Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Differensiering og karakterisering av osteoklaster fra humane induserte pluripotente stamceller

Published: March 22, 2024 doi: 10.3791/66527
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

Summary

Denne protokollen presenterer differensiering av humane osteoklaster fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs) og beskriver metoder for karakterisering av osteoklaster og osteoklastforløpere.

Abstract

Denne protokollen beskriver forplantning og passering av humane iPSCs og deres differensiering i osteoklaster. Først dissosieres iPSCs til en encellesuspensjon for videre bruk i embryoid kroppsinduksjon. Etter mesodermal induksjon gjennomgår embryoidlegemer hematopoietisk differensiering, og produserer en flytende hematopoietisk cellepopulasjon. Deretter gjennomgår de høstede hematopoietiske cellene et makrofagkolonistimulerende faktormodningstrinn og til slutt osteoklastdifferensiering. Etter osteoklastdifferensiering karakteriseres osteoklaster ved farging for TRAP i forbindelse med en metylgrønn nukleær flekk. Osteoklaster observeres som multinukleerte, TRAP+ polykaryoner. Deres identifikasjon kan støttes ytterligere av Cathepsin K-farging. Ben- og mineralresorpsjonsanalyser tillater funksjonell karakterisering, og bekrefter identiteten til bona fide osteoklaster. Denne protokollen demonstrerer en robust og allsidig metode for å skille humane osteoklaster fra iPSCer og muliggjør enkel adopsjon i applikasjoner som krever store mengder funksjonelle humane osteoklaster. Søknader innen beinforskning, kreftforskning, vevsteknikk og endoproteseforskning kan tenkes.

Introduction

Osteoklaster (OC) er hematopoietisk-avledede 1,2, allsidige celletyper som ofte brukes av forskere på områder som forskning på beinsykdom 3,4, kreftforskning 5,6, vevsteknikk 7,8 og endoproteseforskning 9,10. Likevel kan OC-differensiering være utfordrende, da fusjon av mononukleære forløpere til multinukleære OC-er er nødvendig for å skape funksjonelle OC-er11. Flere biologiske faktorer, som reseptoraktivator av NF-κB-ligand (RANKL) og makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF), er nødvendige for OC-differensiering. M-CSF har blitt rapportert å ha en positiv effekt på celleproliferasjon, celleoverlevelse og RANK-uttrykk 12,13,14. På den annen side binder RANKL seg til RANK, som aktiverer nedstrøms signalkaskader som induserer osteoklastogenese. Aktivering medieres via TNF-reseptorassosiert faktor 6 (TRAF6), noe som fører til nedbrytning av nukleær faktor av kappa lett polypeptidgenforsterker i B-cellehemmer, alfa (IκB-α), et bindende protein som binder NF-kB-dimerer16,17. Derfor frigjør IκB-α-nedbrytning NF-kB-dimerer, som deretter translokerer inn i kjernen og induserer ekspresjonen av transkripsjonsfaktorene c-Fos og nukleær faktor av aktiverte T-celler 1 (NFATc1). Dette utløser i sin tur transkripsjonen av en rekke OC-differensieringsrelaterte proteiner15,18. Oppregulerte proteiner som DC-Stamp og Atp6v0d2 medierer cellecellefusjon av OC-forløpere, noe som fører til syncytiumdannelse 19,20,21.

Når det gjelder humane primærceller, er CD34+ og CD14+ PBMC for tiden de mest brukte celletypene for differensiering til OC22. Denne tilnærmingen er imidlertid begrenset av heterogeniteten i CD34+ -populasjonen av høstede celler fra donorer23 og deres begrensede utvidbarhet. Humane iPSCer presenterer en alternativ kilde for OSC-er. Siden de kan forplantes på ubestemt tid24, gir de mulighet for utvidelse og oppskalering av OC-produksjon. Dette muliggjør differensiering av et stort antall OC-er, noe som letter OC-forskning.

Flere protokoller for differensiering av iPSCs i OCs har blitt publisert 25,26,27. Hele differensieringsprosessen kan deles inn i en iPSC-forplantningsdel, en mesodermal og hematopoietisk differensieringsdel og OC-differensiering. Forplantning av iPSCer før differensieringsprosessen muliggjør oppskalering av OC-produksjon før differensiering. Det finnes flere tilnærminger til mesodermal og hematopoietisk differensiering. Tradisjonelt har embryoid legemedannelse (EB) blitt brukt til å differensiere hematopoietiske celler, men monolagsbaserte tilnærminger representerer en annen hematopoietisk differensieringsstrategi som ikke krever EB-induksjon. Likevel synes monolayer-baserte systemer å kreve ytterligere optimalisering, da vi og andre har funnet at EB-baserte tilnærminger er mer robuste for differensiering av OC.

