Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Differentiering og karakterisering af osteoklaster fra humant inducerede pluripotente stamceller

Published: March 22, 2024 doi: 10.3791/66527
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

Summary

Denne protokol præsenterer differentieringen af humane osteoklaster fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) og beskriver metoder til karakterisering af osteoklaster og osteoklastprækursorer.

Abstract

Denne protokol beskriver udbredelsen og overførslen af humane iPSC'er og deres differentiering i osteoklaster. For det første dissocieres iPSC'er i en enkeltcellesuspension til videre anvendelse i embryoid kropsinduktion. Efter mesodermal induktion gennemgår embryoidlegemer hæmatopoietisk differentiering, hvilket producerer en flydende hæmatopoietisk cellepopulation. Derefter gennemgår de høstede hæmatopoietiske celler et makrofagkolonistimulerende faktormodningstrin og endelig osteoklastdifferentiering. Efter osteoklastdifferentiering er osteoklaster karakteriseret ved farvning til TRAP i forbindelse med en methylgrøn nuklear plet. Osteoklaster observeres som multinucleated, TRAP + polykaryoner. Deres identifikation kan understøttes yderligere af Cathepsin K-farvning. Knogler og mineraleresorptionsassays muliggør funktionel karakterisering, hvilket bekræfter identiteten af bona fide osteoklaster. Denne protokol demonstrerer en robust og alsidig metode til at differentiere humane osteoklaster fra iPSC'er og giver mulighed for nem anvendelse i applikationer, der kræver store mængder funktionelle humane osteoklaster. Anvendelser inden for knogleforskning, kræftforskning, vævsteknik og endoprosteseforskning kunne forestilles.

Introduction

Osteoklaster (OC'er) er hæmatopoietisk afledte 1,2, alsidige celletyper, der almindeligvis anvendes af forskere inden for områder som knoglesygdomsforskning 3,4, kræftforskning 5,6, vævsteknik 7,8 og endoprosteseforskning 9,10. Ikke desto mindre kan OC-differentiering være udfordrende, da fusion af mononukleære prækursorer til multinucleated OC'er er nødvendig for at skabe funktionelle OC'er11. Flere biologiske faktorer, såsom receptoraktivator af NF-κB ligand (RANKL) og makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF), er nødvendige for OC-differentiering. M-CSF er blevet rapporteret at have en positiv effekt på celleproliferation, celleoverlevelse og RANK-ekspression 12,13,14. På den anden side binder RANKL til RANK, som aktiverer nedstrøms signalkaskader, der inducerer osteoklastogenese. Aktivering medieres via TNF-receptorassocieret faktor 6 (TRAF6), hvilket fører til nedbrydning af nuklear faktor af kappa light polypeptid gene enhancer i B-celleinhibitor, alfa (IκB-α), et bindende protein, der binder NF-kB dimerer16,17. Derfor frigiver IκB-α nedbrydning NF-kB-dimerer, som derefter translokerer ind i kernen og inducerer ekspressionen af transkriptionsfaktorerne c-Fos og nuklear faktor for aktiverede T-celler 1 (NFATc1). Dette udløser igen transkriptionen af en lang række OC-differentieringsrelaterede proteiner15,18. Opregulerede proteiner såsom DC-stempel og Atp6v0d2 medierer celle-cellefusion af OC-prækursorer, hvilket fører til syncytiumdannelse 19,20,21.

Med hensyn til humane primære celler er CD34+ og CD14+ PBMC'er i øjeblikket de mest anvendte celletyper til differentiering i OC'er22. Denne tilgang er imidlertid begrænset af heterogeniteten inden for CD34+ -populationen af høstede celler fra donorer23 og deres begrænsede udvidelsesmuligheder. Menneskelige iPSC'er udgør en alternativ kilde til OC'er. Da de kan formeres på ubestemt tid24, giver de mulighed for udvidelse og opskalering af OC-produktion. Dette giver mulighed for differentiering af et stort antal OC'er, hvilket letter OC-forskning.

Flere protokoller til differentiering af iPSC'er i OC'er er blevet offentliggjort 25,26,27. Hele differentieringsprocessen kan opdeles i en iPSC-formeringsdel, en mesodermal og hæmatopoietisk differentieringsdel og OC-differentiering. Formering af iPSC'er før differentieringsprocessen giver mulighed for opskalering af OC-produktion inden differentiering. Der findes flere tilgange til mesodermal og hæmatopoietisk differentiering. Traditionelt er embryoid kropsdannelse (EB) blevet brugt til at differentiere hæmatopoietiske celler, men monolagsbaserede tilgange repræsenterer en anden hæmatopoietisk differentieringsstrategi, der ikke kræver EB-induktion. Ikke desto mindre synes enkeltlagsbaserede systemer at kræve yderligere optimering, da vi og andre har fundet EB-baserede tilgange til at være mere robuste til differentiering af OC'er.

