Summary
Este protocolo presenta la diferenciación de osteoclastos humanos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y describe métodos para la caracterización de osteoclastos y precursores de osteoclastos.
Abstract
Este protocolo detalla la propagación y el paso de las iPSCs humanas y su diferenciación en osteoclastos. En primer lugar, las iPSC se disocian en una suspensión unicelular para su posterior uso en la inducción de cuerpos embrioides. Después de la inducción mesodérmica, los cuerpos embrioides experimentan diferenciación hematopoyética, produciendo una población flotante de células hematopoyéticas. Posteriormente, las células hematopoyéticas recolectadas se someten a una etapa de maduración del factor estimulante de colonias de macrófagos y, finalmente, a la diferenciación de osteoclastos. Después de la diferenciación de los osteoclastos, los osteoclastos se caracterizan por la tinción de TRAP junto con una tinción nuclear de verde de metilo. Los osteoclastos se observan como policariones multinucleados TRAP+. Su identificación puede ser respaldada por la tinción de catepsina K. Los ensayos de reabsorción ósea y mineral permiten la caracterización funcional, confirmando la identidad de los osteoclastos de buena fe. Este protocolo demuestra un método robusto y versátil para diferenciar los osteoclastos humanos de las iPSC y permite una fácil adopción en aplicaciones que requieren grandes cantidades de osteoclastos humanos funcionales. Se podrían prever aplicaciones en las áreas de investigación ósea, investigación del cáncer, ingeniería de tejidos e investigación de endoprótesis.
Introduction
Los osteoclastos (OC) son tipos celulares versátiles derivados de hematopoyéticos 1,2 que son comúnmente utilizados por los investigadores en áreas como la investigación de enfermedades óseas 3,4, la investigación del cáncer 5,6, la ingeniería de tejidos 7,8 y la investigación de endoprótesis 9,10. Sin embargo, la diferenciación de los CO puede ser un reto, ya que la fusión de precursores mononucleares en CO multinucleados es necesaria para crear OC funcionales11. Varios factores biológicos, como el activador del receptor del ligando NF-κB (RANKL) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), son necesarios para la diferenciación del CO. Se ha reportado que M-CSF tiene un efecto positivo sobre la proliferación celular, la supervivencia celular y la expresión de RANK 12,13,14. Por otro lado, RANKL se une a RANK, que activa cascadas de señalización aguas abajo que inducen osteoclastogénesis. La activación está mediada por el factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF6), que conduce a la degradación del factor nuclear del potenciador del gen del polipéptido de luz kappa en el inhibidor de células B, alfa (IκB-α), una proteína de unión que se une a los dímeros NF-kB16,17. Por lo tanto, la degradación de IκB-α libera dímeros NF-kB, que luego se translocan al núcleo e inducen la expresión de los factores de transcripción c-Fos y el factor nuclear de las células T activadas 1 (NFATc1). Esto, a su vez, desencadena la transcripción de una multitud de proteínas relacionadas con la diferenciación de OC15,18. Las proteínas reguladas al alza, como DC-Stamp y Atp6v0d2, median la fusión célula-célula de los precursores de OC, lo que conduce a la formación de sincitio 19,20,21.
Con respecto a las células primarias humanas, las PBMC CD34+ y CD14+ son actualmente los tipos celulares más utilizados para la diferenciación en OC22. Sin embargo, este enfoque está limitado por la heterogeneidad dentro de la población CD34+ de células recolectadas de donantes23 y su limitada capacidad de expansión. Las iPSC humanas presentan una fuente alternativa para los AO. Como pueden propagarse indefinidamente24, permiten la capacidad de expansión y el aumento de la producción de CO. Esto permite la diferenciación de un gran número de CO, lo que facilita la investigación de CO.
Se han publicado varios protocolos para la diferenciación de las iPSC en CO 25,26,27. Todo el proceso de diferenciación se puede dividir en una parte de propagación de iPSC, una parte de diferenciación mesodérmica y hematopoyética, y una diferenciación de OC. La propagación de iPSCs antes del proceso de diferenciación permite aumentar la producción de CO antes de la diferenciación. Existen varios enfoques con respecto a la diferenciación mesodérmica y hematopoyética. Tradicionalmente, la formación de cuerpos embrioides (EB) se ha utilizado para diferenciar las células hematopoyéticas, pero los enfoques basados en monocapas representan otra estrategia de diferenciación hematopoyética que no requiere la inducción de EB. Sin embargo, los sistemas basados en monocapa parecen requerir una mayor optimización, ya que nosotros y otros hemos encontrado que los enfoques basados en EB son más robustos para la diferenciación de los CO.