Her beskriver vi differensieringen av OC-er fra humane iPSCer ved hjelp av en EB-basert protokoll. Denne protokollen ble tilpasset fra Rössler et al.26 og modifisert for å øke robustheten og tillate kryopreservering under differensieringsprosessen. Først høstet vi hematopoietiske celler bare en gang etter 10 dager med differensiering. Hematopoietiske celler ble deretter kryopreservert for å tillate mer fleksibilitet under differensieringsprosessen. I tillegg økte vi den hematopoietiske cellesåtettheten fra 1 x 105 til 2 x 105 celler / cm2 for OC-differensiering. Et nyere humant iPSC serumfritt medium (hiPSC-SFM, se materialtabell) ble brukt, og belegging av brønner ble utført med 200-300 μg/ml basalmembranekstrakt (se materialtabell) i stedet for 0,1 % gelatin. Penicillin/streptomycin ble ikke tilsatt media.

Protokollen av Rössler et al.26 ble opprinnelig tilpasset fra en iPSC til en makrofagdifferensieringsprotokoll28 som bruker EB-dannelse for hematopoietisk differensiering. Mens EB-dannelse har blitt brukt i lengre tid av forskere for hematopoietisk differensiering29,30, har flere metoder for EB-induksjon blitt beskrevet i litteraturen, for eksempel spontan aggregering, sentrifugering i en rundbunnsbrønnplate, hengende dråpekultur, bioreaktorkultur, konisk rørkultur, langsomt svingende lateralt kar og mikromoldgelkultur31. Denne protokollen bruker sentrifugering av dissosierte iPSCer i en rundbunns brønnplate for å bringe enkle iPSC-celler i nærheten av hverandre og for å tillate kuledannelse (EB), som beskrevet nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle reagenser som brukes i denne protokollen, finnes i materialfortegnelsen. Med mindre annet er spesifisert, ble alle medier forhåndslikevektet til 37 °C før bruk. Alle sentrifugeringstrinn utføres ved 37 °C og ved å bruke den langsomste akselerasjons-/retardasjonsmodusen. Med mindre annet er spesifisert, fjernes supernatant alltid ved hjelp av engangs Pasteur-glasspipetter.

1. Tining og formering av menneskelige iPSCer

  1. En dag før tining av iPSCs, belegg en brønn av en 6-brønns plate med 1 ml av et basalmembranekstrakt i en konsentrasjon på 200-300 μg / ml. Plasser brønnplaten på 4 °C over natten.
  2. Neste dag, tine og overføre cellene til et 15 ml rør ved hjelp av en P1000 pipette. Dropwise, legg til 5-7 ml DMEM / F-12 med 15 mM HEPES.
  3. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter. Fjern cellene forsiktig fra sentrifugen, og pass på at du ikke forstyrrer cellepelleten.
  4. Fjern forsiktig supernatanten med en Pasteur-glasspipette og resuspender cellene i 1 ml hiPSC-serumfritt medium (hiPSC-SFM inneholdende 10 μM Rho-kinase (ROCK)-hemmer Y-27632) ved bruk av P1000 med brede borespisser.
  5. Aspirer basalmembranekstraktet fra brønnen belagt dagen før (trinn 1.1) og overfør 1 ml hiPSC-SFM med 10 μM Y-27632 til brønnen. Legg resuspenderte iPSCer til brønnen for å nå et endelig volum på 2 ml per brønn.
  6. Roter platen for jevnt fordelte iPSC-aggregater før du legger den i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
  7. Utfør fulle middels endringer annenhver dag ved bruk av hiPSC-SFM (uten tillegg av ROCK-hemmer Y-27632). iPSC når vanligvis 70-80% sammenløp etter 3-4 dagers forplantning.

