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Developmental Biology

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से ओस्टियोक्लास्ट्स का भेदभाव और लक्षण वर्णन

Published: March 22, 2024 doi: 10.3791/66527
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से मानव ऑस्टियोक्लास्ट के भेदभाव को प्रस्तुत करता है और ओस्टियोक्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट अग्रदूतों के लक्षण वर्णन के लिए तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

यह प्रोटोकॉल मानव आईपीएससी के प्रसार और पासिंग और ओस्टियोक्लास्ट में उनके भेदभाव का विवरण देता है। सबसे पहले, IPSC भ्रूण शरीर प्रेरण में आगे उपयोग के लिए एक एकल सेल निलंबन में dissociated हैं. मेसोडर्मल प्रेरण के बाद, भ्रूण शरीर हेमटोपोइएटिक भेदभाव से गुजरते हैं, जिससे एक अस्थायी हेमटोपोइएटिक कोशिका आबादी पैदा होती है। इसके बाद, काटा हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं एक मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक परिपक्वता चरण से गुजरती हैं और अंत में, ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव। ओस्टियोक्लास्ट भेदभाव के बाद, ओस्टियोक्लास्ट को मिथाइल ग्रीन परमाणु दाग के साथ संयोजन के रूप में टीआरएपी के लिए धुंधला होने की विशेषता है। ओस्टियोक्लास्ट को बहुउद्देशीय, TRAP+ पॉलीकैरियोन के रूप में देखा जाता है। उनकी पहचान को कैथेप्सिन के धुंधला द्वारा समर्थित किया जा सकता है। हड्डी और खनिज पुनर्जीवन परख कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं, जो बोना फाइड ओस्टियोक्लास्ट की पहचान की पुष्टि करते हैं। यह प्रोटोकॉल IPSC से मानव osteoclasts अलग करने के लिए एक मजबूत और बहुमुखी विधि प्रदर्शित करता है और कार्यात्मक मानव osteoclasts की बड़ी मात्रा की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों में आसान गोद लेने के लिए अनुमति देता है. हड्डी अनुसंधान, कैंसर अनुसंधान, ऊतक इंजीनियरिंग और एंडोप्रोस्थेसिस अनुसंधान के क्षेत्रों में अनुप्रयोगों की कल्पना की जा सकती है।

Introduction

ओस्टियोक्लास्ट्स (ओसी) हेमटोपोइएटिक-व्युत्पन्न 1,2, बहुमुखी सेल प्रकार हैं जो आमतौर पर शोधकर्ताओं द्वारा हड्डी रोग अनुसंधान 3,4, कैंसर अनुसंधान 5,6, ऊतक इंजीनियरिंग 7,8, और एंडोप्रोस्थेसिस अनुसंधान 9,10 जैसे क्षेत्रों में उपयोग किए जाते हैं. फिर भी, ओसी भेदभाव चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि बहुउद्देशीय ओसी में मोनोन्यूक्लियर अग्रदूतों का संलयन कार्यात्मक ओसी11 बनाने के लिए आवश्यक है। कई जैविक कारक, जैसे एनएफ-बी लिगैंड (आरएएनएल) और मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) के रिसेप्टर एक्टिवेटर, ओसी भेदभाव के लिए आवश्यक हैं। एम-सीएसएफ सेल प्रसार, सेल अस्तित्व, और रैंक अभिव्यक्ति 12,13,14 पर सकारात्मक प्रभाव होने की सूचना मिली है। दूसरी ओर, RANKL RANK से बांधता है, जो डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड को सक्रिय करता है जो ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को प्रेरित करता है। सक्रियण TNF रिसेप्टर से जुड़े कारक 6 (TRAF6), जो बी कोशिकाओं अवरोधक, अल्फा (IκB-α), एनएफ-केबी डिमरबांधता है कि बांधता है में कप्पा प्रकाश पॉलीपेप्टाइड जीन बढ़ाने के परमाणु कारक के परमाणु कारक के क्षरण की ओर जाता है (), एक बाध्यकारी प्रोटीन एनएफ-केबी डिमर 16,17. इसलिए, IκB-α गिरावट NF-kB डिमर छोड़ती है, जो तब नाभिक में स्थानांतरित हो जाती है और प्रतिलेखन कारकों c-Fos और सक्रिय T-कोशिकाओं 1 (NFATc1) के परमाणु कारक की अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है। यह, बदले में, ओसी भेदभाव से संबंधित प्रोटीन15,18 की एक भीड़ के प्रतिलेखन से चलाता है. डीसी-स्टाम्प और एटीपी 6 वी 0 डी 2 जैसे विनियमित प्रोटीन ओसी अग्रदूतों के सेल-सेल संलयन की मध्यस्थता करते हैं, जिससे सिंकिटियम गठन 19,20,21 होता है।

मानव प्राथमिक कोशिकाओं के संबंध में, सीडी 34 + और सीडी 14 + पीबीएमसी वर्तमान में ओसी22 में भेदभाव के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकार हैं। हालांकि, यह दृष्टिकोण दाताओं23 से काटी गई कोशिकाओं की सीडी 34+ आबादी और उनकी सीमित विस्तारशीलता के भीतर विषमता द्वारा सीमित है। मानव IPSC OCs के लिए एक वैकल्पिक स्रोत प्रस्तुत करते हैं। चूंकिउन्हें अनिश्चित काल तक प्रचारित किया जा सकता है, वे ओसी उत्पादन के विस्तार और उन्नयन की अनुमति देते हैं। यह बड़ी संख्या में ओसी के भेदभाव की अनुमति देता है, जो ओसी अनुसंधान की सुविधा प्रदान करता है।

ओसी में आईपीएससी के भेदभाव के लिए कई प्रोटोकॉल 25,26,27 प्रकाशित किए गए हैं। संपूर्ण भेदभाव प्रक्रिया को एक आईपीएससी प्रसार भाग, एक मेसोडर्मल और हेमटोपोइएटिक भेदभाव भाग और ओसी भेदभाव में विभाजित किया जा सकता है। भेदभाव प्रक्रिया से पहले IPSC के प्रसार भेदभाव से पहले OC उत्पादन के upcaling के लिए अनुमति देता है. मेसोडर्मल और हेमटोपोइएटिक भेदभाव के संबंध में कई दृष्टिकोण मौजूद हैं। परंपरागत रूप से, भ्रूण शरीर (ईबी) गठन का उपयोग हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया है, लेकिन मोनोलेयर-आधारित दृष्टिकोण एक और हेमटोपोइएटिक भेदभाव रणनीति का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसमें ईबी प्रेरण की आवश्यकता नहीं होती है। फिर भी, मोनोलेयर-आधारित प्रणालियों को और अनुकूलन की आवश्यकता होती है, क्योंकि हमने और अन्य लोगों ने ईबी-आधारित दृष्टिकोणों को ओसी के भेदभाव के लिए अधिक मजबूत पाया है।

यहाँ, हम एक ईबी आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग कर मानव IPSC से OCs के भेदभाव का वर्णन. इस प्रोटोकॉल Rössler एट अल.26 से अनुकूलित किया गया था और मजबूती बढ़ाने और भेदभाव प्रक्रिया के दौरान cryopreservation के लिए अनुमति देने के लिए संशोधित किया गया. सबसे पहले, हमने 10 दिनों के भेदभाव के बाद केवल एक बार हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं की कटाई की। हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को तब भेदभाव प्रक्रिया के दौरान अधिक लचीलेपन की अनुमति देने के लिए क्रायोप्रिजर्व किया गया था। इसके अतिरिक्त, हमने ओसी भेदभाव के लिए हेमटोपोइएटिक सेल सीडिंग घनत्व को 1 x 105 से 2 x 105 कोशिकाओं/सेमी2 तक बढ़ा दिया। एक और हाल ही में मानव आईपीएससी सीरम मुक्त माध्यम (hiPSC-SFM, सामग्री की तालिकादेखें) इस्तेमाल किया गया था, और कुओं की कोटिंग के साथ प्रदर्शन किया गया था 200-300 एक बेसल झिल्ली निकालने के माइक्रोग्राम / एमएल ( सामग्री की तालिकादेखें) के बजाय 0.1% जिलेटिन. स्ट्रेप्टोमाइसिन को मीडिया में नहीं जोड़ा गया था।

Rössler एट अल.26 द्वारा प्रोटोकॉल मूल रूप से एक मैक्रोफेज भेदभाव प्रोटोकॉल28 कि hematopoietic भेदभाव के लिए EB गठन का उपयोग करता है के लिए एक IPSC से अनुकूलित किया गया था. जबकि ईबी गठन हेमटोपोइएटिक भेदभाव29,30 के लिए शोधकर्ताओं द्वारा एक विस्तारित समय के लिए इस्तेमाल किया गया है, ईबी प्रेरण के कई तरीकों सहज एकत्रीकरण, एक दौर नीचे अच्छी तरह से थाली में केन्द्रापसारकता, फांसी ड्रॉप संस्कृति, बायोरिएक्टर संस्कृति, शंक्वाकार ट्यूब संस्कृति, धीमी गति से मोड़ पार्श्व पोत, और माइक्रोमोल्ड जेल संस्कृति31 के रूप में साहित्य में वर्णित किया गया है. इस प्रोटोकॉल एक दौर नीचे अच्छी तरह से थाली में dissociated IPSC के centrifugation का उपयोग करता है एक दूसरे के निकटता में एकल IPSC कोशिकाओं लाने के लिए और क्षेत्र के लिए अनुमति देने के लिए (EB) गठन, इसके बाद वर्णित के रूप में.

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों को सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न हो, सभी मीडिया उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-संतुलित थे। सभी सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों को 37 डिग्री सेल्सियस पर और सबसे धीमी त्वरण/मंदी मोड का उपयोग करके किया जाता है। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न हो, सतह पर तैरनेवाला हमेशा डिस्पोजेबल पाश्चर ग्लास पिपेट का उपयोग करके हटा दिया जाता है।

1. मानव IPSC का विगलन और प्रसार

  1. IPSC पिघलने से एक दिन पहले, 200-300 μg/mL की एकाग्रता पर एक बेसल झिल्ली निकालने के 1 एमएल के साथ एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं को कोट करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से थाली रखें.
  2. अगले दिन, पिघलना और एक P1000 विंदुक का उपयोग कर एक 15 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं हस्तांतरण. ड्रॉपवाइज, 15 एमएम एचईपीईएस के साथ डीएमईएम/एफ-12 के 5-7 एमएल जोड़ें।
  3. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. धीरे अपकेंद्रित्र से कोशिकाओं को हटा दें, और सेल गोली को परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें।
  4. ध्यान से एक पाश्चर ग्लास विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें और hiPSC-सीरम मुक्त माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (hiPSC-SFM Rho kinase (रॉक) अवरोध करनेवाला Y-27632 के 10 माइक्रोन युक्त) व्यापक बोर सुझावों के साथ P1000 का उपयोग कर.
  5. अच्छी तरह से लेपित पिछले दिन (चरण 1.1) से बेसल झिल्ली निकालने महाप्राण और अच्छी तरह से में 10 माइक्रोन वाई -27632 के साथ hiPSC-SFM के 1 एमएल हस्तांतरण. अच्छी तरह से 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से एक अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए अच्छी तरह से निलंबित iPSCs जोड़ें.
  6. प्लेट भंवर समान रूप से IPSC समुच्चय वितरित करने के लिए पर एक इनक्यूबेटर में रखने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2.
  7. hiPSC-SFM (रॉक अवरोधक Y-27632 के अलावा के बिना) का उपयोग कर हर दूसरे दिन पूर्ण मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन. IPSC आमतौर पर तक पहुँचने 70-80% प्रसार के 3-4 दिनों के बाद संगम है.

2. IPSC पासिंग

  1. IPSC पारित करने से पहले एक दिन पहले, की एकाग्रता में एक बेसल झिल्ली निकालने के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली के कोट कुओं 200-300 μg/mL. रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से थाली रखें.
    नोट: पुष्टि करें कि कोशिकाएं लगभग 70-80% संगम तक पहुंच गई हैं। सुनिश्चित करें कि IPSC overconfluent नहीं मिलता है (से अधिक 80% संगम), इस सहज भेदभाव को बढ़ावा देगा के रूप में.
  2. विभेदित क्षेत्रों या स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत कई मृत IPSC समुच्चय के साथ क्षेत्रों को हटाकर IPSC पासिंग शुरू 10 माइक्रोन या 20 माइक्रोन विंदुक युक्तियाँ या एक सेल खुरचनी. विभेदित क्षेत्र रंग में सघन या सफेद दिखाई देंगे।
    नोट: स्क्रैप-ऑफ सेल समुच्चय अभी भी आंशिक रूप से अच्छी तरह से नीचे से जुड़ सकते हैं।
  3. एक विस्तृत बोर P1000 विंदुक के साथ अच्छी तरह से नीचे कई बार धो लें किसी भी समुच्चय है कि अभी भी आंशिक रूप से अच्छी तरह से नीचे से जुड़ी हो सकती है हटाने के लिए.
  4. खर्च किए गए माध्यम को त्यागें जिसमें आईपीएससी की खेती की गई है जिसमें अलग आईपीएससी समुच्चय शामिल हैं। फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ धोने के चरण को दो बार दोहराएं।
  5. अगला, अच्छी तरह से प्रति 5 यू / एमएल डिस्पेस के 1 एमएल जोड़ें। IPSC कालोनियों के किनारों अच्छी तरह से थाली, जो कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट इनक्यूबेशन के बाद stereomicroscope के तहत मनाया जा सकता है से दूर लिफ्ट जाएगा.
  6. थोड़ा अलग समुच्चय को हटाने से बचने के लिए डिस्पेस को सावधानीपूर्वक हटा दें और 15 एमएम एचईपीईएस के साथ डीएमईएम/एफ-12 के 1 एमएल को जोड़ें। समुच्चय को छोटे आकार में काटने के लिए एक डिस्पोजेबल सेल लिफ्टर का उपयोग करें। IPSC कुल आकार की स्थिरता एक स्टेम सेल passaging उपकरण के साथ सुधार किया जा सकता है.
  7. अच्छी तरह से में माध्यम के साथ कटा हुआ IPSC समुच्चय धो लें और एक विस्तृत बोर टिप के साथ एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक या P1000 का उपयोग कर एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में समुच्चय के साथ माध्यम हस्तांतरण.
  8. DMEM/F-12 के साथ अच्छी तरह से कुल्ला और IPSC समुच्चय के साथ 15 एमएल ट्यूब के लिए माध्यम हस्तांतरण.
  9. पर कटा हुआ IPSC समुच्चय अपकेंद्रित्र 200 के लिए x ग्राम 3 मिनट. एक पाश्चर ग्लास विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और hiPSC-SFM के 2 एमएल नापसंद और विस्तृत बोर सुझावों के साथ एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक या P1000 का उपयोग कर IPSC फिर से निलंबित जोड़ें.
  10. पूर्व लेपित अच्छी तरह से थाली (रों) से बचे हुए बेसल झिल्ली निकालने महाजीवन और 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए hiPSC SFM के 1 एमएल जोड़ें.
  11. एक 6 अच्छी तरह से थाली के नए कुओं में IPSC स्थानांतरण इतना है कि अंतिम मात्रा है 2 अच्छी तरह से hiPSC-SFM के एमएल व्यापक बोर सुझावों के साथ एक P1000 का उपयोग कर प्रति अच्छी तरह से. IPSC लाइन के आधार पर, विभाजन अनुपात अनुकूलित किया जा करने की आवश्यकता. यहां, 1:6 विभाजन अनुपात का उपयोग किया गया था।
  12. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत फ्लोटिंग समुच्चय और कुल आकार के लिए अच्छी तरह से जांचें। आदर्श रूप से, कुल आकार 50-200 माइक्रोन के बीच होना चाहिए।
  13. समुच्चय स्थानांतरित होने के बाद प्लेट में समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए अच्छी तरह से प्लेट को घुमाएं और 70-80% संगम तक 5% सीओ2 पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

3. वापस IPSC ठंड

  1. IPSC कोशिकाओं को वापस फ्रीज करने के लिए, ऊपर वर्णित के रूप में पारित कोशिकाओं (प्रोटोकॉल चरण देखें "2. आईपीएससी का पासिंग")। कोशिकाओं कालोनियों में कटा हुआ है और अच्छी तरह से नीचे (2.10 कदम) बंद धोया गया है के बाद, 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कटा हुआ समुच्चय नीचे स्पिन. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण।
  2. 15 एमएल ट्यूब के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति सीरम मुक्त cryopreservation माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और एक विस्तृत बोर टिप के साथ एक P1000 का उपयोग कर कटा हुआ समुच्चय resuspended है.
  3. कोशिकाओं को प्रीलेबल्ड क्रायोट्यूब में स्थानांतरित करें। बंद ट्यूबों और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक prechilled cryopreservation कंटेनर में स्थानांतरण ट्यूबों. 24-48 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की दुकान.
  4. दीर्घकालिक भंडारण के लिए क्रायोवियल्स को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
    नोट: ओसी भेदभाव प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध सारांश चित्रा 1 में सचित्र है।

4. भ्रूण शरीर प्रेरण

  1. खेती और पर्याप्त IPSC का विस्तार के रूप में EB प्रेरण के लिए ऊपर वर्णित है.
    नोट: ओसी उत्पादन भ्रूण निकायों की संख्या में वृद्धि करके बढ़ाया जा सकता है, जो बदले में हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं की समग्र उच्च उपज का उत्पादन करता है। का एक अच्छी तरह से 70-80% संगम iPSCs पैदावार लगभग 8.4 एक्स 10एक 6 अच्छी तरह से थाली अच्छी तरह से प्रति 5 कोशिकाओं. 12,500 एकल कोशिका IPSC एक भ्रूण शरीर फार्म की जरूरत है.
  2. IPSC संस्कृतियों से खर्च किए गए माध्यम को महाप्राण करें और D-PBS के साथ IPSC कालोनियों को कुल्ला।
  3. कमरे के तापमान एकल-सेल पृथक्करण अभिकर्मक के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में 0.5 एमएल जोड़ें और पूरी अच्छी तरह से सतह को कोट करने के लिए संस्कृति पोत को घुमाएं। 5-8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति पोत सेते हैं.
  4. इनक्यूबेटर से पोत निकालें, एकल कोशिका पृथक्करण अभिकर्मक महाप्राण, और कुओं के लिए चरण 1 भेदभाव माध्यम के 1 एमएल जोड़ें, 50 एनजी / एमएल मानव हड्डी morphogenetic प्रोटीन के साथ hiPSC सीरम मुक्त माध्यम से मिलकर 4 (hBMP4), 50 एनजी / एमएल मानव संवहनी endothelial विकास कारक -165 (hVEGF), 20 एनजी / एमएल मानव स्टेम सेल कारक (hSCF), और 10 माइक्रोन वाई -27632।
  5. धीरे स्टेज 1 माध्यम के साथ अच्छी तरह से rinsing द्वारा कोशिकाओं को अलग. पूल एक में iPSCs dissociated 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब.
  6. कुओं में स्टेज 1 भेदभाव माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और किसी भी शेष कोशिकाओं को धो लें या आसानी से धोना नहीं है कि कालोनियों के लिए एक सेल खुरचनी का उपयोग करें।
  7. ट्यूब के लिए सभी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के बाद, एक सेल गोली फार्म करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र. महाप्राण और एक विस्तृत बोर टिप के साथ एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक या एक P1000 का उपयोग कर पूर्व संतुलन चरण 1 भेदभाव माध्यम के कुल 2 एमएल में कोशिकाओं respend.
  8. एक हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल गिनती डिवाइस का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना. स्टेज 1 भेदभाव माध्यम के 100 माइक्रोन में एक गोल नीचे अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेट में 12,500 कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए सिंगल सेल सस्पेंशन युक्त 15 एमएल ट्यूब में माध्यम जोड़ें।
    नोट: माइक्रोस्कोप के तहत, कोशिकाओं को अच्छी तरह से भर में बिखरे हुए कोशिकाओं के साथ एक एकल सेल निलंबन के रूप में दिखाई देगा।
  9. 100 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों अपकेंद्रित्र. अपकेंद्रित्र के बाद, कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप के नीचे देखे जाने पर स्फेरॉइड जैसा दिखना शुरू हो जाना चाहिए। प्लेट को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  10. स्टेज 1 भेदभाव माध्यम के साथ दिन 1 और दिन 2 पर माध्यम के आधे हिस्से को बदलें। दक्षता में सुधार करने के लिए, पेट्री डिश में खर्च किए गए स्टेज 1 भेदभाव माध्यम के 50 माइक्रोन के निपटान के लिए एक मल्टीचैनल विंदुक का उपयोग करें।
  11. 96 अच्छी तरह से थाली से माध्यम के निपटान के बाद, गलती से हटा दिया गया है कि हो सकता है कि stereomicroscope के तहत EBs के लिए जाँच करें. स्थानांतरण गलती से हटा दिया ईबी विस्तृत बोर सुझावों के साथ एक P1000 विंदुक का उपयोग 96 अच्छी तरह से थाली के लिए.
  12. एक मल्टीचैनल विंदुक का उपयोग करके एक गोल नीचे अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में ताजा स्टेज 1 भेदभाव माध्यम के 50 माइक्रोन जोड़ें।

5. हेमटोपोइएटिक भेदभाव

  1. हेमटोपोइएटिक भेदभाव शुरू करने से एक दिन पहले, 200-300 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता पर एक बेसल झिल्ली निकालने के 1 एमएल के साथ 6-अच्छी प्लेट का एक कुआं कोट करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से थाली रखें.
    नोट: प्रत्येक अच्छी तरह से इस प्रोटोकॉल के बाद के बिंदु पर 8 ईबीएस प्राप्त होगा। तैयार किए गए ईबी की संख्या के आधार पर, कोट कुओं तदनुसार।
  2. अतिरिक्त बेसल झिल्ली निकालने और स्टेज 2 भेदभाव माध्यम के 3 एमएल के साथ 6 अच्छी तरह से प्लेट के पूर्व भरण कुओं महाप्राण, जिसमें 2 मिमी अल्ट्राग्लूटामाइन, 55 माइक्रोन 2-मर्कैप्टोथेनॉल, 25 एनजी / एमएल मानव इंटरल्यूकिन 3 (एचआईएल -3), और 100 एनजी / एमएल मानव मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (एचएम-सीएसएफ) जोड़ा जाता है।
  3. विस्तृत बोर सुझावों के साथ एक P1000 का प्रयोग, 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 8 EBs हस्तांतरण. स्थानांतरित करने के बाद, आंख से या स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत पुष्टि करें कि 8 ईबी प्रत्येक कुएं में हैं।
    नोट: 1 दिन के बाद, फ्लोटिंग ईबीएस अच्छी तरह से नीचे का पालन करेंगे। निम्नलिखित 5-7 दिनों में, हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं वाली एक अस्थायी कोशिका आबादी दिखाई देनी चाहिए। हेमटोपोइएटिक भेदभाव अवधि 7 दिनों से शुरू होकर विविध हो सकती है। 10 दिनों के लिए भेदभाव ने एक हेमटोपोइएटिक आबादी दिखाई जिसमें बड़ी सीडी 45+, सीडी 14 + और सीडी 11 बी + उप-जनसंख्या शामिल थी।
  4. स्टेज 2 भेदभाव माध्यम के साथ उपचार के 5 दिनों के बाद, खर्च किए गए माध्यम को हटाकर और इसे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में वितरित करके एक मध्यम परिवर्तन करें। पिपेट धीरे-धीरे संभव के रूप में कम अस्थायी कोशिकाओं को हटाने के लिए और कतरनी तनाव के रूप में संभव के रूप में कम रखने की कोशिश करने के लिए. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत पाइपिंग कोशिकाओं के आकस्मिक हटाने से बचने में मदद कर सकती है।
  5. तुरंत कुओं के लिए ताजा चरण 2 भेदभाव माध्यम के 1 एमएल जोड़ें. किसी भी फ्लोटिंग हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए जो पहले से ही भेदभाव प्रक्रिया में इस बिंदु पर मौजूद हो सकते हैं, डिस्पेंस्ड माध्यम को त्यागें नहीं। बल्कि, 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर खर्च किए गए माध्यम के साथ ट्यूब को स्पिन करें, और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करें।
  6. ट्यूब में ताजा स्टेज 2 भेदभाव माध्यम जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए फिर से निलंबित करें जो खर्च किए गए माध्यम के साथ स्थानांतरित हो सकते हैं।
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से बरामद कोशिकाओं के साथ ताजा स्टेज 2 भेदभाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें, जो पहले स्टेज 2 भेदभाव माध्यम के 1 एमएल से भरा था।
  8. हेमटोपोइएटिक भेदभाव के 10 दिन, बड़ी संख्या में फ्लोटिंग हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं की उपस्थिति की जांच करें। उन्हें 50 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करके फसल लें। उन्हें या तो 10% डीएमएसओ, 50% एफबीएस और 40% माध्यम में वापस जमे हुए किया जा सकता है या कोशिकाओं को ओसी में अलग करने के लिए तुरंत उपयोग किया जा सकता है।

6. एम-सीएसएफ परिपक्वता और ओसी भेदभाव

  1. टिशू कल्चर पर 200,000 कोशिकाओं/सेमी2 की एकाग्रता पर बीज कोशिकाओं ने अच्छी प्लेटों का इलाज किया और अल्फा-एमईएम के साथ इलाज किया, 10% एफबीएस और 50 एनजी / एमएल एचएम-सीएसएफ के साथ पूरक किया।
  2. कार्यात्मक परख या इमेजिंग करने के लिए, एक विस्तृत बोर टिप के साथ P1000 का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म पीबीएस के साथ धोने से बोने के 3 दिन बाद एम-सीएसएफ परिपक्व कोशिकाओं को अलग करें। कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग करने के लिए बार-बार धोने के चरणों की आवश्यकता हो सकती है।
  3. अलग कोशिकाओं को एक विस्तृत बोर टिप और 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के साथ P1000 का उपयोग करके 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  4. ओसी भेदभाव माध्यम के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित और भंग करें, जिसमें अल्फा-एमईएम 10% एफबीएस, 50 एनजी/एमएल एचएम-सीएसएफ, और 80 एनजी/एमएल एचआरएनसीएल के साथ पूरक है। एक हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल गिनती डिवाइस का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और कार्यात्मक परख या इमेजिंग (यानी, हड्डी पुनर्जीवन परख, इमेजिंग के लिए कवरस्लिप स्लाइड, आदि) के लिए एक उपयुक्त संस्कृति वेयर में 200,00-250,000 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर एम-सीएसएफ परिपक्व कोशिकाओं को फिर से तैयार करें।
  5. 7-9 दिनों के लिए OC भेदभाव माध्यम के साथ अंतर करें। हर 2-3 दिनों में ताजा ओसी भेदभाव माध्यम के साथ एक पूर्ण अच्छी तरह से मध्यम परिवर्तन करें।
    नोट: बहुउद्देशीय OCs आमतौर पर 5-7 दिनों के बाद दिखाई देते हैं।

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Representative Results

भेदभाव प्रक्रिया के दौरान सेल आकृति विज्ञान की निगरानी
नीचे वर्णित सभी परिणाम OC भेदभाव के लिए MCND-TENS2 IPSC लाइन का उपयोग कर उत्पन्न किए गए थे. इस आईपीएससी लाइन पहले कई अध्ययनों32,33 में इस्तेमाल किया गया है. फिर भी, अन्य आईपीएससी लाइनों को भी सफलतापूर्वक इस भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ इस्तेमाल किया गया है.

नियमित दृश्य मूल्यांकन ओसीएस (चित्रा 2) के लिए भेदभाव प्रक्रिया भर में आईपीएससी के अलग और अलग रूपात्मक विशेषताओं का पता चलता है. आईपीएससी कालोनियों (चित्रा 2 ए) को एक एकल सेल निलंबन में अलग कर दिया गया था, जो सेंट्रीफ्यूजेशन (चित्रा 2बी) से पहले गोल नीचे अच्छी तरह से प्लेट में अलग-अलग कोशिकाओं के रूप में प्रकट होता है। सेंट्रीफ्यूजेशन (प्रोटोकॉल में चरण 4.9) के बाद, कोशिकाएं गोल नीचे अल्ट्रा-लो अटैचमेंट वेल प्लेट के केंद्र में एकत्र होंगी और बाद में गोले (भ्रूण निकायों, ईबीएस, चित्रा 2सी) का निर्माण करेंगी। ईबीएस मेसोडर्मल भेदभाव प्रक्रिया(चित्रा 2डी)के दौरान आकार में दो से तीन गुना बढ़ जाएगा और 4-दिवसीय भेदभाव अवधि(चित्रा 2ई)के अंत में आंखों को आसानी से दिखाई देगा। EBs का पालन करते हुए और hematopoietic भेदभाव (प्रोटोकॉल में कदम 5.3, चित्रा 2F) के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं में हस्तांतरण के बाद अच्छी तरह से थाली नीचे के साथ फ्यूज देखा जा सकता है. 7-8 दिनों के बाद, बड़ी मात्रा में फ्लोटिंग हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं संस्कृति माध्यम (चित्रा 2जी) में दिखाई देती हैं। कटाई और hematopoietic कोशिकाओं replating के बाद, एक एम सीएसएफ परिपक्वता चरण इस प्रकार है, और ओसी भेदभाव (प्रोटोकॉल में कदम 6.4) शुरू की है. 5-6 दिनों के भीतर, एक बड़े पारदर्शी सेल बॉडी के साथ बहुउद्देशीय कोशिकाएं पहले दिखाई देती हैं (चित्र 2H)। इस स्तर पर बड़ी संख्या में मोनोन्यूक्लियर सेल अभी भी दिखाई दे रहे हैं। ओसी भेदभाव के 2-3 और दिनों के बाद, ओसी आगे भी अधिक नाभिक(चित्रा 2I)के साथ बड़े polykarions फार्म करने के लिए आसन्न कोशिकाओं के साथ फ्यूज होगा.

ईबी-व्युत्पन्न हेमटोपोइएटिक आबादी का आकलन
हेमटोपोइएटिक भेदभाव समय की एक चर लंबाई के लिए किया जा सकता है। साहित्य में 7 दिनों से शुरू होकर 9 सप्ताह तक की समयावधि का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हेमटोपोइएटिक भेदभाव 10 दिनों की अवधि के लिए किया जाता है। हमने पाया कि हेमटोपोइएटिक भेदभाव के 10 दिनों में प्रारंभिक सीडी 34 + (0.53%, चित्रा 3 ए) की कम संख्या और बड़ी संख्या में मध्यावधि चरण सीडी 43 + (48.5%, चित्रा 3 बी) हेमटोपोइएटिक पूर्वज प्राप्त हुए। अधिक गंभीर रूप से, सीडी 45 + (96.2%, चित्रा 3 सी), सीडी 14 + (33%, चित्रा 3 डी), और सीडी 11 बी + (35.9%, चित्रा 3 ई) एचपीसी की पर्याप्त मात्रा 10 दिनों की उपचार अवधि के बाद उत्पन्न हुई थी ताकि उन्हें ओसी में आगे अलग किया जा सके। हालांकि, हेमटोपोइएटिक भेदभाव (प्रोटोकॉल में चरण 5.4) के लिए साइटोकिन उपचार अवधि को सीडी 45 +, सीडी 14 + और सीडी 11 बी + कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा उत्पन्न करने के लिए आईपीएससी लाइन के आधार पर समायोजित और अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

औसतन, 8 ईबी के साथ प्रत्येक कुएं से भेदभाव के 10 दिनों के बाद औसतन 6 मिलियन हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को काटा गया था।

ओसी आकृति विज्ञान और गतिविधि का आकलन
ओसी भेदभाव के बाद, OCs का मूल्यांकन रूपात्मक और कार्यात्मक रूप से किया जा सकता है। ओसी अग्रदूतों को एम-सीएसएफ परिपक्वता कदम के बाद चैम्बर स्लाइड या कवरस्लिप स्लाइड पर फिर से बीज दिया जाता है ताकि छवि गुणवत्ता में सुधार किया जा सके जब टीआरएपी या कैथेप्सिन के लिए धुंधला हो जाना ओसी भेदभाव के बाद एंजाइमैटिक ट्रैप धुंधला हो जाना बड़ा, बहुउद्देशीय, ट्रैप-पॉजिटिव ओसी(चित्रा 4ए)दिखाता है। इसके अतिरिक्त, थोड़ा ट्रैप-पॉजिटिव मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को मल्टीन्यूक्लियर ओसी के बीच में देखा जा सकता है। RANKL को जोडेको बिना नकारात्मक नियन्त्रण फ्यूज्ड बहु-परमाणु OC प्रदर्शन गर्दैन। फिर भी, थोड़ा ट्रैप-पॉजिटिव मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की एक छोटी संख्या को चित्रित किया जा सकता है(चित्र 4बी)।

कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) छवियां कैथेप्सिन के (फ़िरोज़ा) और एफ-एक्टिन (लाल) के लिए ओसी को डीएपीआई परमाणु दाग (नीला)(चित्रा 4सी, 4डी)के संयोजन में दिखाती हैं। प्रोटोकॉल के अनुसार रैंकएल के साथ इलाज किए जाने पर बड़े मल्टीन्यूक्लियर ओसी दिखाई देते हैं, जो एक व्यापक एफ-एक्टिन साइटोस्केलेटल संरचना और कैथेप्सिन के(चित्रा 4सी)के लिए सकारात्मक दाग को दर्शाता है। दूसरी ओर, RANKL के अतिरिक्त के बिना नकारात्मक नियंत्रण, फ्यूज्ड मल्टीन्यूक्लियर कोशिकाओं को नहीं दिखाते हैं।

पुनरुत्थान गतिविधि को मापकर OCs का कार्यात्मक रूप से और मूल्यांकन किया जा सकता है। हड्डी या खनिज पुनर्जीवन परख का उपयोग पुनरुत्थान गतिविधि को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यहां, ओसी अग्रदूतों को कैल्शियम फॉस्फेट-लेपित कुओं पर वरीयता दी गई थी और टर्मिनल रूप से विभेदित किया गया था। बड़े क्षेत्र जहां खनिज कोटिंग को पुनर्जीवित किया गया था, वे नीले-भूरे रंग (चित्रा 4ई) में दिखाई दे रहे हैं। विभिन्न आकारों के पुनरुत्थान गड्ढों की पहचान की जा सकती है। पुनर्निर्मित नहीं, शेष कैल्शियम फॉस्फेट-कोटिंग भूरे रंग में दिखाई देती है। पुनर्जीवन गड्ढों की उपस्थिति ओसी के रूप में विभेदित बहुउद्देशीय कोशिकाओं की पहचान की पुष्टि करती है। इसके अतिरिक्त, पुनरुत्थान गड्ढों को पुनरुत्थान गतिविधि का आकलन और तुलना करने के लिए और अधिक मात्रा निर्धारित की जा सकती है। कुल अच्छी तरह से सतह क्षेत्र पर पुनर्जीवन खनिज के कुल क्षेत्र को प्रतिशत माप के रूप में निर्धारित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, पुनर्जीवन गड्ढों के आकार और संख्या को और अधिक मात्रा निर्धारित की जा सकती है। अनुपचारित नकारात्मक नियंत्रणों ने पुनर्जीवन गड्ढों (चित्रा 4एफ) को प्रदर्शित नहीं किया।

Figure 1
चित्रा 1: मानव आईपीएससी से ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव प्रक्रिया का योजनाबद्ध चित्रण। एफिनिटी डिज़ाइनर 2.1.1 का उपयोग करके हन्ना ब्लमके द्वारा तैयार किया गया चित्रण। चित्रण पहले इस्तेमाल किया चित्र33 का उपयोग करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ओस्टियोक्लास्ट की ओर मानव आईपीएससी की भेदभाव प्रक्रिया के दौरान माइक्रोस्कोपी छवियां। (ए) प्रसार के दौरान अविभाजित आईपीएससी कालोनियों. (बी)centrifugation से पहले एक एकल सेल निलंबन में पृथक्करण के बाद गोल नीचे कुओं में IPSCs. (ग) केन्द्राभिषेक के बाद केन्द्रीय रूप से एकत्रित एकल सेल आईपीएससी। (डी) ईबीएस 4-दिवसीय मेसोडर्मल भेदभाव अवधि के दौरान आकार में बढ़ते हैं। (ई) मेसोडर्मल भेदभाव के बाद दृश्यमान भ्रूण निकाय। (एफ) बेसल झिल्ली निकालने लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटों लेपित पर भ्रूण निकायों के हस्तांतरण के बाद, भ्रूण निकायों का पालन और अच्छी तरह से तल के साथ फ्यूज देखा जा सकता है. (जी) हेमटोपोइएटिक भेदभाव के 5-7 दिनों के बाद, माध्यम में बड़ी संख्या में फ्लोटिंग हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को देखा जा सकता है। (एच) एम-सीएसएफ परिपक्वता के बाद, 3-4 नाभिक के साथ पहला ऑस्टियोक्लास्ट रैंकल के साथ भेदभाव के 5-7 दिनों के बाद दिखाई देता है। (I) ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव के अंत में, बड़ी बहुउद्देशीय कोशिकाओं को देखा जा सकता है। स्केल बार: ए, डी, एफ, जी = 200 माइक्रोन, बी, सी, एच, मैं = 50 माइक्रोन, ई = 1 मिमी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके भ्रूण शरीर व्युत्पन्न हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं का सतह मार्कर विश्लेषण। मार्कर अभिव्यक्ति हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के विश्लेषण और सिंगलेट और जीवित कोशिकाओं के लिए गेटिंग के बाद उप-आबादी की पहचान के लिए अनुमति देता है। (ए) Ontogenetically प्रारंभिक CD34 + हेमटोपोइएटिक पूर्वज सेल आबादी इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में अनुपस्थित करने के लिए बहुत छोटा है. (बी) सीडी 43+ कोशिकाएं पूरी आबादी का लगभग 50% बनाती हैं। (सी) बाद के चरण सीडी 45+ हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाएं 96.2% के साथ हेमटोपोइएटिक आबादी का सबसे बड़ा हिस्सा बनाती हैं। (डी, ई) अधिक प्रत्यक्ष CD14+ और CD11b+ OC अग्रदूत क्रमशः 33% और 36% बनाते हैं। लाल रंग में: बिना दाग वाला नकारात्मक नियंत्रण, नीले रंग में: आइसोटाइप नियंत्रण, पीले रंग में: संबंधित मार्कर एंटीबॉडी के साथ सना हुआ कोशिकाएं। भूखंड पहले प्रकाशित डेटाका उपयोग करते हैं 33. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आईपीएससी-विभेदित मानव ऑस्टियोक्लास्ट के रूपात्मक और कार्यात्मक मूल्यांकन। (ए)ओस्टियोक्लास्ट भेदभाव के बाद ट्रैप धुंधला बड़े, बहुउद्देशीय, टीआरएपी सकारात्मक ओस्टियोक्लास्ट दिखाता है। थोड़ा टीआरएपी पॉजिटिव मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को मल्टीन्यूक्लियर ओस्टियोक्लास्ट के बीच में देखा जा सकता है। (बी) टीआरएपी के लिए सना हुआ रैंकएल के अतिरिक्त के बिना नकारात्मक नियंत्रण फ्यूज्ड मल्टीन्यूक्लियर ओस्टियोक्लास्ट प्रदर्शित नहीं करते हैं। फिर भी, थोड़ा टीआरएपी सकारात्मक, मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की एक छोटी संख्या को चित्रित किया जा सकता है। (सी) डीएपीआई परमाणु दाग (नीला) के साथ संयोजन के रूप में एफ-एक्टिन (लाल) और कैथेप्सिन के (फ़िरोज़ा) के लिए दाग वाली कवरस्लिप स्लाइड पर ओस्टियोक्लास्ट विभेदित हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं की कंफोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी छवियां बड़े बहुउद्देशीय कैथेप्सिन के सकारात्मक ऑस्टियोक्लास्ट दिखाती हैं। (डी) रैंकएल के अतिरिक्त के बिना नकारात्मक नियंत्रण कम सेल घनत्व पर (बी) मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के समान दिखाते हैं। (ई) ओस्टियोक्लास्ट की पुनर्जीवन गतिविधि का आकलन करके कार्यात्मक मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके लिए, ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव एक हड्डी या खनिज पुनर्जीवन परख पर किया जाता है। चरण विपरीत मोड में एक उल्टे वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त टाइल वाली अच्छी तरह से छवियां कैल्शियम फॉस्फेट खनिज परत के बड़े पुनर्जीवन क्षेत्रों को दर्शाती हैं। कुल क्षेत्रफल पर पुनर्जीवन क्षेत्र को मापकर पुनरुत्थान गतिविधि को और अधिक मात्रा में निर्धारित किया जा सकता है। (एफ) रैंकएल के अतिरिक्त के बिना नकारात्मक नियंत्रण पुनर्जीवन क्षेत्रों को नहीं दिखाते हैं। स्केल बार: ए, बी = 100 माइक्रोन, सी, डी = 50 माइक्रोन, ई, एफ = 1 मिमी। छवियाँ पहले प्रकाशित डेटा33 से संपादित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल OCs में IPSC अंतर करने के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत विधि प्रदान करता है. फिर भी, कई नुकसान हैं जिनका सामना भेदभाव प्रक्रिया के दौरान किया जा सकता है। विभिन्न ऊतक मूल की कोशिकाओं से उत्पन्न मानव IPSC लाइनों सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल33 का उपयोग कर विभेदित किया गया है. जब वापस IPSC ठंड (प्रोटोकॉल कदम देखें "3. फ्रीजिंग बैक आईपीएससी"), पासिंग के बिंदु पर एक कुआं वापस एक क्रायोवियल में जमे हुए था। विगलन करते समय (प्रोटोकॉल चरण "1 देखें। मानव आईपीएससी के विगलन और प्रसार"), एक क्रायोवियल को 6-वेल प्लेट के एक कुएं में पिघलाया गया था। अलग-अलग आईपीएससी लाइनें थोड़ा अलग तरीके से व्यवहार करेंगी, और प्रसार दर अलग-अलग होगी। विभाजन दर को तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होगी।

जब IPSC गुजर या EB प्रेरण के लिए एक एकल सेल निलंबन में IPSC dissociating, यह प्रभावशीलता और mesodermal और hematopoietic भेदभाव की दक्षता में सुधार करने के लिए किसी भी सहज विभेदित कालोनियों या मृत कोशिकाओं के समुच्चय को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह एक सेल खुरचनी, एक P10 या P20 विंदुक, या एक पाश्चर विंदुक35 से निर्मित एक खुरचन उपकरण विंदुक का उपयोग करके एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किया जा सकता है.

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, इस प्रोटोकॉल ईबी प्रेरण के लिए एक एकल सेल निलंबन में आईपीएससी कालोनियों के पृथक्करण शामिल, जबकि अन्य प्रोटोकॉल के साथ, आईपीएससी समुच्चय के रूप में छोड़ दिया जाता है ईबी प्रेरण के लिए centrifuged किया जा करने के लिए36. ईबी आकार, सेल नंबर, आकार, और आकृति विज्ञान सभी भेदभाव37,38,39 को प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है. इस प्रकार, हम परिकल्पना करते हैं कि एकल-कोशिका निलंबन में पृथक्करण सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद आकार और आकार में बेहतर ईबी-टू-ईबी एकरूपता की अनुमति देता है और इसलिए, हेमटोपोइएटिक सेल उत्पादन31 के अधिक सुसंगत परिणाम।

ईबी प्रेरण के लिए अन्य तरीकों का वर्णन किया गया है। सेल अस्तित्व में सुधार करने के लिए रॉक अवरोधक के साथ संयोजन के रूप में एक एकल कोशिका निलंबन का उपयोग करने वाले ऐसे तरीकों को ईबी आकार और भेदभाव परिणाम31को नियंत्रित करने में फायदेमंद बताया गया है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित गोल-नीचे 96-अच्छी तरह से प्लेट ईबी प्रेरण विधि ईबीएस के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए उपयुक्त है और ओसी उत्पादन के अपसंस्कृति के लिए अनुमति देता है। भेदभाव प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने की क्षमता के साथ एक भ्रूण शरीर प्रेरण कदम के बिना हेमटोपोइएटिक भेदभाव के लिए अधिक उपन्यास तरीकों हाल ही में32 वर्णित किया गया है. बहरहाल, इन प्रोटोकॉल अभी तक OC भेदभाव33 के लिए स्थापित नहीं किया गया है.

उपर्युक्त प्रोटोकॉल में, हम हेमटोपोइएटिक भेदभाव के दिन 5 पर मध्यम परिवर्तन का वर्णन करते हैं। फ्लोटिंग कोशिकाओं की एक छोटी संख्या पहले से ही भेदभाव के दिन 4-5 के आसपास दिखाई दे सकती है। किसी भी फ्लोटिंग कोशिकाओं को त्यागने से बचने के लिए, माध्यम को एक ट्यूब में एकत्र किया जाना चाहिए और त्यागने से पहले अपकेंद्रित्र किया जाना चाहिए। ट्यूब के तल पर सेल गोली तो ताजा माध्यम के साथ उखाड़ फेंका जाना चाहिए और एक 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं को वापस स्थानांतरित किया जाना चाहिए. हालांकि, ओसी भेदभाव में प्रारंभिक फ्लोटिंग सेल आबादी का महत्व अभी भी निर्धारित करने की आवश्यकता है।

हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के उत्पादन का मूल्यांकन प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके किया जा सकता है। सीडी 45 +, सीडी 14 + और सीडी 11 बी + कोशिकाओं की उच्च पैदावार ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव33 के लिए वांछनीय हैं। काटे गए फ्लोटिंग हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन को आम तौर पर सीमित वसूली दर और कम सेल व्यवहार्यता40,41 के साथ चुनौतीपूर्ण बताया गया है। एक क्रायोप्रेज़र्वेशन माध्यम में हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को क्रायोप्रेज़र्विंग करके जिसमें सीरम मुक्त हेमटोपोइएटिक सेल विस्तार माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें), 40% एफबीएस और 10% डीएमएसओ का 50% शामिल है, हम लगभग 90.3% की सेल व्यवहार्यता के साथ कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने ±में सक्षम थे 2.62 एसडी (एन = 7) पोस्ट विगलन।

ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस को बहुउद्देशीय ओस्टियोक्लास्ट बनाने के लिए कई मोनोन्यूक्लिएटेड ओसी अग्रदूतों के संलयन की आवश्यकता होती है जो खनिज और हड्डी के पुनरुत्थान में सक्षम होते हैं। जबकि murine OC-अग्रदूत सेल लाइनों बस OC गठन42 प्रेरित करने के लिए RANKL के अलावा की जरूरत है, मानव अग्रदूतों सेल अस्तित्व और प्रसार43 के लिए अतिरिक्त एम सीएसएफ की आवश्यकता है. ओएससीएआर को हाल ही में ओसी भेदभाव में शामिल एक अतिरिक्त रिसेप्टर के रूप में खोजा गया है, भले ही केवल टाइप I कोलेजन को अब तक लिगैंड के रूप में पहचाना गया है। जबकि आईपीएससी-व्युत्पन्न ओसी के साथ ओएससीएआर का शोध अभी भी सीमित है, इन विट्रो आरएकेएल में सुपरफिजियोलॉजिकल और एम-सीएसएफ सांद्रता एक murine सेल लाइन में ओएससीएआर सक्रियण44 के लिए आवश्यकता को बायपास करने लगते हैं, विवो में ओएससीएआर की सक्रियता ऑस्टियोक्लास्टोजेनेसिस45 के लिए एक आवश्यक कॉस्टिमुलेटरी सिग्नल प्रतीत होती है। एक अतिरिक्त कारक जिस पर विचार करने की आवश्यकता है वह है अच्छी तरह से प्लेट की सतह। रासायनिक46 और भौतिकसतह गुणों को ऑस्टियोक्लास्ट भेदभाव को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है और या तो सफल भेदभाव को बढ़ावा दे सकता है या बाधा डाल सकता है। अग्रदूत आबादी के भीतर एक निश्चित विषमता भी ओसी के सफल संलयन के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होती है, क्योंकि सीडी 47 और डीसी-स्टाम्प जैसे विभिन्न संलयन संबंधी कारक ओस्टियोक्लास्ट संलयन48 के विभिन्न चरणों में कार्य करते हैं।

अंत में, इस प्रोटोकॉल को सुविधाजनक बनाने और OC अनुसंधान में तेजी लाने के लिए IPSC से मानव OC के भेदभाव को सक्षम बनाता है.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक जियाचेली लैब के सदस्यों को उनकी तकनीकी मदद और समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम डब्ल्यूएम केक माइक्रोस्कोपी सेंटर और केक सेंटर मैनेजर, डॉ नथानियल पीटर्स को धन्यवाद देते हैं, जो कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी छवियों को प्राप्त करने में सहायता के लिए हैं। हम तकनीकी सहायता और सहायता के लिए UW फ्लो कोर फैसिलिटी और फ्लो कोर फैसिलिटी मैनेजर, ऑरेलियो सिल्वेस्ट्रोनी को भी धन्यवाद देते हैं। अंत में, हम चित्रण और ग्राफिक डिजाइन के समर्थन के लिए हन्ना ब्लमके को धन्यवाद देते हैं।

राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान R35 HL139602-01 के माध्यम से वित्त पोषण प्रदान किया गया था। हम WM केक सेंटर में इंस्ट्रूमेंट फंडिंग के लिए NIH S10 अनुदान S10 OD016240 के साथ-साथ UW फ्लो कोर फैसिलिटी में इंस्ट्रूमेंट फंडिंग के लिए NIH अनुदान 1S10OD024979-01A1 को भी स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K  Abcam ab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45 BD 555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14 BD 563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD 563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 Abcam ab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14 R&D Systems FAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b R&D Systems FAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 BD 560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b Biolegend 301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Biolegend 400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 BD 563521
Bone Resorption Assay Kit CosmoBioUSA CSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher 16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract R&D Sytems 3434-010-02 Basal membrane extract
DAPI R&D Systems 5748/10
Dispase (5 U/mL) STEMCELL Technologies 7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Stem Cell 36254
DMSO Sigma Aldrich D2650
DPBS Sigma Aldrich D8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) STEMCELL Technologies 78211
Human IL-3 STEMCELL Technologies 78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) STEMCELL Technologies 78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) STEMCELL Technologies 78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF) STEMCELL Technologies 78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) Biolegend 422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) STEMCELL Technologies 78073
Invitrogen Rhodamine Phalloidin Invitrogen R415
MEM α, nucleosides, no phenol red ThermoFisher 41061029
mFreSR STEMCELL Technologies 05855 Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus medium STEMCELL Technologies 100-0276 Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Thermo Scientific 174925 Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore Tips ThermoFisher 2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632 STEMCELL Technologies 72304
StemSpan SFEM StemCell 09650 Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red Thermo Fisher 12563011 Single-cell dissociation reagent
Ultraglutamine Bioscience Lonza BE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Bioscience Lonza 04-418Q Hematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well High Ibidi 80806

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 205
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से ओस्टियोक्लास्ट्स का भेदभाव और लक्षण वर्णन
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Blümke, A., Simon, J., Leber, E., Scatena, M., Giachelli, C. M. Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (205), e66527, doi:10.3791/66527 (2024).

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