Her beskriver vi differentieringen af OC'er fra humane iPSC'er ved hjælp af en EB-baseret protokol. Denne protokol blev tilpasset fra Rössler et al.26 og modificeret for at øge robustheden og muliggøre kryopræservering under differentieringsprocessen. For det første høstede vi hæmatopoietiske celler kun én gang efter 10 dages differentiering. Hæmatopoietiske celler blev derefter kryopræserveret for at give mulighed for mere fleksibilitet under differentieringsprocessen. Derudover øgede vi den hæmatopoietiske cellesåtæthed fra 1 x 105 til 2 x 105 celler / cm2 for OC-differentiering. Et nyere humant iPSC-serumfrit medium (hiPSC-SFM, se materialetabel) blev anvendt, og belægning af brønde blev udført med 200-300 μg/ml basalmembranekstrakt (se materialetabel) i stedet for 0,1% gelatine. Penicillin/streptomycin blev ikke tilsat medierne.

Protokollen af Rössler et al.26 blev oprindeligt tilpasset fra en iPSC til en makrofagdifferentieringsprotokol28, der bruger EB-dannelse til hæmatopoietisk differentiering. Mens EB-dannelse er blevet brugt i længere tid af forskere til hæmatopoietisk differentiering29,30, er flere metoder til EB-induktion blevet beskrevet i litteraturen, såsom spontan aggregering, centrifugering i en rundbundet brøndplade, hængende dråbekultur, bioreaktorkultur, konisk rørkultur, langsomt drejende lateral beholder og mikroskimmelgelkultur31. Denne protokol anvender centrifugering af dissocierede iPSC'er i en rundbundet brøndplade for at bringe enkelte iPSC-celler i nærheden af hinanden og for at muliggøre kugledannelse (EB) som beskrevet nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle reagenser, der anvendes i denne protokol, findes i materialetabellen. Medmindre andet er angivet, var alle medier præekvilibreret til 37 °C før brug. Alle centrifugeringstrin udføres ved 37 °C og ved anvendelse af den langsomste accelerations-/decelerationstilstand. Medmindre andet er angivet, fjernes supernatanten altid med engangspipetter af Pasteur-glas.

1. Optøning og formering af humane iPSC'er

  1. En dag før optøning af iPSC'er skal du belægge en brønd med en 6-brønds plade med 1 ml basalmembranekstrakt i en koncentration på 200-300 μg / ml. Brøndpladen anbringes ved 4 °C natten over.
  2. Næste dag tøes op og overføres cellerne til et 15 ml rør ved hjælp af en P1000-pipette. Tilsæt 5-7 ml DMEM/F-12 med 15 mM HEPES.
  3. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 min. Fjern forsigtigt cellerne fra centrifugen, og sørg for ikke at forstyrre cellepelleten.
  4. Supernatanten fjernes forsigtigt med en Pasteur-glaspipette og resuspenderes cellerne i 1 ml hiPSC-serumfrit substrat (hiPSC-SFM indeholdende 10 μM Rho-kinase (ROCK)-hæmmer Y-27632) ved hjælp af P1000 med brede borespidser.
  5. Basalmembranekstraktet suges op fra den brønd, der blev belagt den foregående dag (trin 1.1), og 1 ml hiPSC-SFM overføres med 10 μM Y-27632 til brønden. Tilsæt resuspenderede iPSC'er til brønden for at nå et slutvolumen på 2 ml pr. Brønd.
  6. Pladen hvirvles rundt, så iPSC-aggregaterne fordeles jævnt, inden de anbringes i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
  7. Udfør fulde medieskift hver anden dag ved hjælp af hiPSC-SFM (uden tilsætning af ROCK-hæmmer Y-27632). iPSC'er når normalt 70-80% sammenløb efter 3-4 dages formering.