2. Passerer iPSCs

  1. En dag før iPSC passerer, belegg brønner av en 6-brønns plate med et basalmembranekstrakt i en konsentrasjon på 200-300 μg / ml. Plasser brønnplaten på 4 °C over natten.
    MERK: Bekreft at cellene har nådd omtrent 70-80% konfluens. Sørg for at iPSCer ikke blir overstrømmende (mer enn 80% sammenløp), da dette vil fremme spontan differensiering.
  2. Begynn å passere iPSCs ved å fjerne differensierte regioner eller regioner med mange døde iPSC-aggregater under stereomikroskopet ved å bruke 10 μL eller 20 μL pipettespisser eller en celleskraper. Differensierte områder vil virke tettere eller hvitere i fargen.
    MERK: Skrapte celleaggregater kan fortsatt delvis feste seg til brønnbunnen.
  3. Vask brønnbunnen flere ganger med en P1000-pipette med bred boring for å fjerne tilslag som fortsatt kan være delvis festet til brønnbunnen.
  4. Kast det brukte mediet som iPSCene har blitt dyrket i, som inneholder de frittliggende iPSC-aggregatene. Gjenta vasketrinnet to ganger til med fosfatbufret saltvann (PBS).
  5. Deretter tilsettes 1 ml 5 U/ml Dispase per brønn. Kantene på iPSC-koloniene vil løfte seg fra brønnplaten, som kan observeres under stereomikroskopet etter 3-5 min inkubasjon ved romtemperatur.
  6. Fjern forsiktig Dispase for å unngå å løsne lett løsrevne aggregater og tilsett 1 ml DMEM/F-12 med 15 mM HEPES. Bruk en engangs celleløfter til å skjære aggregatene i små størrelser. Konsistensen av iPSC-aggregatstørrelser kan forbedres med et stamcellepasseringsverktøy.
  7. Vask av de skivede iPSC-aggregatene med mediet i brønnen og overfør mediet med aggregater til et 15 ml konisk rør ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette eller P1000 med en bred borespiss.
  8. Skyll brønnen med DMEM/F-12 og overfør mediet til 15 ml røret med iPSC-aggregatene.
  9. Sentrifuger de skivede iPSC-aggregatene ved 200 x g i 3 minutter. Fjern supernatanten med en Pasteur-glasspipette og tilsett 2 ml hiPSC-SFM for å løsne og resuspendere iPSCene ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette eller P1000 med brede borespisser.
  10. Aspirer det gjenværende basalmembranekstraktet fra den forhåndsbelagte brønnplaten(e) og tilsett 1 ml hiPSC-SFM til hver brønn på 6-brønnsplaten.
  11. Overfør iPSCs til nye brønner på en 6-brønns plate slik at det endelige volumet er 2 ml hiPSC-SFM per brønn ved bruk av en P1000 med brede borespisser. Avhengig av iPSC-linjen må delingsforholdene optimaliseres. Her ble det brukt et delingsforhold på 1:6.
  12. Sjekk brønnen for flytende aggregater og samlet størrelse under stereomikroskopet. Ideelt sett bør aggregatstørrelsen være mellom 50-200 μm.
  13. Virvle brønnplaten for å fordele cellene jevnt over platen etter at aggregatene er overført og inkuber ved 37 °C ved 5% CO2 til 70-80% konfluens.

3. Fryser tilbake iPSCs

  1. For å fryse iPSC-celler tilbake, passasje celler som beskrevet ovenfor (se protokolltrinn "2. Passering av iPSCs"). Etter at cellene har blitt skåret i kolonier og vasket av brønnbunnen (trinn 2.10), spinn ned de skivede aggregatene ved 200 x g i 3 minutter. Aspirer supernatanten.
  2. Tilsett 1 ml serumfritt kryopreserveringsmedium per brønn av en 6-brønnsplate til 15 ml røret og resuspender de skivede aggregatene ved hjelp av en P1000 med en bred borespiss.
  3. Overfør celler til forhåndsmerkede kryorør. Lukk slangene og overfør slangen til en forkjølt kryopreserveringsbeholder ved 4 °C. Oppbevar celler ved -80 °C i 24-48 timer.
  4. Overfør kryovialer til flytende nitrogen for langtidslagring.
    MERK: En skjematisk oppsummering av OC-differensieringsprosessen er illustrert i figur 1.

