संसाधन है जो मल्टीप्लेक्सिंग के दौरान ब्लीड-थ्रू से बच जाएगा। अधिकांश माध्यमिक 1x पीबीएस में 1:1000 कमजोर पड़ने पर प्रभावी होते हैं।
    7. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें। 1x पीबीएस में 1 माइक्रोग्राम/एमएल डीएपीआई समाधान बनाएं और प्रति अच्छी तरह से 100 माइक्रोन जोड़ें। 20 मिनट के लिए सेते हैं. DAPI निकालें. 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें।
    8. इमेजिंग के लिए 1x पीबीएस के 100 माइक्रोन में निश्चित मोनोलेयर रखें। स्लाइड को वापस माइक्रोस्कोप चरण पर रखें, एक्स और वाई निर्देशांक को लाइव इमेजिंग रन से पुनः लोड करें, और चैनल पर प्रत्येक बहु-बिंदु की छवि जो धुंधला होने के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी से मेल खाती है। लाइव इमेजिंग रन से छवियों का संदर्भ लें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि समान बिंदुओं पर कब्जा कर लिया गया है।

6. अंतरकोशिकीय कैल्शियम तरंगों की मात्रा का ठहराव

  1. सुनिश्चित करें कि फिजी जस्ट इमेजजे (फिजी) निम्नलिखित प्लग-इन के साथ स्थापित है: जैव-प्रारूप (फिजी में पूर्व-स्थापित होना चाहिए लेकिन इमेजजे में नहीं होगा); रसोई की किताब: स्थापित करने के लिए, फिजी मेनू से, अपडेट > मदद करें > अपडेट साइटों को प्रबंधित करें पर जाएं। कुकबुक चेक करें। फिजी को पुनरारंभ करें।
  2. लाइव इमेजिंग रन से डेटा फ़ाइल को कई फाइलों में विभाजित करें, प्रत्येक X, Y समन्वय को अलग करें। Nikon NES तत्वों में, फ़ाइल > आयात/निर्यात > विभाजित बहु-बिंदु का चयन करें। निर्यात के लिए एक फ़ोल्डर और एक उपयुक्त उपसर्ग का चयन करें।
  3. फिजी खोलें। स्प्लिट मल्टीपॉइंट्स से एक फ़ाइल लोड करें। यदि मल्टी-चैनल छवि का उपयोग कर रहे हैं, तो चैनलों को विभाजित करें। 488 एनएम चैनल (GCaMP) से छवियों के साथ विंडो का चयन करें.
  4. प्रत्येक पिक्सेल मान में एक टाइमपॉइंट से अगले में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए DeltaF Up फ़ंक्शन चलाएँ। ऐसा करने के लिए, कुकबुक > टी-फ़ंक्शंस > डेल्टा एफ अप चुनें।
  5. स्टैक के माध्यम से स्क्रॉल करें जब तक कि कैल्शियम तरंग वाली छवि न मिल जाए। कैल्शियम तरंग को ध्यान में रखते हुए, छवि > > थ्रेशोल्ड समायोजित करें पर क्लिक करके एक थ्रेशोल्ड सेट करें। सिग्नल की मात्रा को कम करने के लिए निचली सीमा को समायोजित करें जो लहर का हिस्सा नहीं है जो इसे थ्रेशोल्ड से आगे बढ़ाता है। ऊपर वर्णित मापदंडों का उपयोग करके प्राप्त 16-बिट छवियों के लिए, 600 की निचली सीमा से शुरू करें और आवश्यकतानुसार समायोजित करें।
  6. कणों का विश्लेषण > विश्लेषण पर क्लिक करके तरंगों को खंडित करने के लिए कण विश्लेषक चलाएँ। सीमा को समायोजित करके माइक्रोन2 में तरंग का न्यूनतम आकार निर्धारित करें। यह बेसलाइन पर 0-अनंत पर सेट है। 20x उद्देश्य का उपयोग करके अधिग्रहित MA104 कोशिकाओं की छवियों के लिए, निचली सीमा को 10,000 माइक्रोन2 तक बढ़ाकर शुरू करें और उपयुक्त के रूप में समायोजित करें।