2. Bestået iPSC'er

  1. En dag før iPSC'er passeres, skal du belægge brønde af en 6-brønds plade med et basalmembranekstrakt i en koncentration på 200-300 μg/ml. Brøndpladen anbringes ved 4 °C natten over.
    BEMÆRK: Bekræft, at cellerne har nået ca. 70-80% sammenløb. Sørg for, at iPSC'er ikke bliver oversammenflydende (mere end 80% sammenløb), da dette vil fremme spontan differentiering.
  2. Begynd at overføre iPSC'er ved at fjerne differentierede regioner eller områder med mange døde iPSC-aggregater under stereomikroskopet ved hjælp af 10 μL eller 20 μL pipettespidser eller en celleskraber. Differentierede områder vises tættere eller hvidere i farven.
    BEMÆRK: Afskrabede celleaggregater kan stadig delvist fastgøres til brøndbunden.
  3. Vask brøndbunden flere gange med en P1000-pipette med bred boring for at fjerne eventuelle aggregater, der stadig delvist kan være fastgjort til brøndens bund.
  4. Kassér det brugte medium, hvori iPSC'erne er dyrket, og som indeholder de løsrevne iPSC-aggregater. Gentag vasketrinnet to gange mere med fosfatbufret saltvand (PBS).
  5. Derefter tilsættes 1 ml 5 E / ml Dispase pr. Hul. Kanterne af iPSC-kolonierne løftes fra brøndpladen, som kan observeres under stereomikroskopet efter 3-5 minutters inkubation ved stuetemperatur.
  6. Fjern forsigtigt Dispase for at undgå at løsne let løsrevne aggregater, og tilsæt 1 ml DMEM/F-12 med 15 mM HEPES. Brug en engangscelleløfter til at skære aggregaterne i små størrelser. Konsistensen af iPSC-aggregatstørrelser kan forbedres med et stamcelleoverførselsværktøj.
  7. De skiveskårne iPSC-aggregater vaskes af med mediet i brønden, og mediet med aggregater overføres til et 15 ml konisk rør ved hjælp af en 5 ml serologisk pipette eller P1000 med en bred borespids.
  8. Skyl brønden med DMEM/F-12 og overfør mediet til 15 ml røret med iPSC-aggregaterne.
  9. De skiveskårne iPSC-aggregater centrifugeres ved 200 x g i 3 minutter. Supernatanten fjernes med en Pasteur-glaspipette, og der tilsættes 2 ml hiPSC-SFM for at løsne og resuspendere iPSC'erne ved hjælp af en 5 ml serologisk pipette eller P1000 med bred borespids.
  10. Det resterende basalmembranekstrakt suges ud af de(n) forbehandlede brøndplade(r), og der tilsættes 1 ml hiPSC-SFM til hvert hul i 6-brøndspladen.
  11. Overfør iPSC'er til nye brønde i en 6-brønds plade, så det endelige volumen er 2 ml hiPSC-SFM pr. brønd ved hjælp af en P1000 med brede borespidser. Afhængigt af iPSC-linjen skal splitforholdene optimeres. Her blev der brugt et 1:6 splitforhold.
  12. Kontroller brønden for flydende aggregater og aggregatstørrelse under stereomikroskopet. Ideelt set bør den samlede størrelse være mellem 50-200 μm.
  13. Brøndpladen hvirvles rundt for at fordele cellerne jævnt over pladen, efter at aggregaterne er overført, og inkuberes ved 37 °C ved 5 % CO2 indtil 70-80 % sammenløb.

3. Frysning af iPSC'er

  1. For at fryse iPSC-celler tilbage, passage celler som beskrevet ovenfor (se protokol trin "2. Overførsel af iPSC'er"). Efter at cellerne er skåret i kolonier og vasket af brøndbunden (trin 2.10), drejes de skivede aggregater ned ved 200 x g i 3 minutter. Opsug supernatanten.
  2. Der tilsættes 1 ml serumfrit kryopræserveringsmedium pr. hul i en 6-brønds plade til 15 ml røret, og de skiveskårne aggregater resuspenderes ved hjælp af en P1000 med en bred borespids.
  3. Overfør celler til forudmærkede kryorør. Rør lukkes og overføres til en forkølet kryopræserveringsbeholder ved 4 °C. Opbevar celler ved -80 °C i 24-48 timer.
  4. Overfør cryovials til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
    BEMÆRK: En skematisk oversigt over OC-differentieringsprocessen er illustreret i figur 1.