4. Induksjon av embryoid kropp

  1. Dyrk og utvid tilstrekkelige iPSCer som beskrevet ovenfor for EB-induksjon.
    MERK: OC-produksjonen kan oppskaleres ved å øke antall embryoide legemer, noe som igjen gir et samlet høyere utbytte av hematopoietiske celler. En brønn på 70-80% sammenflytende iPSCer gir ca. 8,4 x 105 celler per brønn i en 6-brønns platebrønn. 12 500 encellede iPSCer trengs for å danne en embryoid kropp.
  2. Aspirer det brukte mediet fra iPSC-kulturene og skyll iPSC-koloniene med D-PBS.
  3. Tilsett 0,5 ml forvarmet til romtemperatur encellet dissosiasjonsreagens til hver brønn på en 6-brønnsplate og virvle kulturbeholderen for å belegge hele brønnoverflaten. Inkuber dyrkningsbeholderen ved 37 °C i 5-8 minutter.
  4. Fjern beholderen fra inkubatoren, aspirer enkeltcelledissosiasjonsreagenset og tilsett 1 ml av trinn 1-differensieringsmediet til brønnene, bestående av hiPSC-serumfritt medium med 50 ng / ml humant benmorfogenetisk protein 4 (hBMP4), 50 ng / ml humant vaskulært endotelial vekstfaktor-165 (hVEGF), 20 ng / ml human stamcellefaktor (hSCF), og 10 μM Y-27632.
  5. Løsne cellene forsiktig ved å skylle brønnen med trinn 1-mediet. Pool dissosierte iPSCs til et 15 ml konisk rør.
  6. Tilsett 1 ml trinn 1 differensieringsmedium til brønnene og vask eventuelle gjenværende celler av eller bruk en celleskraper for kolonier som ikke vaskes av lett.
  7. Etter overføring av alle celler til røret, sentrifuge ved 200 × g i 5 minutter ved romtemperatur for å danne en cellepellet. Aspirer og resuspender cellene i totalt 2 ml pre-equilibrert trinn 1 differensieringsmedium ved bruk av en 5 ml serologisk pipette eller en P1000 med bred borespiss.
  8. Telle celler ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celletellingsenhet. Legg mediet til 15 ml røret som inneholder enkeltcellesuspensjonen til plate 12 500 celler per brønn i en rund bunn ultra-lav vedlegg 96-brønnplate i 100 μL av trinn 1 differensieringsmedium.
    MERK: Under mikroskopet vil celler vises som en enkeltcellesuspensjon med celler spredt over hele brønnen.
  9. Sentrifuge 96-brønnsplatene i 3 minutter ved 100 x g. Etter sentrifugering skal cellene begynne å ligne sfæroider når de ses under mikroskopet. Legg platen i en 37 °C kuvøse i 24 timer.
  10. Endre halvparten av mediet på dag 1 og dag 2 med trinn 1-differensieringsmediet. For å forbedre effektiviteten, bruk en flerkanals pipette for å avhende 50 μL av det brukte trinn 1 differensieringsmediet i en petriskål.
  11. Etter å ha kastet mediet fra 96-brønnplaten, sjekk for EB under stereomikroskopet som ved et uhell kan ha blitt fjernet. Ved et uhell ble EB-er fjernet til 96-brønnsplaten ved hjelp av en P1000-pipette med brede borespisser.
  12. Tilsett 50 μL ferskt trinn 1 differensieringsmedium til hver brønn i en rund bunn 96-brønns plate med ultralavt vedlegg ved hjelp av en flerkanalspipettte.

5. Hematopoietisk differensiering

  1. En dag før du starter hematopoietisk differensiering, belegg en brønn av en 6-brønns plate med 1 ml av et basalmembranekstrakt i en konsentrasjon på 200-300 μg / ml. Plasser brønnplaten på 4 °C over natten.
    MERK: Hver brønn vil motta 8 EBs på et senere tidspunkt i denne protokollen. Avhengig av antall tilberedte EB-er, belegg brønner tilsvarende.
  2. Aspirer overflødig basalmembranekstrakt og forfyllingsbrønner på 6-brønnsplaten med 3 ml av trinn 2-differensieringsmediet, bestående av et hematopoietisk basalmedium hvor 2 mM ultraglutamin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 25 ng / ml humant interleukin 3 (hIL-3) og 100 ng / ml humant makrofagkolonistimulerende faktor (hM-CSF) tilsettes.
  3. Ved hjelp av en P1000 med brede borespisser, overfør 8 EB til hver brønn på 6-brønnsplaten. Etter overføring, bekreft med øye eller under stereomikroskopet at 8 EB er i hver brønn.
    MERK: Etter 1 dag vil de flytende EB-ene feste seg til brønnbunnen. I løpet av de neste 5-7 dagene skal en flytende cellepopulasjon bestående av hematopoietiske celler bli synlig. Den hematopoietiske differensieringsperioden kan varieres, starter med 7 dager. Differensiering i 10 dager viste en hematopoietisk populasjon bestående av store CD45+, CD14+ og CD11b+ subpopulasjoner.
  4. Etter 5 dagers behandling med trinn 2-differensieringsmediet, utfør en middels endring ved å fjerne det brukte mediet og dispensere det i et 50 ml konisk rør. Pipett sakte for å prøve å fjerne så lite flytende celler som mulig og holde skjærspenningen så lav som mulig. Pipettering under et stereomikroskop kan bidra til å unngå utilsiktet fjerning av celler.
  5. Tilsett umiddelbart 1 ml ferskt trinn 2 differensieringsmedium til brønnene. For å gjenopprette eventuelle flytende hematopoietiske celler som allerede kan være tilstede på dette punktet i differensieringsprosessen, må du ikke kaste det dispenserte mediet. Spinn heller ned røret med det brukte mediet ved 300 x g i 5 minutter, og aspirer supernatanten.
  6. Legg til nytt trinn 2 differensieringsmedium til røret og resuspender for å løsne celler som kan ha blitt overført med det brukte mediet.
  7. Tilsett 2 ml av det friske trinn 2-differensieringsmediet med de gjenvunnede cellene i hver brønn, som tidligere var fylt med 1 ml av trinn 2-differensieringsmediet.
  8. På dag 10 av hematopoietisk differensiering, kontroller for tilstedeværelsen av et stort antall flytende hematopoietiske celler. Høst ved å samle dem i et 50 ml rør. De kan enten fryses tilbake i 10% DMSO, 50% FBS og 40% medium eller brukes umiddelbart for å skille cellene i OC.

6. M-CSF modning og OC differensiering

  1. Frøceller i en konsentrasjon på 200 000 celler/cm2 på vevskulturbehandlede brønnplater og behandle med alfa-MEM, supplert med 10% FBS og 50 ng/ml hM-CSF.
  2. For å utføre funksjonelle analyser eller avbildning, løsne M-CSF modne celler 3 dager etter såing ved vask med forvarmet PBS til 37 °C ved bruk av en P1000 med bred borespiss. Gjentatte vasketrinn kan være nødvendig for å løsne celler helt.
  3. Overfør de frittliggende cellene til et 15 ml rør ved hjelp av en P1000 med bred borespiss og sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter. Kast supernatanten.
  4. Resuspendere og oppløse cellepelleten med OC differensieringsmediet, bestående av alfa-MEM supplert med 10% FBS, 50 ng / ml hM-CSF og 80 ng / ml hRANKL. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celletellingsenhet og frø M-CSF modne celler med en tetthet på 200,00-250,000 celler / cm2 i en passende kultur ware for funksjonelle analyser eller avbildning (dvs. benresorpsjonsanalyser, coverslip lysbilder for avbildning, etc.).
  5. Differensiere med OC differensieringsmediet i 7-9 dager. Utfør en komplett brønnmiddelendring med det ferske OC-differensieringsmediet hver 2-3 dag.
    MERK: Multinukleerte OC-er vises vanligvis etter 5-7 dager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overvåking av cellemorfologi gjennom differensieringsprosessen
Alle resultatene beskrevet nedenfor ble generert ved hjelp av MCND-TENS2 iPSC-linjen for OC-differensiering. Denne iPSC-linjen har tidligere blitt brukt i flere studier32,33. Likevel har andre iPSC-linjer også blitt brukt med denne differensieringsprotokollen.

Regelmessig visuell vurdering avslører forskjellige og distinkte morfologiske egenskaper ved iPSCs gjennom differensieringsprosessen til OCs (figur 2). iPSC-kolonier (figur 2A) ble dissosiert til en encellesuspensjon, som opptrer som individuelle celler gjennom den runde bunnbrønnplaten før sentrifugering (figur 2B). Etter sentrifugering (trinn 4.9 i protokollen) vil celler samle seg i midten av den runde bunnens ultra-lave festebrønnplate og deretter danne kuler (embryoidlegemer, EB, figur 2C). EB vil øke to til tre ganger i størrelse gjennom hele den mesodermale differensieringsprosessen (figur 2D) og bli lett synlig for øyet ved slutten av 4-dagers differensieringsperioden (figur 2E). EB kan sees feste og smelte sammen med brønnplatebunnen etter overføring til brønner av en 6-brønnsplate for hematopoietisk differensiering (trinn 5.3 i protokollen, figur 2F). Etter 7-8 dager blir store mengder flytende hematopoietiske celler synlige i kulturmediet (figur 2G). Etter høsting og replating av hematopoietiske celler følger en M-CSF modningsfase, og OC differensiering initieres (trinn 6.4 i protokollen). I løpet av 5-6 dager blir flerkjernede celler med en stor gjennomsiktig cellekropp først synlige (figur 2H). Et stort antall mononukleære celler er fortsatt synlige på dette stadiet. Etter 2-3 dager med OC-differensiering, vil OC-er ytterligere smelte sammen med tilstøtende celler for å danne store polykarioner med enda flere kjerner (figur 2I).

Vurdering av den EB-deriverte hematopoietiske populasjonen
Hematopoietisk differensiering kan utføres i variabel tidsperiode. Tidsperioder som starter med 7 dager opp til 9 uker er beskrevet i litteraturen. I denne protokollen utføres hematopoietisk differensiering i en periode på 10 dager. Vi fant at 10 dager med hematopoietisk differensiering ga lavt antall tidlige CD34+ (0,53%, figur 3A) og et større antall CD43+ (48,5%, figur 3B) hematopoietiske progenitorer. Mer kritisk ble tilstrekkelige mengder CD45+ (96,2 %, figur 3C), CD14+ (33 %, figur 3D) og CD11b+ (35,9 %, figur 3E) HPC generert etter en behandlingsperiode på 10 dager for å kunne differensiere dem ytterligere til OC. Imidlertid kan det hende at cytokinbehandlingsperioden for hematopoietisk differensiering (trinn 5.4 i protokollen) må justeres og optimaliseres basert på iPSC-linjen for å generere tilstrekkelige mengder CD45+-, CD14+- og CD11b+ -celler.

I gjennomsnitt ble 6 millioner hematopoietiske celler høstet etter 10 dagers differensiering fra hver brønn med 8 EB.

Vurdering av OC-morfologi og aktivitet
Etter OC-differensiering kan p-piller vurderes morfologisk og funksjonelt. OC-forløpere blir sådd på kammerlysbilder eller coverslip-lysbilder etter M-CSF-modningstrinnet for å forbedre bildekvaliteten ved farging for TRAP eller Cathepsin K. Enzymatisk TRAP-farging etter OC-differensiering viser store, multinukleerte, TRAP-positive OC-er (figur 4A). I tillegg kan litt TRAP-positive mononukleære celler sees ispedd multinukleære OC-er. Negative kontroller uten tillegg av RANKL viser ikke smeltet multinukleær OC. Likevel kan et lite antall lett TRAP-positive mononukleære celler avbildes (figur 4B).

Konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) bilder viser OCs farget for Cathepsin K (turkis) og F-aktin (rød) i forbindelse med DAPI kjernefysisk flekk (blå) (figur 4C, 4D). Store multinukleære p-piller er synlige ved behandling med RANKL i henhold til protokollen, som viser en omfattende F-aktin cytoskjelettstruktur og flekkpositiv for Cathepsin K (figur 4C). Negative kontroller uten tillegg av RANKL, derimot, viser ikke smeltede multinukleære celler.

P-piller kan vurderes videre funksjonelt ved å måle resorptivaktiviteten. Ben- eller mineralresorpsjonsanalyser kan brukes til å bestemme resorptiv aktivitet. Her ble OC-forløpere sådd på kalsiumfosfatbelagte brønner og terminalt differensiert. Store områder hvor mineralbelegget ble resorbert, er synlige i en blåaktig grå farge (figur 4E). Resorpsjonsgroper av forskjellige størrelser kan identifiseres. Ikke resorbert, det gjenværende kalsiumfosfatbelegget er synlig i brunt. Tilstedeværelsen av resorpsjonsgroper bekrefter identiteten til de differensierte multinukleerte cellene som OC. I tillegg kan resorpsjonsgroper videre kvantifiseres for å vurdere og sammenligne resorptiv aktivitet. Det totale arealet av resorbert mineral over det totale brønnflatearealet kan kvantifiseres som et prosentmål. I tillegg kan størrelsen og antallet resorpsjonsgroper videre kvantifiseres. Ubehandlede negative kontroller viste ikke resorpsjonsgroper (figur 4F).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av osteoklastdifferensieringsprosessen fra humane iPSCer. Illustrasjon tegnet av Hannah Blümke med Affinity Designer 2.1.1. Illustrasjonen benytter tidligere brukte tegninger33. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Mikroskopibilder gjennom differensieringsprosessen av humane iPSCer mot osteoklaster. (A) Udifferensierte iPSC-kolonier gjennom forplantning. (B) iPSCer i rundbunnsbrønner etter dissosiasjon til en enkeltcellesuspensjon før sentrifugering. (C) Sentralt innsamlede encellede iPSCer etter sentrifugering. (D) EB vokser i størrelse gjennom hele 4-dagers mesodermal differensieringsperioden. (E) Synlige embryoidlegemer etter mesodermal differensiering. (F) Etter overføring av embryoide legemer til basalmembranekstraktbelagte 6-brønnsplater, kan embryoidlegemer sees feste og smelte sammen med brønnbunnen. (G) Etter 5-7 dager med hematopoietisk differensiering kan et stort antall flytende hematopoietiske celler observeres i mediet. (H) Etter modning av M-CSF opptrer de første osteoklastene med 3-4 kjerner etter 5-7 dagers differensiering med RANKL. (I) På slutten av osteoklastdifferensiering kan store multinukleerte celler observeres. Skalastolper: A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Overflatemarkøranalyse av embryoide hematopoietiske celler fra embryoide legemer ved hjelp av flowcytometri. Markøruttrykk tillater analyse av hematopoietiske celler og identifisering av underpopulasjoner etter gating for singleter og levende celler. (A) Ontogenetisk tidlig CD34+ hematopoietisk stamcellepopulasjon er svært liten til fraværende i forbindelse med denne protokollen. (B) CD43+ celler utgjør ca. 50 % av hele befolkningen. (C) Senere stadium CD45+ hematopoietiske stamceller utgjør den største delen av den hematopoietiske populasjonen med 96,2%. (D, E) Mer direkte CD14+ og CD11b+ OC-forløpere utgjør henholdsvis 33 % og 36 %. I rødt: ufarget negativ kontroll, i blått: isotypekontroller, i gult: celler farget med det respektive markørantistoffet. Plott bruker tidligere publiserte data33. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Morfologisk og funksjonell vurdering av iPSC-differensierte humane osteoklaster. (A) TRAP-farging etter osteoklastdifferensiering viser store, multinukleerte, TRAP-positive osteoklaster. Litt TRAP positive mononukleære celler kan sees ispedd mellom multinukleære osteoklaster. (B) Negative kontroller uten tillegg av RANKL farget for TRAP viser ikke smeltede multinukleære osteoklaster. Likevel kan et lite antall litt TRAP-positive, mononukleære celler avbildes. (C) Konfokal laserskanningsmikroskopibilder av osteoklastdifferensierte hematopoietiske celler på et deksellysbilde farget for F-aktin (rød) og Cathepsin K (turkis) i forbindelse med DAPI kjernefysisk flekk (blå) viser store multinukleerte Cathepsin K-positive osteoklaster. (D) Negative kontroller uten tillegg av RANKL viser tilsvarende (B) mononukleære celler ved lavere celletetthet. (E) Funksjonsvurdering kan utføres ved å vurdere osteoklasters resorpsjonsaktivitet. For dette utføres osteoklastdifferensiering på en bein- eller mineralresorpsjonsanalyse. Flislagte brønnbilder tatt med et invertert bredfeltsmikroskop i fasekontrastmodus viser store resorpsjonsområder av kalsiumfosfatminerallaget. Resorptiv aktivitet kan kvantifiseres ytterligere ved å måle resorpsjonsområdet over det totale arealet. (F) Negative kontroller uten tillegg av RANKL viser ikke resorpsjonsområder. Skalastenger: A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. Bildene er redigert fra tidligere publiserte data33. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen tilbyr en pålitelig og robust metode for å skille iPSCer i OCC-er. Likevel er det flere fallgruver som kan oppstå gjennom differensieringsprosessen. Humane iPSC-linjer generert fra celler med forskjellig vevsopprinnelse har blitt differensiert ved hjelp av denne protokollen33. Ved frysing av iPSCs (se protokolltrinn "3. Fryser tilbake iPSCs"), ble en brønn på passasjepunktet frosset tilbake til en cryovial. Ved tining (se protokolltrinn "1. Tining og forplantning av humane iPSCs"), ble en kryovial tint i en enkelt brønn på en 6-brønnsplate. Ulike iPSC-linjer vil oppføre seg litt annerledes, og spredningshastighetene vil variere. Delingsraten må justeres tilsvarende.