  7. प्रदर्शन परिणाम और परिणाम साफ़ करें के लिए बॉक्स चेक करें. "दिखाएँ" ड्रॉपडाउन मेनू से, बाह्यरेखाएँ चुनें, फिर ठीक पर क्लिक करें. इसका परिणाम 2 आउटपुट में होना चाहिए: एक विंडो, परिणाम, पता लगाई गई प्रत्येक तरंग, लहर के क्षेत्र और इसके माध्य, न्यूनतम और अधिकतम तीव्रता मूल्यों (डेल्टा एफ के आधार पर) को सूचीबद्ध करेगा। [फ़ाइल नाम] की ड्राइंग शीर्षक वाली दूसरी विंडो में खंडित तरंगों की रूपरेखा के साथ एक नया स्टैक शामिल होगा। तरंग का पता लगाने की पुष्टि करने के लिए इसका इस्तेमाल करें। यदि आवश्यक हो तो थ्रेशोल्ड मान और आकार सीमा समायोजित करें, और तरंग कॉल को फिर से जांचें।
  8. बैच प्रोसेसिंग के लिए, शामिल मैक्रो स्क्रिप्ट का उपयोग करें (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1)। इसका उपयोग करने के लिए, नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
    1. चरण 6.2 में वर्णित के रूप में एकल फ़ाइलों में बहु-बिंदुओं को विभाजित करें। फिजी खोलें। मैक्रो > बैच > प्रक्रिया का चयन करें। "इनपुट" बॉक्स में, स्प्लिट मल्टीपॉइंट फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर को मानचित्र प्रदान करें। "आउटपुट" बॉक्स को खाली छोड़ दें।
    2. पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 से स्क्रिप्ट को बॉक्स में पेस्ट करें। चरण 6.5 और 6.6 से अनुकूलित मापदंडों को प्रतिबिंबित करने के लिए स्क्रिप्ट में तीव्रता थ्रेशोल्ड और आकार थ्रेशोल्ड समायोजित करें।
    3. प्रक्रिया पर क्लिक करें. कंप्यूटर के बहु-बिंदुओं और प्रसंस्करण गति की संख्या के आधार पर, सभी छवियों को संसाधित करने में 30 मिनट या उससे अधिक समय लग सकता है। एक बार पूरा हो जाने पर, डेटा को डेस्कटॉप पर "लिखने के बाद मेरा नाम बदलें" नामक एक नई स्प्रेडशीट फ़ाइल में लिखा जाएगा। आउटपुट फ़ाइल में प्रत्येक मल्टीपॉइंट के लिए, एक तरंग गणना और तरंग मीट्रिक (क्षेत्र, औसत तीव्रता, न्यूनतम और अधिकतम तीव्रता, और तीव्रता घनत्व) शामिल होना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 1 ए एक बीएमएम गुंबद दिखाता है जिसमें 3-आयामी मानव आंतों के ऑर्गेनोइड होते हैं जिन्हें जीसीएएमपी 6 को स्थिर रूप से व्यक्त करने के लिए ट्रांसड्यूड किया गया है। चित्रा 1 बी 24, 48, और 72 घंटे के बाद बोने पर एक मोनोलेयर के रूप में replated organoid की एक ही लाइन से पता चलता है. GCaMP6s के समारोह को मान्य करने के लिए, monolayer प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी हर 2 एस 4 मिनट के लिए imaged था, और 100 एनएम ADP ~ 20 s के बाद मीडिया में जोड़ा गया था. ADP endoplasmic जालिका से कैल्शियम रिहाई elicits, साइटोसोलिक कैल्शियम में वृद्धि. प्रत्येक जोखिम पर 488 एनएम चैनल पर पता चला प्रतिदीप्ति तीव्रता चित्रा 1 सी में साजिश रची है. ट्रेस एडीपी जोड़ पर तेजी से वृद्धि के बाद एक स्थिर आधारभूत प्रतिदीप्ति तीव्रता से पता चलता है, और आधार रेखा की ओर एक क्रमिक वापसी. एक वाहन नियंत्रण को यह सत्यापित करने के लिए शामिल किया गया है कि प्रतिक्रिया एक सच्ची सिग्नलिंग घटना है, न कि केवल प्रतिदीप्ति तीव्रता में बदलाव जो मीडिया के अलावा से उत्पन्न हो सकता है।