4. Embryoid kropsinduktion

  1. Dyrk og udvid tilstrækkelige iPSC'er som beskrevet ovenfor til EB-induktion.
    BEMÆRK: OC-produktion kan opskaleres ved at øge antallet af embryoide legemer, hvilket igen producerer et samlet højere udbytte af hæmatopoietiske celler. En brønd med 70-80% sammenflydende iPSC'er giver ca. 8,4 x 105 celler pr. brønd i en 6-brønds pladebrønd. 12.500 enkeltcellede iPSC'er er nødvendige for at danne et embryoidlegeme.
  2. Det brugte substrat suges ud af iPSC-kulturerne, og iPSC-kolonierne skylles med D-PBS.
  3. Tilsæt 0,5 ml forvarmet til stuetemperatur enkeltcelledissociationsreagens til hver brønd i en 6-brøndplade og hvirvl kulturbeholderen for at belægge hele brøndoverfladen. Kuber kulturbeholderen ved 37 °C i 5-8 min.
  4. Beholderen fjernes fra inkubatoren, der suges til enkeltcelledissociationsreagenset, og der tilsættes 1 ml af trin 1-differentieringsmediet til hullerne, bestående af hiPSC-serumfrit substrat med 50 ng/ml humant knoglemorfogenetisk protein 4 (hBMP4), 50 ng/ml human vaskulær endotelvækstfaktor-165 (hVEGF), 20 ng/ml human stamcellefaktor (hSCF) og 10 μM Y-27632.
  5. Fjern forsigtigt cellerne ved at skylle brønden med trin 1-mediet. Pool dissocierede iPSC'er i et 15 ml konisk rør.
  6. Tilsæt 1 ml trin 1-differentieringsmedium til brøndene, og vask eventuelle resterende celler af, eller brug en celleskraber til kolonier, der ikke let vaskes af.
  7. Efter overførsel af alle celler til røret centrifugeres ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur for at danne en cellepille. Opsug og resuspender cellerne i i alt 2 ml præækvilibreret trin 1-differentieringsmedium ved hjælp af en 5 ml serologisk pipette eller en P1000 med en bred borespids.
  8. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer eller automatiseret celletællingsenhed. Tilsæt mediet til 15 ml røret indeholdende enkeltcellesuspensionen til plade 12.500 celler pr. hul i en rundbundet ultra-lav fastgørelsesplade med 96 brønde i 100 μL af trin 1-differentieringsmediet.
    BEMÆRK: Under mikroskopet vises celler som en enkeltcellesuspension med celler spredt gennem brønden.
  9. Pladerne med 96 brønde centrifugeres i 3 minutter ved 100 x g. Efter centrifugering skal cellerne begynde at ligne sfæroider, når de ses under mikroskopet. Pladen anbringes i en 37 °C inkubator i 24 timer.
  10. Skift halvdelen af mediet på dag 1 og dag 2 med trin 1-differentieringsmediet. For at forbedre effektiviteten skal du bruge en multikanalpipette til at bortskaffe 50 μL af det brugte trin 1-differentieringsmedium i en petriskål.
  11. Efter bortskaffelse af mediet fra 96-brøndspladen skal du kontrollere, om der er EB'er under stereomikroskopet, der ved et uheld kan være blevet fjernet. Overfør utilsigtet fjernede EB'er til 96-brøndpladen ved hjælp af en P1000-pipette med brede borespidser.
  12. Der tilsættes 50 μL frisk trin 1-differentieringsmedium til hvert hul i en rundbundet 96-brønds plade med ultralav fastgørelse ved hjælp af en multikanalpipette.

5. Hæmatopoietisk differentiering

  1. En dag før start af hæmatopoietisk differentiering skal du belægge en brønd med en 6-brønds plade med 1 ml basalmembranekstrakt i en koncentration på 200-300 μg / ml. Brøndpladen anbringes ved 4 °C natten over.
    BEMÆRK: Hver brønd modtager 8 EB'er på et senere tidspunkt i denne protokol. Afhængigt af antallet af forberedte EB'er skal du belægge brønde tilsvarende.
  2. Det overskydende basalmembranekstrakt og forfyldningshullerne i 6-brøndpladen opsuges med 3 ml trin 2-differentieringsmedium, der består af et hæmatopoietisk basalmedium, hvortil der tilsættes 2 mM ultraglutamin, 55 μM 2-mercaptoethanol, 25 ng/ml humant interleukin 3 (hIL-3) og 100 ng/ml human makrofagkolonistimulerende faktor (hM-CSF).
  3. Brug en P1000 med brede borespidser til at overføre 8 EB'er til hver brønd på 6-brøndspladen. Efter overførsel skal du bekræfte med øjet eller under stereomikroskopet, at der er 8 EB'er i hver brønd.
    BEMÆRK: Efter 1 dag klæber de flydende EB'er til brøndbunden. I de følgende 5-7 dage skal en flydende cellepopulation bestående af hæmatopoietiske celler blive synlig. Den hæmatopoietiske differentieringsperiode kan varieres, begyndende med 7 dage. Differentiering i 10 dage viste en hæmatopoietisk population bestående af store CD45+, CD14+ og CD11b+ subpopulationer.
  4. Efter 5 dages behandling med trin 2-differentieringsmediet udføres en medieændring ved at fjerne det brugte medium og dispensere det i et 50 ml konisk rør. Pipetten pipetteres langsomt for at forsøge at fjerne så lidt flydende celler som muligt og holde forskydningsspændingen så lav som muligt. Pipettering under et stereomikroskop kan hjælpe med at undgå utilsigtet fjernelse af celler.
  5. Tilsæt straks 1 ml frisk trin 2-differentieringsmedium til hullerne. For at genvinde eventuelle flydende hæmatopoietiske celler, der allerede kan være til stede på dette tidspunkt i differentieringsprocessen, må du ikke kassere det dispenserede medium. Drej i stedet røret ned med det brugte medium ved 300 x g i 5 minutter, og sug supernatanten op.
  6. Tilsæt frisk trin 2-differentieringsmedium til røret og resuspender for at løsne celler, der muligvis er blevet overført med det brugte medium.
  7. Tilsæt 2 ml af det friske trin 2-differentieringsmedium med de genvundne celler i hvert hul, som tidligere var fyldt med 1 ml af trin 2-differentieringsmediet.
  8. På dag 10 af hæmatopoietisk differentiering skal du kontrollere tilstedeværelsen af et stort antal flydende hæmatopoietiske celler. Høst ved at samle dem i et 50 ml rør. De kan enten fryses tilbage i 10% DMSO, 50% FBS og 40% medium eller bruges straks til at differentiere cellerne i OC'er.

6. M-CSF-modning og OC-differentiering

  1. Frøceller i en koncentration på 200.000 celler/cm2 på vævskultur behandlede brøndplader og behandles med alfa-MEM, suppleret med 10% FBS og 50 ng/ml hM-CSF.
  2. For at udføre funktionelle assays eller billeddannelse løsnes de M-CSF-modne celler 3 dage efter såning ved vask med forvarmet PBS til 37 °C ved hjælp af en P1000 med en bred borespids. Gentagne vasketrin kan være nødvendige for at løsne cellerne helt.
  3. Overfør de løsrevne celler til et 15 ml rør ved hjælp af en P1000 med en bred borespids og centrifuger ved 300 x g i 5 minutter. Supernatanten kasseres.
  4. Cellepelleten resuspenderes og opløses med OC-differentieringsmediet, der består af alfa-MEM suppleret med 10% FBS, 50 ng/ml hM-CSF og 80 ng/ml hRANKL. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller automatiseret celletælleanordning og genfrø M-CSF-modne celler med en densitet på 200,00-250,000 celler /cm2 i en passende kulturvare til funktionelle assays eller billeddannelse (dvs. knogleresorptionsassays, coverslip-dias til billeddannelse osv.).
  5. Differentier med OC-differentieringsmediet i 7-9 dage. Udfør en komplet brøndmedium ændring med det friske OC-differentieringsmedium hver 2-3 dage.
    BEMÆRK: Multinucleated OC'er vises typisk efter 5-7 dage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overvågning af cellemorfologi gennem hele differentieringsprocessen
Alle resultater beskrevet nedenfor blev genereret ved hjælp af MCND-TENS2 iPSC-linjen til OC-differentiering. Denne iPSC-linje er tidligere blevet brugt i flere undersøgelser32,33. Ikke desto mindre er andre iPSC-linjer også blevet brugt med succes med denne differentieringsprotokol.

Regelmæssig visuel vurdering afslører forskellige og forskellige morfologiske egenskaber ved iPSC'er gennem hele differentieringsprocessen til OC'er (figur 2). iPSC-kolonier (figur 2A) blev dissocieret i en enkeltcellesuspension, der fremstår som individuelle celler i hele den runde bundbrøndplade før centrifugering (figur 2B). Efter centrifugering (trin 4.9 i protokollen) samles celler i midten af den rundbundede ultra-lave fastgørelsesbrøndplade og danner derefter kugler (embryoidlegemer, EB'er, figur 2C). EB'er vil stige to til tre gange i størrelse gennem hele mesodermal differentieringsprocessen (figur 2D) og blive let synlige for øjet ved afslutningen af 4-dages differentieringsperioden (figur 2E). EB'er kan ses klæbe og smelte sammen med brøndpladens bund efter overførsel til brønde af en 6-brøndplade til hæmatopoietisk differentiering (trin 5.3 i protokollen, figur 2F). Efter 7-8 dage bliver store mængder flydende hæmatopoietiske celler synlige i dyrkningsmediet (figur 2G). Efter høst og genplettering af hæmatopoietiske celler følger en M-CSF-modningsfase, og OC-differentiering initieres (trin 6.4 i protokollen). Inden for 5-6 dage bliver multinucleated celler med en stor gennemsigtig cellekrop først synlige (figur 2H). Et stort antal mononukleære celler er stadig synlige på dette stadium. Efter yderligere 2-3 dage med OC-differentiering vil OC'er yderligere smelte sammen med tilstødende celler for at danne store polykarioner med endnu flere kerner (figur 2I).

Vurdering af den EB-afledte hæmatopoietiske population
Hæmatopoietisk differentiering kan udføres i en variabel tid. Tidsperioder, der starter med 7 dage op til 9 uger, er beskrevet i litteraturen. I denne protokol udføres hæmatopoietisk differentiering i en periode på 10 dage. Vi fandt, at 10 dages hæmatopoietisk differentiering gav et lavt antal tidlige CD34+ (0,53%, figur 3A) og et større antal CD43+ (48,5%, figur 3B) hæmatopoietiske forfædre. Mere kritisk blev der genereret tilstrækkelige mængder CD45+ (96,2%, figur 3C), CD14+ (33%, figur 3D) og CD11b+ (35,9%, figur 3E) HPC'er efter en behandlingsperiode på 10 dage for med succes at differentiere dem yderligere til OC'er. Imidlertid skal cytokinbehandlingsperioden for hæmatopoietisk differentiering (trin 5.4 i protokollen) muligvis justeres og optimeres baseret på iPSC-linjen for at generere tilstrækkelige mængder CD45+, CD14+ og CD11b+ celler.

I gennemsnit blev 6 millioner hæmatopoietiske celler høstet efter 10 dages differentiering fra hver brønd med 8 EB'er.

Vurdering af OC-morfologi og aktivitet
Efter OC-differentiering kan OC'er vurderes morfologisk og funktionelt. OC-prækursorer sås igen på kammerglas eller coverslip-dias efter M-CSF-modningstrinnet for at forbedre billedkvaliteten ved farvning til TRAP eller Cathepsin K. Enzymatisk TRAP-farvning efter OC-differentiering viser store, multinucleated, TRAP-positive OC'er (figur 4A). Derudover kan let TRAP-positive mononukleære celler ses spredt mellem multinukleære OC'er. Negative kontroller uden tilsætning af RANKL viser ikke sammensmeltet multinuklear OC. Ikke desto mindre kan et lille antal let TRAP-positive mononukleære celler afbildes (figur 4B).

Konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) billeder viser OC'er farvet for katepsin K (turkis) og F-actin (rød) i forbindelse med DAPI-nuklear plet (blå) (figur 4C, 4D). Store multinukleære OC'er er synlige, når de behandles med RANKL i henhold til protokollen, som viser en omfattende F-actin cytoskeletal struktur og pletpositiv for katepsin K (figur 4C). Negative kontroller uden tilsætning af RANKL viser derimod ikke sammensmeltede multinukleære celler.

OC'er kan vurderes yderligere funktionelt ved at måle den resorptive aktivitet. Knogler eller mineraleresorptionsassays kan anvendes til at bestemme den resorptive aktivitet. Her blev OC-prækursorer podet på calciumphosphatbelagte brønde og terminalt differentieret. Store områder, hvor mineralbelægningen blev resorberet, er synlige i en blågrå farve (figur 4E). Resorptionsgrave i forskellige størrelser kan identificeres. Ikke resorberet, den resterende calciumphosphatbelægning er synlig i brun. Tilstedeværelsen af resorptionsgruber bekræfter identiteten af de differentierede multinucleerede celler som OC'er. Derudover kan resorptionsgruber yderligere kvantificeres for at vurdere og sammenligne resorptionsaktiviteten. Det samlede areal af resorberet mineral over det samlede brøndoverfladeareal kan kvantificeres som et procentmål. Desuden kan størrelsen og antallet af resorptionsgruber yderligere kvantificeres. Ubehandlede negative kontroller viste ikke resorptionsgruber (figur 4F).

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af osteoklastdifferentieringsprocessen fra humane iPSC'er. Illustration tegnet af Hannah Blümke ved hjælp af Affinity Designer 2.1.1. Illustrationen anvender tidligere anvendte tegninger33. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Mikroskopibilleder gennem hele differentieringsprocessen af humane iPSC'er mod osteoklaster. (A) Udifferentierede iPSC-kolonier gennem formering. B) iPSC'er i huler med rundbundet bund efter dissociation i en enkeltcellesuspension før centrifugering. C) Centralt indsamlede enkeltcellede iPSC'er efter centrifugering. (D) EB'er vokser i størrelse i løbet af den 4-dages mesodermale differentieringsperiode. E) Synlige embryoide legemer efter mesodermal differentiering. (F) Efter overførsel af embryoide legemer til basalmembranekstraktbelagte 6-brøndsplader kan embryoide legemer ses klæbe og smelte sammen med brøndbunden. (G) Efter 5-7 dages hæmatopoietisk differentiering kan et stort antal flydende hæmatopoietiske celler observeres i mediet. (H) Efter M-CSF-modning vises de første osteoklaster med 3-4 kerner efter 5-7 dages differentiering med RANKL. (I) Ved afslutningen af osteoklastdifferentiering kan store multinucleerede celler observeres. Skalastænger: A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Overflademarkøranalyse af embryoide kropsafledte hæmatopoietiske celler ved hjælp af flowcytometri. Markørekspression muliggør analyse af hæmatopoietiske celler og identifikation af underpopulationer efter gating for singlets og levende celler. (A) Ontogenetisk tidlig CD34+ hæmatopoietisk stamcellepopulation er meget lille til fraværende i forbindelse med denne protokol. (B) CD43+ celler udgør ca. 50% af hele befolkningen. (C) Senere fase CD45+ hæmatopoietiske stamceller udgør den største del af den hæmatopoietiske befolkning med 96,2%. (D, E) Mere direkte CD14+ og CD11b+ OC prækursorer udgør henholdsvis 33% og 36%. I rødt: ufarvet negativ kontrol, i blåt: isotypekontroller, i gult: celler farvet med det respektive markørantistof. Plots bruger tidligere offentliggjorte data33. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Morfologisk og funktionel vurdering af iPSC-differentierede humane osteoklaster. (A) TRAP-farvning efter osteoklastdifferentiering viser store, multinucleated, TRAP-positive osteoklaster. Lidt TRAP-positive mononukleære celler kan ses spredt mellem multinukleære osteoklaster. (B) Negative kontroller uden tilsætning af RANKL farvet til TRAP viser ikke sammensmeltede multinukleare osteoklaster. Ikke desto mindre kan et lille antal let TRAP-positive, mononukleære celler afbildes. (C) Konfokale laserscanningsmikroskopibilleder af osteoklastdifferentierede hæmatopoietiske celler på et dækslipsglas farvet for F-actin (rød) og katepsin K (turkis) sammen med DAPI-kerneplet (blå) viser store multinucleated Cathepsin K-positive osteoklaster. (D) Negative kontroller uden tilsætning af RANKL viser svarende til (B) mononukleære celler ved en lavere celletæthed. E) Funktionsvurdering kan udføres ved at vurdere osteoklasters resorptionsaktivitet. Til dette udføres osteoklastdifferentiering på et knogleresorptionsassay. Flisebelagte brøndbilleder erhvervet med et omvendt widefield-mikroskop i fasekontrasttilstand viser store resorptionsområder af calciumphosphatminerallaget. Resorptionsaktiviteten kan kvantificeres yderligere ved at måle resorptionsarealet over det samlede areal. (F) Negative kontroller uden tilsætning af RANKL viser ikke resorptionsområder. Skalastænger: A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. Billeder er redigeret ud fra tidligere offentliggjorte data33. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol tilbyder en pålidelig og robust metode til at differentiere iPSC'er i OC'er. Ikke desto mindre er der flere faldgruber, der kan opstå gennem differentieringsprocessen. Humane iPSC-linjer genereret fra celler af forskellig vævsoprindelse er med succes blevet differentieret ved hjælp af denne protokol33. Ved frysning af iPSC'er (se protokoltrin "3. Frysning tilbage iPSC'er"), blev en brønd på tidspunktet for passaging frosset tilbage til en kryoial. Ved optøning (se protokoltrin "1. Optøning og formering af humane iPSC'er"), blev en kryovial optøet i en enkelt brønd på en 6-brøndplade. Forskellige iPSC-linjer vil opføre sig lidt anderledes, og spredningshastighederne vil variere. Splitkursen skal justeres tilsvarende.

Ved overførsel af iPSC'er eller dissociering af iPSC'er til en enkeltcellesuspension til EB-induktion er det vigtigt at fjerne spontant differentierede kolonier eller aggregater af døde celler for at forbedre effektiviteten og effektiviteten af mesodermal og hæmatopoietisk differentiering. Dette kan gøres under et stereomikroskop ved hjælp af en celleskraber, pipettespidser fra en P10- eller P20-pipette eller et skrabeværktøj bygget af en Pasteur-pipette35.

Som nævnt ovenfor involverer denne protokol dissociation af iPSC-kolonier i en enkeltcellesuspension til EB-induktion, mens iPSC'er med andre protokoller efterlades som aggregater, der skal centrifugeres til EB-induktion36. EB-størrelse, cellenummer, form og morfologi er alle rapporteret at påvirke differentiering 37,38,39. Således antager vi, at dissociationen i en enkeltcellesuspension giver mulighed for bedre EB-til-EB-ensartethed i størrelse og form efter centrifugering og dermed mere konsistente resultater af hæmatopoietisk celleproduktion31.

Andre metoder til EB-induktion er blevet beskrevet. Sådanne metoder, der anvender en enkeltcellesuspension sammen med ROCK-hæmmer for at forbedre celleoverlevelsen, er rapporteret at være fordelagtige til at kontrollere EB-størrelse og differentieringsresultat31.

Den rundbundede EB-induktionsmetode med 96 brønde, der er beskrevet i denne protokol, er velegnet til storskalaproduktion af EB'er og giver mulighed for opskalering af OC-produktion. Mere nye metoder til hæmatopoietisk differentiering uden et embryoid kropsinduktionstrin med potentiale til at lette differentieringsprocessen er for nylig blevet beskrevet32. Ikke desto mindre er disse protokoller endnu ikke blevet fastlagt for OC-differentiering33.

I ovennævnte protokol beskriver vi mediumændringen på dag 5 af hæmatopoietisk differentiering. Et lille antal flydende celler kan allerede forekomme omkring dag 4-5 af differentiering. For at undgå at kassere flydende celler skal substratet opsamles i et rør og centrifugeres, før det kasseres. Cellepillen i bunden af røret skal derefter løsnes med det friske medium og overføres tilbage til brønde i en 6-brøndplade. Betydningen af den tidlige flydende cellepopulation i OC-differentiering mangler dog stadig at blive bestemt.

Produktionen af hæmatopoietiske celler kan vurderes ved anvendelse af flowcytometri. Høje udbytter af CD45+, CD14+ og CD11b+ celler er ønskelige for osteoklastdifferentiering33. Kryopræservering af høstede flydende hæmatopoietiske celler er rapporteret at være udfordrende med generelt begrænsede genoprettelsesrater og lav cellelevedygtighed40,41. Ved at kryobevare hæmatopoietiske celler i et kryopræserveringsmedium bestående af 50% af et serumfrit hæmatopoietisk celleekspansionsmedium (se materialetabel), 40% FBS og 10% DMSO, var vi i stand til at genvinde celler med en cellelevedygtighed på ca. 90,3% ± 2,62 SD (n = 7) efter optøning.

Osteoklastogenese kræver fusion af flere mononukleerede OC-prækursorer til dannelse af multinucleated osteoklaster, der er i stand til mineral- og knogleresorption. Mens murine OC-precursorcellelinjer simpelthen har brug for tilsætning af RANKL for at inducere OC-dannelse42, kræver humane forstadier yderligere M-CSF til celleoverlevelse og proliferation43. OSCAR er for nylig blevet opdaget som en yderligere receptor involveret i OC-differentiering, selvom kun type I-kollagen hidtil er blevet identificeret som en ligand. Mens forskning af OSCAR med iPSC-afledte OC'er stadig er begrænset, synes suprafysiologiske in vitro RANKL- og M-CSF-koncentrationer i en murincellelinje at omgå nødvendigheden af OSCAR-aktivering44, aktivering af OSCAR in vivo synes at være et nødvendigt costimulatorisk signal for osteoklastogenese45. En yderligere faktor, der skal overvejes, er brøndpladens overflade. Kemiske46 og fysiske47 overfladeegenskaber er kendt for at påvirke osteoklastdifferentiering og kan enten fremme eller hindre vellykket differentiering. En vis heterogenitet inden for prækursorpopulationen synes også at være afgørende for vellykket fusion af OC'er, da forskellige fusionsrelaterede faktorer såsom CD47 og DC-STAMP virker på forskellige stadier af osteoklastfusion48.

Afslutningsvis muliggør denne protokol differentiering af human OC fra iPSC'er for at lette og fremskynde OC-forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Giachelli-laboratoriet for deres tekniske hjælp og støtte. Vi takker W. M. Keck Microscopy Center og Keck Center manager, Dr. Nathanial Peters, for hjælp med at opnå konfokal mikroskopi og widefield mikroskopi billeder. Vi takker også UW Flow Core Facility og Flow Core Facility manager, Aurelio Silvestroni, for teknisk support og assistance. Endelig takker vi Hannah Blümke for støtten med illustration og grafisk design.

Finansieringen blev ydet gennem National Institutes of Health-tilskud R35 HL139602-01. Vi anerkender også NIH S10-tilskud S10-OD016240 til instrumentfinansiering på W. M. Keck Center samt NIH-tilskud 1S10OD024979-01A1 til instrumentfinansiering på UW Flow Core Facility.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250-10ML
Antibody - Anti-Cathepsin K  Abcam ab19027
Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45 BD 555485
Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555751
Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14 BD 563372
Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD 563125
Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 Abcam ab150079
Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14 R&D Systems FAB3832P-025
Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b R&D Systems FAB16991P-025
Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 BD 560710
Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 557872
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b Biolegend 301308
Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Biolegend 400118
Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 550795
Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 BD 563521
Bone Resorption Assay Kit CosmoBioUSA CSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher 16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract R&D Sytems 3434-010-02 Basal membrane extract
DAPI R&D Systems 5748/10
Dispase (5 U/mL) STEMCELL Technologies 7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Stem Cell 36254
DMSO Sigma Aldrich D2650
DPBS Sigma Aldrich D8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) STEMCELL Technologies 78211
Human IL-3 STEMCELL Technologies 78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) STEMCELL Technologies 78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) STEMCELL Technologies 78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF) STEMCELL Technologies 78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) Biolegend 422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) STEMCELL Technologies 78073
Invitrogen Rhodamine Phalloidin Invitrogen R415
MEM α, nucleosides, no phenol red ThermoFisher 41061029
mFreSR STEMCELL Technologies 05855 Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus medium STEMCELL Technologies 100-0276 Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Thermo Scientific 174925 Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore Tips ThermoFisher 2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632 STEMCELL Technologies 72304
StemSpan SFEM StemCell 09650 Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red Thermo Fisher 12563011 Single-cell dissociation reagent
Ultraglutamine Bioscience Lonza BE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Bioscience Lonza 04-418Q Hematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well High Ibidi 80806

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
  2. Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
  3. Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
  4. Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
  5. Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
  6. Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
  7. Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
  8. Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
  9. Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
  10. Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
  11. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
  12. Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
  13. Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
  14. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  15. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  16. Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35 (2015).
  17. Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
  18. Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
  19. Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
  20. Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
  21. Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
  22. Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
  23. Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
  24. Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
  25. Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
  26. Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
  27. Chen, I. -P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
  28. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  29. Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
  30. Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
  31. Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
  32. Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
  33. Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
  34. Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
  35. Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
  36. Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
  37. Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
  38. Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
  39. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  40. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
  41. Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
  42. Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
  43. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  44. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
  45. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
  46. Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
  47. Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
  48. Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).

Tags

Udviklingsbiologi nr. 205
Differentiering og karakterisering af osteoklaster fra humant inducerede pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blümke, A., Simon, J., Leber,… More

Blümke, A., Simon, J., Leber, E., Scatena, M., Giachelli, C. M. Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (205), e66527, doi:10.3791/66527 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter