Summary
Este protocolo apresenta a diferenciação de osteoclastos humanos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e descreve métodos para a caracterização de osteoclastos e precursores de osteoclastos.
Abstract
Este protocolo detalha a propagação e passagem de iPSCs humanas e sua diferenciação em osteoclastos. Primeiro, as iPSCs são dissociadas em uma suspensão de célula única para uso posterior na indução do corpo embrionário. Após a indução mesodérmica, os corpos embrionários sofrem diferenciação hematopoiética, produzindo uma população de células hematopoéticas flutuante. Posteriormente, as células hematopoéticas colhidas passam por uma etapa de maturação do fator estimulador de colônias de macrófagos e, finalmente, diferenciação dos osteoclastos. Após a diferenciação dos osteoclastos, os osteoclastos são caracterizados pela coloração para TRAP em conjunto com uma coloração nuclear verde de metila. Os osteoclastos são observados como policaríneos TRAP+ multinucleados. Sua identificação pode ser apoiada pela coloração de catepsina K. Os ensaios de reabsorção óssea e mineral permitem a caracterização funcional, confirmando a identidade dos osteoclastos de boa-fé. Este protocolo demonstra um método robusto e versátil para diferenciar osteoclastos humanos de iPSCs e permite fácil adoção em aplicações que requerem grandes quantidades de osteoclastos humanos funcionais. Aplicações nas áreas de pesquisa óssea, pesquisa de câncer, engenharia de tecidos e pesquisa de endopróteses poderiam ser vislumbradas.
Introduction
Os osteoclastos (CO) são derivados dahematopoética1,2, tipos celulares versáteis e comumente utilizados por pesquisadores em áreas como pesquisa de doençasósseas3,4, pesquisa decâncer5,6, engenharia detecidos7,8 e pesquisa de endopróteses9,10. No entanto, a diferenciação de CO pode ser desafiadora, uma vez que a fusão de precursores mononucleares em COs multinucleados é necessária para criar CO funcionais11. Vários fatores biológicos, como o receptor ativador do ligante NF-κB (RANKL) e o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), são necessários para a diferenciação do CO. Foi relatado que o M-CSF tem um efeito positivo sobre a proliferação celular, sobrevivência celular e expressão de RANK 12,13,14. Por outro lado, o RANKL liga-se ao RANK, que ativa cascatas de sinalização a jusante que induzem a osteoclastogênese. A ativação é mediada pelo fator 6 associado ao receptor de TNF (TRAF6), que leva à degradação do fator nuclear do intensificador do gene do polipeptídeo kappa light no inibidor de células B, alfa (IκB-α), uma proteína ligadora que se liga aos dímeros do NF-kB16,17. Assim, a degradação de IκB-α libera dímeros de NF-kB, que então se translocam para o núcleo e induzem a expressão dos fatores de transcrição c-Fos e Fator Nuclear de Células T Ativadas 1 (NFATc1). Isso, por sua vez, desencadeia a transcrição de uma infinidade de proteínas relacionadas à diferenciação dos CO 15,18. Proteínas upregulated como DC-Stamp e Atp6v0d2 medeiam a fusão célula-célula de precursores de OC, levando à formação de sincício 19,20,21.
Com relação às células primárias humanas, as CMSP CD34+ e CD14+ são atualmente os tipos celulares mais utilizados para diferenciação emCO22. No entanto, essa abordagem é limitada pela heterogeneidade dentro da população CD34+ de células colhidas de doadores23 e sua limitada capacidade de expansão. As iPSCs humanas apresentam uma fonte alternativa para os COs. Como podem ser propagados indefinidamente24, permitem a expansibilidade e o upscaling da produção de OC. Isso permite a diferenciação de um grande número de COs, o que facilita a pesquisa de CO.
Vários protocolos para a diferenciação de iPSCs em CO foram publicados 25,26,27. Todo o processo de diferenciação pode ser dividido em uma parte de propagação de iPSC, uma parte de diferenciação mesodérmica e hematopoiética e diferenciação de OC. A propagação de iPSCs antes do processo de diferenciação permite o aumento da produção de OC antes da diferenciação. Existem várias abordagens em relação à diferenciação mesodérmica e hematopoiética. Tradicionalmente, a formação do corpo embrióide (BE) tem sido usada para diferenciar células hematopoéticas, mas abordagens baseadas em monocamadas representam outra estratégia de diferenciação hematopoética que não requer indução de EB. No entanto, sistemas baseados em monocamadas parecem exigir maior otimização, pois nós e outros descobrimos que as abordagens baseadas em EB são mais robustas para a diferenciação de OCs.