HIO मोनोलेयर स्कोर करने से रोटावायरस संक्रमण की दक्षता बढ़ जाती है। जबकि स्कोरिंग के लिए तकनीक अलग-अलग होती है, मोनोलेयर की लंबाई के साथ एकल स्कोर का उपयोग करके लगातार संक्रमण प्राप्त करना सबसे आसान होता है, जैसा कि चित्र 2A में दिखाया गया है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले रोटावायरस के पुनः संयोजक उपभेदों का उपयोग करते समय, संक्रमण को लाइव इमेजिंग(चित्रा 2बी)के दौरान सत्यापित किया जा सकता है। एक तनाव का उपयोग करते समय जो एक मार्कर को व्यक्त नहीं करता है, इमेजिंग के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा संक्रमण का पता लगाया जा सकता है। एचआईओ मोनोलेयर्स में कोशिकाओं की गतिशीलता को देखते हुए, समय के साथ एक संक्रमित कोशिका को ट्रैक करना अक्सर मुश्किल होता है। इसके बजाय, संक्रमण को सत्यापित करने और संक्रमण की बहुलता की पुष्टि करने के लिए एक विधि के रूप में समापन बिंदु धुंधला का उपयोग करें, क्षेत्र-के-दृश्य(चित्रा 2सी)के बीच मिलान किया जाता है।

एचआईओ में अंतरकोशिकीय कैल्शियम तरंगों को गुणात्मक रूप से देखा जा सकता है, जैसा कि चित्र 3 ए में दर्शाया गया है। हालांकि, किसी दिए गए क्षेत्र में कैल्शियम तरंगों की आवृत्ति का निर्धारण करने के लिए मात्रात्मक विश्लेषण की आवश्यकता होती है। सफल विभाजन के कदम, जैसा कि ऊपर प्रोटोकॉल के चरण 6 में वर्णित है, चित्रा 3 ए में चित्रित किया गया है। आंकड़ा कच्ची छवि (चित्रा 3Ai) दिखाता है, पिछले फ्रेम से पिक्सेल तीव्रता के बाद की छवि घटाई गई है (चित्र 3Aii), फिर खंडित कैल्शियम तरंग(चित्रा 3Aiii)।

एक बार कैल्शियम तरंगों खंडित किया गया है और इमेजिंग रन के पाठ्यक्रम पर प्रत्येक क्षेत्र के दृश्य के लिए मात्रा निर्धारित की गई है, यह अक्सर विभिन्न स्थितियों के संपर्क में monolayers में तरंगों की आवृत्ति की तुलना करने के लिए जानकारीपूर्ण है. चित्रा 3 बी में पट्टी चार्ट नकली और rotavirus-inoculated monolayers में क्षेत्र के दृश्य प्रति कैल्शियम तरंगों की कुल संख्या से पता चलता है. इस उदाहरण में RV के दो उपभेद शामिल हैं: मानव रोटावायरस (Ito HRV) का एक तनाव और सिमियन रोटावायरस SA11 का एक पुनः संयोजक तनाव जो mRuby (SA11-mRuby) को व्यक्त करता है। नकली संक्रमित नियंत्रण को आधारभूत कैल्शियम तरंग आवृत्ति के रूप में लिया जाता है, अनुपचारित रोटावायरस-संक्रमित मोनोलेयर सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं, और रोटावायरस-संक्रमित, उपचारित मोनोलेयर प्रयोगात्मक स्थितियां हैं। एडीपी रिसेप्टर अवरोधक, बीपीटीयू सहित दवाओं के साथ इलाज किए गए मॉक-संक्रमित और आरवी-संक्रमित मोनोलेयर्स की तुलना एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा दोनों नियंत्रण स्थितियों से की जा सकती है। डेटा बताता है कि बीपीटीयू प्रभावी रूप से अंतरकोशिकीय कैल्शियम तरंगों की आवृत्ति को कम करता है।

Figure 1
चित्रा 1: जेजुनल मानव आंतों के ऑर्गेनोइड में GCaMP6s अभिव्यक्ति का सत्यापन। (ए) लेंटवायरस पारगमन के बाद, GCaMP-व्यक्त HIO ने चयन और कई मार्ग किए, जो सबसे हाल के मार्ग के बाद से 7 दिनों में यहां दिखाए गए हैं। 488 एनएम लेजर के साथ उत्तेजना पर, GCaMP6s अभिव्यक्ति 3-आयामी स्फेरॉइड (एआई) के रूप में 15 माइक्रोन बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में चढ़ाया गया ट्रांसड्यूड HIO में स्पष्ट है। 50 एमएस एक्सपोजर को 20x उद्देश्य का उपयोग करके 50% लेजर पावर पर अधिग्रहित किया गया था, फिर पूरे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबद की कल्पना करने के लिए एक साथ सिले गए थे। इसी तरह की प्रक्रिया 4 एमएस ब्राइटफील्ड एक्सपोजर (एआईआई) का उपयोग करके की गई थी। ब्राइटफील्ड छवि में, गुंबद के केंद्र में अंधेरे HIO एक संकेत हैं कि संस्कृतियां पारित होने के लिए तैयार हैं। (बी) एचआईओ एंजाइमेटिक रूप से एकल-सेल निलंबन में पच गए थे, फिर कोलेजन चतुर्थ के साथ पूर्व-लेपित इमेजिंग-बॉटम प्लेट के प्रति 150,000 कोशिकाओं (व्यास में 5 मिमी) के घनत्व पर फिर से चढ़ाया गया। 72 घंटे के बाद बोने तक, मोनोलेयर संगम और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार था। GCaMP के समारोह को मान्य करने के लिए, छवियों 488 मिनट के लिए हर 2 एस 50% लेजर शक्ति पर 50 एमएस एक्सपोजर के साथ सेट 488 एनएम फिल्टर का उपयोग कर अधिग्रहित किया गया. (ग) निशान यहाँ दिखाया इमेजिंग के पाठ्यक्रम पर पहले अधिग्रहण के लिए सामान्यीकृत पूरे क्षेत्र प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं. लगभग 20 एस (तीर) पर, दसवें एक्सपोजर के बाद, साइटोसोलिक कैल्शियम (लाल) में एक स्पाइक को प्राप्त करने के लिए 100 एनएम एडेनोसिन डिपोस्फेट (एडीपी) जोड़ा गया था। 1x पीबीएस की एक समान मात्रा के अलावा एक सार्थक प्रतिक्रिया (नीला) प्राप्त नहीं किया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: आरवी संक्रमण की सुविधा के लिए एक एचआईओ मोनोलेयर स्कोरिंग। (ए) यह आंकड़ा 25 जी सुई का उपयोग करके मोनोलेयर स्कोर करने के लिए एक उपयुक्त तकनीक दिखाता है। (बी) एक एचआईओ मोनोलेयर आरवी के पुनः संयोजक तनाव से संक्रमित था जो एमआरयूबी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (मैजेंटा, तीर) को व्यक्त करता है, जिससे संक्रमित कोशिकाओं की पहचान की अनुमति मिलती है। वैकल्पिक रूप से, आरवी के स्वाभाविक रूप से होने वाले तनाव का उपयोग करते समय, संक्रमित कोशिकाओं को इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। (सी) दिखाए गए चित्र निर्धारण के बाद 4 अलग-अलग एचआईओ मोनोलेयर्स से हैं, डीएपीआई धुंधला (नीला), और रोटावायरस एंटीजन (मैजेंटा) के एंटीबॉडी लेबलिंग। दोनों तकनीकें मोनोलेयर के स्कोर वाले हिस्से के पास अधिमान्य आरवी संक्रमण का वर्णन करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आरवी-प्रेरित अंतरकोशिकीय कैल्शियम तरंगों का विभाजन और परिमाणीकरण। GCaMP6s व्यक्त RV संक्रमित HIOs के 488 एनएम जोखिम प्रोटोकॉल का उपयोग कर 16 घंटे के लिए हर 1 मिनट हासिल कर लिया गया. (ए) आंकड़ा अंतरकोशिकीय कैल्शियम तरंग विभाजन की प्रक्रिया को दिखाता है। सबसे पहले, पिछले अधिग्रहण (टी -1) से पिक्सेल मूल्यों प्रतिदीप्ति तीव्रता (एआईआई) में परिवर्तन यों करने के लिए प्रत्येक कच्चे छवि (ऐ) से घटाया जाता है. पिछले फ्रेम से तीव्रता में प्रयोगात्मक रूप से अनुकूलित न्यूनतम वृद्धि के आधार पर एक सीमा तब लागू की जाती है। छवियों को तब अंतरकोशिकीय कैल्शियम तरंगों (एiii) के लिए चयन करने और एकल-सेल कैल्शियम संकेतों को बाहर करने के लिए न्यूनतम सन्निहित संकेत क्षेत्र के लिए फ़िल्टर किया जाता है। यह प्रसंस्करण प्रत्येक क्षेत्र के दृश्य में कैल्शियम तरंगों की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है। इस प्रयोग में, मोनोलेयर या तो नकली संक्रमित थे, मानव रोटावायरस (एचआरवी) के आईटीओ तनाव से संक्रमित थे, या जीन खंड 7 पर सिमियन रोटावायरस एन्कोडिंग mRuby के पुनः संयोजक तनाव से संक्रमित थे, गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 3 (SA11-mRuby) के डाउनस्ट्रीम। संक्रमित मोनोलेयर्स का या तो एडीपी रिसेप्टर अवरोधक बीपीटीयू के साथ इलाज किया गया था या अनुपचारित छोड़ दिया गया था। मोनोलेयर्स को तब 8 अलग-अलग पदों पर चित्रित किया गया था, और प्रत्येक क्षेत्र के दृश्य में कैल्शियम तरंगों को इस प्रोटोकॉल में वर्णित पाइपलाइन का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी। स्ट्रिप चार्ट पर बिंदु प्रत्येक स्थिति में पाई गई कैल्शियम तरंगों की संख्या को इंगित करते हैं, जो माध्य और एसडी को चिह्नित करने वाले बार चार्ट पर आरोपित होते हैं। डनेट के परीक्षणों के बाद एक तरफा एनोवा से पता चलता है कि आरवी के या तो तनाव से असंक्रमित समूह के ऊपर अंतरकोशिकीय कैल्शियम तरंगों की आवृत्ति बढ़ जाती है, बीपीटीयू उपचार कैल्शियम तरंग आवृत्ति में आरवी-मध्यस्थता वृद्धि को रोकता है। **पी<0.01, ***पी<0.001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) पारक्रमणअ नियंत्रण
Y-27632 (1 मिमी स्टॉक) 4 माइक्रोन 4 माइक्रोन
पॉलीब्रेन (1 मिलीग्राम/μL स्टॉक) 2 माइक्रोन 2 माइक्रोन
लेंटवायरस चर*
HighWnt-WRNE *नोट्स देखें 400 माइक्रोन तक 400 माइक्रोन तक

