Summary
Aplysia تطوير الخلايا العصبية californica مخاريط النمو الكبير في الثقافة التي هي ممتازة لتصوير عالية الدقة في القدرة على الحركة مخروط النمو والتوجيه. هنا ، نقدم بروتوكول للتشريح والطلاء خلية من الخلايا العصبية Aplysia حقيبة فضلا عن انشاء غرفة للتصوير الخلايا الحية.
Abstract
المخاريط نمو الخلايا العصبية هي هياكل متحركة غاية في غيض من المحاور التي يمكن الكشف عن توجيه اشارات في البيئة وتنبيغ هذه المعلومات في حركة الاتجاه نحو الخلية المستهدفة المناسبة. لنفهم تماما كيف يتم نقل المعلومات على توجيه من سطح الخلية الأساسية للشبكات هيكل الخلية الحيوية ، يحتاج المرء إلى نموذج مناسب لنظام التصوير خلية حية من البروتين في الديناميات عالية الدقة الزمنية والمكانية. نموذجي مخاريط النمو الفقاريات هي صغيرة جدا لتحليل كمي F - أكتين وديناميات أنيبيب. الخلايا العصبية من californica البحر Aplysia الأرنب 5-10 مرات أكبر من الخلايا العصبية الفقاريات ، ويمكن بسهولة أن تبقى في درجة حرارة الغرفة وخلايا قوية للغاية والقياسات الفيزيائية الحيوية المجهرية. حددت المخاريط نموها جدا هيولي المناطق ونظام جيد وصفها هيكل الخلية. يمكن microinjected الهيئات الخلايا العصبية مع مجموعة متنوعة من التحقيقات لدراسة حركية النمو مخروط والتوجيه. في هذا البروتوكول أن نبرهن على إجراء تشريح العقدة في البطن ، والثقافة ، من الخلايا العصبية الخلية كيس وإنشاء غرفة للتصوير التصوير خلية حية من مخاريط النمو.
Protocol
الحلول
- L15 - ASW مستنبت الخلية (1L)
- 1 كيس من مسحوق L15
- إضافة 800 مل من O 2 H عالى النقاء
- كلوريد الصوديوم 400 ملم
- MgSO 4 27 ملي
- MgCl 2 28 ملي
- الجلوتامين L - 4 مم
- جنتاميسين 50 ميكروغرام / مل
- HEPES 5 مم.
- التكيف مع درجة الحموضة 7.9
- إضافة قطرة قطرة CaCl 2 9.3 ملم (إذا وقف رواسب)
- إضافة H 2 O عالى النقاء إلى 1 لتر
- الاختيار الأسمولية (950-1000 ملمول / كغ) مع مقياس التناضح (Wescor وضغط البخار # 5520)
- تصفية 0.22 ميكرون باستخدام الترشيح بالضغط الإيجابي وحدة (الفلاتر : SVGV010RS ميليبور)
- المحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر
- بولي - L - يسين (70-150 دينار كويتي) أبقى 200 ميكروغرام / مل محلول المخزون في العقيمة عالى النقاء H 2 O في -20 درجة مئوية
- 0.5 م 2 MgCl الحل
يوم 1 : تشريح العقدة Aplysia البطن
إعداد الحل تفارق الأنزيمية
- وزن 90-10 ملغ من انزيم Dispase (رثينجتون ، القط : LS02111) في أنبوب إيبندورف
- إضافة 900 ميكرولتر من L15 - ASW الثقافة المتوسطة ، و 100 ميكرولتر من العقيمة عالى النقاء H 2 O
- مزيج والمكان في درجة حرارة الغرفة (RT)
تشريح العقدة في البطن
- ملء الحقنة 50 مل مع 0.5 M الحل MgCl 2.
- تتخذ واحدا من الحيوان للدبابات ، والتعامل برفق لتفادي استجابة الحيوان الدفاع التحبير.
- ضع Aplysia على جانبها على لوحة التشريح (الستايروفوم المجلس) ، جنبا إلى جنب منقاري ، والحق الذيلية إلى اليسار.
- ادخال الإبرة في الحيوانات فقط وراء الرأس وحقن جميع MgCl 2 الحل في تجويف الجسم.
- بلطف فرك الحيوان لتفريق MgCl 2 حل جميع أنحاء تجويف الجسم ، انتظر لبضع دقائق للحيوان أن تكون مخدرة تماما.
- دبوس الرأس والذيل من الحيوان إلى لوحة تشريح مع اثنين من الإبر.
- استخدام ملقط لرفع الجلد ، وقطع طريق الجلد والعضلات مع مقص طبقة كبيرة نحو الرأس والذيل لإحداث فتحة كبيرة على الجانب.
- العثور على العقدة في البطن تحت المبيض مثل الفرشاة. استخدام ملقط لعقد الأعصاب التي تربط حوالي 1 سم في الجبهة من العقدة في البطن ، وقطع مع مقص تشريح الأعصاب في موقف الجبهة من وراء عقد ملقط العقدة في البطن.
- عقدة المكان إلى حل Dispase واحتضان ل15-16 ساعة عند 22 درجة مئوية باستخدام حمام مائي درجة الحرارة التي تسيطر عليها.
يوم 2 : التصفيحات كيس من الخلايا Aplysia
إعداد بولي يسين المغلفة coverslips
- مقعد في التدفق ، وإعداد ثلاثة أطباق بتري 35mm كما تعمل الأطباق لتشريح العقدة ، وملء لهم مع 4 - L15 المتوسطة ASW مل لكل منهما. نقل العقدة في البطن من الحل dispase إلى واحد من الأطباق العمل بعد 15.5 ساعة من عملية الهضم.
- باستخدام الملقط تأخذ حمض تنظيفها # 1.5 coverslips (22x22 ملم) المخزنة في الإيثانول ، إزالة الكحول وتعقيم coverslips المشتعلة التي لها فترة وجيزة على الموقد بنسن. السماح لهم بارد لفترة وجيزة قبل وضع coverslips في أطباق الثقافة.
- يعد طلاء غيض منحني عن طريق الانحناء تلميح الصفراء على الموقد بنسن (لهب لفترة وجيزة فقط لتجنب ذوبان البلاستيك!).
- إعداد القدر المناسب من 20 ميكروغرام / مل حل بولي يسين بواسطة تمييع 200 ميكروغرام / مل محلول المخزون العقيمة مع H 2 O عالى النقاء.
- تغطية كل ساترة مع 500 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل بولي يسين واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
- يغسل كل ساترة 3-5 مرات مع 500 ميكرولتر العقيمة عالى النقاء H O 2 لكل منهما.
- إزالة المياه من coverslips ؛ ملء كل طبق مع 4 مل من مستنبت - L15 ASW.
تفكك خلايا كيس
- تشريح تحت المجهر ، وقطع العقدة في نصف البطن باستخدام مقص تشريح وملقط تنظيفها سابقا مع الايثانول 95 ٪ (الشكل 1 سطر 1).
- على واحدة من نصف العقدة ، وقطع ما بين الكتلة الخلية كيس والخلايا hemiganglion (الشكل 1 سطر 2) ، وقطع العصب بعيدا ملحقات المتبقية على الجانب الآخر من خلايا كيس (الشكل 1 السطر 3). العمل على نصف العقدة في وقت واحد ؛ ترك النصف الآخر في صحن مطلي بينما يجري الخلايا من المجموعة الأولى.
- باستخدام اثنين ملقط (أو أحد ملقط ومقص تشريح) ، كتلة الخلية كيس الإفراج عن طريق دفع جانبا غمد النسيج الضام المحيطة الكتلة الخلية كيس. قطع النسيج الضام مع مقص تشريح إذا لزم الأمر. حذار لا للضغط واللمس الكتلة الخلية كيس الكثير خلال هذه العملية.
- عند إزالة أكثر من النسيج الضام ، ونقل بأعد AG الكتلة الخلية في طبق العمل الجديدة مع ترجيح كفة الأصفر عازمة في وقت سابق. يجب الحرص على عدم السماح لتكون الكتلة الخلية محاصرين داخل كيس غيض الأصفر أو عالقا في الهواء واجهة / متوسطة.
- متمزج الكتلة الصفراء مع تلميح لإزالة كيس الخلايا الفردية. القيام بذلك عن طريق pipetting الكتلة داخل وخارج الحافة. تبدأ قوى القص المنخفضة وزيادة القوة عند الحاجة. دوما استخدام القوة المطلوبة أدنى لإزالة الخلايا العصبية من دون قتل العديد من الخلايا.
- 3-5 جمع الخلايا حقيبة صحية ونقلها إلى طبق مع ساترة بولي يسين المغلفة. تجنب التقاط الخلايا الميتة (هم أسود / شفافة في الوسط) والضام الحطام الأنسجة.
- كرر الخطوة 6. وحول مكان الخلايا العصبية 15-25 يعيش في وسط كل ساترة. إذا تم نقل الخلايا الميتة أو الحطام وكذلك إزالة المواد غير المرغوب فيها عن طريق التقاط لأعلى أو لتهب بعيدا عن الخلايا السليمة. هذه العملية تستغرق حوالي 2-3 ساعات لكلتا المجموعتين.
- بمجرد الانتهاء إبقاء الأطباق الثقافة على مقاعد البدلاء تدفق ما لا يقل عن 2 ساعة على RT السماح الخلايا لنعلق (إبقاء مقعد قبالة تدفق منفاخ لتجنب الاهتزاز غير المرغوب فيه).
- ضع الأطباق في الحاضنة عند 14 درجة مئوية خلال الليل ، أو حتى استخدامها مرة أخرى. قد تتطور في مخاريط النمو 40-10 ساعة.
الشكل 1. التخطيطي للعقدة californica Aplysia البطن. خطوط ملونة تشير فيها الى خفض للحصول على كتل الخلية كيس.
اليوم 3 : إعداد غرفة للتصوير الخلايا الحية كيس Aplysia
التجمع من غرفة التصوير
- قبل استخدام الخلايا الحية لحقيبة تجارب التصوير الخلية ، وفحص الخلايا على المجهر منخفضة الطاقة. اذا لم تتطور خلايا المخاريط النمو الصحي ، وإمدادات جديدة والمتوسطة في إجازة لمدة 1-2 ساعات RT.
- لتوريد لوحات متوسطة مع L15 - ASW العذبة ، وإزالة نصف (~ 2ml) من متوسط العمر مع خط فراغ ، وإضافة 2 مل من جديد L15 - ASW المتوسطة في طبق بتري. فمن المهم عدم إزالة كافة المتوسطة من الطبق في كل مرة ، حيث سيؤدي ذلك إلى إزالة الخلايا من ساترة.
- التصوير الخلية كيس ، ونحن التجمع two coverslips واثنين من الفواصل البلاستيكية في غرفة التصوير مثل شطيرة. هو قطع رأس ساترة في شطيرة أقصر التي تتيح تبادل سهل من المتوسط والكواشف. خلال التجمع ، ينبغي المغمورة coverslips مع الخلايا في حقيبة تعلق L15 - ASW المتوسطة في جميع الأوقات لمنع الخلايا من طرد.
- لإعداد غرفة ، وقطع من الجانب الأيمن لملم coverslips # 1 22x22 مع قلم الماس (قطع الزجاج) والحاكم 2mm و~.
- استخدام حقنة 1 مل ، وتطبيق عالية الشحوم فراغ لهما وجهان لأقصر ساترة ، والفواصل البلاستيكية نعلق على كل جانب. تطبيق الشحوم فراغ إلى الأعلى كل من الفواصل.
- اقلب ساترة والتجمع الفاصل ، ووضع في طبق بتري تحتوي على خلايا كيس على ساترة. محاذاة واضغط بلطف إلى أسفل إلى أعلى إلى عصا ساترة ساترة القاع مع نهاية عكس اثنين من Q - النصائح.
- باستخدام ملقط ، ترفع بلطف التجمع شطيرة من طبق بتري دون المتوسطة تسرب. محاذاة coverslips اثنين ، إذا لزم الأمر ، وتمحو المتوسطة الزائدة مع Kimwipe. وضع شطيرة على الجزء السفلي من حامل الشرائح المجهر وأرفق مع تغطية الرعاية باستخدام مقاطع.
- مست نظيفة وسط الجزء العلوي من الشطيرة مع Q - نصائح في نظافة الزجاج (يتم استخدام البريق ونظافة الزجاج). يجف بسرعة قبالة منظف الزجاج مع وجافة second Q - تلميح لتجنب خطوط متتالية. تفعل الشيء نفسه بالنسبة للساترة القاع. coverslips نظيفة خالية من خطوط متتالية هامة للتصوير عالية الجودة.
حقيبة الخلايا على المجهر
منذ الثقافات Aplysia الخلية العصبية هي في حقيبة منخفض الكثافة ، فمن الأفضل إذا كان الإعداد الخاص وظائف المجهر لتحديد المواقع لتسهيل مرحلة الانتقال بين الخلايا. يمكن الخلايا بسهولة في حقيبة أبقى RT لعدة ساعات على خشبة المسرح خلال تجارب التصوير. تبادل المتوسطة بشكل دوري لتجنب التبخر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلية العصبية Aplysia حقيبة توفير المصل خالية من الخلايا العصبية ثقافة النظام مع الخلايا العصبية غير قليلة جدا. هذه الخلايا العصبية شكل مخاريط نمو كبيرة جدا مناسبة لمعالجة عدد من المسائل الهامة الخلية البيولوجية. يمكن أن الخلايا العصبية الخلية كيس يمكن بسهولة التلاعب بها وتصويرها في درجة حرارة الغرفة على مدى عدة ساعات. باستخدام الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM) واحد يمكن تحليل كمي المعلمات مختلف أكتين - F والبلمرة أنيبيب وديناميات إزفاء. هذه الأدوات التصوير جنبا إلى جنب مع المعلومات الصادرة مؤخرا Aplysia الجينوم فضلا عن تحسين تقنيات التعبير جعل هذه الخلايا العصبية القوية نظام نموذجي لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية من نمو الخلايا العصبية الحركية مخروط والتوجيه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نشكر Maneri ريان (Oystercatcher إنتاجات ، ذ م م) للتصوير الداخلي لدينا ورودني ماكفيل (قسم العلوم البيولوجية ، جامعة بوردو) للمساعدة في تحرير الفيديو تشريح. ويدعم البحوث في المختبر سوتر من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 NS049233) ومركز العلوم البيولوجية بيندلي في جامعة بوردو في DMS
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 glass coverslips 22x22 mm | Tool | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22x22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington Biochemical | LS02111 |
References
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