Aqui, descrevemos a diferenciação de COs de iPSCs humanas usando um protocolo baseado em EB. Esse protocolo foi adaptado de Rössler et al.26 e modificado para aumentar a robustez e permitir a criopreservação durante o processo de diferenciação. Primeiro, colhemos as células hematopoéticas apenas uma vez após 10 dias de diferenciação. As células hematopoéticas foram então criopreservadas para permitir maior flexibilidade durante o processo de diferenciação. Adicionalmente, aumentamos a densidade de semeadura de células hematopoéticas de 1 x 105 para 2 x 105 células/cm2 para diferenciação de CO. Um meio iPSC humano isento de soro mais recente (hiPSC-SFM, ver Tabela de Materiais) foi usado, e o revestimento dos poços foi realizado com 200-300 μg/mL de um extrato de membrana basal (ver Tabela de Materiais) em vez de 0,1% de gelatina. Penicilina/estreptomicina não foi adicionada à mídia.
O protocolo de Rössler et al.26 foi originalmente adaptado de uma iPSC para um protocolo de diferenciação de macrófagos28 que utiliza a formação de EB para diferenciação hematopoiética. Embora a formação da EB tenha sido utilizada por tempo prolongado por pesquisadores para diferenciação hematopoética29,30, vários métodos de indução da EB têm sido descritos na literatura, como agregação espontânea, centrifugação em placa de poço de fundo redondo, cultura em gota suspensa, cultura em biorreator, cultura de tubo cônico, vaso lateral de giro lento e cultura em gel de micromolde31. Este protocolo utiliza a centrifugação de iPSCs dissociadas em uma placa de poço de fundo redondo para aproximar células iPSC únicas umas das outras e permitir a formação de esferas (EB), como descrito a seguir.
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Protocol
NOTA: Todos os reagentes utilizados neste protocolo podem ser encontrados na Tabela de Materiais. Salvo especificação em contrário, todos os meios foram pré-equilibrados a 37 °C antes da utilização. Todas as etapas de centrifugação são realizadas a 37 °C e usando o modo de aceleração/desaceleração mais lento. Salvo indicação em contrário, o sobrenadante é sempre removido utilizando pipetas de vidro Pasteur descartáveis.
1. Descongelamento e propagação de iPSCs humanas
- Um dia antes do descongelamento das iPSCs, revestir um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de extrato da membrana basal na concentração de 200-300 μg/mL. Coloque a placa do poço a 4 °C durante a noite.
- No dia seguinte, descongelar e transferir as células para um tubo de 15 mL usando uma pipeta P1000. Em gota, adicionar 5-7 mL de DMEM/F-12 com 15 mM HEPES.
- Centrifugar as células a 300 x g durante 5 min. Remova suavemente as células da centrífuga e certifique-se de não perturbar o pellet celular.
- Remover cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur e ressuspender as células em 1 mL de meio livre de soro hiPSC (hiPSC-SFM contendo 10 μM de inibidor de Rho quinase (ROCK) Y-27632) usando P1000 com pontas largas.
- Aspirar o extracto da membrana basal do poço revestido no dia anterior (passo 1.1) e transferir 1 ml de hiPSC-SFM com 10 μM Y-27632 para o poço. Adicione iPSCs ressuspendidas ao poço para atingir um volume final de 2 mL por poço.
- Agitar a placa para distribuir uniformemente os agregados iPSC antes de colocar em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
- Realizar trocas completas de meio a cada dois dias usando hiPSC-SFM (sem a adição do inibidor ROCK Y-27632). As iPSCs geralmente atingem 70-80% de confluência após 3-4 dias de propagação.
2. Passagem de iPSCs
- Um dia antes da passagem de iPSCs, revestir poços de uma placa de 6 poços com um extrato de membrana basal a uma concentração de 200-300 μg/mL. Coloque a placa do poço a 4 °C durante a noite.
NOTA: Confirme se as células atingiram aproximadamente 70-80% de confluência. Certifique-se de que as iPSCs não fiquem superconfluentes (mais de 80% de confluência), pois isso promoverá a diferenciação espontânea. - Comece a passar iPSCs removendo regiões diferenciadas ou regiões com muitos agregados iPSC mortos sob o estereomicroscópio usando pontas de pipeta de 10 μL ou 20 μL ou um raspador de células. Regiões diferenciadas aparecerão de cor mais densa ou branca.
NOTA: Os agregados de células raspadas ainda podem se fixar parcialmente ao fundo do poço. - Lave o fundo do poço várias vezes com uma pipeta P1000 de furo largo para remover quaisquer agregados que ainda possam estar parcialmente presos ao fundo do poço.
- Descarte o meio usado no qual as iPSCs foram cultivadas que contém os agregados iPSC destacados. Repita a etapa de lavagem mais duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Em seguida, adicionar 1 mL de Dispase 5 U/mL por poço. As bordas das colônias iPSC irão decolar da placa do poço, o que pode ser observado sob o estereomicroscópio após 3-5 min de incubação à temperatura ambiente.
- Remover cuidadosamente Dispase para evitar o deslocamento de agregados ligeiramente destacados e adicionar 1 mL de DMEM/F-12 com 15 mM HEPES. Use um elevador de células descartável para fatiar os agregados em tamanhos pequenos. A consistência dos tamanhos de agregados iPSC pode ser melhorada com uma ferramenta de passagem de células-tronco.
- Lavar os agregados iPSC fatiados com o meio no poço e transferir o meio com agregados para um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta sorológica de 5 mL ou P1000 com uma ponta de furo largo.
- Enxaguar o poço com DMEM/F-12 e transferir o meio para o tubo de 15 mL com os agregados iPSC.
- Centrifugar os agregados iPSC fatiados a 200 x g por 3 min. Remover o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur e adicionar 2 mL de hiPSC-SFM para desalojar e ressuspender as iPSCs usando uma pipeta sorológica de 5 mL ou P1000 com pontas largas.
- Aspirar o extrato remanescente da membrana basal da(s) placa(s) de poço pré-revestida e adicionar 1 mL de hiPSC-SFM a cada poço da placa de 6 poços.
- Transfira iPSCs para novos poços de uma placa de 6 poços de modo que o volume final seja de 2 mL de hiPSC-SFM por poço usando um P1000 com pontas largas. Dependendo da linha iPSC, as taxas de divisão precisam ser otimizadas. Aqui, uma razão de divisão de 1:6 foi usada.
- Verifique o poço para agregados flutuantes e tamanho de agregado sob o estereomicroscópio. Idealmente, o tamanho do agregado deve estar entre 50-200 μm.
- Agitar a placa do poço para distribuir as células uniformemente pela placa após a transferência dos agregados e incubar a 37 °C a 5% CO2 até 70-80% de confluência.
3. Congelamento de iPSCs de volta
- Para congelar as células iPSC de volta, as células de passagem conforme descrito acima (consulte a etapa de protocolo "2. Passagem de iPSCs"). Depois que as células tiverem sido fatiadas em colônias e lavadas do fundo do poço (etapa 2.10), gire os agregados fatiados a 200 x g por 3 min. Aspirar o sobrenadante.
- Adicionar 1 mL de meio de criopreservação sem soro por poço de uma placa de 6 poços ao tubo de 15 mL e ressuspender os agregados fatiados usando um P1000 com uma ponta de furo largo.
- Transfira células para criotubos pré-marcados. Feche os tubos e transfira os tubos para um recipiente de criopreservação pré-resfriado a 4 °C. Conservar as células a -80 °C durante 24-48 horas.
- Transfira os criósteros para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
NOTA: Um resumo esquemático do processo de diferenciação do OC é ilustrado na Figura 1.
4. Indução do corpo embrionário
- Cultivar e expandir iPSCs suficientes, conforme descrito acima, para indução de EB.
NOTA: A produção de OC pode ser aumentada aumentando o número de corpos embrionários, que por sua vez produzem um rendimento geral maior de células hematopoiéticas. Um poço de 70-80% de iPSCs confluentes produz aproximadamente 8,4 x 105 células por poço de um poço de placa de 6 poços. São necessárias 12.500 iPSCs unicelulares para formar um corpo embrionário. - Aspirar o meio irradiado das culturas iPSC e enxaguar as colônias iPSC com D-PBS.
- Adicionar 0,5 mL de reagente de dissociação de célula única pré-aquecido à temperatura ambiente a cada poço de uma placa de 6 poços e girar o vaso de cultura para revestir toda a superfície do poço. Incubar o recipiente de cultura a 37 °C durante 5-8 min.