तालिका 1: लेंटवायरस पारगमन माध्यम। ट्रांसडक्शन मीडिया तैयार करें और क्रमशः दूसरे और तीसरे कॉलम में इंगित वॉल्यूम में अभिकर्मकों के संयोजन से मीडिया को नियंत्रित करें। प्रति सेल 10 लेंटवायरस ट्रांसडक्शन इकाइयों के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता का लक्ष्य रखें। घर में पैक किए गए एलवी के लिए, इसके लिए आमतौर पर केंद्रित एलवी के ~ 25-50 माइक्रोन की आवश्यकता होती है। अधिकांश व्यावसायिक रूप से पैक किए गए एलवी के टिटर को विश्लेषण प्रमाणपत्र प्रदान किया जाएगा।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: बैच प्रसंस्करण द्वारा कैल्शियम तरंग मात्रा की मात्रा के लिए अनुमति देने के लिए इमेजजे मैक्रो स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

साइटोसोलिक सीए2+ स्तरों में परिवर्तन उपकला 10,16,17 के भीतर विकृति का कारण और प्रभाव दोनों हो सकता है। साइटोसोलिक कैल्शियम में वृद्धि सीधे18,19 TMEM16A कैल्शियम पर निर्भर क्लोराइड चैनल के सक्रियण के माध्यम से स्राव ड्राइव कर सकते हैं. सीए2 + के जवाब में TMEM16A की सक्रियता क्लोराइड के शिखर प्रवाह के लिए अनुमति देता है, एक आसमाटिक ढाल की स्थापना करता है जो द्रव स्राव20,21को बढ़ावा देता है। इसके अलावा, एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाओं के भीतर सीए2+ में वृद्धि सेरोटोनिन की रिहाई को ट्रिगर करती है, जो अभिवाही संवेदी न्यूरॉन्स को उत्तेजित करती है जो एंटरिक तंत्रिका तंत्र22 के भीतर गतिविधि को संशोधित कर सकती है। सीए2+ संकेतों भी तंग जंक्शनों मिलाना बाधा समारोह23,24 को प्रभावित करने के लिए, और आंतों स्टेम कोशिकाओं25 में प्रसार को विनियमित कर सकते हैं. इस प्रकार, सीए2 + के डिसरेग्यूलेशन के व्यापक और दूरगामी प्रभाव हो सकते हैं।

कई वायरस साइटोसोलिक सीए2 + प्रतिकृति26 के लिए अनुकूल एक सेलुलर वातावरण बनाने के लिए हेरफेर करते हैं। रोटावायरस आंतों के उपकला27 के भीतर इसका एक प्रमुख उदाहरण है। रोटावायरस गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 4 (NSP4) एक Ca2+-संचालन चैनल है जो एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम से साइटोसोल28,29 में Ca2+ के प्रवाह की अनुमति देता है। यह ऑटोफैगी को उत्तेजित करता है और बाहरी कैप्सिड30,31,32 की असेंबली में सहायता करता है। रोटावायरस संक्रमण भी एडीपी की रिहाई को प्रेरित करता है, अंतरकोशिकीय सीए2+ तरंगों को ट्रिगर करता है जो रोगजनन17 में योगदान करते हैं। अन्य आंत्र वायरस, दोनों caliciviruses और enteroviruses सहित, सीए2 + का संचालन viroporins है कि संक्रमित कोशिकाओं33,34 के भीतर सीए2 + के समान dysregulation ट्रिगर सांकेतिक शब्दों में बदलना.

मानव आंतों के ऑर्गेनोइड की लाइव-सेल सीए2+ इमेजिंग उपकला के भीतर वायरस-प्रेरित सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी मंच प्रदान करती है। हालांकि, इमेजिंग डेटा से निकाले गए निष्कर्षों की ताकत, एचआईओ के स्वास्थ्य और गुणवत्ता, उपयुक्त इमेजिंग मापदंडों और एक ध्वनि विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण पर निर्भर करती है।

नई HIO लाइनों की स्थापना करते समय कुशल लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन अक्सर सीमित कदम होता है, लेकिन उच्च-टिटर लेंटवायरस और कई पारगमन पर्याप्त ट्रांसजीन अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने में मदद करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, यह पारगमन पर महत्वपूर्ण सेलुलर तनाव के लिए क्षमता के साथ संतुलित किया जाना होगा. यह अक्सर अस्थायी होता है और चयन और कई मार्ग के बाद कम हो जाता है। बहरहाल, यह महत्वपूर्ण है कि एचआईओ को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर जीईसीआई प्रयोगों शुरू करने से पहले सामान्य विकास और प्रसार प्रदर्शित करते हैं। इसी तरह, 3-आयामी HIO को फैलाना और उन्हें मोनोलेयर के रूप में सुधारना सेलुलर तनाव को प्रेरित करता है। चढ़ाना के बाद मोनोलेयर को अनुकूलित करने के लिए तीन या अधिक दिनों की अनुमति देना सबसे अच्छा अभ्यास है। कोलेजन चतुर्थ के साथ प्लेटों कोटिंग मोनोलेयर अखंडता35,36 के लिए महत्वपूर्ण है. कोलेजन IV को एलिकोट करना और उपयोग के बीच -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करना मोनोलेयर पालन सुनिश्चित करने में मदद करता है। प्रत्येक HIO लाइन के लिए इष्टतम सीडिंग घनत्व का निर्धारण भी स्थिरता में सुधार करने में मदद कर सकता है। अंत में, उचित नियंत्रणों सहित, और प्रयोगों में उनकी तुलना करना, यह सुनिश्चित करने के लिए अपरिहार्य है कि कोई भी अवलोकन तकनीकी कन्फ़्यूडर के बजाय प्रश्न में चर की प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है।