Aquí, describimos la diferenciación de los OC de las iPSC humanas utilizando un protocolo basado en EB. Este protocolo fue adaptado de Rössler et al.26 y modificado para aumentar la robustez y permitir la criopreservación durante el proceso de diferenciación. En primer lugar, recolectamos células hematopoyéticas solo una vez después de 10 días de diferenciación. A continuación, las células hematopoyéticas se criopreservaron para permitir una mayor flexibilidad durante el proceso de diferenciación. Además, aumentamos la densidad de siembra de células hematopoyéticas de 1 x 105 a 2 x 105 células/cm2 para la diferenciación de OC. Se utilizó un medio humano más reciente libre de suero iPSC (hiPSC-SFM, ver Tabla de Materiales), y el recubrimiento de los pocillos se realizó con 200-300 μg/mL de un extracto de membrana basal (ver Tabla de Materiales) en lugar de gelatina al 0,1%. La penicilina/estreptomicina no se añadió a los medios de comunicación.
El protocolo de Rössler et al.26 fue adaptado originalmente de una iPSC a un protocolo de diferenciación de macrófagos28 que utiliza la formación de EB para la diferenciación hematopoyética. Si bien la formación de EB ha sido utilizada durante un tiempo prolongado por los investigadores para la diferenciación hematopoyética29,30, se han descrito varios métodos de inducción de EB en la literatura, como la agregación espontánea, la centrifugación en una placa de pocillo de fondo redondo, el cultivo en gotas colgantes, el cultivo en biorreactor, el cultivo en tubo cónico, el vaso lateral de giro lento y el cultivo en gel de micromoho31. Este protocolo utiliza la centrifugación de iPSC disociadas en una placa de pocillos de fondo redondo para acercar las células iPSC individuales entre sí y permitir la formación de esferas (EB), como se describe a continuación.
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Protocol
NOTA: Todos los reactivos utilizados en este protocolo se pueden encontrar en la Tabla de Materiales. A menos que se especifique lo contrario, todos los medios se preequilibraron a 37 °C antes de su uso. Todos los pasos de centrifugación se realizan a 37 °C y utilizando el modo de aceleración/desaceleración más lento. A menos que se especifique lo contrario, el sobrenadante siempre se elimina con pipetas de vidrio desechables Pasteur.
1. Descongelación y propagación de iPSCs humanas
- Un día antes de descongelar las iPSC, cubra un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de un extracto de membrana basal a una concentración de 200-300 μg/ml. Coloque la placa del pocillo a 4 °C durante la noche.
- Al día siguiente, descongele y transfiera las células a un tubo de 15 ml con una pipeta P1000. Gota a gota, agregue 5-7 mL de DMEM/F-12 con 15 mM de HEPES.
- Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min. Retire suavemente las células de la centrífuga y asegúrese de no alterar el gránulo de la celda.
- Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio libre de suero hiPSC (hiPSC-SFM que contiene 10 μM de inhibidor de la Rho quinasa (ROCK) Y-27632) utilizando P1000 con puntas de diámetro ancho.
- Aspirar el extracto de membrana basal del pocillo recubierto el día anterior (paso 1.1) y transferir 1 mL de hiPSC-SFM con 10 μM Y-27632 al pocillo. Agregue iPSC resuspendidas al pocillo para alcanzar un volumen final de 2 ml por pocillo.
- Agite la placa para distribuir uniformemente los agregados de iPSC antes de colocarlos en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
- Realice cambios completos del medio cada dos días utilizando hiPSC-SFM (sin la adición del inhibidor de ROCK Y-27632). Las iPSC suelen alcanzar el 70-80% de confluencia después de 3-4 días de propagación.
2. Pasar las iPSC
- Un día antes de pasar las iPSC, cubra los pocillos de una placa de 6 pocillos con un extracto de membrana basal a una concentración de 200-300 μg/mL. Coloque la placa de pocillos a 4 °C durante toda la noche.
NOTA: Confirme que las células han alcanzado aproximadamente el 70-80% de confluencia. Asegúrese de que las iPSC no tengan una confluencia excesiva (más del 80 % de confluencia), ya que esto promoverá la diferenciación espontánea. - Comience a pasar las iPSC eliminando las regiones diferenciadas o las regiones con muchos agregados de iPSC muertos bajo el microscopio estereoscópico utilizando puntas de pipeta de 10 μL o 20 μL o un raspador de células. Las regiones diferenciadas aparecerán de color más denso o más blanco.
NOTA: Los agregados celulares raspados aún pueden adherirse parcialmente al fondo del pozo. - Lave el fondo del pozo varias veces con una pipeta P1000 de diámetro ancho para eliminar los agregados que aún puedan estar parcialmente adheridos al fondo del pozo.
- Deseche el medio gastado en el que se han cultivado las iPSC que contiene los agregados de iPSC desprendidos. Repita el paso de lavado dos veces más con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- A continuación, agregue 1 mL de 5 U/mL de Dispasa por pocillo. Los bordes de las colonias de iPSC se desprenderán de la placa del pocillo, lo que se puede observar bajo el microscopio estereoscópico después de 3-5 minutos de incubación a temperatura ambiente.
- Retire con cuidado Dispasa para evitar que los agregados se desprendan ligeramente y agregue 1 mL de DMEM/F-12 con 15 mM de HEPES. Use un elevador de celdas desechable para cortar los agregados en tamaños pequeños. La consistencia de los tamaños agregados de iPSC se puede mejorar con una herramienta de paso de células madre.
- Lave los agregados iPSC cortados en rodajas con el medio en el pocillo y transfiera el medio con agregados a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta serológica de 5 ml o P1000 con una punta de orificio ancho.
- Enjuague el pocillo con DMEM/F-12 y transfiera el medio al tubo de 15 ml con los agregados iPSC.
- Centrifugar los agregados de iPSC cortados en rodajas a 200 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur y agregue 2 ml de hiPSC-SFM para desalojar y resuspender las iPSC con una pipeta serológica de 5 ml o P1000 con puntas de ánima ancha.
- Aspire el extracto de membrana basal sobrante de la(s) placa(s) de pocillos prerrevestida y agregue 1 mL de hiPSC-SFM a cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
- Transfiera las iPSC a nuevos pocillos de una placa de 6 pocillos de modo que el volumen final sea de 2 ml de hiPSC-SFM por pocillo utilizando un P1000 con puntas de diámetro ancho. Dependiendo de la línea iPSC, es necesario optimizar las relaciones de división. En este caso, se utilizó una relación de división de 1:6.
- Verifique el pozo en busca de agregados flotantes y el tamaño del agregado bajo el microscopio estereoscópico. Idealmente, el tamaño del agregado debe estar entre 50-200 μm.
- Agite la placa de pocillos para distribuir las células uniformemente a través de la placa después de que los agregados se hayan transferido e incubar a 37 °C al 5% de CO2 hasta una confluencia del 70-80%.
3. Congelar las iPSC
- Para volver a congelar las células iPSC, pase las células como se ha descrito anteriormente (consulte el paso del protocolo "2. Aprobación de iPSC"). Después de que las células se hayan cortado en colonias y se hayan lavado del fondo del pocillo (paso 2.10), gire los agregados cortados a 200 x g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante.
- Agregue 1 ml de medio de criopreservación sin suero por pocillo de una placa de 6 pocillos al tubo de 15 ml y vuelva a suspender los agregados en rodajas con un P1000 con una punta de orificio ancho.
- Transfiera las células a criotubos premarcados. Cierre los tubos y transfiéralos a un recipiente de criopreservación preenfriado a 4 °C. Almacenar las celdas a -80 °C durante 24-48 h.
- Transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
NOTA: En la Figura 1 se ilustra un resumen esquemático del proceso de diferenciación de OC.
4. Inducción del cuerpo embrioide
- Cultive y expanda suficientes iPSC como se describió anteriormente para la inducción de EB.
NOTA: La producción de OC se puede aumentar aumentando el número de cuerpos embrioides, lo que a su vez produce un mayor rendimiento general de células hematopoyéticas. Un pocillo de iPSC confluentes al 70-80% produce aproximadamente 8,4 x 105 células por pocillo de un pocillo de placa de 6 pocillos. Se necesitan 12.500 iPSC unicelulares para formar un cuerpo embrioide. - Aspire el medio gastado de los cultivos de iPSC y enjuague las colonias de iPSC con D-PBS.
- Agregue 0,5 ml de reactivo de disociación de una sola celda precalentado a temperatura ambiente a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y agite el recipiente de cultivo para cubrir toda la superficie del pocillo. Incubar el recipiente de cultivo a 37 °C durante 5-8 min.
- Retire el recipiente de la incubadora, aspire el reactivo de disociación de una sola célula y agregue 1 ml del medio de diferenciación de la etapa 1 a los pocillos, que consiste en medio libre de suero hiPSC con 50 ng/ml de proteína morfogenética ósea humana 4 (hBMP4), 50 ng/ml de factor de crecimiento endotelial vascular humano-165 (hVEGF), 20 ng/ml de factor de células madre humanas (hSCF), y 10 μM Y-27632.
- Separe suavemente las células enjuagando el pocillo con el medio de la Etapa 1. Pool disoció las iPSC en un tubo cónico de 15 mL.
- Agregue 1 ml de medio de diferenciación de la etapa 1 a los pocillos y lave las células restantes o use un raspador de células para las colonias que no se lavan fácilmente.
- Después de transferir todas las células al tubo, centrifugue a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente para formar un gránulo de celda. Aspirar y resuspender las células en un total de 2 mL de medio de diferenciación preequilibrado de la Etapa 1 utilizando una pipeta serológica de 5 mL o una P1000 con una punta de diámetro ancho.
- Cuente las células con un hemocitómetro o un dispositivo automatizado de recuento de células. Agregue el medio al tubo de 15 ml que contiene la suspensión de una sola célula para colocar 12.500 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja de fondo redondo en 100 μl del medio de diferenciación de la etapa 1.
NOTA: Bajo el microscopio, las células aparecerán como una suspensión unicelular con células dispersas por todo el pocillo. - Centrifugar las placas de 96 pocillos durante 3 minutos a 100 x g. Después de la centrifugación, las células deben comenzar a parecerse a los esferoides cuando se observan bajo el microscopio. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 24 h.
- Cambie la mitad del medio en el día 1 y el día 2 con el medio de diferenciación de la etapa 1. Para mejorar la eficiencia, utilice una pipeta multicanal para desechar 50 μl del medio de diferenciación gastado de la Etapa 1 en una placa de Petri.
- Después de desechar el medio de la placa de 96 pocillos, verifique si hay EB bajo el microscopio estereoscópico que puedan haber sido extraídos accidentalmente. Transfiera los EB extraídos accidentalmente a la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta P1000 con puntas de diámetro ancho.
- Añada 50 μl de medio de diferenciación fresco de la fase 1 a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultrabajo de fondo redondo con una pipeta multicanal.
5. Diferenciación hematopoyética
- Un día antes de comenzar la diferenciación hematopoyética, recubra un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 mL de un extracto de membrana basal a una concentración de 200-300 μg/mL. Coloque la placa del pocillo a 4 °C durante la noche.
NOTA: Cada pozo recibirá 8 EB en un momento posterior de este protocolo. Dependiendo de la cantidad de EB preparados, cubra los pozos en consecuencia. - Aspirar el exceso de extracto de membrana basal y prellenar los pocillos de la placa de 6 pocillos con 3 mL del medio de diferenciación de la Etapa 2, que consiste en un medio basal hematopoyético al que se agregan 2 mM de ultraglutamina, 55 μM de 2-mercaptoetanol, 25 ng/mL de interleucina humana 3 (hIL-3) y 100 ng/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos (hM-CSF).
- Usando un P1000 con puntas de diámetro ancho, transfiera 8 EB a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Después de la transferencia, confirme a ojo o bajo el microscopio estereoscópico que hay 8 EB en cada pocillo.
NOTA: Después de 1 día, los EB flotantes se adherirán al fondo del pozo. En los siguientes 5-7 días, una población de células flotantes que comprende células hematopoyéticas debería hacerse visible. El período de diferenciación hematopoyética puede variar, comenzando con 7 días. La diferenciación durante 10 días mostró una población hematopoyética compuesta por grandes subpoblaciones CD45+, CD14+ y CD11b+ . - Después de 5 días de tratamiento con el medio de diferenciación de la etapa 2, realice un cambio de medio retirando el medio gastado y dispensándolo en un tubo cónico de 50 ml. Pipetear lentamente para tratar de eliminar la menor cantidad posible de células flotantes y mantener el esfuerzo cortante lo más bajo posible. El pipeteo bajo un microscopio estereoscópico puede ayudar a evitar la extracción accidental de células.
- Agregue inmediatamente 1 ml de medio de diferenciación fresco de la etapa 2 a los pocillos. Para recuperar las células hematopoyéticas flotantes que ya puedan estar presentes en este punto del proceso de diferenciación, no deseche el medio dispensado. Más bien, gire por el tubo con el medio gastado a 300 x g durante 5 minutos y aspire el sobrenadante.
- Agregue medio de diferenciación fresco de la etapa 2 al tubo y vuelva a suspender para separar las células que podrían haber sido transferidas con el medio gastado.
- Agregue 2 mL del medio de diferenciación fresco de la Etapa 2 con las células recuperadas en cada pocillo, que previamente se llenó con 1 mL del medio de diferenciación de la Etapa 2.
- En el día 10 de la diferenciación hematopoyética, verifique la presencia de un gran número de células hematopoyéticas flotantes. Cosechar recogiéndolos en un tubo de 50 mL. Pueden congelarse de nuevo en 10% de DMSO, 50% de FBS y 40% de medio o usarse inmediatamente para diferenciar las células en OC.
6. Maduración de M-CSF y diferenciación de OC
- Las células semilla a una concentración de 200.000 células/cm2 en placas de cultivo de tejidos tratadas y tratadas con alfa-MEM, suplementadas con FBS al 10% y 50 ng/mL de hM-CSF.
- Para realizar ensayos funcionales o imágenes, separe las células maduras de M-CSF 3 días después de la siembra lavándolas con PBS precalentado a 37 °C utilizando un P1000 con una punta de diámetro ancho. Es posible que se necesiten pasos de lavado repetidos para separar completamente las células.
- Transfiera las células separadas a un tubo de 15 ml con un P1000 con punta de diámetro ancho y centrifugue a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender y disuelva el gránulo celular con el medio de diferenciación de OC, que consiste en alfa-MEM suplementado con FBS al 10%, 50 ng/mL hM-CSF y 80 ng/mL hRANKL. Contar las células utilizando un hemocitómetro o un dispositivo automatizado de recuento celular y volver a sembrar las células maduras de M-CSF a una densidad de 200.00-250.000 células/cm2 en un material de cultivo apropiado para ensayos funcionales o de obtención de imágenes (es decir, ensayos de resorción ósea, portaobjetos de cubreobjetos para la obtención de imágenes, etc.).
- Diferenciar con el medio de diferenciación OC durante 7-9 días. Realice un cambio completo del medio de pocillo con el medio de diferenciación OC fresco cada 2-3 días.
NOTA: Los AO multinucleados suelen aparecer después de 5 a 7 días.
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Representative Results
Monitorización de la morfología celular a lo largo del proceso de diferenciación
Todos los resultados que se describen a continuación se generaron utilizando la línea MCND-TENS2 iPSC para la diferenciación de OC. Esta línea iPSC ha sido utilizada previamente en varios estudios 32,33. Sin embargo, otras líneas de iPSC también se han utilizado con éxito con este protocolo de diferenciación.
La evaluación visual periódica revela características morfológicas diferentes y distintas de las iPSC a lo largo del proceso de diferenciación a los AO (Figura 2). Las colonias de iPSC (Figura 2A) se disociaron en una suspensión unicelular, que aparece como células individuales a lo largo de la placa de pocillo de fondo redondo antes de la centrifugación (Figura 2B). Después de la centrifugación (paso 4.9 del protocolo), las células se acumularán en el centro de la placa de pocillos de fijación ultra baja de fondo redondo y, posteriormente, formarán esferas (cuerpos embrioides, EB, Figura 2C). Los EB aumentarán de dos a tres veces su tamaño a lo largo del proceso de diferenciación mesodérmica (Figura 2D) y se volverán fácilmente visibles a simple vista al final del período de diferenciación de 4 días (Figura 2E). Se puede ver que los EB se adhieren y se fusionan con el fondo de la placa de pocillos después de la transferencia a los pocillos de una placa de 6 pocillos para la diferenciación hematopoyética (paso 5.3 del protocolo, Figura 2F). Después de 7-8 días, grandes cantidades de células hematopoyéticas flotantes se hacen visibles en el medio de cultivo (Figura 2G). Después de recolectar y resembrar las células hematopoyéticas, sigue una fase de maduración del M-CSF y se inicia la diferenciación del OC (paso 6.4 del protocolo). En 5-6 días, las células multinucleadas con un gran cuerpo celular transparente se hacen visibles por primera vez (Figura 2H). Un gran número de células mononucleares todavía son visibles en esta etapa. Después de 2-3 días más de diferenciación de OC, los OC se fusionarán aún más con las células adyacentes para formar policariones grandes con aún más núcleos (Figura 2I).
Evaluación de la población hematopoyética derivada de EB
La diferenciación hematopoyética se puede realizar durante un período de tiempo variable. En la literatura se han descrito períodos de tiempo que van desde 7 días hasta 9 semanas. En este protocolo, la diferenciación hematopoyética se realiza durante un período de 10 días. Encontramos que 10 días de diferenciación hematopoyética produjeron un bajo número de progenitores hematopoyéticos CD44+ tempranos (0,53%, Figura 3A) y un mayor número de progenitores hematopoyéticos CD43+ en etapa intermedia (48,5%, Figura 3B). Y lo que es más importante, se generaron cantidades suficientes de HPC CD45+ (96,2 %, Figura 3C), CD14+ (33 %, Figura 3D) y CD11b+ (35,9 %, Figura 3E) después de un período de tratamiento de 10 días para diferenciarlas con éxito en CO. Sin embargo, es posible que sea necesario ajustar y optimizar el período de tratamiento con citocinas para la diferenciación hematopoyética (paso 5.4 del protocolo) en función de la línea iPSC para generar cantidades adecuadas de células CD45+, CD14+ y CD11b+ .
En promedio, se recolectaron 6 millones de células hematopoyéticas después de 10 días de diferenciación de cada pocillo con 8 EB.
Evaluación de la morfología y la actividad del CO
Después de la diferenciación de los CO, los CO pueden ser evaluados morfológica y funcionalmente. Los precursores de OC se vuelven a sembrar en portaobjetos de cámara o portaobjetos de cubreobjetos después del paso de maduración de M-CSF para mejorar la calidad de la imagen cuando se tiñe para TRAP o catepsina K. La tinción enzimática de TRAP después de la diferenciación de OC muestra OC grandes, multinucleados y positivos para TRAP (Figura 4A). Además, se pueden ver células mononucleares ligeramente positivas para TRAP intercaladas entre los OC multinucleares. Los controles negativos sin la adición de RANKL no muestran OC multinuclear fusionado. Sin embargo, se puede representar un pequeño número de células mononucleares ligeramente positivas para TRAP (Figura 4B).
Las imágenes de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) muestran anticonceptivos orales teñidos para catepsina K (turquesa) y F-actina (rojo) junto con tinción nuclear DAPI (azul) (Figura 4C, 4D). Los anticonceptivos orales multinucleares de gran tamaño son visibles cuando se tratan con RANKL de acuerdo con el protocolo, que muestra una extensa estructura del citoesqueleto de actina F y una tinción positiva para la catepsina K (Figura 4C). Por otro lado, los controles negativos sin la adición de RANKL no muestran células multinucleares fusionadas.
Los CO pueden evaluarse funcionalmente midiendo la actividad de reabsorción. Se pueden utilizar ensayos de resorción ósea o mineral para determinar la actividad de reabsorción. Aquí, los precursores de OC se sembraron en pocillos recubiertos de fosfato de calcio y se diferenciaron terminalmente. Las grandes áreas donde se reabsorbió el recubrimiento mineral son visibles en un color gris azulado (Figura 4E). Se pueden identificar pozos de reabsorción de diferentes tamaños. Al no reabsorberse, el recubrimiento de fosfato de calcio restante es visible en marrón. La presencia de fosas de reabsorción confirma la identidad de las células multinucleadas diferenciadas como OC. Además, los pozos de reabsorción se pueden cuantificar aún más para evaluar y comparar la actividad de reabsorción. El área total de mineral reabsorbido sobre el área total de la superficie del pozo se puede cuantificar como una medida porcentual. Además, se puede cuantificar aún más el tamaño y el número de pozos de reabsorción. Los controles negativos no tratados no mostraron hoyos de reabsorción (Figura 4F).
Figura 1: Ilustración esquemática del proceso de diferenciación de osteoclastos de las iPSC humanas. Ilustración dibujada por Hannah Blümke con Affinity Designer 2.1.1. La ilustración utiliza dibujos utilizados anteriormente33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes microscópicas a lo largo del proceso de diferenciación de las iPSC humanas hacia los osteoclastos. (A) Colonias indiferenciadas de iPSC a lo largo de la propagación. (B) iPSC en pocillos de fondo redondo después de la disociación en una suspensión de una sola célula antes de la centrifugación. (C) iPSC de una sola célula recolectadas centralmente después de la centrifugación. (D) Los EB crecen en tamaño a lo largo del período de diferenciación mesodérmica de 4 días. (E) Cuerpos embrioides visibles después de la diferenciación mesodérmica. (F) Después de la transferencia de cuerpos embrioides a placas de 6 pocillos recubiertas de extracto de membrana basal, se pueden ver cuerpos embrioides adhiriéndose y fusionándose con el fondo del pocillo. (G) Después de 5-7 días de diferenciación hematopoyética, se puede observar una gran cantidad de células hematopoyéticas flotantes en el medio. (H) Tras la maduración del M-CSF, aparecen los primeros osteoclastos con 3-4 núcleos a los 5-7 días de diferenciación con RANKL. (I) Al final de la diferenciación de los osteoclastos, se pueden observar grandes células multinucleadas. Barras de escala: A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de marcadores de superficie de células hematopoyéticas derivadas del cuerpo embrioide mediante citometría de flujo. La expresión de marcadores permite el análisis de células hematopoyéticas y la identificación de subpoblaciones después de la activación de singletes y células vivas. (A) La población ontogenéticamente temprana de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ es muy pequeña o ausente junto con este protocolo. (B) Las células CD43+ constituyen aproximadamente el 50% de toda la población. (C) Las células progenitoras hematopoyéticas CD45+ en etapa tardía constituyen la mayor parte de la población hematopoyética con un 96,2%. (D, E) Los precursores más directos de CO CD14+ y CD11b+ representan el 33% y el 36%, respectivamente. En rojo: control negativo sin teñir, en azul: controles de isotipo, en amarillo: células teñidas con el respectivo anticuerpo marcador. Los gráficos utilizan datos publicados anteriormente33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación morfológica y funcional de osteoclastos humanos diferenciados por iPSC. (A) La tinción de TRAP después de la diferenciación de osteoclastos muestra osteoclastos grandes, multinucleados y positivos para TRAP. Se pueden ver células mononucleares ligeramente positivas para TRAP intercaladas entre osteoclastos multinucleares. (B) Los controles negativos sin la adición de RANKL teñido para TRAP no muestran osteoclastos multinucleares fusionados. Sin embargo, se puede representar un pequeño número de células mononucleares ligeramente positivas para TRAP. (C) Las imágenes de microscopía de barrido láser confocal de células hematopoyéticas diferenciadas por osteoclastos en un portaobjetos teñido para F-actina (rojo) y catepsina K (turquesa) junto con la tinción nuclear DAPI (azul) muestran grandes osteoclastos multinucleados positivos para catepsina K. (D) Los controles negativos sin la adición de RANKL muestran células mononucleares similares a (B) a una densidad celular más baja. (E) La evaluación funcional puede realizarse mediante la evaluación de la actividad de reabsorción de los osteoclastos. Para ello, la diferenciación de osteoclastos se realiza mediante un ensayo de reabsorción ósea o mineral. Las imágenes de pocillos en mosaico adquiridas con un microscopio de campo amplio invertido en modo de contraste de fase muestran grandes áreas de reabsorción de la capa mineral de fosfato de calcio. La actividad de reabsorción se puede cuantificar aún más midiendo el área de reabsorción sobre el área total. (F) Los controles negativos sin la adición de RANKL no muestran áreas de reabsorción. Barras de escala: A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. Las imágenes han sido editadas a partir de datos publicados anteriormente33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo ofrece un método fiable y robusto para diferenciar las iPSC en OC. Sin embargo, hay varios escollos que se pueden encontrar a lo largo del proceso de diferenciación. Las líneas de iPSC humanas generadas a partir de células de diferentes orígenes tisulares se han diferenciado con éxito utilizando este protocolo33. Al volver a congelar las iPSC (consulte el paso de protocolo "3. Congelación de iPSCs"), un pozo en el punto de paso se congeló de nuevo en un criovial. Al descongelar (consulte el paso del protocolo "1. Descongelación y propagación de iPSCs humanas"), un criovial se descongeló en un solo pocillo de una placa de 6 pocillos. Las diferentes líneas de iPSC se comportarán de manera ligeramente diferente y las tasas de proliferación variarán. La tasa de división deberá ajustarse en consecuencia.
Al pasar iPSCs o disociar iPSCs en una suspensión unicelular para la inducción de EB, es importante eliminar cualquier colonia o agregado de células muertas espontáneamente diferenciadas para mejorar la eficacia y eficiencia de la diferenciación mesodérmica y hematopoyética. Esto se puede hacer bajo un microscopio estereoscópico utilizando un raspador de células, puntas de pipeta de una pipeta P10 o P20, o una herramienta de raspado construida a partir de una pipeta Pasteur35.
Como se mencionó anteriormente, este protocolo implica la disociación de colonias de iPSC en una suspensión de una sola célula para la inducción de EB, mientras que con otros protocolos, las iPSC se dejan como agregados para ser centrifugadas para la inducción de EB36. Se ha informado que el tamaño, el número de células, la forma y la morfología de la EB influyen en la diferenciación 37,38,39. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la disociación en una suspensión unicelular permite una mejor uniformidad de EB a EB en tamaño y forma después de la centrifugación y, por lo tanto, resultados más consistentes de la producción de células hematopoyéticas31.
Se han descrito otros métodos para la inducción de EB. Se ha informado que estos métodos que utilizan una suspensión unicelular junto con un inhibidor de ROCK para mejorar la supervivencia celular son ventajosos para controlar el tamaño de la EB y el resultado de la diferenciación31.
El método de inducción de EB de placa de 96 pocillos de fondo redondo descrito en este protocolo es adecuado para la producción a gran escala de EB y permite aumentar la producción de CO. Recientemente se han descrito métodos más novedosos para la diferenciación hematopoyética sin un paso de inducción del cuerpo embrioide con el potencial de facilitar el proceso de diferenciación32. Sin embargo, estos protocolos aún no se han establecido para la diferenciación del CO33.
En el protocolo antes mencionado, describimos el cambio de medio en el día 5 de diferenciación hematopoyética. Es posible que ya aparezca un pequeño número de células flotantes alrededor del día 4-5 de diferenciación. Para evitar el descarte de células flotantes, el medio debe recogerse en un tubo y centrifugarse antes de desecharse. Luego, el gránulo de celda en la parte inferior del tubo debe desprenderse con el medio fresco y debe transferirse nuevamente a los pocillos de una placa de 6 pocillos. Sin embargo, aún no se ha determinado la importancia de la población temprana de células flotantes en la diferenciación del CO.
La producción de células hematopoyéticas se puede evaluar mediante citometría de flujo. Los altos rendimientos de células CD45+, CD14+ y CD11b+ son deseables para la diferenciación de osteoclastos33. Se ha reportado que la criopreservación de células hematopoyéticas flotantes recolectadas es un desafío, con tasas de recuperación generalmente limitadas y baja viabilidad celular40,41. Mediante la criopreservación de células hematopoyéticas en un medio de criopreservación que consiste en un 50% de un medio de expansión celular hematopoyético libre de suero (ver Tabla de Materiales), 40% de FBS y 10% de DMSO, pudimos recuperar células con una viabilidad celular de aproximadamente el 90,3% ± 2,62 DE (n = 7) después de la descongelación.
La osteoclastogénesis requiere la fusión de múltiples precursores mononucleados de OC para formar osteoclastos multinucleados que sean capaces de resorción mineral y ósea. Mientras que las líneas celulares murinos precursoras de OC simplemente necesitan la adición de RANKL para inducir la formación de OC42, los precursores humanos requieren M-CSF adicional para la supervivencia y proliferación celular43. Recientemente se ha descubierto OSCAR como un receptor adicional implicado en la diferenciación del CO, aunque hasta ahora sólo se ha identificado colágeno de tipo I como ligando. Si bien la investigación de OSCAR con AO derivadas de iPSC es aún limitada, las concentraciones suprafisiológicas in vitro de RANKL y M-CSF en una línea celular murina parecen eludir la necesidad de activación de OSCAR44, la activación de OSCAR in vivo parece ser una señal coestimuladora necesaria para la osteoclastogénesis45. Un factor adicional que debe tenerse en cuenta es la superficie de la placa del pocillo. Se sabe que las propiedades de la superficie química46 yfísica 47 influyen en la diferenciación de los osteoclastos y pueden promover o dificultar la diferenciación exitosa. Una cierta heterogeneidad dentro de la población precursora también parece ser crítica para el éxito de la fusión de los CO, ya que diferentes factores relacionados con la fusión, como CD47 y DC-STAMP, actúan en diferentes etapas de la fusión de osteoclastos48.
En conclusión, este protocolo permite diferenciar el CO humano de las iPSC para facilitar y acelerar la investigación del CO.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Giachelli por su ayuda técnica y apoyo. Agradecemos al Centro de Microscopía W. M. Keck y al gerente del Centro Keck, el Dr. Nathanial Peters, por su ayuda en la obtención de las imágenes de microscopía confocal y microscopía de campo amplio. También agradecemos a la UW Flow Core Facility y al gerente de Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, por su apoyo técnico y asistencia. Por último, agradecemos a Hannah Blümke el apoyo con la ilustración y el diseño gráfico.
La financiación se proporcionó a través de la subvención R35 HL139602-01 de los Institutos Nacionales de Salud. También reconocemos la subvención S10 de los NIH S10 OD016240 para la financiación de instrumentos en el Centro W. M. Keck, así como la subvención 1S10OD024979-01A1 de los NIH para la financiación de instrumentos en el Centro Central de Flujo de la UW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody - Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
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