- Retirar o vaso da incubadora, aspirar o reagente de dissociação de célula única e adicionar 1 mL do meio de diferenciação Estágio 1 aos poços, consistindo de meio livre de soro hiPSC com 50 ng/mL de proteína morfogenética óssea humana 4 (hBMP4), 50 ng/mL de fator de crescimento endotelial vascular humano-165 (hVEGF), 20 ng/mL de fator de células-tronco humanas (hSCF), e 10 μM Y-27632.
- Desenrole suavemente as células enxaguando o poço com o meio Estágio 1. Agrupar iPSCs dissociadas em um tubo cônico de 15 mL.
- Adicione 1 mL de meio de diferenciação Estágio 1 aos poços e lave as células restantes ou use um raspador de células para colônias que não se lavam facilmente.
- Depois de transferir todas as células para o tubo, centrifugar a 200 × g por 5 min à temperatura ambiente para formar um pellet de células. Aspirar e ressuspender as células em um total de 2 mL de meio de diferenciação pré-equilibrado Estágio 1 usando uma pipeta sorológica de 5 mL ou uma P1000 com uma ponta de furo largo.
- Conte células usando um hemocitômetro ou dispositivo automatizado de contagem celular. Adicione o meio ao tubo de 15 mL contendo a suspensão de célula única à placa de 12.500 células por poço em uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa de fundo redondo em 100 μL do meio de diferenciação Estágio 1.
NOTA: Sob o microscópio, as células aparecerão como uma suspensão de célula única com células dispersas por todo o poço. - Centrifugar as placas de 96 poços por 3 min a 100 x g. Depois de centrifugadas, as células devem começar a se assemelhar a esferoides quando vistas ao microscópio. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C durante 24 horas.
- Troque metade do meio no Dia 1 e no Dia 2 com o meio de diferenciação Estágio 1. Para melhorar a eficiência, use uma pipeta multicanal para descartar 50 μL do meio de diferenciação Estágio 1 gasto em uma placa de Petri.
- Depois de descartar o meio da placa de 96 poços, verifique se há EBs sob o estereomicroscópio que possam ter sido removidos acidentalmente. Transfira EBs removidos acidentalmente para a placa de 96 poços usando uma pipeta P1000 com pontas largas.
- Adicione 50 μL de meio de diferenciação fresco Estágio 1 a cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa de fundo redondo usando uma pipeta multicanal.
5. Diferenciação hematopoética
- Um dia antes de iniciar a diferenciação hematopoiética, revestir um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de extrato da membrana basal na concentração de 200-300 μg/mL. Coloque a placa do poço a 4 °C durante a noite.
NOTA: Cada poço receberá 8 EBs em um ponto posterior deste protocolo. Dependendo do número de EBs preparadas, revestir poços correspondentemente. - Aspirar o extrato da membrana basal em excesso e pré-encher os poços da placa de 6 poços com 3 mL do meio de diferenciação Estágio 2, consistindo de um meio hematopoético basal ao qual são adicionados 2 mM de Ultraglutamina, 55 μM de 2-mercaptoetanol, 25 ng/mL de interleucina humana 3 (hIL-3) e 100 ng/mL de fator estimulador de colônia de macrófagos humanos (hM-CSF).
- Usando um P1000 com pontas largas, transfira 8 EBs para cada poço da placa de 6 poços. Após a transferência, confirme a olho ou no estereomicroscópio que 8 EBs estão em cada poço.
NOTA: Após 1 dia, os EBs flutuantes irão aderir ao fundo do poço. Nos 5-7 dias seguintes, uma população de células flutuantes composta por células hematopoiéticas deve tornar-se visível. O período de diferenciação hematopoiética pode ser variado, iniciando-se com 7 dias. A diferenciação por 10 dias mostrou uma população hematopoiética composta por grandes subpopulações CD45+, CD14+ e CD11b+ . - Após 5 dias de tratamento com o meio de diferenciação Estágio 2, realizar a troca do meio retirando o meio gasto e dispensando-o em um tubo cônico de 50 mL. Pipetar lentamente para tentar remover o mínimo possível de células flutuantes e manter a tensão de cisalhamento o mais baixa possível. Pipetting sob um estereomicroscópio pode ajudar a evitar a remoção acidental de células.
- Adicione imediatamente 1 mL de meio de diferenciação fresco Estágio 2 aos poços. Para recuperar quaisquer células hematopoiéticas flutuantes que possam já estar presentes neste ponto do processo de diferenciação, não descarte o meio dispensado. Em vez disso, gire o tubo com o meio gasto a 300 x g por 5 minutos e aspirar o sobrenadante.
- Adicione um novo meio de diferenciação Estágio 2 ao tubo e ressuspenda para separar as células que podem ter sido transferidas com o meio gasto.
- Adicionar 2 mL do meio de diferenciação fresco Estágio 2 com as células recuperadas em cada poço, que foi previamente preenchido com 1 mL do meio de diferenciação Estágio 2.
- No 10º dia de diferenciação hematopoiética, verificar a presença de grande número de células hematopoéticas flutuantes. Colher recolhendo-os em tubo de 50 mL. Eles podem ser congelados de volta em 10% DMSO, 50% FBS e 40% meio ou usados imediatamente para diferenciar as células em OCs.
6. Maturação do M-CSF e diferenciação do CO
- Células de sementes na concentração de 200.000 células/cm2 em cultura de tecidos tratadas bem em placas e tratadas com alfa-MEM, suplementadas com FBS a 10% e 50 ng/mL hM-CSF.
- Para realizar ensaios funcionais ou de imagem, destacar as células maturadas M-CSF 3 dias após a semeadura, lavando com PBS pré-aquecido a 37 °C usando um P1000 com uma ponta de furo largo. Etapas repetidas de lavagem podem ser necessárias para desprender totalmente as células.
- Transfira as células destacadas para um tubo de 15 mL usando um P1000 com uma ponta de furo largo e centrifuga a 300 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
- Ressuspender e dissolver o pellet celular com o meio de diferenciação OC, consistindo de alfa-MEM suplementado com 10% FBS, 50 ng/mL hM-CSF e 80 ng/mL hRANKL. Conte as células usando um hemocitômetro ou dispositivo automatizado de contagem de células e resemeie células maturadas M-CSF a uma densidade de 200,00-250.000 células/cm2 em um material de cultura apropriado para ensaios funcionais ou de imagem (ou seja, ensaios de reabsorção óssea, lâminas de lamínula para geração de imagens, etc.).
- Diferenciar com o meio de diferenciação OC por 7-9 dias. Realize uma troca completa do meio do poço com o meio de diferenciação de OC fresco a cada 2-3 dias.
NOTA: OCs multinucleados normalmente aparecem após 5-7 dias.
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Representative Results
Monitoramento da morfologia celular ao longo do processo de diferenciação
Todos os resultados descritos abaixo foram gerados usando a linha MCND-TENS2 iPSC para diferenciação de CO. Essa linhagem de iPSC já foi utilizada em diversos estudos32,33. No entanto, outras linhagens de iPSC também têm sido utilizadas com sucesso com esse protocolo de diferenciação.
A avaliação visual regular revela características morfológicas diferentes e distintas das iPSCs ao longo do processo de diferenciação para CO (Figura 2). As colônias iPSC (Figura 2A) foram dissociadas em uma suspensão unicelular, que aparece como células individuais em toda a placa do poço inferior redondo antes da centrifugação (Figura 2B). Após a centrifugação (passo 4.9 do protocolo), as células se coletarão no centro da placa do poço de fixação ultrabaixa de fundo redondo e, posteriormente, formarão esferas (corpos embrionários, EBs, Figura 2C). As EBs aumentarão de duas a três vezes de tamanho ao longo do processo de diferenciação mesodérmica (Figura 2D) e tornar-se-ão facilmente visíveis aos olhos ao final do período de diferenciação de 4 dias (Figura 2E). As EBs podem ser vistas aderindo e fundindo-se com o fundo da placa do poço após a transferência para os poços de uma placa de 6 poços para diferenciação hematopoética (passo 5.3 do protocolo, Figura 2F). Após 7-8 dias, grandes quantidades de células hematopoéticas flutuantes tornam-se visíveis no meio de cultura (Figura 2G). Após a colheita e replaqueamento das células hematopoéticas, segue-se uma fase de maturação M-CSF e inicia-se a diferenciação do CO (passo 6.4 do protocolo). Dentro de 5-6 dias, células multinucleadas com um grande corpo celular transparente tornam-se visíveis pela primeira vez (Figura 2H). Um grande número de células mononucleares ainda é visível nesta fase. Após mais 2-3 dias de diferenciação do CO, os CO se fundirão ainda mais com as células adjacentes para formar grandes policariões com ainda mais núcleos (Figura 2I).
Avaliação da população hematopoética derivada da EB
A diferenciação hematopoética pode ser realizada por um período variável de tempo. Períodos de tempo que se iniciam com 7 dias até 9 semanas têm sido descritos na literatura. Neste protocolo, a diferenciação hematopoiética é realizada por um período de 10 dias. Observamos que 10 dias de diferenciação hematopoiética produziram baixo número de progenitores hematopoéticos CD34+ precoces (0,53%, Figura 3A) e maior número de progenitores hematopoéticos CD43+ (48,5%, Figura 3B) em estágio médio de estágio. Mais criticamente, quantidades suficientes de HPCs CD45+ (96,2%, Figura 3C), CD14+ (33%, Figura 3D) e CD11b+ (35,9%, Figura 3E) foram geradas após um período de tratamento de 10 dias para diferenciá-las ainda mais em COs. No entanto, o período de tratamento com citocinas para diferenciação hematopoética (passo 5.4 do protocolo) pode precisar ser ajustado e otimizado com base na linhagem iPSC para gerar quantidades adequadas de células CD45+, CD14+ e CD11b+ .
Em média, 6 milhões de células hematopoéticas foram colhidas após 10 dias de diferenciação de cada poço com 8 EBs.
Avaliação da morfologia e atividade do CO
Após a diferenciação dos CO, os CO podem ser avaliados morfológica e funcionalmente. Os precursores de CO são resemeados em lâminas de câmara ou lâminas de deslizamento de cobertura seguindo a etapa de maturação M-CSF para melhorar a qualidade da imagem ao colorir para TRAP ou catepsina K. A coloração enzimática TRAP após a diferenciação de OC mostra OCs grandes, multinucleados e positivos para TRAP (Figura 4A). Além disso, células mononucleares levemente positivas para TRAP podem ser vistas intercaladas entre CO multinucleares. Controles negativos sem a adição de RANKL não exibem OC multinuclear fundido. No entanto, um pequeno número de células mononucleares levemente positivas para TRAP pode ser representado (Figura 4B).
Imagens de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) mostram OCs corados para catepsina K (turquesa) e F-actina (vermelho) em conjunto com coloração nuclear DAPI (azul) (Figura 4C, 4D). Grandes CO multinucleares são visíveis quando tratados com RANKL de acordo com o protocolo, que mostra uma extensa estrutura citoesquelética de actina F e coloração positiva para catepsina K (Figura 4C). Controles negativos sem a adição de RANKL, por outro lado, não mostram células multinucleares fundidas.
Os CO podem ser avaliados funcionalmente através da medição da atividade reabsortiva. Ensaios de reabsorção óssea ou mineral podem ser usados para determinar a atividade reabsortiva. Aqui, precursores de CO foram semeados em poços revestidos com fosfato de cálcio e terminalmente diferenciados. Grandes áreas onde o revestimento mineral foi reabsorvido são visíveis na cor cinza-azulada (Figura 4E). Poços de reabsorção de diferentes tamanhos podem ser identificados. Não reabsorvido, o restante revestimento de fosfato de cálcio é visível em marrom. A presença de fossas de reabsorção confirma a identidade das células multinucleadas diferenciadas como CO. Adicionalmente, as cavidades de reabsorção podem ser quantificadas para avaliar e comparar a atividade reabsortiva. A área total do mineral reabsorvido sobre a superfície total do poço pode ser quantificada como uma medida percentual. Além disso, o tamanho e o número de cavas de reabsorção podem ser quantificados. Os controles negativos não tratados não apresentaram fossas de reabsorção (Figura 4F).
Figura 1: Ilustração esquemática do processo de diferenciação dos osteoclastos a partir de iPSCs humanas. Ilustração desenhada por Hannah Blümke usando Affinity Designer 2.1.1. A ilustração utiliza desenhos previamente utilizados33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens de microscopia durante todo o processo de diferenciação das iPSCs humanas em relação aos osteoclastos. (A) Colônias indiferenciadas de iPSC ao longo da propagação. (B) iPSCs em poços de fundo redondo após dissociação em uma única suspensão celular antes da centrifugação. (C) IPSCs de célula única coletadas centralmente após centrifugação. (D) As EBs crescem de tamanho ao longo do período de diferenciação mesodérmica de 4 dias. (E) Corpos embrionários visíveis após diferenciação mesodérmica. (F) Após a transferência dos corpos embrionários para o extrato da membrana basal revestido com placas de 6 poços, os corpos embrionários podem ser vistos aderindo e se fundindo com o fundo do poço. (G) Após 5-7 dias da diferenciação hematopoiética, um grande número de células hematopoéticas flutuantes pode ser observado no meio. (H) Após a maturação do M-CSF, os primeiros osteoclastos com 3-4 núcleos aparecem após 5-7 dias de diferenciação com RANKL. (I) Ao final da diferenciação dos osteoclastos, observam-se grandes células multinucleadas. Barras de escala: A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de marcadores de superfície de células hematopoéticas derivadas do corpo embrionário por citometria de fluxo. A expressão de marcadores permite a análise de células hematopoéticas e a identificação de subpopulações após o gating para singlets e células vivas. (A) A população de células progenitoras hematopoéticas CD34+ ontogeneticamente precoces é muito pequena ou ausente em conjunto com este protocolo. (B) As células CD43+ constituem aproximadamente 50% de toda a população. (C) As células progenitoras hematopoéticas CD45+ em estádio mais avançado constituem a maior parte da população hematopoética, com 96,2%. (D, E) Precursores mais diretos de CD14+ e CD11b+ OC representam 33% e 36%, respectivamente. Em vermelho: controle negativo não corado, em azul: controles isotípicos, em amarelo: células coradas com o respectivo anticorpo marcador. As parcelas utilizam dados previamente publicados33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação morfológica e funcional dos osteoclastos humanos diferenciados por iPSC. (A) A coloração TRAP após a diferenciação osteoclástica mostra osteoclastos grandes, multinucleados e TRAP positivos. Células mononucleares levemente positivas para TRAP podem ser vistas intercaladas entre osteoclastos multinucleares. (B) Controles negativos sem adição de RANKL corados por TRAP não exibem osteoclastos multinucleares fundidos. No entanto, um pequeno número de células mononucleares levemente positivas para TRAP pode ser descrito. (C) Imagens confocais de microscopia de varredura a laser de células hematopoéticas diferenciadas de osteoclastos em lâmina de lamínula coradas para F-actina (vermelho) e catepsina K (turquesa) em conjunto com coloração nuclear DAPI (azul) mostram grandes osteoclastos positivos para catepsina K multinucleados. (D) Controles negativos sem a adição de RANKL mostram-se semelhantes a (B) células mononucleares em menor densidade celular. (E) A avaliação funcional pode ser realizada pela avaliação da atividade de reabsorção dos osteoclastos. Para isso, a diferenciação dos osteoclastos é realizada em um ensaio de reabsorção óssea ou mineral. Imagens de poço em azulejo adquiridas com microscópio invertido de campo largo em modo de contraste de fase retratam grandes áreas de reabsorção da camada mineral de fosfato de cálcio. A atividade reabsortiva pode ser quantificada medindo-se a área de reabsorção sobre a área total. (F) Controles negativos sem adição de RANKL não apresentam áreas de reabsorção. Barras de escala: A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. As imagens foram editadas a partir de dados previamente publicados33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo oferece um método confiável e robusto para diferenciar iPSCs em OCs. No entanto, existem várias armadilhas que podem ser encontradas ao longo do processo de diferenciação. Linhagens humanas de iPSC geradas a partir de células de diferentes origens teciduais têm sido diferenciadas com sucesso por meio desse protocolo33. Ao congelar iPSCs de volta (consulte a etapa de protocolo "3. Congelamento de iPSCs"), um poço no ponto de passagem foi congelado de volta em um criovial. Ao descongelar (ver passo de protocolo "1. Descongelamento e propagação de iPSCs humanas"), um criovial foi descongelado em um único poço de uma placa de 6 poços. Diferentes linhas iPSC se comportarão de forma ligeiramente diferente, e as taxas de proliferação variarão. A taxa de divisão terá de ser ajustada de forma correspondente.
Ao passar iPSCs ou dissociar iPSCs em uma suspensão unicelular para indução de EB, é importante remover colônias espontaneamente diferenciadas ou agregados de células mortas para melhorar a eficácia e eficiência da diferenciação mesodérmica e hematopoiética. Isso pode ser feito sob um estereomicroscópio usando um raspador de células, pontas de pipeta de uma pipeta P10 ou P20, ou uma ferramenta de raspagem construída a partir de uma pipeta Pasteur35.
Como mencionado acima, esse protocolo envolve a dissociação de colônias iPSC em uma suspensão unicelular para indução de EB, enquanto que com outros protocolos, iPSCs são deixadas como agregados a serem centrifugadas para indução de EB36. O tamanho, o número celular, a forma e a morfologia da EB influenciam a diferenciação 37,38,39. Assim, hipotetizamos que a dissociação em uma suspensão unicelular permite melhor uniformidade EB-EB em tamanho e forma após a centrifugação e, portanto, resultados mais consistentes da produção de células hematopoéticas31.
Outros métodos para indução da EB têm sido descritos. Tais métodos que utilizam uma suspensão unicelular em conjunto com inibidor de ROCK para melhorar a sobrevivência celular têm sido relatados como vantajosos no controle do tamanho da EB e desfecho de diferenciação31.
O método de indução de EB de placa de fundo redondo de 96 poços descrito neste protocolo é adequado para a produção em larga escala de EBs e permite o aumento da produção de OC. Mais novos métodos para diferenciação hematopoética sem uma etapa de indução do corpo embrionário com potencial para facilitar o processo de diferenciação têm sido recentemente descritos32. No entanto, esses protocolos ainda não foram estabelecidos para a diferenciação das CO33.
No protocolo supracitado, descrevemos a mudança do meio no 5º dia de diferenciação hematopoiética. Um pequeno número de células flutuantes já pode aparecer por volta do Dia 4-5 de diferenciação. Para evitar o descarte de células flutuantes, o meio deve ser coletado em tubo e centrifugado antes de ser descartado. O pellet de célula no fundo do tubo deve então ser desalojado com o meio fresco e deve ser transferido de volta para poços de uma placa de 6 poços. No entanto, o significado da população inicial de células flutuantes na diferenciação de CO ainda precisa ser determinado.
A produção de células hematopoéticas pode ser avaliada por citometria de fluxo. Altos rendimentos de células CD45+, CD14+ e CD11b+ são desejáveis para a diferenciação dos osteoclastos33. A criopreservação de células hematopoéticas flutuantes captadas tem sido relatada como desafiadora, com taxas de recuperação geralmente limitadas e baixa viabilidade celular40,41. Através da criopreservação de células hematopoéticas em meio de criopreservação constituído por 50% de meio de expansão celular hematopoiético livre de soro (ver Tabela de Materiais), 40% FBS e 10% DMSO, conseguimos recuperar células com viabilidade celular de aproximadamente 90,3% ± 2,62 DP (n = 7) pós-descongelamento.
A osteoclastogênese requer a fusão de múltiplos precursores mononucleados de CO para formar osteoclastos multinucleados capazes de reabsorção mineral e óssea. Enquanto linhagens celulares precursoras de OC murinas simplesmente precisam da adição de RANKL para induzir a formação de OC42, precursores humanos requerem M-CSF adicional para sobrevivência e proliferação celular43. OSCAR foi recentemente descoberto como um receptor adicional envolvido na diferenciação de CO, embora apenas o colágeno tipo I tenha sido identificado até agora como um ligante. Enquanto a pesquisa de OSCAR com OCs derivados de iPSC ainda é limitada, concentrações suprafisiológicas in vitro de RANKL e M-CSF em uma linhagem celular murina parecem ignorar a necessidade de ativação de OSCAR44, a ativação de OSCAR in vivo parece ser um sinal costimulatório necessário para osteoclastogênese45. Um fator adicional que precisa ser considerado é a superfície da placa do poço. Sabe-se que as propriedades químicas46 e físicas47 superficiais influenciam a diferenciação dos osteoclastos e podem promover ou dificultar o sucesso da diferenciação. Uma certa heterogeneidade dentro da população precursora também parece crítica para o sucesso da fusão de CO, uma vez que diferentes fatores relacionados à fusão, como CD47 e DC-STAMP, atuam em diferentes estágios da fusão dos osteoclastos48.
Em conclusão, este protocolo permite a diferenciação de CO humanos de iPSCs para facilitar e acelerar a pesquisa de CO.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos membros do laboratório Giachelli pela ajuda técnica e apoio. Agradecemos ao Centro de Microscopia W. M. Keck e ao gerente do Keck Center, Dr. Nathanial Peters, pela assistência na obtenção das imagens de microscopia confocal e de campo amplo. Agradecemos também ao UW Flow Core Facility e ao gerente do Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, pelo suporte técnico e assistência. Por fim, agradecemos a Hannah Blümke pelo apoio com ilustração e design gráfico.
O financiamento foi fornecido através do National Institutes of Health grant R35 HL139602-01. Também reconhecemos a concessão S10 do NIH S10 OD016240 para financiamento de instrumentos no W. M. Keck Center, bem como a concessão NIH 1S10OD024979-01A1 para financiamento de instrumentos no UW Flow Core Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody - Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
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