जबकि एक मोनोलेयर स्कोर करने से अवांछित कोशिका क्षति हो सकती है, यह 2 डी एचआईओ के आरवी संक्रमण को बहुत बढ़ाता है। चित्रा 2 यह दिखाता है, के रूप में लगभग सभी संक्रमित कोशिकाओं सीधे खरोंच के निकट हैं. प्रायोगिक सबूत बताते हैं कि आरवी आंतों के उपकला कोशिकाओं37 की बेसोलेटरल सतह पर सबसे कुशलता से संक्रमित करता है। इस प्रकार, यह भविष्यवाणी की जाती है कि एक मोनोलेयर स्कोर करना बेसोलेटरल सतह को उजागर करके संक्रामकता को बढ़ाता है। कुशल मोनोलेयर संक्रमण को संस्कृति माध्यम वाले कुओं में निलंबित पॉली कार्बोनेट झिल्ली पर एचआईओ चढ़ाना द्वारा भी प्राप्त किया जा सकता है, जो बेसोलेटरल सतह तक पहुंच की अनुमति देता है। हालांकि, प्लेट और पॉली कार्बोनेट झिल्ली के बीच अपेक्षाकृत लंबी दूरी, पॉली कार्बोनेट झिल्ली, और कुएं के आधार पर प्लास्टिक की सतह उन्हें एपिफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त प्रदान करती है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में वर्णित स्कोरिंग विधि पसंदीदा दृष्टिकोण बनी हुई है। यह देखते हुए कि स्कोरिंग ही संकेत गड़बड़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, असंक्रमित, स्कोर नियंत्रण का समावेश व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है. वायरस के लिए, जैसे मानव नोरोवायरस, जो कुशलतापूर्वक शिखर झिल्ली के माध्यम से संक्रमित करते हैं, मोनोलेयर को स्कोर करने की आवश्यकता नहीं है38.

किसी भी लाइव इमेजिंग सिस्टम के साथ, फोटोटॉक्सिसिटी आसानी से HIO मोनोलेयर्स का उपयोग करने वाले प्रयोगों को भ्रमित कर सकती है। एक इमेजिंग प्रयोग के दौरान, यह अप्रत्याशित vacuolization, झिल्ली blebbing, या तनाव39 के अन्य रूपात्मक संकेतक के लिए निगरानी करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि इनमें से किसी भी संकेत का पता लगाया जाता है, तो अवधि, आवृत्ति या उत्तेजना की शक्ति को कम किया जाना चाहिए। सिग्नल-टू-शोर अनुपात बढ़ाना अक्सर दीर्घकालिक सेल स्वास्थ्य की कीमत पर आता है, इस प्रकार, अनुभवजन्य रूप से मापदंडों का अनुकूलन महत्वपूर्ण है। Photobleaching, के रूप में समय के साथ आधारभूत प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी से संकेत मिलता है, सेल तनाव का एक अग्रदूत है और बचा जाना चाहिए.

इमेजिंग डेटा की दृश्यता जांचकर्ताओं को मात्रात्मक विश्लेषण के बजाय गुणात्मक पक्ष में ले जा सकती है। हालांकि, किसी भी तौर-तरीके के साथ, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य निष्कर्षों को परिमाणीकरण की आवश्यकता होती है। मात्रात्मक छवि विश्लेषण में एक पांडुलिपि में शामिल होने की तुलना में कहीं अधिक जटिलता होती है, लेकिन कुछ प्रमुख बिंदुओं को उजागर करना सार्थक है। सबसे पहले, लगातार मात्रा का निर्धारण लगातार अधिग्रहण की आवश्यकता है। अधिग्रहण मापदंडों के किसी दिए गए सेट के लिए विकसित एक विश्लेषण पाइपलाइन विभिन्न आवृत्तियों, जोखिम समय, लेजर शक्तियों या तरंग दैर्ध्य पर प्राप्त छवियों के लिए प्रभावी नहीं हो सकती है। दूसरा, संक्रमण की बहुलता का वायरल प्रेरित कैल्शियम संकेतों की आवृत्ति पर एक बाहरी प्रभाव पड़ता है। जैसे, प्रति क्षेत्र-दृश्य संक्रमित कोशिकाओं की संख्या का मूल्यांकन करना और उपचार की स्थिति में स्थिरता सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, प्रति क्षेत्र-दृश्य संक्रमित कोशिकाओं की संख्या के लिए सिग्नल आवृत्ति को सामान्य करने से त्रुटि को कम करने में मदद मिल सकती है। अंत में, जबकि हाल ही में विकसित एमएनजी-आधारित कैल्शियम संकेतक (एनईएमओ) कोशिकाओं40 में पूर्ण सीए2+ सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है, अधिकांश बायोसेंसर जैविक प्रणालियों के बारे में केवल सापेक्ष जानकारी देते हैं। इस प्रकार, पृष्ठभूमि घटाव, सामान्यीकरण, और एक नियंत्रण की तुलना महत्वपूर्ण हैं।

जबकि यह प्रोटोकॉल वायरल संक्रमण के दौरान कैल्शियम इमेजिंग पर केंद्रित है, सामान्य दृष्टिकोण आसानी से अनुकूलनीय है। वायरल संक्रमण को वैकल्पिक उपचार की स्थिति के लिए आसानी से प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और कई अलग-अलग सेलुलर मार्गों और प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए बायोसेंसर की बढ़ती लीटनी है। किसी भी प्रोटोकॉल अनुकूलन के साथ, जांचकर्ताओं को विश्लेषण को सबसे ऊपर रखना चाहिए, स्पष्ट, मात्रात्मक परिणामों के साथ प्रयोगों को डिजाइन करना चाहिए।

कुल मिलाकर, लाइव इमेजिंग बेजोड़ अस्थायी संकल्प प्रदान करता है, अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं के लक्षण वर्णन को बढ़ाता है। लाइव इमेजिंग प्रयोगों में ऑर्गेनोइड को शामिल करना इन प्रक्रियाओं के अवलोकन के लिए एक सच्चे-से-ऊतक, शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल में अनुमति देता है। हमें उम्मीद है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक डिजाइन और अनुकूलन की सुविधा प्रदान करता है, शोधकर्ताओं को सेल और ऊतक सिग्नलिंग के उपन्यास पहलुओं को उजागर करने के लिए सशक्त बनाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) से अनुदान R01DK115507 और R01AI158683 (पीआई: जेएम हाइसर) द्वारा समर्थित किया गया था। प्रशिक्षु समर्थन एनआईएच अनुदान F30DK131828 (पीआई: जेटी गेबर्ट), F31DK132942 (पीआई: एफजे स्क्रिबानो), और F32DK130288 (पीआई: केए एंगेविक) द्वारा प्रदान किया गया था। हम ऑर्गेनॉइड रखरखाव मीडिया प्रदान करने के लिए टेक्सास मेडिकल सेंटर पाचन रोग एंटॉइड कोर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
[Leu15]-Gastrin I Sigma-Aldrich G9145
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
1.5mL microcentrifuge tubes Fisherbrand 5408137
15mL conical tubes Thermofisher Scientific 0553859A
16% formaldehyde Thermofisher Scientific 28906
1M HEPES Gibco 15630080
1M HEPES Gibco 15630080
1X PBS Corning  21-040-CV
25 gauge needle Thermofisher Scientific 1482113D
A-83-01 Tocris 2939
ADP Sigma-Aldrich  A2754
Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
Antibiotic-antimycocytic  Gibco 15240062
Antibiotic-antimycotic  Gibco 15240062
B27 Supplement Gibco 17504-044
Bovine serum albumin FisherScientific  BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments Greiner 543979
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
DAPI Thermofisher Scientific D1306
EDTA Corning 46-034-CI
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fluorobrite Gibco A1896701
GlutaMAX  Gibco  35050079
GlutaMAX  Gibco  35050079
Human epidermal growth factor ProteinTech HZ-1326
Lentivirus VectorBuilder (variable)
Matrigel BD Biosceicen 356231/CB40230C
N2 Supplement Gibco 17502-048
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
NH4Cl Sigma-Aldrich  A9434
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates Thermofisher Scientific 142475
Polybrene MilliporeSigma TR1003G
SB202190 Sigma-Aldrich S70767
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red Thermofisher Scientific 12604013
Trypsin Worthington Biochemical NC9811754
Y-27632 Tocris 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
  2. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  3. Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
  4. Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
  5. Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
  6. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  7. Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
  8. Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
  9. Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
  10. Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
  11. Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
  14. Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
  15. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  16. Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
  17. Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
  18. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  19. Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
  20. Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
  21. Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
  22. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
  23. Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
  24. Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
  25. Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
  26. Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
  27. Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
  28. Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
  29. Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
  30. Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
  31. Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
  32. Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
  33. Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
  34. Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
  35. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
  36. Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
  37. Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
  38. Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
  39. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
  40. Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).

Tags

इस महीने JoVE में अंक 203
आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करके वायरस से संक्रमित मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड मोनोलेयर्स की लाइव कैल्शियम इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gebert, J. T., Scribano, F. J.,… More

Gebert, J. T., Scribano, F. J., Engevik, K. A., Hyser, J. M. Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (203), e66132, doi:10.3791/66132 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter