Summary
Aplysia californica의 뉴런 성장 콘 운동성 및지도 고해상도 이미지를위한 최고의 아르 문화의 큰 성장 콘을 개발. 여기서 우리는 절개 및 Aplysia 가방 셀 뉴런의 도금뿐만 아니라 라이브 셀 이미징을위한 챔버를 설정을위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
의 연결을 성장 콘은 환경에서지도 신호를 감지하고 적절한 대상 세포쪽으로 방향 움직임에이 정보를 transduce 수 axons의 끝에 높은 운동성이있는 구조입니다. 완벽하게지도 정보가 기본 동적 cytoskeletal 네트워크에 세포 표면에서 전달하는 방법 이해하기 위해서, 하나는 높은 시간적 및 공간적 해상도에서 단백질 역학 라이브 셀 이미징에 적합한 모델 시스템이 필요합니다. 전형적인 척추 성장 콘은 양적 F - 굴지와 미세 소관의 역학을 분석하는 너무 작은 수 있습니다. 군소 Aplysia californica에서 뉴런은 뉴런 척추보다 5-10 배 큰 쉽게 실온에서 보관 수 있으며, 미세 조작 및 biophysical 측정을 매우 강력한 세포 수 있습니다. 그들의 성장 콘은 매우 세포질 지역과 잘 설명 cytoskeletal 시스템을 정의했습니다. 의 연결을 세포 기관은 성장 콘 운동성 및지도를 공부에 대한 프로브의 다양한 microinjected 수 있습니다. 현재의 프로토콜에서는 복부 신경절, 가방 셀 뉴런의 문화와 성장 콘 라이브 셀 이미징에 대한 이미징 챔버를 설정 해부를위한 절차를 설명합니다.
Protocol
솔루션
- L15 - ASW의 세포 배양 매체 (일리터)
- L15 가루 1 봉지
- H 2 O ultrapure 800 ML을 추가
- NaCl 400 MM
- MgSO 4 27 MM
- MgCl 2 28 MM
- L - 글루타민 4 MM
- Gentamicin 50 μg / ML
- HEPES 5 MM
- 산도 7.9로 조정
- (precipitates 경우 스톱) 드롭 CaCl 2 9.3 MM을 들러 추가
- 1리터에 H 2 O ultrapure 추가
- osmometer (증기압, Wescor # 5520)와 osmolarity (950-1000 mmol / kg)를 확인
- 긍정적인 압력 여과 장치 (Millipore의 SVGV010RS 필터)를 사용하여 필터 0.22 μm의
- 최대 1 개월 4 ° C에 보관
- 폴리 - L - 라이신은 (70-150 KD) 200 살균 H 2 O ultrapure에 μg / ML 주식 솔루션은 -20 O C에서 보관
- 0.5 M MgCl 2 용액
1 일 : Aplysia 복부 신경절의 해부
효소 분리 솔루션의 준비
- Eppendorf 튜브에 : Dispase 효소 (LS02111 워싱턴, 고양이)의 90-10 MG를 달다
- L15 - ASW 문화 매체 900 μl 및 살균 H 2 O ultrapure 100 μl 추가
- 실온 (RT)에서 혼합 및 장소
복부 신경절의 해부
- 0.5 M MgCl 2 솔루션으로 50 ML의 주사기를 채우십시오.
- 탱크에서 한 동물을, 동물의 inking 방어 반응을 피하기 위해 부드럽게 처리할 수 있습니다.
- 왼쪽으로 오른쪽, 꼬리쪽으로 절개 보드의 측면에 Aplysia (스티로폼 보드), 주동이의 옆에 놓습니다.
- 그냥 머리 뒤에 동물에 바늘을 삽입하고 뱃속에 모든 MgCl 2 솔루션을 주입.
- 부드럽게 뱃속 내내 MgCl 2 솔루션을 해산하기 위해 동물을 문질러 완전히 anaesthetized하는 동물을위한 몇 분 동안 기다립니다.
- 이 바늘로 해부 보드 동물의 머리와 꼬리를 핀.
- 측면에 큰 열기를 만들기 위해 머리와 꼬리를 향해 큰 가위로 피부와 근육의 계층을 통해 잘라내기, 피부를 리프트에 집게를 사용하십시오.
- 브러시와 같은 난소에서 복부 신경절을 찾아보십시오. 복부 신경절 앞에서 1cm에 대한 연결 신경 잡아 집게를 사용하여, 포셉 보관 위치 앞에와 복부 신경절 뒤에 해부 가위로 신경을 절단.
- 22 Dispase 솔루션 및 15-16 H에 대한 부화에 플레이스 신경절 ° C 온도 제어 물을 욕조를 사용합니다.
