Summary
Aplysia californica Neuronen entwickeln große Wachstum Kegel in Kultur, die sich hervorragend für hochauflösende Bildgebung des Wachstums Kegel Motilität und Führung sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Präparation und Beschichtung von Aplysia Tasche Zelle Neuronen sowie für die Einrichtung einer Kammer für Live Cell Imaging.
Abstract
Neuronale Wachstum Kegel sind die sehr beweglichen Strukturen an der Spitze der Axone, die Führung cues in der Umgebung zu erkennen und kann transduzieren diese Informationen in gerichtete Bewegung in Richtung der entsprechenden Zielzelle. Um vollständig zu verstehen, wie Führung Informationen von der Zelloberfläche an die zugrunde liegende Dynamik des Zytoskeletts Netzwerke übertragen, benötigt man ein Modell-System eignet sich für Live Cell Imaging von Protein Dynamik bei hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung. Typische Wirbeltiere Wachstum Kegel sind zu klein, um quantitativ zu analysieren F-Aktin und Mikrotubuli-Dynamik. Neuronen aus dem Seehasen Aplysia californica sind 5-10 mal größer als Wirbeltiere Neuronen, kann leicht bei Raumtemperatur aufbewahrt werden und sind sehr robust Zellen für Mikromanipulation und biophysikalische Messungen. Ihr Wachstum Kegel sehr zytoplasmatischen Regionen und eine gut beschriebene Zytoskelett-System definiert. Die neuronalen Zellkörpern können mit einer Vielzahl von Sonden zur Untersuchung von Wachstum Kegel Motilität und Führung mikroinjiziert werden. In der vorliegenden Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Präparation des Abdominalganglion, Kultur bag Zelle Neuronen und die Einrichtung eines bildgebenden Kammer für Live Cell Imaging Wachstum Kegel.
Protocol
Lösungen
- L15-ASW Zellkulturmedium (1l)
- 1 Beutel Pulver L15
- Add 800 ml H 2 O Reinstwasser
- NaCl 400 mM
- MgSO 4 27 mM
- MgCl 2 28 mM
- L-Glutamin 4 mM
- Gentamicin 50 pg / ml
- HEPES 5 mM
- Passen Sie auf pH 7,9
- Add Tropfen für Tropfen CaCl 2 9,3 mm (Stopp, wenn Niederschläge)
- Add H 2 O Reinstwasser auf 1 l
- Überprüfen Sie Osmolarität (950-1000 mmol / kg) mit Osmometer (Dampfdruck, Wescor # 5520)
- Filter 0,22 um mit einer positiven Druckfiltration Einheit (Filter: Millipore SVGV010RS)
- Lagerung bei 4 ° C für bis zu 1 Monat
- Poly-L-Lysin (70-150 kD) 200 pg / ml Stammlösung in sterilem H 2 O Reinstwasser bei -20 o C
- 0,5 M MgCl 2-Lösung
Tag 1: Präparation Aplysia Abdominalganglion
Vorbereitung der enzymatischen Spaltung Lösung
- Wiegen 9-10 mg der Dispase Enzym (Worthington, Cat: LS02111) in ein Eppendorf-Röhrchen
- Add 900 ul L15-ASW Kulturmedium und 100 ul sterilem H 2 O Reinstwasser
- Mix und bei Raumtemperatur (RT)
Präparation Abdominalganglion
- Füllen Sie eine 50 ml Spritze mit 0,5 M MgCl 2-Lösung.
- Nehmen Sie ein Tier aus dem Tank, sanft behandeln, um Tieres Farbwerk Abwehrreaktion zu vermeiden.
- Legen Sie die Aplysia auf seiner Seite auf eine Dissektion Bord (Styropor board), rostral Seite auf die rechte, kaudalen Seite nach links.
- Legen Sie die Nadel in Tier unmittelbar hinter dem Kopf und injizieren alle MgCl 2-Lösung in die Körperhöhle.
- Reiben Sie das Tier auf die MgCl 2-Lösung im gesamten Körperhöhle zerstreuen, für ein paar Minuten für das Tier warten, um vollständig betäubt.
- Pin den Kopf und Schwanz des Tieres, um die Zerlegung Board mit zwei Nadeln.
- Verwenden einer Pinzette die Haut anheben, Schnitt durch Haut und Muskel-Schicht mit großen Scheren auf den Kopf und Schwanz, um eine große Öffnung an der Seite zu machen.
- Finden Sie die Abdominalganglion unter der Bürste wie Eierstock. Verwenden einer Pinzette, um den Anschluss Nerven ca. 1 cm vor dem Abdominalganglion halten, schneiden Sie die Nerven mit Dissektion Schere vor der Zange Halteposition und hinter dem Abdominalganglion.
- Legen Sie Ganglion in die Dispase-Lösung und Inkubation für den 15./16 h bei 22 ° C mit einer Temperatur-kontrollierten Wasserbad.
Tag 2: Beschichtung von Aplysia Tasche Zellen
Herstellung von Poly-Lysin-beschichtete Deckgläschen
- In einem Fluss Bank, bereiten drei 35mm Petrischalen als Arbeitszeit Gerichte für die Präparation des Ganglion, die sie mit 4 ml L15-ASW Medium jeder. Übertragen Sie die Abdominalganglion aus der Dispase Lösung für eine der Arbeitssprachen Gerichte nach 15,5 Stunden der Verdauung.
- Mit einer Pinzette zu nehmen Säure gereinigt # 1.5 Deckgläser (22x22 mm) in Ethanol gelagert, entfernen Sie Alkohol und sterilisieren Deckgläser durch Abflammen sie kurz über Bunsenbrenner. Lassen Sie sie kurz abkühlen, bevor Sie die Deckgläser in den Kulturschalen.
- Bereiten Sie eine gebogene Spitze Beschichtung durch Biegen einer gelben Spitze über dem Bunsenbrenner (Flamme nur kurz zum Schmelzen von Kunststoff zu vermeiden!).
- Bereiten Sie entsprechende Menge von 20 ug / ml Poly-Lysin-Lösung durch Verdünnung 200 ug / ml Stammlösung mit sterilem H 2 O Reinstwasser.
- Cover jede Deckglas mit 500 ul 20 pg / ml Poly-Lysin und inkubieren für 20 Minuten bei RT.
- Waschen Sie jeden Deckglas 3-5 mal mit 500 ul sterilem H 2 O Reinstwasser jeder.
- Entfernen von Wasser aus Deckgläser; füllen jedes Gericht mit 4 ml L15-ASW Kulturmedium.
Die Dissoziation von bag-Zellen
- Unter einem Dissektionsmikroskop, schneiden Sie die Abdominalganglion in Hälfte mit Dissektion Schere und Pinzette zuvor mit 95% igem Ethanol (Abbildung 1 Zeile 1) gereinigt.
- Auf der einen Hälfte des Ganglion, zwischen Sack Zellverband und die hemiganglion Zellen (Abbildung 1 Zeile 2) geschnitten, und schneiden übrigen Nerven-Erweiterungen auf der anderen Seite der Tasche Zellen (Abbildung 1 Zeile 3). Die Arbeit auf der einen Hälfte des Ganglion zu einer Zeit, lassen Sie die andere Hälfte in die Schüssel, während Zellen, die aus ersten Cluster sind vergoldet werden.
- Mit zwei Zangen (oder einer Pinzette und Schere Dissektion), Release Bag Zellverband, indem Sie neben dem Bindegewebe um die Tasche Zellverband. Cut entfernt Bindegewebe mit Dissektion Schere, wenn nötig. Vorsicht nicht zu quetschen und berühren Sie die Tasche Zellverband zu viel während dieses Prozesses.
- Wenn die meisten der Bindegewebe entfernt ist, übertragen Sie die bag Zellklumpen in einer neuen Arbeitsgruppe Schale mit dem gebogenen gelben Spitze vorbereitet früher. Seien Sie vorsichtig, dass keine der Tasche Zellhaufen innerhalb der gelben Spitze eingefangen werden oder stecken in der Luft / Medium-Schnittstelle.
- Man reibt den Cluster mit gelber Spitze, um einzelne Tüte Zellen zu entfernen. Tun Sie dies durch Pipettieren der Cluster in und aus der Spitze. Beginnen Sie mit geringen Scherkräften und erhöhen Kraft nach Bedarf. Verwenden Sie immer den niedrigsten Kraft benötigt, um Neuronen, ohne töten zu viele Zellen zu entfernen.
- Sammeln Sie 3-5 gesunde Tasche Zellen und übertragen Sie sie auf einen Teller mit einem Poly-Lysin-beschichtete Deckglas. Vermeiden Abholung toten Zellen (sie sind schwarz / transparent in der Mitte) und Bindegewebe Schutt.
- Wiederholen Sie Schritt 6. Ort und ca. 15-25 Live-Neuronen in der Mitte jedes Deckglas. Wenn tote Zellen oder Schmutz sowie transferiert werden, entfernen Sie die unerwünschten Material, indem man es nach oben oder bläst es weg von den gesunden Zellen. Dieser Vorgang dauert ca. 2-3 Stunden für beide Cluster.
- Sobald Sie fertig sind halten die Kulturschalen auf der Flow Bench für mindestens 2 Stunden bei RT, damit Zellen zu befestigen (keep Flow Bench Gebläse ausschalten, um unerwünschte Schwingungen zu vermeiden).
- Die Schalen werden in einem Brutschrank bei 14 ° C über Nacht oder bis zur weiteren Verwendung. Wachstum Kegel kann in 4-10 Stunden zu entwickeln.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Aplysia californica Abdominalganglion. Farbe Linien zeigen, wo zu schneiden, um bag Zellhaufen zu erhalten.
Tag 3: Einrichten Kammer für die Live-Darstellung von Aplysia Tasche Zellen
Versammlung der Bildgebung Kammer
- Vor der Verwendung Tasche Zellen für Live Cell Imaging Experimenten untersuchen Zellen auf einem Low-Power-Mikroskop. Wenn Zellen nicht ein gesundes Wachstum Kegel entwickelt haben, liefern frisches Medium und lassen bei RT für 1-2 Stunden.
- Zur Versorgung Platten mit frischem L15-ASW Medium, entfernen Sie die Hälfte (~ 2 ml) des alten Mediums mit einer Vakuum-Linie, und 2 ml der neuen L15-ASW Medium pro Petrischale. Es ist wichtig, nicht vollständig entfernen Medium aus der Schale auf einmal, da diese Zellen aus dem Deckglas entfernt werden.
- Für Beutel cell imaging, montieren wir zwei Deckgläsern und zwei Abstandhalter aus Kunststoff in einer Sandwich-Imaging-Kammer. Die obere Deckglas in das Sandwich ist kürzer geschnitten, um den einfachen Austausch von Medium und Reagenzien ermöglichen. Bei der Montage sollte Deckgläser mit Tasche Zellen befestigt in L15-ASW Medium jederzeit getaucht werden, um Zellen aus Verdrängen zu verhindern.
- Zur Vorbereitung der Kammer, abgeschnitten ~ 2mm von der rechten Seite eines # 1 Deckgläser 22x22 mm mit Diamant-Stift (Glasschneider) und der Herrscher.
- Mit einer 1 ml Spritze, gelten Hochvakuumfett zu beiden Seiten der kürzeren Deckglas, und befestigen Sie Abstandhalter aus Kunststoff auf beiden Seiten. Bewerben Vakuumfett an die Spitze der beiden Abstandshalter.
- Kehren Sie die Deckglas und spacer Montage, und setzen in Petrischale mit Tasche Zellen auf einem Deckglas. Richten und sanft nach unten drücken, um Top-Deckglas nach unten Deckglas-Stick mit dem hinteren Ende von zwei Q-Tips.
- Mit einer Pinzette vorsichtig aus Sandwich-Montage aus der Petrischale, ohne das Medium austritt. Richten Sie die beiden Deckgläser, falls erforderlich, und wischen Sie überschüssiges Medium mit einem Kimwipe. Legen Sie das Sandwich auf den unteren Teil der Objektträger Halter und befestigen Sie den Deckel vorsichtig mit Clips.
- Reinigen Sie die Mitte der oberen Seite des Sandwich mit Q-Tips abgetupft in Glasreiniger (Sparkle ist als Glasreiniger verwendet). Trocknen schnell aus dem Glasreiniger mit einem zweiten, trockenen Q-Tip, der Streifen Linien zu vermeiden. Machen Sie dasselbe für die untere Deckglas. Saubere Deckgläser frei von Streifen Linien sind für hohe Bildqualität wichtig.
Bag-Zellen unter dem Mikroskop
Da Aplysia Tasche Zelle neuronalen Kulturen mit geringer Dichte sind, ist es am besten, wenn Ihr Mikroskop Setup Tischpositionierarbeitsweg Funktionen zur Erleichterung der Wechsel zwischen den Zellen. Bag-Zellen können leicht bei RT für mehrere Stunden auf der Bühne gehalten während der Bildgebung Experimente. Austausch des Mediums in regelmäßigen Abständen, um Verdunstung zu vermeiden.
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Discussion
Aplysia Tasche Zelle Neuronen eine serumfreien neuronalen Zellkultur-System mit sehr wenigen nicht-neuronalen Zellen. Diese Neuronen bilden sehr große Wachstum Kegel geeignet, um eine Reihe von wichtigen zellbiologischen Fragestellungen zu beantworten. Bag Zelle Neuronen können leicht manipuliert werden und abgebildet bei Raumtemperatur über mehrere Stunden. Unter Verwendung von fluoreszierenden Speckle Microscopy (FSM) kann man quantitativ zu analysieren die verschiedenen Parameter des F-Aktin und Mikrotubuli-Polymerisation und Translokation Dynamik. Diese bildgebenden Verfahren zusammen mit dem kürzlich veröffentlichten Aplysia Genom Informationen sowie eine verbesserte Expression Techniken machen diese Neuronen eine leistungsfähige Modellsystem für die Erforschung der molekularen und zellulären Mechanismen der neuronalen Wachstumskegel Motilität und Beratung.
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Acknowledgments
Wir möchten Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) für die Dreharbeiten unsere Verfahren und Rodney McPhail (Department of Biological Sciences, Purdue University) für die Unterstützung bei der Bearbeitung der Dissektion Video danken. Die Forschung im Labor Suter wird durch Zuschüsse aus dem NIH (R01 NS049233) und die Bindley Bioscience-Center an der Purdue University, um DMS unterstützt
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 glass coverslips 22x22 mm | Tool | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22x22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington Biochemical | LS02111 |
References
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