Ved passering av iPSCs eller dissosiering av iPSCs til en encellet suspensjon for EB-induksjon, er det viktig å fjerne spontant differensierte kolonier eller aggregater av døde celler for å forbedre effektiviteten av mesodermal og hematopoietisk differensiering. Dette kan gjøres under et stereomikroskop ved å bruke en celleskrape, pipettespisser fra en P10- eller P20-pipette, eller et skrapeverktøy bygget av en Pasteur-pipette35.

Som nevnt ovenfor innebærer denne protokollen dissosiasjon av iPSC-kolonier til en encellesuspensjon for EB-induksjon, mens med andre protokoller blir iPSCer igjen som aggregater som skal sentrifugeres for EB-induksjon36. EB-størrelse, celleantall, form og morfologi har alle blitt rapportert å påvirke differensiering 37,38,39. Dermed hypoteser vi at dissosiasjonen i en enkeltcellesuspensjon muliggjør bedre EB-til-EB-ensartethet i størrelse og form etter sentrifugering og dermed mer konsistente resultater av hematopoietisk celleproduksjon31.

Andre metoder for EB-induksjon er beskrevet. Slike metoder som bruker en enkeltcellesuspensjon i forbindelse med ROCK-hemmer for å forbedre celleoverlevelse, har blitt rapportert å være fordelaktige for å kontrollere EB-størrelse og differensieringsutfall31.

Den rundbunns 96-brønns plate EB-induksjonsmetoden beskrevet i denne protokollen er egnet for storskala produksjon av EB-er og muliggjør oppskalering av OC-produksjon. Flere nye metoder for hematopoietisk differensiering uten et embryoid kroppsinduksjonstrinn med potensial til å lette differensieringsprosessen er nylig beskrevet32. Likevel er disse protokollene ennå ikke etablert for OC differensiering33.

I ovennevnte protokoll beskriver vi mediumendringen på dag 5 av hematopoietisk differensiering. Et lite antall flytende celler kan allerede vises rundt dag 4-5 av differensiering. For å unngå å kaste bort flytende celler, bør mediet samles i et rør og sentrifugeres før det kastes. Cellepelleten i bunnen av røret må deretter løsnes med det friske mediet og skal overføres tilbake til brønner på en 6-brønnsplate. Betydningen av den tidlige flytende cellepopulasjonen i OC-differensiering må imidlertid fortsatt bestemmes.

Produksjonen av hematopoietiske celler kan vurderes ved hjelp av flowcytometri. Høyt utbytte av CD45+, CD14+ og CD11b+ celler er ønskelig for osteoklastdifferensiering33. Kryopreservering av høstede flytende hematopoietiske celler har blitt rapportert å være utfordrende med generelt begrenset utvinningsgrad og lav celle levedyktighet40,41. Ved å kryopreservere hematopoietiske celler i et kryopreserveringsmedium bestående av 50% av et serumfritt hematopoietisk celleekspansjonsmedium (se materialtabell), 40% FBS og 10% DMSO, var vi i stand til å gjenopprette celler med en cellelevedyktighet på ca. 90,3% ± 2,62 SD (n = 7) etter tining.

Osteoklastogenese krever fusjon av flere mononukleerte OC-forløpere for å danne multinukleerte osteoklaster som er i stand til mineral- og benresorpsjon. Mens murine OC-forløpercellelinjer bare trenger tillegg av RANKL for å indusere OC-dannelse42, krever menneskelige forløpere ytterligere M-CSF for celleoverlevelse og spredning43. OSCAR har nylig blitt oppdaget som en ekstra reseptor involvert i OC-differensiering, selv om bare type I kollagen hittil har blitt identifisert som en ligand. Mens forskning på OSCAR med iPSC-deriverte p-piller fortsatt er begrenset, synes suprafysiologiske in vitro RANKL- og M-CSF-konsentrasjoner i en murine cellelinje å omgå nødvendigheten av OSCAR-aktivering44, synes aktivering av OSCAR in vivo å være et nødvendig kostimulerende signal for osteoklastogenese45. En ekstra faktor som må vurderes er brønnplateoverflaten. Kjemiske46 og fysiske47 overflateegenskaper er kjent for å påvirke osteoklastdifferensiering og kan enten fremme eller hindre vellykket differensiering. En viss heterogenitet i forløperpopulasjonen synes også å være kritisk for vellykket fusjon av OC, da ulike fusjonsrelaterte faktorer som CD47 og DC-STAMP virker på forskjellige stadier av osteoklastfusjon48.

Avslutningsvis muliggjør denne protokollen differensiering av human OC fra iPSCs for å lette og akselerere OC-forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke medlemmene av Giachelli lab for deres tekniske hjelp og støtte. Vi takker WM Keck Microscopy Center og Keck Center manager, Dr. Nathanial Peters, for hjelp til å skaffe konfokal mikroskopi og widefield mikroskopi bilder. Vi takker også UW Flow Core Facility og lederen for Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, for teknisk støtte og assistanse. Til slutt takker vi Hannah Blümke for støtten med illustrasjon og grafisk design.

Finansiering ble gitt gjennom National Institutes of Health grant R35 HL139602-01. Vi anerkjenner også NIH S10 tilskudd S10 OD016240 for instrumentfinansiering ved WM Keck Center samt NIH tilskudd 1S10OD024979-01A1 for instrumentfinansiering ved UW Flow Core Facility.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K  Abcam ab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45 BD 555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14 BD 563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD 563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 Abcam ab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14 R&D Systems FAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b R&D Systems FAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 BD 560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b Biolegend 301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Biolegend 400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 BD 563521
Bone Resorption Assay Kit CosmoBioUSA CSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher 16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract R&D Sytems 3434-010-02 Basal membrane extract
DAPI R&D Systems 5748/10
Dispase (5 U/mL) STEMCELL Technologies 7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Stem Cell 36254
DMSO Sigma Aldrich D2650
DPBS Sigma Aldrich D8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) STEMCELL Technologies 78211
Human IL-3 STEMCELL Technologies 78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) STEMCELL Technologies 78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) STEMCELL Technologies 78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF) STEMCELL Technologies 78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) Biolegend 422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) STEMCELL Technologies 78073
Invitrogen Rhodamine Phalloidin Invitrogen R415
MEM α, nucleosides, no phenol red ThermoFisher 41061029
mFreSR STEMCELL Technologies 05855 Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus medium STEMCELL Technologies 100-0276 Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Thermo Scientific 174925 Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore Tips ThermoFisher 2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632 STEMCELL Technologies 72304
StemSpan SFEM StemCell 09650 Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red Thermo Fisher 12563011 Single-cell dissociation reagent
Ultraglutamine Bioscience Lonza BE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Bioscience Lonza 04-418Q Hematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well High Ibidi 80806

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
  2. Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
  3. Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
  4. Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
  5. Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
  6. Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
  7. Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
  8. Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
  9. Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
  10. Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
  11. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
  12. Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
  13. Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
  14. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  15. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  16. Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35 (2015).
  17. Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
  18. Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
  19. Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
  20. Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
  21. Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
  22. Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
  23. Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
  24. Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
  25. Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
  26. Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
  27. Chen, I. -P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
  28. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  29. Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
  30. Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
  31. Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
  32. Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
  33. Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
  34. Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
  35. Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
  36. Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
  37. Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
  38. Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
  39. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  40. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
  41. Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
  42. Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
  43. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  44. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
  45. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
  46. Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
  47. Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
  48. Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 205
Differensiering og karakterisering av osteoklaster fra humane induserte pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blümke, A., Simon, J., Leber,… More

Blümke, A., Simon, J., Leber, E., Scatena, M., Giachelli, C. M. Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (205), e66527, doi:10.3791/66527 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter