Summary
Aplysia californica neuroni sviluppare grandi coni di crescita nella cultura che sono eccellenti per imaging ad alta risoluzione della motilità del cono di crescita e di orientamento. Qui, vi presentiamo un protocollo per la dissezione e la placcatura dei neuroni borsa cellule Aplysia così come per la creazione di una camera per l'imaging cellulare dal vivo.
Abstract
Coni di crescita neuronali sono strutture altamente mobili sulla punta degli assoni in grado di rilevare segnali di orientamento per l'ambiente e trasducono queste informazioni in movimento direzionale verso la cellula bersaglio appropriato. Per comprendere pienamente come le informazioni di guida viene trasmessa dalla superficie cellulare al connesse reti dinamica del citoscheletro, si ha la necessità di un sistema modello adatto per l'imaging di cellule in vivo di proteine dinamica ad alta risoluzione temporale e spaziale. Tipici coni di crescita vertebrati sono troppo piccoli per analizzare quantitativamente F-actina e la dinamica dei microtubuli. I neuroni dalla lepre mare Aplysia californica sono 5-10 volte più grande di neuroni vertebrati, può facilmente essere conservato a temperatura ambiente e sono cellule molto robusto per micromanipolazione e misure biofisici. I loro coni di crescita sono ben definite regioni citoplasmatiche e ben descritto sistema del citoscheletro. I corpi delle cellule neuronali possono essere microiniettati con una varietà di sonde per studiare la motilità del cono di crescita e di orientamento. Nel presente protocollo si dimostra una procedura per la dissezione del ganglio addominale, la cultura dei neuroni delle cellule borsa e la creazione di una camera di imaging per l'imaging cellulare dal vivo di coni di crescita.
Protocol
Soluzioni
- L15-ASW terreno di coltura cellulare (1l)
- 1 bustina di polvere L15
- aggiungere 800 ml di H 2 O ultrapura
- NaCl 400 mM
- MgSO 4 27 mM
- MgCl 2 28 mM
- L-Glutammina 4 mM
- Gentamicina 50 mg / ml
- HEPES 5 mM
- Regolare a pH 7,9
- Aggiungere goccia a goccia CaCl 2 9,3 mm (arresto se precipitati)
- Aggiungi H 2 O ultrapura a 1 l
- Controllare osmolarità (950-1000 mg / kg) con osmometer (pressione di vapore, Wescor # 5520)
- Filtro 0,22 micron con una positiva unità di filtrazione a pressione (Filtri: SVGV010RS Millipore)
- Conservare a 4 ° C fino a 1 mese
- Poli-L-lisina (70-150 kD) 200 mg / ml di soluzione in magazzino sterile H 2 O ultrapura conservato a -20 ° C
- 0,5 M soluzione di MgCl 2
1 ° giorno: dissezione di Aplysia ganglio addominale
Preparazione della soluzione enzimatica dissociazione
- Pesare 9-10 mg di dispasi enzima (Worthington, Cat: LS02111) in una provetta Eppendorf
- Aggiungere 900 ml di L15-ASW terreno di coltura, e 100 ml di H 2 O sterile ultrapura
- Mescolare e posto a temperatura ambiente (RT)
Dissezione di ganglio addominale
- Riempire una siringa da 50 ml con 0,5 M MgCl 2 soluzione.
- Prendere un animale da serbatoio, trattata con delicatezza per evitare la difesa dell'animale risposta inchiostrazione.
- Posizionare il Aplysia su un lato su una tavola di dissezione (Styrofoam bordo), parte rostrale a destra, lato caudale a sinistra.
- Inserire l'ago nel animale appena dietro la testa e iniettare tutta MgCl 2 soluzione nella cavità del corpo.
- Strofinare delicatamente l'animale per disperdere i MgCl 2 soluzione tutto cavità del corpo, attendere qualche minuto per l'animale di essere completamente anestetizzata.
- Attacca la testa e la coda dell'animale alla scheda di dissezione con due aghi.
- Usare pinze per sollevare la pelle, tagliare la pelle e lo strato muscolare con le forbici grandi verso la testa e la coda per fare una grande apertura sul lato.
- Trova il ganglio addominale sotto il pennello di tipo ovaio. Usare pinze per tenere i nervi di collegamento di circa 1 cm di fronte al ganglio addominale, tagliare i nervi con le forbici dissezione di fronte alla posizione Pinza e dietro il ganglio addominale.