일 2 : Aplysia 가방 세포의 도금
폴리 - 라이신 - 코팅 coverslips 준비
- 흐름 벤치에서, 4 ML L15 - ASW 매체 각을 작성, 신경절의 해부를 위해 요리를 작업을 피해 3 35mm 배양 접시를 준비합니다. 소화의 15.5 시간 후 작업 요리 중 하나 dispase 솔루션에서 복부 신경절을 전송합니다.
- 포셉 취할 사용하면 산성 - 청소 # 1.5 coverslips (22x22 mm)는 에탄올에 저장된, 알코올을 제거하고 알콜 램프를 통해 간단히 그들을 불타는하여 coverslips을 소독. 문화 요리에 coverslips를 삽입하기 전에 그들이 잠시 더위 좀 식히자.
- 알콜 램프에 비해 노란색 팁 (불꽃은 간단히 플라스틱의 용융을 피하기 위해를!) 굴곡하여 곡선 도금 팁을 준비합니다.
- 무균 H 2 O ultrapure 200 μg / ML 주식 솔루션을 diluting 20 μg / ML - 폴리 리신 솔루션의 적절한 금액을 준비합니다.
- 20 μg / ML - 폴리 리신과 RT에서 20 분에 대해 품어 500 μl 각 coverslip을 커버.
- 500 μl 무균 H 2 O ultrapure 각 각 coverslip 3-5 번 씻으십시오.
- coverslips 물을 제거, L15 - ASW 문화 매체 4 ML 각 요리를 입력합니다.
가방 세포의 분리
- 해부 현미경에서 이전에 95 %의 에탄올 (그림 1 라인 1) 청소 이분의 일 사용 해부 가위와 집게의 복부 신경절를 잘라.
- 가방 전지 클러스터 hemiganglion 세포 (그림 1 2 호선) 사이 컷 신경절, 그리고 가방 세포의 반대편에 남아있는 신경 확장 (그림 1 라인 3) 버려야 중 절반에. 한 번에 신경절의 반은 작업, 첫 번째 클러스터의 세포가 도금되는 동안 접시에있는 다른 반쪽을 두십시오.
- 이 포셉 (또는 한 포셉 및 해부 가위), 가방 전지 클러스터를 둘러싼 결합 조직 칼집을 별도로 추진하여 릴리스 가방 셀 클러스터를 사용합니다. 필요한 경우 해부 가위 들고 도망 결합 조직을 잘라. 이 과정에서 당기 너무 많은 가방 셀 클러스터를 만지지 않도록 조심하십시오.
- 대부분 결합 조직의 제거되면 B를 전송벤트 노란 팁으로 새 작업을 그릇에 AG 전지 클러스터는 이전 준비. 가방 전지 클러스터가 노란색 팁 안에 갇혀 또는 공기 / 미디어 인터페이스에 붙어있을 수 있도록하지 않도록주의하십시오.
- 개인 가방 세포를 제거하는 노란색 팁으로 클러스터를 씹다. 팁에서 퇴원 클러스터를 pipetting하여이 작업을 수행합니다. 낮은 전단 병력과 함께 시작하여 필요에 따라 힘을 향상시킬 수 있습니다. 항상 너무 많은 세포를 죽이지 않고 뉴런을 제거하는 데 필요한 최저 힘을 사용합니다.
- 3-5 건강한 가방 세포를 수집하고 쓰임새 라이신 - 코팅 coverslip있는 요리로 전송할 수 있습니다. 죽은 세포 (그들은 중앙에 검은 / 투명) 및 결합 조직의 파편을 채취하지 마십시오.
- 6 단계를 반복합니다. 각 coverslip의 중심에 15-25 살 뉴런에 대한 곳. 죽은 세포이나 먼지가 잘으로 전송하는 경우, 그것을 수확하거나 건강한 세포에서 멀리 불어하여 원치 않는 물질을 제거합니다. 이 과정은 두 클러스터에 대한 2-3시간 걸립니다.
- 일단 (원치 않는 진동을 피하기 위해 해제 흐름 벤치 송풍기 유지) 세포를 첨부할 수 있도록 RT 적어도 2 시간 흐름 벤치에서 문화 요리를 보관 마쳤다.
- ° C 하룻밤, 또는 추가를 사용하기 전까지 14에서 인큐베이터에 요리를 놓습니다. 성장 원뿔은 40-10시간에서 개발 있습니다.
그림 1. Aplysia californica 복부 신경절의 개략도. 가방 전지 클러스터를 얻기 위해 상처 어디에 컬러 라인 나타냅니다.
3 일 : Aplysia 가방 세포의 라이브 영상을위한 챔버 설정
이미지 챔버 조립
- 라이브 셀 이미징 실험을위한 가방 세포를 사용하기 전에, 낮은 전력 현미경에서 세포를 검사합니다. 세포가 건강하게 성장 콘을 개발하지 않은 경우, 1-2 시간 동안 RT에서 신선한 매체와 휴가를 제공합니다.
- 신선한 L15 - ASW 매체와 번호판을 공급하기 위해 진공 라인 오래된 매체의 절반 (~ 2ml)를 제거하고 새로운 2 ML L15 - ASW의 배양 접시 당 매체를 추가하십시오. 이 coverslip에서 세포를 제거하므로 완전히 한꺼번에 접시에서 모든 매체를 제거하지 않는 것이 중요합니다.
- 가방 세포 이미징을 위해, 우리는 샌드위치와 같은 영상 챔버의 두 coverslips 두 플라스틱 스페이서를 조립. 샌드위치의 맨 coverslip는 중간 및 시약을 쉽게 교환할 수 있도록 짧은 컷입니다. 조립하는 동안 연결된 가방 세포와 coverslips는 dislodging에서 세포를 방지하기 위해 항상 L15 - ASW 매체에 빠져들해야합니다.
- 챔버를 준비하려면, 잘라 ~ 2mm를 다이아몬드 펜 (유리 커터)와 통치자와 # 1 coverslips 22x22 mm의 오른쪽에서.
- 1 ML의 주사기를 사용하여 짧은 coverslip의 양면 높은 진공 그리스를 적용하고, 각 측면에 플라스틱 스페이서를 연결합니다. 두 스페이서의 상단에 진공 그리스를 적용합니다.
- coverglass에 가방 세포를 포함하는 페트리 접시에 coverslip와 스페이서 조립, 장소 반전. 정렬 부드럽게이 Q - 팁 리버스 엔드와 하단 coverslip 맨 coverslip을 막대기 아래로 누르십시오.
- 포셉을 사용하여 부드럽게 밖으로 누출 매체없이는 배양 접시의 샌드위치 조립을 리프트. 필요한 경우, 두 coverslips를 정렬하고, Kimwipe로 초과 매체를 닦아. 현미경 슬라이드 홀더의 하단 부분에 샌드위치를 장소와 클립을 사용하여주의 덮개를 부착합니다.
- Q - 팁을 샌드위치의 맨 위에 측면의 중심을 깨끗이 유리 청소기 ( '스파클'은 유리 청소기로 사용됩니다)에 dabbed. 신속 리크 라인을 피하기 위해 두 번째 건조 Q - 팁과 유리 청소기를 건조. 하단 coverslip에 대해 동일한 작업을 수행. 리크 라인 무료 깨끗한 coverslips는 고품질의 영상을 위해 중요합니다.
현미경에 가방 세포
Aplysia 가방 세포의 연결을 문화가 저밀도에 있기 때문에 귀하의 현미경 설정은 세포 사이를 전환할 촉진 무대 위치 기능을 가지고있다면, 그것은 최고입니다. 가방 세포는 쉽게 이미징 실험을하는 동안 무대에서 몇 시간 동안 RT에 보관하실 수 있습니다. 증발을 방지하기 위해 정기적으로 매체를 교환.
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Discussion
Aplysia 가방 세포 뉴런은 거의 비의 연결을 세포와 혈청의 연결이없는 세포 배양 시스템을 제공합니다. 이러한 뉴런 중요한 세포 생물 학적 질문 숫자를 해결하기 위해 적합한 매우 큰 성장 원뿔을 형성합니다. 가방 세포 뉴런 쉽게 몇 시간 동안 조작하고 실온에서 몇 군데하실 수 있습니다. 형광등을 사용하면 하나 양적 F - 굴지와 미세 소관의 중합 및 translocation 역학의 다양한 매개 변수를 분석할 수 현미경 (FSM)을 스페클. 최근 출시된 Aplysia 게놈 정보뿐만 아니라 개선 표현 기법과 함께 이러한 이미징 도구의 연결을 성장 콘 운동성 및지도 분자 및 세포 메커니즘을 공부하고 이러한 뉴런은 강력한 모델 시스템을합니다.
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Acknowledgments
우리는 해부 비디오 편집과 지원을위한 절차와 로드니 맥페일을 (생물 과학학과, 퍼듀 대학교) 촬영을 위해 라이언 마네리을 (오이스터캐쳐 프로덕션, LLC) 감사드립니다. 수터 실험실 연구는 DMS에 퍼듀 대학에서 NIH (R01 NS049233)와 빈들리 Bioscience 센터에서 기금에 의해 지원됩니다
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 glass coverslips 22x22 mm | Tool | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22x22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington Biochemical | LS02111 |
References
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