- Ganglio posto nella soluzione dispasi e incubare per 15-16 ore a 22 ° C con una temperatura controllata bagnomaria.
Giorno 2: Placcatura di cellule borsa Aplysia
Preparazione poli-lisina rivestite coprioggetto
- In un banco di flusso, 35 millimetri preparare tre piatti di Petri come lavorare piatti per la dissezione del ganglio, riempiendole di 4 ml L15-ASW media ciascuno. Trasferire il ganglio addominale dalla soluzione dispasi a uno dei piatti di funzionare dopo 15,5 ore di digestione.
- Utilizzando pinze prendere acido-pulito # 1.5 coprioggetti (22x22 mm) conservati in etanolo, rimuovere l'alcol e sterilizzare coprioggetto da fiamme brevemente su becco Bunsen. Lasciateli raffreddare prima di mettere brevemente i coprioggetti in capsule di Petri.
- Preparare una punta ricurva placcatura piegando una punta di giallo sopra il becco Bunsen (fiamma solo per breve tempo per evitare la fusione della plastica!).
- Preparare la quantità appropriata di 20 mg / ml soluzione di poli-lisina diluendo 200 mg / ml Soluzione sterile con H 2 O ultrapura.
- Coprire ogni coprioggetto con 500 ml di 20 mg / ml di poli-lisina e incubare per 20 minuti a RT.
- Lavare ogni coprioggetto 3-5 volte con 500 microlitri sterile H 2 O ultrapura ciascuno.
- Rimuovere l'acqua dal coprioggetto; riempire ogni piatto con 4 ml di L15-ASW terreno di coltura.
Dissociazione delle cellule borsa
- Sotto un microscopio dissezione, tagliare il ganglio addominale a metà forbici e pinze con dissezione precedentemente puliti con etanolo al 95% (Figura 1 linea 1).
- Su una metà del ganglio, tagliare tra cluster borsa cellulare e le cellule hemiganglion (Figura 1 linea 2), e tagliare via le estensioni dei nervi rimasti al di là di cellule borsa (Figura 1 linea 3). Lavorare su una metà del ganglio alla volta, lasciando l'altra metà nel piatto, mentre le cellule dal primo gruppo sono stati placcati.
- Utilizzando due pinze (o una pinza e forbici dissezione), sacco a grappolo rilascio delle cellule mettendo da parte la guaina di tessuto connettivo che circonda il cluster di cellule borsa. Tagliare il tessuto connettivo con le forbici dissezione, se necessario. Attenzione a non stringere e toccare il cluster di cellule borsa troppo durante questo processo.
- Quando la maggior parte del tessuto connettivo viene rimosso, trasferire il bgrappolo di cellule ag in un piatto nuovo a lavorare con la punta piegata giallo preparato in precedenza. Fare attenzione a non lasciare che il gruppo di cellule sacchetto essere intrappolato dentro la punta di colore giallo o bloccati in aria / medio interfaccia.
- Triturare il cluster con la punta giallo per rimuovere le cellule singolo sacchetto. Fate questo pipettando il cluster dentro e fuori la punta. Iniziare con basse forze di taglio e aumentare la forza se necessario. Utilizzare sempre la più bassa forza necessaria per rimuovere i neuroni senza uccidere le cellule troppi.
- Raccogliere 3-5 cellule sane borsa e trasferirli in un piatto con un poli-lisina rivestite coprioggetto. Evitate di raccogliere le cellule morte (sono nero / trasparente al centro) e detriti del tessuto connettivo.
- Ripetere il passaggio 6. e luogo circa 15-25 neuroni vivere al centro di ogni coprioggetto. Se le cellule morte e detriti vengono trasferiti anche, rimuovere il materiale indesiderato di raccoglierlo o soffiare via dalle cellule sane. Questo processo richiede circa 2-3 ore per entrambi i gruppi.
- Una volta finito di tenere i piatti della cultura in panchina di flusso per almeno 2 ore a temperatura ambiente per permettere alle cellule di allegare (tenere banco flusso ventilatore spento per evitare vibrazioni indesiderate).
- Porre le capsule in un incubatore a 14 ° C per una notte, o fino a quando un ulteriore uso. Coni di crescita si possono sviluppare in 4-10 ore.
Figura 1. Schematica del ganglio Aplysia californica addominale. Linee di colore indicano dove tagliare per ottenere gruppi di cellule borsa.
Giorno 3: Impostazione da camera per immagini dal vivo di cellule borsa Aplysia
Assemblaggio di immagini da camera
- Prima di utilizzare cellule borsa per esperimenti dal vivo l'imaging cellulare, ispezionare le cellule utilizzando un microscopio a bassa potenza. Se le cellule non hanno sviluppato coni di crescita sana, di approvvigionamento a medio dolce e lasciarlo a temperatura ambiente per 1-2 ore.
- Per la fornitura di piatti con prodotti freschi di media L15-ASW, rimuovere la metà (~ 2 ml) di media età con una linea di vuoto, e aggiungere 2 ml di nuovi L15-ASW medio per capsula di Petri. E 'importante non rimuovere completamente tutti i media dal piatto tutto in una volta, in modo da rimuovere le cellule dal vetrino.
- Per l'imaging cellulare borsa, montiamo due coprioggetto e due distanziatori di plastica in un sandwich-come camera di imaging. Il coprioggetto top nel panino viene tagliato corto per permettere un facile scambio di medie e reagenti. Durante il montaggio, coprioggetto con le cellule borsa allegata devono essere immersi in L15-ASW medio in ogni momento di impedire alle cellule di sloggiare.
- Per preparare la camera, tagliati fuori ~ 2 mm dal lato destro di mm # 1 coprioggetto 22x22 con diamante penna (tagliatore di vetro) e il righello.
- Usando una siringa da 1 ml, applicare grasso alto vuoto ai due lati del vetrino più brevi, e allegare distanziatori di plastica per ogni lato. Ingrassare vuoto nella parte superiore di entrambi i distanziali.
- Invertire il coprioggetto e montaggio distanziatore, e posto in capsula di Petri contenente cellule borsa su un vetrino coprioggetti. Allineare e premere delicatamente verso il basso per attaccare coprioggetto dall'alto verso il basso coprioggetto con la fine inversione di due Q-tips.
- Utilizzando pinze, sollevare delicatamente il montaggio panino fuori della scatola di Petri, senza il supporto fuoriuscire. Allineare le due coprioggetto, se necessario, e pulire medio in eccesso con un Kimwipe. Posizionare il panino sulla parte inferiore della porta vetrino da microscopio e fissare il coperchio con cura utilizzando clip.
- Pulire il centro del lato superiore del panino con Q-tips tamponò in detergente per vetri (Sparkle è usato come detergente per vetri). Rapidamente asciugare il detergente per vetri con un secondo, asciutto Q-tip per evitare linee striscia. Fare lo stesso per il coprioggetto fondo. Coprioggetto pulito, privo di linee striscia sono importanti per l'imaging di alta qualità.
Cellule borsa sul microscopio
Dal Aplysia colture di cellule neuronali borsa sono a bassa densità, è meglio se il vostro setup microscopio ha funzioni di posizionamento stadio per facilitare il passaggio tra le celle. Cellule borsa può essere facilmente conservato a temperatura ambiente per diverse ore sul palco durante gli esperimenti di imaging. Cambio del mezzo periodicamente per evitare l'evaporazione.
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Discussion
Aplysia neuroni delle cellule forniscono una borsa senza siero neuronale sistema di coltura cellulare con pochissime cellule non neuronali. Questi neuroni formano coni di crescita molto grande adatto per affrontare una serie di domande importanti nelle cellule biologiche. I neuroni delle cellule borsa può essere facilmente manipolato e ripreso a temperatura ambiente per diverse ore. Mediante microscopia a fluorescenza Speckle (FSM) si può analizzare quantitativamente i vari parametri di F-actina e polimerizzazione dei microtubuli e la dinamica traslocazione. Questi strumenti di imaging insieme al recentemente rilasciato informazioni Aplysia genoma così come le tecniche di espressione migliorata rendono questi neuroni un potente sistema modello per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari della motilità neuronale cono di crescita e di orientamento.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) per le riprese la nostra procedura e Rodney McPhail (Dipartimento di Scienze Biologiche, Purdue University) per l'assistenza con l'editing del video dissezione. La ricerca nel laboratorio di Suter è sostenuto da finanziamenti del NIH (R01 NS049233) e il Centro Bindley Bioscience alla Purdue University di DMS
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 glass coverslips 22x22 mm | Tool | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22x22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington Biochemical | LS02111 |
References
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
